CN112029791A - 选择真核宿主细胞的选择载体和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及选择真核宿主细胞的选择载体和方法。具体涉及表达载体或至少2个表达载体的组合，所述载体包括：a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的多核苷酸，其中所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少；b)至少一种编码目标多肽的多核苷酸，其中当向宿主细胞引入所述表达载体或至少2个表达载体的组合时，自所述宿主细胞分泌目标多肽。还提供合适的宿主细胞、选择方法和高产率生成多肽的方法。

Description

选择真核宿主细胞的选择载体和方法
技术领域
本发明涉及新型选择系统，其基于突变叶酸受体作为选择性标记物以选择表达目标多肽的宿主细胞，尤其是哺乳动物宿主细胞的应用。本发明提供适当表达载体、宿主细胞和方法，以选择高产率表达目标重组多肽的宿主细胞。此外，本发明涉及高产率有效生成重组多肽的方法。
背景技术
大量克隆和表达目标产物如重组肽和蛋白的能力日益重要。纯化高水平蛋白的能力在人用药物和生物技术领域重要，例如用于生成蛋白药物以及基础研究中，例如用于结晶蛋白从而能测定其三维结构。通过其他方式难以大量获得的蛋白能在宿主细胞中过表达，随后被分离并纯化。
选择生成重组蛋白的表达系统取决于多种因素，包括目标蛋白的细胞生长特性、表达水平、胞内和胞外表达、翻译后修饰和生物活性，以及治疗蛋白生产中的法规问题和经济考量。哺乳动物细胞相比其它表达系统如细菌或酵母的关键优势是完成合适蛋白折叠、复杂N-连接糖基化和真O-连接糖基化以及广泛的其它翻译后修饰的能力。由于所述优势，真核且尤其是哺乳动物细胞是当前选择的用于生成复杂治疗蛋白如单克隆抗体的表达系统。
获得高表达宿主细胞(也称为高生产者)的最常用方法产生用于表达目标多肽的合适表达载体作为第一步。表达载体驱动编码目标多肽的多核苷酸在宿主细胞内的表达并提供至少一个选择性标记物用于产生重组细胞系。
一种已建立的获得高产率表达目标多肽的高生产细胞系的方法是稳定转染宿主细胞。然后，目标多肽分泌到培养基中且能从中大量获得。然而，稳定整合到基因组中是稀有事件，仅一小部分稳定转染细胞是高生产者。
为了获得高产率表达目标多肽的宿主细胞，广泛使用选择性标记物和选择系统。各系统还用于产生和鉴定稳定转染的克隆。用各选择性标记物和选择系统的主要目标是引入选择基因，其在暴露于选择性生长条件后能够鉴定能高水平生成目标重组产物的细胞。例如，已建立的选择性标记物包括二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰氨合成酶(GS)。
另一选择系统基于还原叶酸载体选择系统。还原叶酸载体(RFC)是无所不在地表达的膜糖蛋白，担当摄入还原叶酸如5-甲基-THF和5-甲酰基-THF的主要转运子。然而，RFC展现出对氧化叶酸、叶酸的极弱亲和性。因此，缺乏 RFC表达或缺失基因组RFC基因座的细胞能充当一定条件下转染选择性标记物基因RFC的受体，所述条件中生长培养基中的还原叶酸如5-甲酰基-THF逐步除去，从而迫使细胞表达更高水平的该叶酸转运子。RFC选择系统有几个缺陷：a)必须使用RFC无效受体细胞，其中内源RFC基因座被敲除或通过靶向敲除或失功能突变而失活。b)RFC对叶酸有极弱的转运亲和性且因此所述氧化叶酸不能用于选择。c)与作为单向叶酸摄取系统的叶酸受体基系统(见下)相反，RFC是双向叶酸转运子，其显示同样有效的叶酸输入和输出。这意味着在叶酸缺失情况下，RFC过表达可能对受体细胞有害，所述细胞通过过表达的 RFC进一步输出叶酸。
另一近期提出的选择系统是基于叶酸受体如叶酸受体α作为选择性标记物的应用。WO2009/080759描述了该系统。此系统的数种优势在于，就选择而言，不需要毒性物质而且宿主细胞的内源叶酸受体无需敲除。WO 2010/097240 描述了另一基于叶酸受体用作选择性标记物的选择系统。
叶酸受体和其突变体参见例如Shen等“决定叶酸受体α和β不同配体特异性的氨基酸残基的鉴定”(Identification of amino acid residues that determine thedifferential ligand specificities of folate receptors alpha and beta)(Biochemistry 1997,36,6157-6163)。还描述了与医学疾病相关的叶酸受体α突变。叶酸受体中氨基酸位置还在Ramamoorthy等“计算机模拟分析叶酸受体中的功能性重要残基”(Insilico analysis of functionally important residues in folate receptors)(Bioinformation 2(4):157-162(2007))中分析。
高严格性的选择系统对选择以及因此从转染群中富集高生产细胞是至关重要的。选择系统的严格性越高，选择过程后的低生产者数量越少，且发现极罕见高产克隆的机会越高。此外，非常需要提供比现有技术方法能更迅速获得高产克隆的选择系统。
本发明的目的是提供严格选择系统以选择高产率生成目标多肽的宿主细胞，以及合适的表达载体和宿主细胞。特别地，本发明的目的是提供相比上述现有技术中的选择系统具有某些优势的新型选择系统。
发明内容
本发明涉及适合选择高产率表达目标多肽的宿主细胞的选择系统。所述选择系统基于突变功能膜结合叶酸受体作为选择性标记物的应用。此外，所述选择系统相比使用相应的野生型功能膜结合叶酸受体作为选择性标记物的选择系统，能更严格和快速地选择高生产者。
根据第一方面，本发明提供表达载体或至少2个表达载体的组合，所述载体包括：
a)编码作为选择性标记物的突变叶酸受体的多核苷酸，其中所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少和
b)至少一种编码目标多肽的多核苷酸，
其中当向宿主细胞引入所述表达载体或至少2个表达载体的组合时，所述宿主细胞分泌目标多肽。
根据第二方面，本发明涉及活力取决于叶酸摄取的宿主细胞，包括
a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的引入多核苷酸，所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少，
和
b)至少一种编码目标多肽的引入多核苷酸
其中所述宿主细胞分泌所述目标多肽。
根据第三方面，本发明涉及生成本发明第二方面所述宿主细胞的方法，包括向活力取决于叶酸摄取的宿主细胞引入至少以下物质的步骤
a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的多核苷酸，所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少，
和
b)至少一种编码目标多肽的多核苷酸，其中所述宿主细胞分泌目标多肽。
根据第四方面，本发明提供选择至少一种能表达目标多肽的宿主细胞的方法，包括
a)提供多种第二方面所述的宿主细胞；
b)在含极限浓度叶酸盐的选择性培养基中培养所述多种宿主细胞；
和
c)获得至少一种表达目标多肽的宿主细胞。
根据第五方面，本发明涉及生成目标多肽的方法，包括
a)在容许目标多肽表达和分泌的条件下，培养本发明第二方面所述宿主细胞和/或根据第四方面选定的宿主细胞；
b)从细胞培养基中分离目标多肽和
c)任选进一步加工分离的目标多肽。
根据第六方面，本发明涉及多核苷酸用于选择其活力取决于叶酸摄取的细胞的应用，所述多核苷酸编码以下作为选择性标记物：
a)包括以下序列的突变叶酸受体
Figure BDA0002675710410000041
其中Xaa不是丙氨酸且其中突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较其中Xaa 是丙氨酸的对应野生型叶酸受体(SEQ ID NO 1)减少，
或
b)突变叶酸受体，其所含氨基酸序列与SEQ ID NO 9所示序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，且其中所述突变叶酸受体内的Xaa不是丙氨酸且其中所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较其中Xaa是丙氨酸的对应成熟野生型人叶酸受体α序列(见SEQ ID NO 1)减少。
根据第七方面，本发明涉及多核苷酸用于选择其活力取决于叶酸摄取的细胞的应用，所述多核苷酸编码以下作为选择性标记物：
a)包括以下序列的突变叶酸受体
Figure BDA0002675710410000051
其中Xaa是亮氨酸；
或
b)突变叶酸受体，其所含氨基酸序列与SEQ ID NO 9所示序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，且其中根据b)的所述突变叶酸受体内的Xaa是亮氨酸。
如示例所示，各突变叶酸受体是极有效率且严格的选择性标记物，其还能比野生型叶酸受体更迅速地选择表达各选择性标记物的宿主细胞。
通过下列说明和所附权利要求，本申请的其它目的、特征、优势和方面对本领域技术人员是显而易见的。然而，应理解下列说明、所附权利要求和具体实施例尽管指明本申请的优选实施方式，但仅通过举例方式给出。
附图说明
图1-5显示个体细胞克隆的抗体产率，所述细胞克隆通过从多克隆细胞池中有限稀释获得，所述细胞池事先转染有不同表达载体并用不同选择条件获得。因此，显示选择后所得克隆的产率。对于单细胞克隆，所述细胞在完全培养基(因而在选择后不维持选择压力)或选择培养基(因而在选择后维持选择压力) 中培养。
图1：选择后有V-DHFRref的转染子的单细胞克隆(125nM MTX)。
图2：选择后有V-DHFRref的转染子的单细胞克隆(250nM MTX)。
图3：选择后有V-wtFRα的转染子的单细胞克隆(15nM FA)。
图4：有V-mutFRα的转染子的单细胞克隆(5nM)。如所示，相较使用野生型叶酸受体作为选择性标记物，用突变叶酸受体作为选择性标记物时获得更多高表达细胞克隆。此外，表达率比用DHFR作为选择性标记物选择时观察到的更高。
图5：V-mutFRalpha/V-DHFRref共转染群的单细胞克隆(50nM叶酸(FA) /50nMMTX)。如所示，用所述共选择策略时获得显著更多和更高的表达细胞克隆。
具体实施方式
意外发现通过采用突变型叶酸受体可明显改善基于叶酸受体作为选择性标记物的应用的选择系统。突变选择性标记物能用作选择真核细胞如哺乳动物细胞的主要选择性标记物。相较相应的野生型叶酸受体，所述突变体具有调整的叶酸结合亲和性。发现与相应的野生型叶酸受体相比叶酸结合亲和性减少的突变叶酸受体，作为选择性标记物具有重要的优势。
所述新型系统能用于加速选择、筛选和构建高产率稳定表达并分泌重组多肽的真核尤其是哺乳动物细胞克隆。所述选择能用含极限浓度叶酸盐尤其是极限浓度叶酸的培养基进行。除了与叶酸受体作为选择性标记物应用相关的一般优势外，新型选择系统相比现有技术中可用的选择系统以及相比野生型叶酸受体作为选择性标记物的应用，显示如下所述的数种重要优势。
1.改善的快速性和生长特征。如实施例所示，使用突变叶酸受体作为选择性标记物能比标准选择系统明显更快地选择，所述标准选择系统基于例如 DHFR作为选择性标记物的应用。此外，本发明所述选择系统也比基于野生型叶酸受体作为选择性标记物应用的选择系统快。特别地，相较野生型叶酸受体作为选择性标记物的应用，已结合本发明所述突变叶酸受体作为选择性标记物的细胞在含极低浓度叶酸的选择性培养基中培养时分裂且恢复更快。所获得的快速性是缩短选择周期长度的显著优势。即使选择性培养基采用非常严格的选择条件和相应高极限叶酸浓度、甚至损害转染有野生型叶酸受体作为选择性标记物的细胞的生长，仍观察到各生长优势。因此，用本发明所述突变叶酸受体作为选择性标记物时，能使用更严格的选择条件。相比野生型叶酸受体，本发明所述突变叶酸受体的该优势完全出乎意料。叶酸盐如优选的叶酸必须存在于培养基中且必须有效纳入宿主细胞以维持细胞生长、嘌呤和嘧啶核苷酸生物合成、DNA复制以及因此的细胞增殖。考虑此背景，预期转染有突变叶酸受体 (叶酸结合亲和性减小)的细胞相较转染有野生型叶酸受体的细胞不具有生长优势。甚至认为转染有所述突变叶酸受体作为选择性标记物的细胞甚至相较内源表达野生型叶酸受体(具有完全叶酸结合亲和性)的未转染细胞可能不具有生长优势。尤其，已知如果未转染细胞培养于含极限浓度叶酸盐的培养基中，内源叶酸受体表达增加(参见Zhu等,Journal of Cellular Biochemistry 81:205-219(2001))。因此，当发明人发现叶酸结合亲和性减小的突变叶酸受体提供甚至优于野生型叶酸受体的有效选择性标记物时，非常令人惊讶。
2.改善的严格性和产率。纳入本发明所述突变叶酸受体作为选择性标记物的细胞意外地比含野生型叶酸受体作为选择性标记物的细胞耐受选择性培养基中更低的叶酸盐浓度。这允许使用更严格的选择条件。因此，用本文所述的新型选择性标记物时，能更快获得具有高生产率的细胞。考虑到本发明所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型减少，这完全出乎意料。
3.改善的可靠性。用本发明所述突变叶酸受体作为选择性标记物时，观察到对培养基中叶酸盐浓度的线性剂量依赖性。选择性培养基中的叶酸盐浓度越低，选定细胞的所得产率越高。用野生型叶酸受体作为选择性标记物时，以相同方式未观察到相应依赖性。该线性剂量依赖性有助于更可靠的控制和优化选择条件。此发现也完全出乎意料。
因此，本文所述基于叶酸的新型选择是基于突变叶酸受体作为选择性标记物的应用，所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较对应野生型叶酸受体减少，该新型选择是非常适合加速选择高产率表达目标重组多肽的稳定细胞的极佳策略。本文所述有益结果能在细胞培养基中的低叶酸盐浓度下，且甚至在不含在多种其它选择系统中常规使用的细胞毒性药物选择的条件下获得。
表达载体和表达载体组合
根据第一方面，本发明提供表达载体或至少2个表达载体的组合，所述载体包括：
a)编码作为选择性标记物的突变叶酸受体的多核苷酸，其中所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少；和
b)至少一种编码目标多肽的多核苷酸，
其中当向宿主细胞引入所述表达载体或至少2个表达载体的组合时，所述宿主细胞分泌目标多肽。
本发明所述“载体”特定指能载有至少一种多核苷酸片段的多核苷酸。载体功能类似分子载体，向宿主细胞递送多核苷酸。表达载体可包括至少一个含调控序列的表达盒以适当表达其中所结合的多核苷酸。待引入细胞的多核苷酸 (如编码目标多肽或选择性标记物)可插入载体表达盒以从中表达。引入宿主细胞时，表达盒等能指导细胞机制将所结合的编码目标多肽的多核苷酸转录成 RNA，其随后通常进一步加工并最终翻译成目标多肽。所述载体可以环形或线性(化)形式存在。术语“载体”还包括人工染色体、病毒载体或类似的能转移外来核酸片段的各个多核苷酸。
“多核苷酸”是核苷酸聚合物，其通常将一个脱氧核糖或核糖与另一个连接，且根据上下文指DNA以及RNA。术语“多核苷酸”不包括任何大小限制。
随后，我们描述本发明所述表达载体和至少2个表达载体的组合的实施方式。如果使用至少2个表达载体的组合，编码突变叶酸受体的多核苷酸和编码目标多肽的多核苷酸能位于同一表达载体或不同表达载体上。如果使用至少2 个表达载体的组合，其中一个表达载体包括编码目标多肽的多核苷酸且另一表达载体包括编码突变叶酸受体的多核苷酸，则所述组合共转染到同一宿主细胞以使选择可行。各种的共转染策略为技术人员熟知并也描述于实施例中。随后，我们描述其中2种多核苷酸都位于同一表达载体的特定实施方式和与该实施方式相关的显著优势。然而，所述公开作必要修正后应用于这样的实施方式，其中采用至少2个共转染到细胞中的表达载体的组合。适当时，结合所述表达载体在选择高产率表达目标多肽的宿主细胞中的应用，描述与表达载体或至少2 个表达载体的组合相关的优势。
突变叶酸受体
本文所用的“叶酸受体”指功能性的并因而能输入或摄取叶酸盐或其衍生物到真核细胞尤其是哺乳动物细胞中的受体。优选地，叶酸受体能单向输入或摄取叶酸盐或其衍生物到真核宿主细胞尤其是哺乳动物细胞中。此外，本文所用的叶酸受体是膜结合型。因此，本文所述叶酸受体是功能性膜结合叶酸受体。这适用于突变的以及野生型叶酸受体。例如，通过跨膜锚或糖基磷脂酰肌醇 (GPI)锚能获得膜锚定。优选GPI锚，因为其符合叶酸受体的天然状态。叶酸受体(FR)是高亲和性叶酸结合糖蛋白。其由3种不同基因FRα、FRβ和 FRγ编码。FRα也称为成人叶酸结合蛋白或FDP、叶酸受体1或FOLR(小鼠 folbp1中)以及卵巢癌症相关抗原。FRβ也称为FOLR2(胎儿)和FBP/PL-1 (胎盘)。FRγ也称为FOLR3和FR-G(由M.D.Salazar和M.Ratnam,Cancer Metastasis Rev.2007 26(1),141-152页综述)。充分表征的成熟FR是具有～70-80％氨基酸同一性的同源蛋白且包含229-236个氨基酸以及2-3个N-糖基化位点。 FRα和FRβ是膜结合蛋白。FRα和FRβ是GPI锚定的细胞表面糖蛋白，而FRγ缺乏GPI锚且是分泌蛋白。然而，其能被基因改造以包括跨膜域或GPI锚。如果能如上所述输入或摄取叶酸盐或其衍生物到真核细胞中，这种包括膜锚的改变型FRγ也被认为是野生型叶酸受体。FRα和FRβ展现出对以下的高亲和性：叶酸(Kd＝0.1-1nM)、5,10-双去氮四氢叶酸(DDATHF；洛美曲索；Ki＝0.4-1.3 nM，用[3H]叶酸作为底物)和BGC945(其是仅通过FRα而不是还原叶酸运载体来特异性转运的、环戊二烯并[g]喹唑啉基胸苷酸合成酶抑制剂)(Kd＝1nM)，但对MTX的亲和性低许多(Kd>100nM)。叶酸和叶酸拮抗剂的FR依赖性摄取通过受体介导的胞吞经典机制来推进。
本文所用的“叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少的突变叶酸受体”或类似表达特定指相较对应野生型叶酸受体，对至少一种选自还原叶酸和氧化叶酸的叶酸盐的结合亲和性下降的突变叶酸受体。所述术语特定指与对应野生型叶酸受体相比，对特定叶酸盐的叶酸结合亲和性降低的突变叶酸受体。对其它叶酸盐(即不同于所述特定叶酸盐的叶酸盐)的叶酸结合亲和性可能没有改变。根据一个实施方式，叶酸结合亲和性减少的突变叶酸受体包括至少一个突变，其相较对应野生型叶酸受体，降低对至少一种选自还原叶酸和氧化叶酸的叶酸盐的结合亲和性。根据一个实施方式，相较对应野生型叶酸受体，突变叶酸受体显示对还原叶酸的结合亲和性减少。根据一个实施方式，相较对应野生型叶酸受体，突变叶酸受体显示对5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性降低。根据一个实施方式，突变叶酸受体对还原叶酸(优选5-甲基四氢叶酸盐)的6S非对映异构体的IC50值比对应野生型叶酸受体的IC50值高至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或至少55倍。由于IC50值显著更高，其对所述还原叶酸的结合亲和性相较野生型叶酸受体显著下降。根据一个实施方式，突变叶酸受体显示对叶酸的结合下降。
导致叶酸结合亲和性减少的至少一个突变可以是例如氨基酸取代、缺失或插入。根据一个实施方式，至少一个突变存在于推定的叶酸结合袋。根据一个实施方式，所述突变是推定的叶酸结合袋中的取代。
相较对应野生型叶酸受体，根据本发明用作选择性标记物的突变叶酸受具有减少的叶酸结合亲和性。如上所述且如实施例所示，使用突变叶酸受体是有利的，其相较对应野生型叶酸受体，至少对5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性降低。通过向野生型序列引入一个或多个突变，能实现叶酸结合亲和性减少。合适示例如下所述。不受理论约束地，认为由于叶酸结合亲和性减少，转染有本发明所述表达载体的细胞需要表达更多突变叶酸受体以达到足够的叶酸摄取率，从而在选择性叶酸缺乏条件下存活。因此，目标多肽还通过存活群体以更高水平表达。如实施例所示，当用本文所述突变叶酸受体作为选择性标记物时，如果选择性培养基中的叶酸盐浓度下降，则产率增加。用野生型叶酸受体作为选择性标记物时，以相同方式未观察到相应相关性。此外，用突变叶酸受体作为选择性标记物时，可甚至进一步降低选择性培养基中的叶酸盐浓度并因而进一步增加对转染细胞的选择压力。由此可以得到非常严格且快速的选择系统，其优于使用野生型叶酸受体作为选择性标记物的选择系统。考虑到本发明所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少，这是出乎意料且非常令人惊讶的。此外，意外发现转染有突变叶酸转运子的细胞显示优良特征，尤其是甚至当采用高度严格的选择条件时，其从选择条件中更早恢复。
优选地，用作选择性标记物的突变叶酸受体包括叶酸结合袋中的至少一个突变，相较对应野生型叶酸受体，其中所述突变具有叶酸结合亲和性减少的作用。合适突变如下所述。为了降低叶酸结合亲和性，在叶酸结合袋中纳入突变是非常有效的方法。仅高度过表达所引入的突变叶酸受体的细胞能从培养基中纳入足够量的叶酸盐以维持细胞生长、DNA复制和因此的细胞增殖。令人惊讶的是，即使细胞纳入叶酸亲和性降低的突变叶酸受体作为选择性标记物，转染细胞显示相较转染有野生型叶酸受体的细胞或转染有常规选择性标记物如 DHFR的细胞，生长显著加快。该加速生长是显著优势，因为其减低实施选择所必须的时间。
根据本发明使用的突变叶酸受体可衍生自任何物种的叶酸受体，只要其在本发明内是功能性的，即与所用宿主细胞相容，且当其从转染宿主细胞中表达时，将叶酸盐(尤其是叶酸)从培养基中纳入宿主细胞。
一般，引入真核宿主细胞并用作选择性标记物的突变叶酸受体可与宿主细胞的内源叶酸受体同源或异源(如果内源叶酸受体存在，优选)。如果同源，其源自与宿主细胞相同的物种。如果异源，其源自宿主细胞之外的另一物种。例如，人源性叶酸受体可用作啮齿类宿主细胞如CHO细胞的选择性标记物。优选地，使用源自哺乳动物的叶酸受体，例如源自啮齿类动物如小鼠、大鼠或仓鼠，或更优选源自人。根据一个实施方式，衍生自人叶酸受体α的突变叶酸受体被用作选择性标记物。
突变叶酸受体能选自叶酸受体α、叶酸受体β和叶酸受体γ。突变叶酸受体可衍生自包括以下SEQ ID NO 1、3、4、6、7和8所示氨基酸序列的野生型叶酸受体，然而其中所述突变叶酸受体包括至少一个突变，其导致叶酸结合亲和性相较对应野生型叶酸受体减少。优选地，突变叶酸受体衍生自叶酸受体α，尤其是人叶酸受体α。
成熟的野生型人叶酸受体α包括以下氨基酸(SEQ ID NO 1，1-字母代码，以从N末端到C末端方向显示)：
Figure BDA0002675710410000111
叶酸受体α通过GPI锚自然锚定到细胞膜。GPI锚的信号序列未显示在 SEQ ID NO1中。根据一个实施方式，衍生自SEQ ID NO 1的突变叶酸受体α包括C末端处的GPI锚信号。可使用任何合适的GPI锚信号。人叶酸受体α的天然GPI锚信号序列如下(SEQ ID NO 2，1-字母代码，以从N末端到C末端方向显示)：
Figure BDA0002675710410000112
通过用膜锚如跨膜锚可另外实现膜锚定。在这个实施方式中，突变叶酸受体包括C末端的膜锚。合适锚在本领域已知。
衍生自SEQ ID NO 1的突变叶酸受体α可包括N末端的前导序列。能使用任何合适的前导序列，确保突变叶酸受体的功能表达。
完全氨基酸序列包括野生型人叶酸受体α的天然前导序列(N末端，带下划线)和天然GPI锚信号序列(C末端，带下划线)，如下(SEQ ID NO 3，1-字母代码，以从N末端到C末端方向显示)：
Figure BDA0002675710410000121
成熟的人叶酸受体β野生型序列具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO 4，1- 字母代码，以从N末端到C末端方向显示)：
Figure BDA0002675710410000122
叶酸受体β通过GPI锚自然锚定到膜。GPI锚的信号序列未显示在SEQ ID NO 4中。根据一个实施方式，衍生自SEQ ID NO 4的突变叶酸受体β包括C 末端处的GPI锚信号。可使用任何合适的GPI锚信号。人叶酸受体β的天然 GPI锚信号序列如下(SEQ ID NO 5，1-字母代码，以从N末端到C末端方向显示)：
Figure BDA0002675710410000123
通过用膜锚如跨膜锚，也可实现膜锚定。在这个实施方式中，突变叶酸受体包括C末端的膜锚。合适锚在本领域已知。
衍生自SEQ ID NO 4的突变叶酸受体β可包括N末端的前导序列。能使用任何合适的前导序列，确保突变叶酸受体的功能表达。
完全氨基酸序列包括野生型人叶酸受体β的前导序列(N末端，带下划线) 和天然GPI锚信号序列(C末端，带下划线)，如下(SEQ ID NO 6，1-字母代码，以从N末端到C末端方向显示)：
Figure BDA0002675710410000124
此外，能使用天然非膜结合的叶酸受体。这种非膜结合的叶酸受体可改变成膜结合的。例如，可提供膜锚，所述叶酸受体能表达为含叶酸受体和另一多肽膜锚的融合蛋白。另外，所述序列可修饰成结合GPI锚信号序列。合适的 GPI锚信号序列如上所述且也在本领域已知。因此，叶酸受体能通过GPI锚来锚定到细胞膜。同样，能使用本领域技术人员现成可用的其它变体。这方面的优选实例是基于叶酸受体γ(优选人叶酸受体γ)的突变叶酸受体，其被基因改造成包括膜锚。这里，叶酸受体γ序列根据本发明教导来突变以显示叶酸结合亲和性降低。
野生型人可溶性叶酸受体γ具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO 7，1-字母代码，以从N末端到C末端方向显示)：
Figure BDA0002675710410000131
此外，衍生自SEQ ID NO 7的突变叶酸受体γ可包括N末端的前导序列。能使用任何合适的前导序列确保突变叶酸受体的功能表达。
完全氨基酸序列包括野生型人叶酸受体γ的前导序列(带下划线)，如下(SEQ IDNO 8，1-字母代码，以从N末端到C末端方向显示)：
Figure BDA0002675710410000132
基于叶酸受体γ的本发明所述突变叶酸受体包括各序列中的至少一个突变以提供叶酸结合亲和性降低的突变叶酸受体。所述突变优选在叶酸结合袋中。
根据一个实施方式，突变叶酸受体衍生自叶酸受体α或β。根据一个实施方式，通过提供衍生自叶酸受体α和β的嵌合氨基酸序列，获得突变叶酸受体。叶酸受体α和β中，参与配体结合的重要氨基酸位置参考相应的成熟叶酸受体氨基酸序列(参见例如SEQ ID NO 1和4)的49、104和166位(也参见 Ramamoorthy等,2007)。根据一个实施方式，突变叶酸受体包括处于这样的氨基酸位置中的至少一个取代，所述位置在结构上或通过氨基酸序列同源性对应于选自相应野生型序列49、104和166位的氨基酸位置。还可以取代突变叶酸受体中各位置处的超过一个氨基酸。一个或多个这些氨基酸位置中的取代对叶酸结合亲和性具有强烈影响。所述取代优选使突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较对应野生型叶酸受体减少。根据一个实施方式，所得突变叶酸受体相较对应野生型叶酸受体，显示对5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性降低。根据一个实施方式，所得突变叶酸受体显示对叶酸的结合下降。根据一个实施方式，对应野生型序列中天然出现的氨基酸被非保守氨基酸取代，其中所述取代减少突变叶酸受体的叶酸结合亲和性。根据一个实施方式，对应野生型序列中天然出现的氨基酸被保守氨基酸取代。在保守交换中，氨基酸被具有相似性质的组内的另一氨基酸取代。相应的组的示例是：
-具有非极性侧链的氨基酸：A,G,V,L,I,P,F,W,M
-具有极性侧链的不带电氨基酸：S,T,G,C,Y,N,Q
-具有芳族侧链的氨基酸：F,Y,W
-带正电氨基酸：K,R,H
-带负电氨基酸：D,E
-具有相似尺寸或分子量的氨基酸，其中取代氨基酸的分子量偏离原始氨基酸分子量最多+/-25％(或+/-20％,+/-15％,+/-10％)。
不言而喻，这些组还包括具有各自侧链性质的修饰氨基酸和非天然氨基酸，如在显示带正电侧链的组中的高精氨酸。根据一个实施方式，野生型序列中天然出现的氨基酸被天然L-氨基酸取代以提供突变叶酸受体。
突变叶酸受体优选是叶酸受体α。其可以源自啮齿类动物如小鼠、大鼠或仓鼠，或可以衍生自人叶酸受体α。突变叶酸受体优选衍生自人叶酸受体α。根据一个实施方式，本发明所述突变叶酸受体衍生自具有上述SEQ ID NO 1或 SEQ ID NO 3的野生型人叶酸受体α，然而其中所述突变叶酸受体α包括至少一个突变，其导致叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少。根据一个实施方式，所得突变叶酸受体相较对应野生型叶酸受体，显示对5-甲基四氢叶酸盐的 6S非对映异构体的结合亲和性降低。根据一个实施方式，所得突变叶酸受体另外地或额外地显示对叶酸的结合亲和性降低。
优选地，本发明所述突变叶酸受体包括处于这样的氨基酸位置中的一个取代，所述位置在结构上或通过氨基酸序列同源性对应于SEQ ID NO 1所示成熟野生型人叶酸受体α序列的氨基酸49。成熟野生型叶酸受体α序列的49位突变在叶酸结合袋中引入突变，因而对叶酸结合亲和性具有强烈影响。在人以及对应小鼠野生型叶酸受体α序列中发现野生型序列49位的该丙氨酸。当然，只要该突变叶酸受体是功能性的，本发明所述突变叶酸受体可包括其它位置的额外突变。根据一个实施方式，相较野生型叶酸受体减少叶酸结合亲和性的至少一个突变是成熟野生型叶酸受体α序列49位存在的丙氨酸被选自下组的氨基酸取代：亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和天冬氨酸。丙氨酸优选被亮氨酸取代。发明人意外发现叶酸受体α序列中的A49L取代提供这样的突变叶酸受体α，其作为选择性标记物的特性优于对应野生型叶酸受体α。相较对应野生型叶酸受体α，含各A49L取代的突变叶酸受体α显示对叶酸盐即5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性降低。此外，如实施例所示，当人叶酸受体α的A49L突变体在用作选择标记物以鉴定和选择成功转染的哺乳动物宿主细胞时，显示明显优势。因此，其优选被用作选择标记物以鉴定高产率表达目标重组多肽的宿主细胞。
根据一个实施方式，成熟突变叶酸受体包括的氨基酸序列与人叶酸受体α的成熟野生型序列(SEQ ID NO 1)有至少80％、至少85％、至少90％、至少 95％、至少96％、至少97％或至少98％或至少99％的序列同一性，然而其中所述成熟突变叶酸受体的氨基酸序列包括至少一个导致叶酸结合亲和性相较对应野生型人叶酸受体α减少的突变。如上所述，导致相较野生型叶酸受体减少叶酸结合亲和性的至少一个突变优选是存在于成熟野生型叶酸受体α序列(参见SEQ ID NO.1)49位的丙氨酸被选自亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和天冬氨酸的氨基酸取代。49位的丙氨酸优选被亮氨酸取代。这种突变叶酸受体相较对应野生型叶酸受体，显示对5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性降低且作为选择性标记物的特征改善。
根据一个实施方式，第一多核苷酸编码突变叶酸受体，其中所述突变叶酸受体具有以下特征：
a)成熟的突变叶酸受体包括以下序列
Figure BDA0002675710410000151
其中Xaa不是丙氨酸，其中优选Xaa是选自亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和天冬氨酸的氨基酸且其中更优选Xaa是亮氨酸；
或
b)成熟的突变叶酸受体包括的氨基酸序列与SEQ ID NO 9所示序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、或98％或至少99％的序列同一性，且其中所述突变叶酸受体内的Xaa不是丙氨酸，优选 Xaa是选自亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和天冬氨酸的氨基酸且更优选Xaa是亮氨酸，且其中所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较其中 Xaa是丙氨酸的成熟野生型人叶酸受体α序列(见SEQ ID NO 1)减少。根据一个实施方式，所述突变叶酸受体相较对应野生型叶酸受体，显示对5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性降低。根据一个实施方式，所得突变叶酸受体额外地或另外地显示对叶酸的结合亲和性降低。根据b)的突变叶酸受体可以被视作a)的功能性变体且可包括相较a)所述突变叶酸受体的一个或多个氨基酸额外突变。例如，只要作为叶酸受体的功能不被除去，其可包括一个或多个额外取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。还包括含各突变叶酸受体序列的融合蛋白。
如上所述，Xaa优选是亮氨酸。如实施例所示，野生型叶酸受体α序列 49位所含丙氨酸针对亮氨酸突变，提供作为选择性标记物的特性优于对应野生型序列的突变叶酸受体。如实施例所示，含突变叶酸受体作为选择性标记物的细胞在选择后显示高产率的目标多肽，其通常显著高于用对应野生型叶酸受体作为选择性标记物时达到的产率，且其也高于用其它突变受体形式达到的产率，所述突变叶酸受体携带与叶酸受体α的成熟野生型序列49位对应的位置中的突变。此外，细胞从选择中恢复更快。这些重要优势使得A49L突变叶酸受体特别适合作为选择性标记物。Shen等,1997描述并鉴定了所述突变叶酸受体α。其中，通过从野生型叶酸受体α(2.9)增加约60倍到(179.0)的IC50(nM) 值可以看出，所述突变形式表现出对5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性降低。
突变叶酸受体是膜结合型，可包括例如GPI锚或跨膜锚。如上所述，叶酸受体α和β通过GPI锚自然锚定到细胞膜。当用GPI锚进行膜锚定时，编码多核苷酸必须提供合适信号序列以结合GPI锚。用于GPI锚的合适信号序列在现有技术中已知且上面也有描述。如上所解释，各GPI锚信号序列在C末端给出并能与本发明联用。
根据一个实施方式，未成熟(premature)突变叶酸受体包括野生型功能性人叶酸受体α的前导序列，如下所示(SEQ ID NO 10，1-字母代码，以从N末端到C末端方向显示)：
Figure BDA0002675710410000171
随后显示野生型人叶酸受体β和γ的前导序列(SEQ ID NO 11和12，1- 字母代码，以从N末端到C末端方向显示)：
Figure BDA0002675710410000172
根据一个实施方式，第一多核苷酸编码突变叶酸受体，其中所述突变叶酸受体具有以下特征：
a)突变叶酸受体包括以下序列
Figure BDA0002675710410000173
其中Xaa是亮氨酸；
或
b)突变叶酸受体包括的氨基酸序列与SEQ ID NO 13所示序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，其中根据b)的所述突变叶酸受体内的Xaa是亮氨酸，且其中所述突变叶酸受体对5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性相较其中Xaa是丙氨酸的成熟野生型人叶酸受体α序列(见SEQ ID NO 1)减少。
目标多肽
表达载体或表达载体组合包括至少一个编码目标多肽的多核苷酸。向本文所述叶酸依赖性宿主细胞如哺乳动物细胞引入所述表达载体或组合载体时，从所述宿主细胞中分泌目标多肽。因此，目标多肽是分泌多肽。所述多核苷酸可编码天然分泌的多肽或其可通过提供合适的分泌前导序列而被改变成分泌的多肽。大部分分泌多肽具有氨基末端前导肽(也称为分泌前导序列或信号肽)，其在生物合成期间从新生前体多肽中切割。分泌前导肽通常为5-60个氨基酸长度。此序列就分泌而言是必需且足够的。许多分泌前导肽的示例为现有技术熟知，因此不需本文任何详细描述。大量这类分泌前导肽的分析揭示在没有显著氨基酸序列同源性的情况下出现共同结构基序[Von Heijne,1981；Perlman等, 1983,Bird等,1990]。一般，分泌前导序列由带正电氨基末端(n)、疏水核心 (h)和定义信号肽酶切割位点的更高极性羧基末端(c)组成。通过缺失或者用亲水或带电氨基酸取代疏水残基来破坏h区会导致信号功能丧失，而改变“n”区则影响不大。羧基末端或切割区通常为约6个氨基酸长度。该区域参与信号肽酶的识别和切割，这通常是实现蛋白终折叠和分泌所需要的。
目标多肽可以是药学或治疗活性化合物，或用于试验等的研究工具。目标多肽可以是任何种类。术语“多肽”指含氨基酸聚合物的分子，所述氨基酸通过肽键连接在一起。多肽包括任何长度的多肽，包括蛋白(如具有超过50个氨基酸)和肽(如2-49个氨基酸)。多肽包括具有任何活性、功能或尺寸的蛋白和/或肽，且可包括例如酶(如蛋白酶、激酶、磷酸酶)、受体、转运子、细菌和/或内毒素结合蛋白、结构多肽、糖蛋白、球蛋白、免疫多肽、毒素、抗生素、激素、生长因子、血液因子、疫苗等。多肽可选自肽激素、白介素、组织纤溶酶原激活物、细胞因子、免疫球蛋白，特别是抗体或功能抗体片段或其变体和Fc融合蛋白。根据本文教导表达的目标多肽还可以是多肽亚基或结构域，如抗体或其功能片段或衍生物的重链或轻链。术语“目标多肽”可根据上下文，指所述各亚基或结构域或者由各亚基或结构域构成的终蛋白。在一个优选实施方式中，目标多肽是免疫球蛋白分子，更优选抗体，或其亚基或结构域，如抗体重链或轻链。本文所用的术语“抗体”尤其指含至少2条重链和2条轻链的蛋白，所述链由二硫键连接。术语“抗体”包括天然出现的抗体以及重组形式的抗体，如人源化抗体、完全人抗体和嵌合抗体。各重链通常由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)构成。各轻链通常由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。然而，术语“抗体”还包括其它抗体类型如单域抗体、重链抗体(即仅由一条或多条尤其是2条重链构成的抗体)，以及纳米抗体(即仅由单一单体可变域构成的抗体)。如上所述，编码目标多肽的多核苷酸还可编码一个或多个抗体亚基或结构域，例如重链或轻链或其功能片段或衍生物，作为目标多肽。所述亚基或结构域能从相同或不同表达盒中表达。抗体的“功能片段或衍生物”特定指衍生自抗体且能结合同一抗原的多肽，尤其是与抗体相同的表位。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体片段或其衍生物执行。抗体片段或衍生物示例包括(i)Fab片段，由各重链和轻链的可变区及第一恒定域组成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，含2个Fab片段的二价片段，2个Fab片段由二硫桥在铰链区连接；(iii)Fd片段，由重链的可变区和第一恒定域CH1 组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的重链和轻链可变区组成；(v)由单一多肽链组成的scFv片段、Fv片段；(vi)(Fv)2片段，由共价连接在一起的2个Fv片段组成；(vii)重链可变域；和(viii)由共价连接在一起的重链可变区和轻链可变区组成的多抗体，所述可变区共价连接的方式使得重链和轻链可变区的联合仅能在分子间而不是分子内发生。
额外选择性标记物
根据一个实施方式，本发明所述表达载体或至少2个表达载体的组合额外包括一个或多个编码其它选择性标记物的多核苷酸。选择性标记物允许在合适选择性培养条件下选择表达所述选择性标记物的宿主细胞。选择性标记物提供在选择条件下有存活和/或生长优势的所述标记物载体。通常，选择性标记物基因会赋予对筛选剂(如药物，例如抗生素或其它毒剂)的抗性，或补偿宿主细胞中的代谢或异化作用缺陷。其可以是正或负选择性标记物。为了选择成功转染的宿主细胞，可用含筛选剂的培养基培养宿主细胞，所述筛选剂能选择所用的选择性标记物。在其它实施方式中，选择性标记物能使宿主细胞在化合物缺乏或减少的情况下存活并增殖，所述化合物对缺少选择性标记物的宿主细胞存活和/或增殖是必需的。根据一个实施方式，所述选择性标记物是药物抗性标记物，其编码赋予对涉及所述药物的选择条件的抗性的蛋白。多种选择性标记物基因为技术人员熟知且已在文献中描述(参见例如WO 92/08796,WO 94/28143, WO2004/081167,WO2009/080759,WO2010/097240)。根据一个实施方式，选择性标记物可以是可扩增选择性标记物。常用于哺乳动物细胞的选择性标记物基因包括以下的基因：氨基糖苷磷酸转移酶(APH)、潮霉素磷酸转移酶(hyg)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(tk)、谷氨酰氨合成酶、天冬酰胺合成酶，以及编码对新霉素(G418)、嘌呤霉素、潮霉素和博莱霉素抗性的基因。除了突变叶酸受体，也可使用这种选择性标记物。
根据一个实施方式，表达载体或表达载体的组合包括编码选择性标记物的额外多核苷酸，该选择性标记物参与叶酸代谢且其中所述选择性标记物的活性至少部分受突变叶酸受体活性影响。额外选择性标记物的活性至少部分受突变叶酸受体活性影响的特性尤其意味着所述额外选择性标记物的活性受突变叶酸受体的活性或功能影响或者至少一定程度上直接或间接取决于此。突变叶酸受体和其它选择性标记物的所述依赖性/相互作用能用于显著增加宿主细胞在选择性培养条件下的选择压力。
根据一个实施方式，所述额外选择性标记物是酶，其加工底物(叶酸盐、叶酸盐衍生物)和/或能通过加工叶酸盐如DHF或THF或上述功能变体或衍生物来获得的产物。各底物对核酸生成重要。所述额外选择性标记物优选是二氢叶酸还原酶(DHFR)或在DHFR下游或与其联合运作的酶如胸苷酸合成酶(TS) 和丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)。所述额外选择性标记物优选是DHFR。DHFR 还可表达为融合蛋白的一部分。
使用各选择性标记物组合，即本发明所述突变叶酸受体和参与上述叶酸代谢的额外选择性标记物，优选DHFR，提供非常严格的选择系统以从转染宿主细胞群中获得和富集高生产细胞。叶酸受体作为选择性标记物与另一参与叶酸代谢的选择性标记物(如优选是DHFR)联用的想法和相关优势公开于WO 2010/097240，所述专利通过引用纳入本文。如示例所示，此实施方式所述选择系统的高严格性显著降低选择后所得群体中的低生产者数量，因而提高发现极罕见的过度生产克隆的机会。此外，选择后获得更均一的高生产细胞群，减少了筛选工作。这简化高生产细胞的单细胞克隆。如示例所示，将本文所述突变叶酸受体与另一上述参与叶酸代谢的额外选择性标记物(优选DHFR)联用，与野生型叶酸受体与所述选择性标记物的联用相比，引起结果改善。因此，同样用各选择性标记物的组合时，本发明由于使用突变叶酸受体提供显著优势。
如上所讨论，所述额外选择性标记物优选是DHFR酶。数种合适的DHFR 酶和相应基因在本领域已知，能结合本发明用作选择性标记物。术语“二氢叶酸还原酶”或“DHFR”指野生型DHFR以及相比对应野生型DHFR酶有一个或多个氨基酸序列交换(如缺失、取代或添加)的DHFR酶，包含一个和多个修饰成提供额外结构和/或功能的DHFR酶的融合蛋白，以及上述的功能片段，所述功能片段仍提供至少一种DHFR酶功能。这些实施方式为本领域熟知，因而不需详细描述。例如，DHFR酶可用作选择性标记物，其相比野生型DHFR 酶和/或宿主细胞内源表达的DHFR酶(若表达)，对叶酸拮抗剂如MTX更敏感或不太敏感。各DHFR酶为本领域熟知，例如描述于EP 0 246 049和其他文献。只要在本发明内是功能性的(即与所用哺乳动物宿主细胞相容)，DHFR 酶能获自任何物种。例如，主抗MTX的突变小鼠DHFR已广泛用作哺乳动物细胞中的主要选择性标记物。DHFR酶可用作这样的选择性标记物，其相比 DHFR+(+)宿主细胞和因此含功能性内源DHFR基因的宿主细胞中内源表达的 DHFR酶，对DHFR抑制剂如MTX不太敏感。根据一个实施方式，内含子或其片段置于DHFR基因开放阅读框3’末端。DHFR表达盒所用的内含子产生更小、非功能性DHFR基因变体(Grillari等.,2001,J.Biotechnol.87,59-65)。由此，DHFR基因表达水平降低，这进一步提高选择严格性。采用内含子降低 DHFR基因表达水平的替代方法参见EP0 724 639且也能使用。
编码额外选择性标记物的多核苷酸能位于与编码突变叶酸受体的多核苷酸和/或至少一种编码目标多肽的多核苷酸相同的表达载体，或如果使用表达载体组合，其能位于不同表达载体。此情况中，含所有多核苷酸(编码突变叶酸受体、目标多肽和额外选择性标记物)的表达载体组合会共转染到宿主细胞中以使选择可行。
根据一个优选实施方式，所述表达载体或表达载体组合包括：
-编码突变叶酸受体的多核苷酸，所述突变叶酸受体包括至少一个突变，其在结构上对应于成熟野生型人叶酸受体α序列(参见SEQ ID NO 1)氨基酸 49或与之相关的氨基酸位置，其中所述突变相较野生型叶酸受体α减少叶酸结合亲和性，其中优选所述位置的野生型序列存在的丙氨酸被亮氨酸取代，和
-编码DHFR的多核苷酸，所述DHFR相比野生型DHFR酶和/或宿主细胞内源表达的DHFR酶(作为额外选择性标记物)，对MTX不太敏感。所述 DHFR优选还包括上述内含子。如果DHFR+(+)细胞用作宿主细胞，尤其优选各标记物组合。DHFR+(+)细胞表达内源DHFR。如示例所示，用各载体或表达载体组合时，能有效选择极高产细胞克隆。
本发明所述表达载体或至少2个表达载体的组合可额外包括一种或多种编码选择性标记物的其它多核苷酸。除了突变叶酸受体和参与叶酸代谢的额外选择性标记物(优选DHFR)，可存在该其它选择性标记物。
除了能选择真核宿主细胞的其它真核选择性标记物之外，原核选择性标记物也能存在于表达载体或表达载体组合。例如，这允许载体在原核生物中扩增。“原核选择性标记物”是在合适选择条件下在原核宿主细胞中能选择的选择性标记物。各原核选择性标记物的示例是提供抗生素抗性的标记物，所述抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素和/或氯霉素。
其它载体元件和表达载体的实施方式
表达载体或至少2个表达载体的组合能额外包括其它载体元件。例如，能包括至少一种编码其它目标多肽的额外多核苷酸。如上所解释且与所述的可表达多肽示例明显不同，待由宿主细胞生成和分泌的最终多肽还可以是由数个单独亚基或结构域构成的蛋白。各蛋白的优选示例是免疫球蛋白分子，尤其是含例如重链和轻链的抗体。有数种选择用于生成由不同个体亚基或结构域构成的各蛋白，且合适的载体设计在本领域是已知的。根据一个实施方式，所述蛋白的2个或更多亚基或结构域从1个表达盒中表达。在此实施方式中，从含蛋白个体亚基或结构域编码区的各表达盒获得一个长转录本。根据一个实施方式，至少一个IRES元件(内部核糖体进入位点)功能定位于个体亚基或结构域的编码区之间，各编码区之前是分泌前导序列。因此，确保从所述转录本获得单独翻译产物，且终蛋白能正确组装并分泌。各技术在本领域已知，因此不需本文任何详述。
然而，其也在本发明范围，对于一些实施方式如抗体表达，甚至优选从不同表达盒中表达个体亚基或结构域。根据一个实施方式，用于表达目标多肽的表达盒是单顺反子表达盒。优选地，所述表达载体或表达载体组合所含全部表达盒是单顺反子的。因此，根据一个实施方式，各表达盒包括编码待表达为目标多肽的蛋白的一个亚基或结构域的多核苷酸。例如，在抗体的情况中，一个表达盒编码抗体轻链而另一表达盒编码抗体重链。个体亚基/结构域从个体表达盒中表达后，终蛋白如抗体由所述亚基或结构域组装并从宿主细胞中分泌。此实施方式特别适于表达免疫球蛋白分子如抗体。此情况中，编码目标多肽的第一多核苷酸编码例如免疫球蛋白分子的重链或轻链，编码目标多肽的第二多核苷酸编码免疫球蛋白分子的其它链。根据一个实施方式，所述表达载体或至少2个表达载体的组合包括至少一个含编码免疫球蛋白分子重链的多核苷酸或其功能片段的表达盒以及至少一个含编码免疫球蛋白分子轻链多核苷酸或其功能片段的表达盒。在使用至少2个表达载体的组合的情况下，所述多核苷酸可位于相同或不同表达载体。所述多核苷酸在转染的宿主细胞中表达后，获得功能性免疫球蛋白，且从宿主细胞中分泌。
用于表达目标重组产物的表达载体通常包含适于驱动转录的转录控制元件作为表达盒元件，如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录暂停或终止信号。优选包括合适的翻译控制元件，如5’非翻译区，其产生适于募集核糖体的 5’帽结构，以及终止翻译过程的终止密码子。所得的选择性标记物基因和目标多肽的转录本含有功能翻译元件，其促进高蛋白表达(即翻译)和适当翻译终止。能适当驱动所纳入多核苷酸表达的功能表达单位在本文中也称为“表达盒”。编码待分泌目标多肽的多核苷酸和编码本文所述选择性标记物的多核苷酸优选包括在表达盒内。数个实施方式合适，例如，各所述多核苷酸能包括在分开的表达盒内。然而，至少2个相应多核苷酸也可包括在一个表达盒内。根据一个实施方式，至少一个内部核糖体进入位点(IRES)元件功能性地位于从同一表达盒中表达的多核苷酸之间。因此，确保从所述转录本获得单独翻译产物。各基于IRES的表达技术以及其它双顺反子和多顺反子系统是已知的，因而不需在此更多描述。
如所述，本发明所述表达载体或表达载体的组合可包括至少一个启动子和 /或启动子/增强子元件作为表达盒元件。启动子能分成2类，组成型发挥功能的启动子以及通过诱导或去阻遏调节的启动子。两者都适于与本教导内容结合。用于在哺乳动物细胞中高水平生成蛋白的启动子应是强启动子，且优选在广泛范围的细胞类型中有活性。在许多细胞类型中驱动表达的强组成型启动子包括但不限于腺病毒主要晚期启动子、人巨细胞病毒立即早期启动子、SV40和劳氏肉瘤病毒启动子、鼠3-磷酸甘油酸激酶启动子、EF1a。根据一个实施方式，启动子和/或增强子获自CMV和/或SV40。转录启动子能选自SV40启动子、 CMV启动子、EF1α启动子、RSV启动子、BROAD3启动子、鼠rosa 26启动子、pCEFL启动子和β肌动蛋白启动子。
根据一个实施方式，至少一个编码目标多肽的多核苷酸、编码突变叶酸受体的多核苷酸和/或编码第二选择性标记物的多核苷酸在分开的转录启动子的控制下。驱动从多核苷酸中表达的分开转录启动子可以相同或不同。
根据一个实施方式，强启动子和/或增强子用于驱动至少一个编码目标多肽的多核苷酸表达，而不是驱动编码突变叶酸受体和/或一个或多个额外选择性标记物的多核苷酸表达。该安排具有为目标多肽产生的转录本多于为选择性标记物的效果。有利的是目标多肽生成相比选择性标记物生成占主导，因为生成异源产物的个体细胞能力不是无限制的且因此应该集中于目标多肽。此外，选择过程仅在建立表达细胞系初始阶段发生，随后不断生成目标多肽。因此，细胞资源集中于目标多肽表达/生成是有利的。另外，如果用于表达选择性标记物的启动子弱于表达目标多肽的启动子，则进一步增加对转染的宿主细胞的选择压力。
根据一个实施方式，驱动编码目标多肽的多核苷酸表达的启动子是CMV 启动子，驱动编码突变叶酸受体的多核苷酸表达的启动子是SV40启动子。已知CMV启动子是可用于哺乳动物表达的最强启动子之一且产生极佳表达率。认为其产生比SV40启动子显著更多的转录本。然而，也能使用其它启动子。
根据一个实施方式，至少一种编码目标多肽的多核苷酸和编码突变叶酸受体的多核苷酸和/或编码选择性标记物的多核苷酸(若存在)在同一转录启动子的控制下。合适的启动子如上所述。在此实施方式中，从所述转录启动子控制下的各表达盒中获得长转录本。根据一个实施方式，至少一个IRES元件功能性地位于从相同表达盒中表达的多核苷酸之间。
所述表达载体或至少2个表达载体的组合可包括合适转录终止位点作为表达盒元件。因为从上游启动子经第二转录单元连续转录可抑制下游启动子功能，所以该现象称为启动子封堵或转录干扰。转录终止位点是充分表征的且其纳入表达载体显示对基因表达有多重有益效果。
表达盒可包括多聚腺苷酸化位点。有数个能用于哺乳动物表达载体的有效 polyA信号，包括源自牛生长激素(bgh)、小鼠β珠蛋白、SV40早期转录单位和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因等。然而，也已知合成的多聚腺苷酸化位点(参见例如普洛麦格(Promega)的pCI-neo表达载体，其基于Levitt等的1989,Genes Dev.3,(7):1019-1025)。多聚腺苷酸化位点可选自SV40polyA位点，如SV40 晚期和早期polyA位点(参见例如质粒pSV2-DHFR，如Subramani等,1981, Mol.Cell.Biol.854-864所述)、合成polyA位点(参见例如普洛麦格的pCI-neo表达载体，其基于Levitt等的1989,Genes Dev.3,(7):1019-1025)和bgh polyA 位点(牛生长激素)。
此外，表达盒可包括至少一个内含子。通常，内含子位于开放阅读框5’末端，但也可位于3’末端。因此，内含子可包括在表达盒中以增加表达率。所述内含子可位于启动子和/或启动子/增强子元件与待表达多核苷酸开放阅读框 5’末端之间。本领域已知数个能与本发明联用的合适内含子。根据一个实施方式，表达目标多肽的表达盒所用的内含子是合成内含子，如SIS或RK内含子。 RK内含子由CMV启动子的内含子供体剪接位点和小鼠IgG重链可变区的受体剪接位点组成(参见例如Eaton等,1986,Biochemistry 25,8343-8347,Neuberger等,1983,EMBO J.2(8),1373-1378；其可获自pRK-5载体(BD PharMingen))，且优选置于目标基因的ATG起始密码子之前。
本发明所述表达载体或载体组合能以环形或线性化形式转染到宿主细胞中。表达载体在转染前的线性化通常提高稳定转染的效率。如果表达载体在转染前线性化，其作为线性化点也是可控的。例如，WO 2009/080720描述所述线性化位点的合适设计。表达载体还可包括原核复制起点。
本发明所述表达载体或表达载体的组合可包括额外元件以能组合本发明所述基于突变叶酸受体应用的选择方法与本领域已知的其它选择系统。
一种本领域已知的已建立选择方法是基于使用流式细胞术，尤其是荧光激活细胞分选术(FACS)以选择高表达宿主细胞。采用流式细胞术的选择方法具有以下优势：能针对所需特征性表达产率迅速筛选大量细胞。在特别用于鉴定高生产细胞克隆的选择方法中，部分目标多肽如抗体表达为膜结合型融合多肽。因此，部分产物展示为细胞表面的融合多肽。由于所生成融合多肽的量与总表达率相关，通过基于细胞表面所示融合多肽量的流式细胞术能选择宿主细胞。这允许迅速选择高生成宿主细胞。本发明所述选择系统与基于使用流式细胞术的各选择方法联合可能是有利的。为能用FACS有效选择，优选采用特殊表达盒以表达目标多肽。因此，根据一个实施方式，编码目标多肽的多核苷酸包括在这样的表达盒中，其被设计成一部分表达的目标多肽包括跨膜锚。有数种选择可获得该结果。
根据一个实施方式，所述表达目标多肽的表达盒包括至少
(i)编码目标多肽的多核苷酸，
(ii)编码目标多肽的多核苷酸下游的至少一个终止密码子，和
(iii)编码膜锚和/或膜锚信号的在终止密码子下游的另一多核苷酸。
上述表达盒所含的编码目标多肽的多核苷酸的转录产生转录本，所述转录本按连续顺序包括至少
(i)多核苷酸，其中所述多核苷酸翻译产生目标多肽；
(ii)所述多核苷酸下游的至少一个终止密码子；
(iii)所述终止密码子下游的多核苷酸，其编码膜锚和/或膜锚信号。
通过翻译通读至少一个终止密码子，部分转录本翻译成含目标多肽和膜锚的融合多肽。此表达盒设计具有以下效果：通过翻译通读过程(终止密码子“漏读”)，部分目标多肽生成为含膜锚的融合多肽。剩余部分表达为分泌型目标多肽。融合多肽展示在细胞表面，显示高水平膜锚定融合多肽的细胞能通过流式细胞术(优选FACS)选择，例如用适当细胞表面染色技术。由此，选择有高表达率的宿主细胞。基于该终止密码子的技术细节和优选实施方式参见 WO2005/073375和WO2010/022961。参考该公开内容。
根据一个实施方式，所述表达盒额外包括(iv)编码报告子如GFP的多核苷酸。所述编码报告子的多核苷酸位于终止密码子下游。终止密码子通读后，获得含报告子的融合多肽，从而能通过基于所表达报告子特征如其荧光的流式细胞术进行选择。优选地，编码报告子的多核苷酸位于编码膜锚的多核苷酸下游。
根据另一实施方式，所述表达盒包括至少
(i)编码目标多肽的多核苷酸，
(ii)包括5’剪接供体位点和3’剪接受体位点，以及包括框内翻译终止密码子和多聚腺苷酸化信号的内含子，和
(iii)编码膜锚和/或膜锚信号的在所述内含子下游的多核苷酸。
此表达盒设计具有以下效果：通过转录和转录本加工，从表达盒获得至少 2种不同的成熟mRNA(mRNA-POI)和(mRNA-POI-ANCHOR)。mRNA-POI 翻译产生目标多肽。mRNA-POI-ANCHOR翻译产生含目标多肽(POI)和膜锚的融合多肽。因此，此融合多肽再次展示在细胞表面，且显示高水平膜锚定融合多肽的细胞能通过流式细胞术(优选FACS)选择。由此，选择有高表达率的宿主细胞。基于此内含子的技术细节和优选实施方式参见WO2007/131774。参考该公开内容。根据一个实施方式，所述表达盒额外包括(iv)编码报告子(如 GFP)的多核苷酸。所述编码报告子的多核苷酸位于内含子下游。因此，获得含报告子的融合多肽，从而能通过基于报告子特征如其荧光的流式细胞术进行选择。优选地，编码报告子的多核苷酸位于编码膜锚的多核苷酸下游。因而，报告子位于宿主细胞内。
根据一个实施方式，构建表达盒，从而获得约≤50％,≤25％,≤15％,≤10％, ≤5％,≤2.5％,≤1.5％,≤1％或小于≤0.5％的融合多肽。剩余部分生成为不含膜锚的分泌多肽形式。只要能将目标多肽锚定到细胞膜并因而能够在细胞表面展示融合多肽，膜锚可以为任何类型。合适的实施方式包括但不限于GPI锚或跨膜锚。优选跨膜锚以确保融合多肽紧密结合到细胞表面并防止融合蛋白脱落。特别是当抗体表达为目标多肽时，尤其优选使用免疫球蛋白跨膜锚。 WO2007/131774、WO2005/073375和WO 2010/022961描述其它膜锚和免疫球蛋白跨膜锚的优选实施方式。
根据一个实施方式，目标多肽是免疫球蛋白分子如抗体。编码免疫球蛋白分子重链的多核苷酸和编码免疫球蛋白分子轻链的多核苷酸可包括在相同表达盒中，或如上所述优选包括在分开的表达盒中。使用上述表达盒设计(其中部分目标多肽通过翻译通读或交替剪接生成为膜锚定融合多肽)时所述表达盒设计用于表达抗体重链。
宿主细胞
根据第二方面，本发明提供活力取决于叶酸盐摄取的宿主细胞，包括至少
a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的引入多核苷酸，所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少
和
b)编码目标多肽的引入多核苷酸，
其中所述目标多肽从所述宿主细胞中分泌。
“引入多核苷酸”指引入宿主细胞的多核苷酸序列，例如使用重组技术如转染。宿主细胞可包括或不包括功能上对应于引入多核苷酸或与之相同的内源多核苷酸。优选地，用含表达盒的表达载体实现引入，所述表达盒包括待引入的多核苷酸，如编码目标多肽或编码突变叶酸受体的多核苷酸。结合本发明第一方面，本发明所述表达载体和表达载体组合的优选示例如上所述。例如，通过转染可整合入宿主细胞基因组的合适表达载体(稳定转染)可完成引入。如果多核苷酸不插入基因组，其可能在后期丧失，如细胞经历有丝分裂时(瞬时转染)。合适载体还可以在不整合入基因组的条件下维持在宿主细胞内，例如通过附加型复制。稳定转染优选用于产生高表达细胞克隆，所述克隆适于以工业规模生成目标多肽。本领域已知有数种合适方法用于引入多核苷酸(如表达载体)到真核宿主细胞中。各方法包括但不限于磷酸钙转染、电穿孔、核转染、脂质转染、基因枪-和聚合物-介导的基因转移等。除了基于传统随机整合的方法，也可以使用重组介导方法，以将待引入多核苷酸转至宿主细胞基因组内。由于各方法为本领域熟知，不需在此任何详述。然而，本领域还已知其它技术用于将多核苷酸引入宿主细胞，所述技术在下面进一步详述。
根据一个实施方式，所述宿主细胞包括第一方面所述表达载体和至少2 个表达载体的组合，其在上面以及权利要求中详述。参考也在此应用的所述公开内容。优选地，所述表达载体或表达载体的组合稳定整合到基因组内。
为允许用本发明所述系统选择，宿主细胞的细胞活力必须依赖于叶酸盐摄取，优选叶酸摄取。合适的真核细胞可选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞和植物细胞就叶酸盐而言可以是原养型(即这类细胞能自主合成其细胞活力(即细胞生长和增殖)必需的叶酸盐)。本发明涵盖就叶酸盐而言是营养缺陷型或被造成是营养缺陷型的真菌和植物细胞。例如，这可能是由于基因操作，即细胞随后不能合成细胞活力所必需的足够量的叶酸盐。所述宿主细胞优选是哺乳动物细胞。所有哺乳动物细胞依赖于叶酸盐摄取，并因此能与本文所述选择系统联用。根据一个实施方式，所述哺乳动物细胞选自啮齿类动物细胞、人细胞和猴细胞。尤其优选啮齿类动物细胞，其可选自CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、小鼠3T3成纤维细胞和SP2/0细胞。特别优选的啮齿类动物细胞是CHO细胞。人细胞也能使用且选自HEK293细胞、MCF-7细胞、PerC6细胞、CAP细胞和HeLa细胞。猴细胞可选自COS-1、 COS-7细胞和Vero细胞。
根据一个实施方式，所述宿主细胞缺乏至少一种内源叶酸受体的完全活性。通过选择/筛选工艺或基因工程技术，如为了产生敲除细胞系，能获得各细胞系。因此，还提供宿主细胞，其中例如包括至少一个内源叶酸受体的内源单向功能叶酸转运系统缺乏完全的活性，即是减弱的。例如，通过所讨论内源叶酸转运系统如内源叶酸受体的任何类型诱变，如通过点突变、基因破坏等，能提供这类减弱。可以是部分减弱或完全减弱。此情况中，本发明所述宿主细胞不包括内源功能性单向功能叶酸转运系统，如内源叶酸受体。
然而，根据一个优选实施方式，除了例如通过上述表达载体或表达载体组合而引入所述宿主细胞的突变叶酸受体，本发明所述宿主细胞包括至少一个内源功能性单向功能叶酸转运系统，尤其是一个或多个内源叶酸受体。因此，基因未改造的细胞能用于使用本发明所述表达载体或表达载体组合的转染。本发明的一个优势是甚至在这些内源单向功能叶酸转运系统存在的情况下，即当保留这些内源系统时，也能采用本文所述选择系统。这是有利的，因为如果内源系统得以保留并因而具有功能，各宿主细胞在随后的就叶酸而言非选择性条件下发生的生成目标多肽中的应用更易于处理。如上所述，优选哺乳动物宿主细胞。
因此，还提供宿主细胞，包括至少一个内源单向功能叶酸转运系统，其中所述内源单向功能叶酸转运系统优选包括至少一个内源叶酸受体。在其一个优选实施方式中，所述内源叶酸受体选自叶酸受体α和叶酸受体β。
根据一个实施方式，所述宿主细胞还包括编码参与叶酸代谢的额外选择性标记物的引入多核苷酸。实施方式结合第一方面如上所述，参考上面的公开内容。所述额外选择性标记物优选是DHFR。结合此实施方式，例如，缺乏DHFR 基因的宿主细胞(如CHO细胞)(例如通过定向基因组缺失，也称为DHFR– (-)宿主细胞)能用作共转染作为选择性标记物的DHFR基因的受体。然而，在进行DHFR选择时使用内源表达DHFR的宿主细胞(DHFR+(+)宿主细胞)是可能并优选的。此情况中，DHFR酶优选用作选择性标记物，其对MTX的敏感性低于DHFR+(+)宿主细胞表达的内源DHFR酶。
根据一个实施方式，所述内源叶酸代谢或宿主细胞机制在通过转染引入多核苷酸前未经基因改造。
至少一种编码目标多肽的多核苷酸、编码突变叶酸受体的多核苷酸和任选的编码参与叶酸代谢的额外选择性标记物(优选DHFR)的多核苷酸以及任选的上述结合第一方面的其它多核苷酸，可被稳定引入所述宿主细胞。分别转染的稳定引入对建立表达细胞系有利，尤其是对大规模生产分泌型目标多肽如抗体有利。
生成重组宿主细胞的方法
根据第三方面，提供生成第二方面所述宿主细胞的方法，包括向活力取决于叶酸摄取的宿主细胞引入至少
a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的多核苷酸，所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少
和
b)至少一种编码目标多肽的多核苷酸，其中所述目标多肽从所述宿主细胞中分泌。
本领域已知数种合适方法用于将多核苷酸和表达载体引入宿主细胞，包括真核宿主细胞如哺乳动物宿主细胞。各方法在现有技术中已知且也如上所述。除了基于随机整合的传统方法，还能使用重组介导的方法以向宿主细胞基因组转入编码目标多肽的多核苷酸、编码突变叶酸受体的多核苷酸和任选的编码额外选择性标记物的多核苷酸(和/或其它多核苷酸)。这类重组方法可包括位点特异重组酶如Cre、Flp或ΦC31的使用(参见例如Oumard等,Cytotechnology (2006)50:93-108)，所述酶能介导转基因定向插入。或者，可用同源重组机制，以插入所述多核苷酸(综述于Sorrell等,Biotechnology Advances 23(2005) 431-469)。基于重组的基因插入能使被转入/引入宿主细胞的异源核酸中包含的元件数量最少。例如，可使用已提供启动子和poly-A位点(外源或内源) 的插入基因座，从而仅剩余元件需要转移/转染入宿主细胞。涉及目标多肽、突变叶酸受体和一种或多种选择性标记物(若使用)以及其组合的细节如上详述；参考上面的公开内容。根据一个实施方式，第一方面所述表达载体或表达载体的组合被引入宿主细胞。所述表达载体和表达载体的组合在上文和权利要求中详述。参考各自的公开内容。此外，活力取决于叶酸摄取的宿主细胞的合适示例也如上所述；参考各自的公开内容。
选择方法
根据第四方面，本发明提供选择至少一个能高产率表达目标重组多肽的宿主细胞的方法，包括
a)提供多个本发明第二方面所述宿主细胞；
b)在含极限浓度叶酸盐的选择性培养基中培养所述多个宿主细胞；
和
c)获得至少一个表达目标多肽的宿主细胞。
本文所用的术语“挑选”或“选择”特定指采用选择性标记物和选择性培养条件来选择并从而获得纳入待引入多核苷酸(如本发明所述表达载体或载体组合)的宿主细胞的过程。例如，通过从转染宿主细胞群中分离和/或富集，能获得成功转染的宿主细胞。成功转染的宿主细胞能在选择条件下存活并表达目标多肽。该选择方法是离体方法。
本文所用的“极限浓度叶酸盐”特定指对宿主细胞提供选择压力的选择性培养基中的叶酸盐浓度。因此，选择性培养基中不包括丰富的叶酸盐，且该培养基中的叶酸盐限制提供对宿主细胞的选择压力。这种选择条件下，基本上仅纳入叶酸受体作为选择性标记物的宿主细胞生长和/或增殖。在提供极限浓度叶酸盐的选择性培养条件下，未成功纳入待引入多核苷酸(如表达载体或至少2 个表达载体组合)，并因此不表达突变叶酸受体作为选择性标记物或其中表达较低的宿主细胞不能增殖、生长和/或死亡。相反，成功纳入本发明所述表达载体或载体组合且以足够产率表达突变叶酸受体作为选择性标记物(并因而表达共引入的目标多肽)的宿主细胞对选择压力耐受或不太受选择压力影响，因此在选择中的生长速度超过未成功转染或在稳定转染情况下其中的细胞基因组整合位点不利的宿主细胞。
选择性培养基所含的极限浓度叶酸盐能被宿主细胞摄入并加工，尤其是纳入用作选择性标记物的突变叶酸受体的宿主细胞。不会或不能由宿主细胞加工的叶酸盐且特别是叶酸盐衍生物对用于选择纳入叶酸受体作为选择性标记物的宿主细胞的选择压力没有贡献，并因而对叶酸盐极限浓度没有贡献。然而，如果例如按本文所述与作为额外选择性标记物的DHFR进行联合选择，各叶酸盐如叶酸拮抗剂可存在且甚至优选存在。存在于选择性培养基的极限浓度叶酸盐可以是例如氧化叶酸盐或还原叶酸盐或其衍生物。氧化叶酸盐如叶酸以及称为还原叶酸盐或四氢叶酸(THF)的叶酸还原衍生物，是维生素B9族，其是哺乳动物细胞中嘌呤、胸苷酸和某些氨基酸的生物合成的必需辅因子和/或辅酶。还原叶酸盐示例包括5-甲基-四氢叶酸和5-甲酰基-四氢叶酸、10-甲酰基-四氢叶酸和5,10-亚甲基-四氢叶酸。一般地，只要叶酸盐能被宿主细胞摄入并加工以维持生长和增殖，该叶酸盐是有用的。优选地，选择性培养基所含的极限浓度叶酸盐是叶酸。用于提供极限浓度叶酸盐的合适浓度范围如下所述。
选择期间，成功纳入本发明所述表达载体的宿主细胞能从转染的宿主细胞群中富集为细胞池。然后，能分析这种池以鉴定表达目标多肽和例如具有特别良好表达率、生长特征和/或稳定特性的所含宿主细胞。同样，个体宿主细胞能从转染和选定的宿主细胞群中分离为单一克隆(如通过克隆选择或FACS选择)。用于在选择后从存活宿主细胞群中获得单一成功转染克隆(如通过FACS分选或有限稀释)的选择过程的合适实施方式为本领域熟知，并因此不需详述。
宿主细胞、突变选择性标记物、额外选择性标记物和标记物组合、表达载体和载体组合的合适和优选实施方式如上详述，参考上面的公开内容。
如所述，本发明所述选择方法是基于细胞培养基中叶酸盐(优选叶酸)的有限可用性。所述系统应用广泛，尤其能用于选择细胞活力取决于叶酸盐(特别是叶酸)摄取的真核细胞，例如尤其是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞示例如上所述。该基于叶酸盐的选择与突变叶酸受体作为选择性标记物的联用是非常适于在培养的哺乳动物细胞中加速、稳定和高水平过表达多肽的极佳策略。如示例所示，突变叶酸受体用作选择性标记物的本发明所述方法加速过表达高水平重组产物如抗体的宿主细胞，尤其是哺乳动物宿主细胞的选择、筛选和建立。所述结果相比用野生型叶酸受体作为选择性标记物有改善。
如上所述，本发明所述选择系统在转染前不需要内源叶酸受体基因的基因组缺失或减弱，因此能应用于任何受体细胞，即使存在内源叶酸受体基因表达。该关键优势基于以下事实：转染突变叶酸受体作为选择性标记物后，细胞能暴露于生长培养基中突然且严重的叶酸盐(如叶酸)去除。在此，相较采用野生型叶酸受体的选择系统，采用叶酸盐结合亲和性较低的突变叶酸受体时，甚至更低浓度的叶酸盐能用于选择性培养基。仅表达显著量突变叶酸受体作为选择性标记物的转染细胞能转运充足的叶酸盐到宿主细胞内以维持DNA复制和细胞增殖。这甚至在选择周期中没有任何显著内源叶酸受体α基因表达提升的情况下发生。此外，通过叶酸摄取替代途径表达增加(包括内源RFC表达增加)，本发明所述选择系统明显不受选择压力缓解导致的选择严格性减少的影响。这是重要优势，因为叶酸受体α对叶酸有显著亲和性(Kd＝0.1nM)，而RFC展现出对叶酸的亲和性极弱(Km＝0.2-0.4mM)。
本发明的严格筛选/选择过程所得的细胞能从原始细胞群的非选定细胞中分离和富集。其可作为个体细胞或细胞池分离和培养。所得宿主细胞还能用于一轮或多轮额外选择，任选用于额外定性或定量分析，或能用于例如发展克隆细胞系以生成蛋白。根据一个实施方式，如上所述选定的生产宿主细胞富集群直接用作高产率生成目标多肽的细胞群。
优选地，选择稳定表达并且因此分泌目标多肽的宿主细胞。稳定转染/表达的优势如上详述。参考上面的公开内容。优选地，从以所需高产率表达目标蛋白的选定宿主细胞中建立克隆细胞系。
用于至少一个选择步骤b)的选择性培养基可包括一种或多种叶酸盐类型。选择性培养基所含极限浓度叶酸盐能被转染的宿主细胞摄入并由其加工，从而存活且优选维持细胞生长和增殖。用于步骤b)的选择性培养基可具有一种或多种以下特性：
(a)包括极限浓度叶酸盐，其中所述叶酸盐优选是叶酸，浓度选自约 2000nM或更少、约1750nM或更少、约1500nM或更少、约1000nM或更少、约500nM或更少、约350nM或更少、约300nM或更少、约250nM或更少、约150nM或更少、约100nM或更少、约75nM或更少、约50nM或更少、约40nM或更少、约35nM或更少、约30nM或更少、约25nM或更少、约20nM 或更少、约15nM或更少、约10nM或更少、约5nM或更少和约2.5nM或更少；和/或
(b)包括叶酸，浓度选自约2000nM或更少、约1750nM或更少、约1500nM 或更少、约1000nM或更少、约500nM或更少、约100nM或更少、约75nM 或更少、约50nM或更少、约40nM或更少、约35nM或更少、约30nM或更少、约25nM或更少、约40nM或更少、约35nM或更少、约30nM或更少、约25nM或更少、约20nM或更少、约15nM或更少、约10nM或更少、约5nM 或更少和约2.5nM或更少。
选择性培养基中叶酸盐且尤其是叶酸的优选浓度可选自：
(a)约2000nM–0.1nM；
(b)约1750nM–0.1nM；
(c)约1500nM–0.1nM；
(d)约1250nM-0.1nM；
(e)约1000nM-0.1nM；
(f)约750nM–0.1nM；
(g)约500nM–0.1nM；
(h)约250nM–0.1nM；优选约250nM–1nM或约250nM–2.5nM；
(i)约150nM–0.1nM；优选约150nM–1nM或约150nM–2.5nM；
(j)约100nM–0.5nM；优选约100nM–1nM或约100nM–2.5nM；
(k)约75nM–0.5nM，优选约75nM–1nM或约75nM–2.5nM；
(l)约50nM–1nM；优选约50nM–2.5nM或约50nM–5nM；
(m)约35nM–0.5nM；和
(n)约25nM–1nM或约25nM–2.5nM，约20nM–3nM约15nM–4nM或 10nM-5nM。
根据一个实施方式，叶酸是选择性培养基所含的对极限浓度叶酸盐作出贡献的唯一叶酸盐。
上述浓度和浓度范围特别适合快速生长悬浮细胞，如CHO细胞，其对于商业生产细胞系而言是优选的表型。选择性培养基所含叶酸盐优选是叶酸。然而，不同细胞系可具有不同叶酸消耗特性。但合适浓度能由技术人员经实验方便测定。如实施例所示，用突变叶酸受体作为选择性标记物允许在选择性培养基中采用更低的叶酸盐浓度。
根据一个实施方式，在转染和/或选择步骤b)之前，宿主细胞在无叶酸盐培养基或含极限浓度叶酸盐的培养基中预培养。因此，迫使所述细胞用尽其内部叶酸盐存贮。合适的极限浓度叶酸盐如上所述。优选地，预培养宿主细胞的所述培养基包括叶酸盐，尤其是叶酸，浓度为100nM或更少、75nM或更少、 50nM或更少，优选25nM或更少，更优选15nM或更少，最优选10nM或更少或者甚至能无叶酸盐。根据一个实施方式，从以极限浓度叶酸盐(如叶酸) 预培养的所述宿主细胞中建立细胞库，如主细胞库或工作细胞库。这具有转染和细胞系生产的制备时间更短的优势。
根据一个优选实施方式，根据本发明教导用作选择性标记物的突变叶酸受体与上述额外选择性标记物联用。如上所讨论，所述额外选择性标记物优选参与叶酸代谢且优选是DHFR。根据一个实施方式，其中细胞用另一选择性标记物额外转染，用于步骤b)的选择性培养基包括所述额外选择性标记物的至少一种合适抑制剂。选择性培养基中所述抑制剂的所用浓度(其还可逐步增加)有助于选择条件的严格性。此外，为了维持选择压力，培养基不应包括足够量代谢物，其会绕开额外选择性标记物的活性。例如，若DHFR用作参与叶酸代谢的额外选择性标记物，选择性培养基不包括相关核苷酸是有利的。一般应控制，例如避免，选择培养基中的代谢物或其它干扰选定筛选策略的添加剂。
通过采用合适的选择性培养基，用于突变叶酸受体(极限浓度叶酸盐)和用于额外选择性标记物(如DHFR抑制剂，若DHFR用作选择性标记物)的选择条件能同时应用于步骤b)。这增加选择压力并使选择过程更有效，从而降低获得高产率表达目标多肽的合适细胞系的时间。对于选择性标记物组合即突变叶酸受体/DHFR，步骤b)优选使用这样的选择性培养基，其包括极限浓度叶酸盐(叶酸盐的合适浓度和示例如上所述)且额外包括DHFR抑制剂，如叶酸拮抗剂。DHFR抑制剂特定指抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)活性的化合物。例如，各抑制剂可与DHFR底物竞争结合DHFR。例如，合适的DHFR抑制剂是叶酸拮抗剂如氨甲蝶呤(MTX)。更多示例包括但不限于三甲曲沙葡糖醛酯 (Neutrexin)、甲氧苄氨嘧啶、乙嘧啶和培美曲塞。因此，根据一个实施方式，用于步骤b)的选择性培养基额外包括至少一种DHFR抑制剂，如优选叶酸拮抗剂如MTX。
因此，根据一个实施方式，步骤a)提供的宿主细胞额外包括编码选择性标记物(即DHFR)的引入多核苷酸，且步骤b)中，使用含叶酸拮抗剂的选择性培养基，浓度为1500nM或更少、1250nM或更少、1000nM或更少、750nM 或更少、500nM或更少、250nM或更少、200nM或更少、150nM或更少、125nM 或更少、100nM或更少、或75nM或更少。根据一个实施方式，所述选择性培养基包括MTX作为叶酸拮抗剂。优选地，所述选择性培养基包括MTX，浓度为约350nM或更少、200nM或更少，优选约150nM或更少、125nM或更少、 100nM或更少、75nM或更少或者50nM或更少。如示例所示，一个特殊优势在于极低MTX浓度能与本发明方法联用。叶酸拮抗剂且尤其是MTX的优选浓度可选自：
(a)约500nM–1nM；
(b)约350nM–2.5nM；
(c)约200nM–5nM；
(d)约150nM-7.5nM；
(e)约100nM-10nM；和
(f)约75nM–10nM。
上述叶酸盐和叶酸拮抗剂的优选浓度和浓度范围可相互组合。在一个实施方式中，约0.1nM–100nM，优选1nM–75nM，更优选5nM–50nM的叶酸盐浓度与2.5nM–150nM，优选5nM-125nM，更优选7.5nM-100nM，更优选 10nM-50nM的叶酸拮抗剂浓度在选择性培养基内联用。如所述，优选叶酸用作叶酸盐且MTX用作叶酸拮抗剂。
此外，还发现所用叶酸盐和叶酸拮抗剂浓度能相互影响。因此，除了叶酸盐和叶酸拮抗剂的绝对浓度，该比例还可以是提供合适选择条件的因素。叶酸拮抗剂(优选MTX)的浓度可多至约20倍的叶酸盐(优选叶酸)浓度。叶酸拮抗剂(优选MTX)的浓度可以是约10倍的叶酸盐(优选叶酸)浓度。优选地，所述选择性培养基包括浓度比为1:10-10:1的叶酸盐和叶酸拮抗剂，优选浓度比是1:5-5:1。如果使用大致等摩尔浓度的叶酸盐和叶酸拮抗剂，获得极佳结果。如实施例所示，若采用所需选择性标记物组合，这些比例提供非常合适的选择性培养条件以获得高生产宿主细胞。
本发明所述的该实施方式，其中突变叶酸受体和参与叶酸代谢的选择性标记物(优选DHFR)联用以用于选择，其优势在于选择中存活的细胞群产率显著提高。特别地，如果此原则与本发明所述突变叶酸受体联用，平均产率如示例所示明显增加。示例显示选择方法后所得的宿主细胞以特定高产率生成目标多肽。因此，发现高生产者克隆的机会提高，而筛选工作减少。由此，本发明所述选择系统优于现有技术中所用的选择系统。
此外，如果选择步骤b)进行至少2次且其中各选择步骤b)之间，转染细胞在含非限制浓度或至少浓度限制更小的叶酸盐且优选无DHFR抑制剂并因而例如无叶酸拮抗剂的培养基中培养，发现生产率甚至能进一步增高。因此，各选择步骤b)之间，优选在非选择性条件下培养细胞。发现其中允许细胞在选择步骤或选择周期之间恢复的各重复选择提供以特定高产率表达目标蛋白的宿主细胞，而且高生产者数量显著增加。
如上所述，除了突变叶酸受体和除了参与叶酸代谢的选择性标记物，还可使用一种或多种其它选择性标记物。这类其它选择性标记物的选择性条件能在应用步骤b)(用于突变叶酸受体和任选的参与叶酸代谢的选择性标记物)中的选择性条件之前(例如，步骤a)和b)之间进行的预选择步骤)或同时施用。例如，在新霉素磷酸转移酶基因(neo)用作另一选择性标记物的情况中，细胞可首先生长于例如含G418的培养基中，以预选择纳入本发明所述的表达载体或至少2个表达载体组合的细胞。然后根据与基于DHFR选择联合的一个有利的实施方式，用基于突变叶酸受体的选择，从所述预选择细胞群中选出高表达细胞。
此外，如上所述，本发明所述选择方法能与现有技术中基于流式细胞术的已知的选择方法联用。因此，根据一个实施方式，涉及流式细胞术的选择步骤根据本发明方法在宿主细胞选择后并因而在步骤c)后进行。这是为从高产率表达目标多肽的存活群体中选择宿主细胞。这种方法使手动克隆步骤(如有限稀释)被淘汰。为此，优选至少部分目标多肽表达为宿主细胞表面展示的膜锚定融合多肽。根据所展示融合多肽的量，用流式细胞术(优选FACS)能选择高产率表达目标多肽的宿主细胞。使各选择可行的表达编码目标多肽的多核苷酸的合适表达盒如上所述。参考各自的公开内容。对于选择，培养宿主细胞以能表达目标多肽，从而至少部分目标多肽表达为含膜锚的融合多肽，其中所述融合多肽在所述宿主细胞表面展示且其中至少一个宿主细胞根据细胞表面所展示融合多肽的量进行选择。在此，能使用结合胞外融合蛋白部分的标记检测化合物。例如，可采用荧光标记检测化合物。或者，融合蛋白可额外包括标记细胞的报告子如GFP，从而能够基于报告子特征直接选择。优选地，报告子处于跨膜锚下游并因而位于胞内。如上所讨论，宿主细胞能根据表达产率用流式细胞术、尤其是FACS选择。
生成目标多肽的方法
根据第五方面，提供生成目标重组多肽的工艺，包括以下步骤：在使目标多肽能表达和分泌的条件下培养本发明所述宿主细胞和/或根据本发明教导选定的宿主细胞。根据本发明使用宿主细胞生成目标多肽的优势在于，目标多肽能以高产率生成。当实施本发明所述选择方法来选择合适宿主细胞用于表达时尤其如此。因此，本发明提供生成目标多肽的改良方法。合适的宿主细胞如上所述；参考上面的公开内容。
所述多肽分泌到培养基内并且能从中获得。为此，在目标多肽中提供合适的分泌前导肽。示例如上所述。因而，能以高产率有效生成并获得/分离重组多肽。根据一个实施方式，所述宿主细胞在无血清条件下培养。
生成目标多肽的方法可包括至少一个以下步骤：
-从所述细胞培养基中分离目标多肽；和/或
-加工所分离的目标多肽。
根据本发明生成的目标多肽还可经历进一步加工步骤，如纯化和/或修饰步骤以生成所需质量的目标多肽。例如，所述产物可通过常规程序从营养培养基回收，常规程序包括但不限于离心、过滤、超滤、提取或沉淀。纯化可通过本领域已知的多种过程进行，包括但不限于色谱(如离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和体积排阻)、电泳法(如制备式等电聚焦)、差异溶解度(如硫酸铵沉淀)或提取。分离的目标多肽可配制成药物组合物。
目标多肽示例与第一方面的结合如上所述，参考各自的公开内容。哺乳动物细胞可包括或不包括内源多核苷酸，其对应于分别与之相同的编码目标多肽的多核苷酸。根据一个实施方式，哺乳动物细胞不包括对应于目标多肽的内源基因。还提供如上面和权利要求所定义的由本发明所述方法获得的多肽。所述多肽可特定是免疫球蛋白分子或其功能片段。
应用
本发明的第六方面涉及多核苷酸应用，所述多核苷酸编码以下作为选择性标记物：
a)具有或包括以下序列的突变叶酸受体
Figure BDA0002675710410000391
其中Xaa不是丙氨酸且其中突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较其中Xaa 是丙氨酸的对应野生型叶酸受体(SEQ ID NO 1)减少，
或
b)突变叶酸受体，所含氨基酸序列与SEQ ID NO 9所示序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，且其中所述突变叶酸受体内的Xaa不是丙氨酸且其中所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较其中Xaa是丙氨酸的野生型叶酸受体α序列 (见SEQ ID NO 1)减少。所述选择性标记物能用于选择活力取决于叶酸摄取的成功转染的宿主细胞，尤其是哺乳动物细胞。特别地，其能用作选择性标记物以鉴定高产率表达目标重组多肽的宿主细胞。所述突变叶酸受体优选包括在表达载体内。用各突变叶酸受体作为选择性标记物以及合适表达载体的细节、组合和优势如上所述，参考上面的公开内容。尤其优选在本发明方法中的应用。如上所述，Xaa优选是选自亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和天冬氨酸的氨基酸。Xaa最优选是亮氨酸。所述突变叶酸受体优选是GPI锚定的。根据一个实施方式，所述选择性标记物与作为额外选择性标记物的DHFR联用。此实施方式和合适选择条件的细节如上所述，参考上面的公开内容。
本发明的第七方面涉及多核苷酸应用，所述多核苷酸编码以下作为选择性标记物：
a)包括以下序列的突变叶酸受体
Figure BDA0002675710410000392
或
Figure BDA0002675710410000401
其中Xaa是亮氨酸；
或
b)突变叶酸受体，所含氨基酸序列与SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 13所示序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，且其中根据b)的所述突变叶酸受体内的Xaa是亮氨酸。所述选择性标记物能用于选择活力取决于叶酸摄取的细胞，尤其是哺乳动物细胞。特别地，其能用作选择性标记物以鉴定高产率表达目标重组多肽的宿主细胞。用作选择性标记物的所述突变叶酸受体优选包括在表达载体内。用各突变叶酸受体(A49L突变体)作为选择性标记物以及合适和优选表达载体的细节、组合和优势如上所述，并且还描述于实施例中。参考各自的公开内容。尤其优选在本发明方法中的应用。所述突变叶酸受体优选是GPI 锚定的。根据一个实施方式，所述选择性标记物与作为额外选择性标记物的 DHFR联用。此实施方式和合适选择条件的细节如上所述，参考上面的公开内容。所述第七方面的优选实施方式再次描述于下。
根据第七方面的一个实施方式，使用表达载体或至少2个表达载体的组合，包括：
a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的多核苷酸，其中
i)所述突变叶酸受体包括以下序列
Figure BDA0002675710410000402
或
Figure BDA0002675710410000403
其中Xaa是亮氨酸；
或
ii)所述突变叶酸受体包括的氨基酸序列与SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 13 所示序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，且其中根据ii)的所述突变叶酸受体内的 Xaa是亮氨酸
b)至少一种编码目标多肽的多核苷酸。
优选地，编码突变叶酸受体的多核苷酸和编码目标多肽的多核苷酸包含在分开的表达盒中。表达盒和表达载体的合适及优选的实施方式的细节如上所述，参考上面的公开内容。目标多肽优选是分泌多肽。结合第一方面，细节如上所述。根据一个实施方式，所述表达载体或至少2个表达载体的组合额外包括编码选择性标记物的多核苷酸，所述选择性标记物参与叶酸代谢，优选是二氢叶酸还原酶。合适和优选的实施方式如上所述，参考上面的公开内容。所述选择性标记物优选是DHFR，优选包含在分开的表达盒中。
根据此方面的一个实施方式，还提供活力取决于叶酸摄取的宿主细胞，包括
a)编码突变叶酸受体的引入多核苷酸，其中
i)所述突变叶酸受体包括以下序列
Figure BDA0002675710410000411
或
Figure BDA0002675710410000412
其中Xaa是亮氨酸；
或
ii)所述突变叶酸受体包括的氨基酸序列与SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 13 所示序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，且其中根据ii)的所述突变叶酸受体内的Xaa是亮氨酸，和
b)至少一种编码目标多肽的引入多核苷酸，其中目标多肽分泌自所述宿主细胞。
优选地，所述宿主细胞包括上述表达载体或至少2个表达载体的组合。根据一个实施方式，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。其优选是啮齿类动物细胞，更优选CHO细胞。根据一个实施方式，所述哺乳动物宿主细胞表达内源叶酸受体。根据一个实施方式，所述哺乳动物宿主细胞包括编码选择性标记物的引入多核苷酸，所述选择性标记物参与叶酸代谢，优选是二氢叶酸还原酶。合适和优选的实施方式以及生成各宿主细胞的方法如上详述。参考各自的公开内容。
根据此方面的一个实施方式，还提供选择至少一种能以所需产率表达目标重组多肽的宿主细胞的方法，包括
a)提供多种活力取决于叶酸摄取的宿主细胞，包括
aa)编码突变叶酸受体的引入多核苷酸，其中
i)所述突变叶酸受体包括以下序列
Figure BDA0002675710410000421
或
Figure BDA0002675710410000422
其中Xaa是亮氨酸；
或
ii)所述突变叶酸受体包括的氨基酸序列与SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 13 所示序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，且其中根据ii)的所述突变叶酸受体内的 Xaa是亮氨酸，和
bb)至少一种编码目标多肽的引入多核苷酸；
b)在含极限浓度叶酸盐的选择性培养基中培养所述多种宿主细胞；
和
c)获得至少一种表达目标多肽的宿主细胞。
用于步骤b)的选择性培养基包括极限浓度叶酸盐，其中所述叶酸盐优选是叶酸，浓度选自约2000nM或更少、约1750nM或更少、约1500nM或更少、约1000nM或更少、约500nM或更少、约350nM或更少、约300nM或更少、约250nM或更少、约150nM或更少、约100nM或更少、约75nM或更少、约 50nM或更少、约40nM或更少、约35nM或更少、约30nM或更少、约25nM 或更少、约20nM或更少、约15nM或更少、约10nM或更少、约7.5或更少、约5nM或更少和约2.5nM或更少。优选地，叶酸用作叶酸盐。宿主细胞优选是哺乳动物细胞。根据一个实施方式，所述宿主细胞额外包括编码选择性标记物的引入多核苷酸，所述选择性标记物是二氢叶酸还原酶。在此实施方式中，用于步骤b)的选择性培养基根据一个实施方式还包括叶酸拮抗剂，浓度选自 1500nM或更少、1000nM或更少、750nM或更少、500nM或更少、200nM 或更少、150nM或更少、125nM或更少、100nM或更少、75nM或更少、50nM 或更少、25nM或更少、20nM或更少、15nM或更少、12mM或更少和10nM 或更少。根据一个实施方式，在步骤c)后，所述细胞在含非限制浓度叶酸盐的培养基中培养，然后根据步骤b)再次培养并根据步骤c)获得。优选和合适的选择性培养基以及选择方法的实施方式的更多细节与第四方面的结合如上所述，并参考各自的公开内容。
根据此方面的另一实施方式，还提供生成目标多肽的工艺，包括
a)在允许目标多肽表达和分泌的条件下，培养此方面先前段落所述宿主细胞和/或根据此方面先前段落所述方法选择的宿主细胞；
b)从细胞培养基分离目标多肽，和
c)任选加工所分离的目标多肽。
涉及各生成方法以及目标多肽的合适和优选实施方式的细节如上所述，参考上面的公开内容。目标多肽优选是治疗活性多肽，如抗体。
本发明不受本文公开的示例性方法和材料限制。本文所述数值范围包含定义范围的数字。本文提供的标题不对本发明不同的方面或实施方式构成限制，其可整体参考说明书理解。根据一个实施方式，本文所述含某些元件的主题也指由各元件组成的主题。特别地，本文所述含某些序列的多核苷酸还可由各序列组成。优选选择和组合本文所述优选实施方式，从各优选实施方式组合产生的特定主题也属于本发明。
下列实施例用于说明本发明，而不以任何方式限制其范围。实施例特定涉及本发明的优选实施方式。
实施例
在随后的实验中，使用以下载体：
参照载体“V-DHFRref”包括以下主要表达盒：含编码DHFR作为选择性标记物的多核苷酸的表达盒；含编码抗体轻链的多核苷酸的表达盒；含编码抗体重链的多核苷酸的表达盒和含编码新霉素磷酸转移酶的多核苷酸的表达盒。所有表达盒朝向同一方向。全抗体从所述参照载体中表达。WO 2009/080720 也描述合适的载体设计。
通过针对编码叶酸受体作为选择性标记物的多核苷酸，交换编码DHFR 作为选择性标记物的多核苷酸，含叶酸受体作为选择性标记物的载体根据参照载体设计。另外，表达盒保持不变。载体“V-wtFRalpha”包括野生型人叶酸受体α作为选择标记物。载体“V-mutFRalpha”包括含A49L突变的突变人叶酸受体α。
实施例1：单一转染
对于单一转染，野生型人叶酸受体α(载体：V-wtFRalpha)或突变人叶酸受体α(载体：V-mutFRalpha)作为选择性标记物引入CHO细胞。此实验用于分析叶酸受体选择系统的功能，所述系统与DHFR/MTX-系统相反，不基于对细胞生长的毒性抑制，而基于培养基中叶酸丧失导致的生长抑制。叶酸是维生素B9的氧化形式。叶酸的还原形式即四氢叶酸(THF)具有生物活性。细胞内的叶酸在NADPH依赖性反应中通过二氢叶酸还原酶(DHFR)经二氢叶酸(DHF)还原成其生物活性形式的四氢叶酸(THF)。为维持细胞生长和细胞增殖，叶酸摄取对哺乳动物细胞是必需的。
仅将转染载体整合入基因组并高效率表达野生型叶酸受体α(V-wtFRalpha) 或突变叶酸受体α(V-mutFRalpha)的细胞能在基于培养基中极限浓度叶酸盐的选择条件下存活。即使培养基包括极限浓度叶酸盐，这些细胞也能从培养基整合足够量的叶酸进入细胞以维持细胞生长中的增殖。由于表达载体还向细胞引入编码目标蛋白(这些实验中的抗体重链和轻链)的多核苷酸，用基于叶酸受体的选择技术来选择稳定、高生产的细胞系生成是可能的。
为确定叶酸浓度对细胞生长的影响，测试不同的选择性培养基。标准培养基包括11.7μM叶酸(完全培养基)。发现培养基中用≤50nM叶酸时，达到最严格的选择条件。此外，用不同叶酸浓度时，观察到生长速度有差异。培养基中叶酸越少，细胞生长越慢。
首先，CHO细胞的内部叶酸存贮减少，防止从标准培养基(完全培养基) 的叶酸共转至选择培养基中。因此，转染前，旨在以极限叶酸浓度选择的细胞用PBS洗3次，并接种于无叶酸培养基。参比对照(载体V-DHFRref)以相同细胞密度在完全培养基中传代。在转染前分析细胞生长，发现在完全培养基中生长的培养物(5x106 LZ/ml)优于选择培养基中生长的培养物(2.5x106 LZ/ml) 约2倍。
所述载体用核转染来转染到细胞中。5x106活细胞(LZ/ml)用3μg载体 DNA转染。含载体V-wtFRalpha、V-mutFRalph和阴性对照(V-DHFRref且没有DNA)的CHO细胞转移至选择培养基；参照转染转移至完全培养基。表1 概括了所进行的单一转染。选择在转染后48小时开始，从而使细胞能从核转染中恢复并开始表达所引入表达载体。含待测试选择标记物的细胞暴露于极限浓度的叶酸。平行地，选择标记物DHFR(V-DHFRref)暴露于含MTX的不同培养基以及含叶酸(FA)的不同选择培养基。无额外DNA的培养物用作阴性对照。
表1：所进行单一转染的概述
Figure BDA0002675710410000451
Figure BDA0002675710410000461
48h后通过GFP对照测定转染效率。随后表2提供在基于叶酸的选择的第 12天所获得的活细胞密度的概述。
表2：在基于叶酸(FA)的选择第12天的细胞密度(LZ/ml)概述
Figure BDA0002675710410000462
表2显示用对照(V-DHFRref；无DNA)、V-wtFRalpha和V-mutFRalpha 转染并用不同叶酸浓度选择的细胞池的细胞密度[LZ/mL]。可以看出，当选择培养基中的叶酸浓度降低时，生长减少。转染有突变叶酸受体α作为选择性标记物的细胞池显现在含极限浓度叶酸的选择培养基中，细胞生长是其它池中所见细胞生长的约2倍或甚至更高。第12天时，转染有野生型叶酸受体α的细胞未显示生长优势。其生长与含V-DHFRref的群体或阴性对照大致相同。然而，根据所用叶酸浓度，用野生型叶酸受体α在后期开始时(约第16-20天) 观察到生长优势。因此，2种叶酸受体类型(野生型和突变体)都适合在培养基中极限浓度叶酸的基础上选择细胞。然而，本发明所教导的用突变叶酸受体α作为选择性标记物更有利，因为成功转染细胞的生长优势比野生型叶酸受体α更早发现。此外，突变叶酸受体允许在更低叶酸浓度选择，如15nM，甚至 5nM。因此，用本发明所述突变叶酸受体作为选择性标记物时，能采用更严格的选择条件。
在选择的第12天分析细胞池活力时，所见活力与35-50nM叶酸浓度大致相同(细胞池活力>90％)。由于活力高，在这一天传代细胞群是可能的。然而，叶酸浓度更低时，活力减少。在最低叶酸选择性培养基中，仅 V-mutFRalpha转染群显示76％的相对高活力。
此外，分析选择必需的时间。建立新选择标记物时，选择所需的总体时间是重要的。培养CHO细胞时，可根据所用选择条件在15-16天内完成单一选择步骤DHFR-MTX-选择。然而，多步式基因扩增通常耗时明显更长。在这个时间段中，细胞应从选择压力诱导的危机中恢复。表3显示直到下次传代的选择天数，即细胞达到大于90％活力并因而获得能用于抗体效价筛选的细胞所需的时间段。
表3：以天数计的选择时程
Figure BDA0002675710410000471
表3显示直到下次传代的选择天数，即细胞克服选择危机并达到大于90％活力所需的时框。可以看出，起初所有细胞池在含50、45或35nM叶酸的选择性培养基中培养时得到恢复。然而，较低叶酸浓度对细胞形成较高的选择压力，从而仅使用V-mutFRalph就能恢复良好，并因而在这些极严格条件下16 天后有活力。在此，在仅含5nM-25nM叶酸的选择培养基中，转染有 V-mutRFalpha的细胞群恢复并显示大于90％的活力。转染有V-wtFRalpha的细胞需要更多时间且无法在极低叶酸浓度下恢复。
实施例2：测定抗体产率
为分析转染和基于目标基因(在此是参照抗体)表达的选择是否成功，所获得(即根据实施例1选择)的细胞在摇瓶中分批培养13天以测定选择后的细胞产率。细胞具有大于90％的活力。第13天时，培养物上清的抗体浓度用蛋白A亲和色谱测定[mg/L]。结果如表4所示。
表4：分批培养物上清的抗体浓度(mAb)(mg/L)
Figure BDA0002675710410000481
Figure BDA0002675710410000491
从所引入表达载体表达的抗体能在所有细胞群中测出。由于未转染DNA 的细胞池中也测得少量抗体，仅大于9mg/l的值确定为显著。125nM MTX(标准DHFR/MTX选择系统)中的参照群产生28mg/l。4个转染有V-wtFRalpha 的细胞群的结果处于背景范围内的较高叶酸浓度。然而，培养基的叶酸浓度降至15nM叶酸时，抗体表达(24mg/l)与125nM MTX中的参比对照V-DHFRref (28mg/l)几乎一样高。这证实先前的发现：即使没有毒剂用于选择，野生型叶酸受体能用作选择标记物并达到与已建立DHFR/MTX系统相当的效率。转染有V-wtFRalpha的细胞池显示取决于培养基中叶酸浓度的抗体效价呈线性增加。培养基中叶酸浓度越低，所得抗体表达率越高。因此，用本发明所述突变叶酸受体作为选择标记物相比用野生型叶酸受体作为选择标记物有优势。
由于整合的转基因数量对表达率产生重要影响，最重要元件即所表达抗体的轻和重链(LC、HC)的拷贝数以及叶酸受体(突变或野生型)的拷贝数用定量PCR根据细胞池基因组DNA测定。
关于所测抗体效价，拷贝数能提供关于以下问题的间接启示：整合入基因组的位置是否引起强或弱表达。本文进行的定量PCR分析提供转基因拷贝数的平均值，因为分析了在选择下存活的不同细胞群，而不是单细胞克隆。
表5：用定量PCR测定拷贝数
Figure BDA0002675710410000492
Figure BDA0002675710410000501
表5显示V-wtFRalpha和V-mutFRalpha转染子在选择后的定量PCR分析结果。根据对照池，对在最高选择严格性(V-DHFRref:125nM MTX,35nM叶酸,无DNA:25nM叶酸)下存活的细胞池进行分析。此外，无选择压力下培养的未转染CHO细胞作为阴性对照进行分析。表5显示轻链和重链的拷贝数以及用作选择标记物的叶酸受体拷贝数。所述值指CHO细胞的理论基因组大小。表5显示如所预期，在未转染CHO细胞中无法测定抗体序列。此外，仅测定内源野生型叶酸受体α拷贝。用125nM MTX选择的参比对照V-DHFRref 显示平均有2倍的抗体转基因整合。观察用35nM叶酸选择的V-DHFRref群时，可看到高许多的抗体轻链和重链整合。检测到5.5个重链拷贝和6.8个轻链拷贝。FRα基因的拷贝数与亲代CHO细胞相当并可归因于内源等位基因。
相较带V-DHFRref的对照，转染有V-wtFRalpha的细胞池显示HC和LC 拷贝不多。没有观察到浓度依赖性差异。叶酸受体拷贝数在从50nM到35nM 叶酸下增加至2.8个拷贝，但随之在25nM减少。同样，用15nM叶酸选择的细胞池纳入平均2.6个拷贝的抗体链。相反，转染有V-mutFRalpha的细胞池显示抗体链基因拷贝几乎线性增加，这与选择培养基中叶酸降低平行。因此，选择培养基中的叶酸浓度越低，所选细胞中检测的LC和HC基因拷贝数越多。突变叶酸受体α基因的拷贝数显示类似趋势。相比用125nM MTX选择的参比对照V-DHFRref，用5nM叶酸选择的细胞池具有约3倍的整合抗体拷贝。
实施例3：单细胞克隆
为开发高产率稳定生成目标基因的细胞系，需要从根据实施例1选择后存活的所得不同生产细胞群中选出显示高抗体表达率和良好细胞生长的最佳细胞克隆。为此，通过有限稀释从单细胞产生细胞系。有限稀释能从根据实施例 1选择存活的多克隆细胞团开始获得单克隆细胞群。这如下完成：设置一系列增加稀释的亲代(多克隆)细胞培养物。制备亲代细胞悬液。然后，根据起始群的细胞数形成合适的稀释。生成终稀释后，将单细胞置于细胞培养板孔内并从中制备克隆。建立单克隆细胞群确保在延长时间段中的稳定抗体表达。分别克隆选定细胞群V-wtFRalpha(15nM叶酸)、V-mutFRalpha(5nM叶酸)、 V-DHFRref(125nM MTX)和V-DHFRref(250nM MTX–来自不同转染)。克隆在完全培养基中进行且另外在对应选择培养基中预先用于选择。因此，后一种情况下，在单细胞克隆中维持选择压力。成功生长后，克隆在大于70％融合下转至24孔板并就抗体生成进行分批培养测试(持续10天)。分批培养期间，再次使用完全培养基(无选择压力)或选择培养基(维持选择压力)。克隆按最高到最低表达水平排列(取决于培养基)。结果如图1-4所示。
显示在完全培养基(选择后不维持选择压力)和选择培养基(选择后维持选择压力)中实现的克隆结果。在此，可以看出手动克隆程序的典型发展。发现1-5个高生产细胞克隆，之后，曲线迅速下降到低位或甚至无表达细胞克隆。此外，在低生产细胞克隆内，观察到广泛细胞产率，然而其中大多数低于9mg/l 的阈值。
转染有V-DHFRref的细胞(用125nM MTX选择)在完全培养基和选择培养基中克隆，从6x 96孔板产生86个克隆(完全培养基中53个，选择培养基中33个)。最高生产克隆培养于选择培养基并在24孔批次中生成28.4mg/l。 250ml摇瓶(共50ml)中，初始多克隆池还达到28mg/l效价。转染有V-DHFRref 的细胞(用250nM MTX选择)在完全培养基和选择培养基中克隆，能分离 76个克隆(完全培养基中41个，选择培养基中35个)。选择后从完全培养基内培养的细胞中分离3个最佳克隆，否则选择性培养基中生长的细胞显示整体产率高于完全培养基中的克隆。起始多克隆池具有27mg/l的效价，在24孔中最高生产细胞克隆达到42mg/l。2种参比对照显示选择期间所用的最高MTX 浓度不必定产生最高效价。为了能分离最佳克隆，需要分析大量细胞克隆。
转染有载体V-wtFRalpha的细胞还在完全培养基(选择后不维持选择压力) 或选择培养基(因此在克隆期间维持选择压力)中克隆，所述载体包括野生型叶酸受体α作为选择性标记物(用15nM叶酸选择)。2个最高生产克隆在选择性培养基中分离。在24孔模式中最佳克隆达到53mg/l。值得注意的是仅7 个克隆在此选择性培养基中存活。完全培养基中有49个克隆存活。初始池在 250ml摇瓶中具有约24mg/l的抗体浓度。
转染有载体V-mutFRalpha的细胞还在于完全培养基(选择后不维持选择压力)或选择培养基(因而在克隆期间维持选择压力)中克隆，所述载体包括突变叶酸受体α作为选择性标记物(用5nM叶酸选择)。2个最佳克隆从完全培养基以及选择性培养基中分离。最高生产克隆在上清中具有42mg/l的效价。总体上，100个克隆能转至24孔板，其中完全培养基中52个而选择性培养基中48个。在此，在选择性和完全培养基中获得类似结果。表6概括了最佳生产克隆的生产率。
表6：终点稀释后的最高生产克隆(mAb[mg/L])概述
V-wtFRalpha 15nM FA 53.5
V-mutFRalpha 5nM FA 42.1
V-DHFRref 125nM MTX 28.4
V-DHFRref 250nM MTX 41.6
表6显示用2个选择性标记物即野生型叶酸受体α(V-wtFRalpha)和突变叶酸受体α(V-mutFRalpha)的选择，在单细胞克隆后，为在所进行克隆实验中获得的细胞克隆提供与参照选择性标记物DHFR至少同样好的结果。其它实验(见下)显示用本发明所述突变叶酸受体作为选择性标记物时，还能获得更高的整体生产率。
实施例4：共转染实验
为分析采用选择培养基中叶酸丧失和添加MTX形式的双重选择压力的选择严格性和效率，细胞用V-DHFRref和V-mutFRalpha共转染。所有转染载体包括与目标蛋白相同的抗体基因。共转染2个分开的表达载体，其中各载体包括表达抗体轻链和重链的表达盒。转染前，CHO细胞(除了用于DHFR参比对照的细胞)用PBS洗3次以减少来自完全培养基的叶酸遗留，并传达到选择性培养基用于转染。用于转染参比对照V-DHFRref的CHO细胞患有传代在完全培养基中进行。
所述载体用核转染来转染到细胞内。与单载体转染相反，转染双倍细胞量 (1x107LZ/ml)和双倍DNA量(每载体3μg)以用于共转染。在每个细胞基础上，转染的DNA量仍然相同。转染有V-DHFRref/V-mutFRalpha和对照的 CHO细胞转移至选择性培养基；参照转染转移至完全培养基。选择在转染后 48小时开始。每测试设置的3次转染在48小时后合并，离心并重悬于9ml选择培养基或完全培养基中，并分成三份到3个选择培养基。3批共转染细胞池和对照暴露于3种不同浓度的叶酸/MTX用于选择。平行地，参比对照用载体 V-DHFRref通过G418/MTX选择进行。在此，细胞培养于含丰富叶酸的完全培养基。为起始选择周期，随后加入选择剂以诱导选择压力。作为阴性对照，在未加入DNA情况下进行转染。下表7概括了所进行的转染和所用培养基。
表7：所进行共转染的概述
Figure BDA0002675710410000531
选择完成后，从所选细胞制备分批培养物以测定整合抗体基因的表达率。分批培养期间，细胞群在完全培养基中培养。所有细胞群中，为测定抗体表达，在分批培养13天后就共转染和参照转染用蛋白A亲和色谱测定抗体浓度。结果如表8所示，其中分批培养物以其在选择培养基中的来源命名，即以所进行的选择命名(50/50,50/100,12.5/50[nM FA/nMMTX]或V-DHFRref-G418-MTX –一式三份进行)。未存活的细胞池未显示。再次，由于所用的测量方法，仅高于9mg/l的值被视作显著。
表8：分批培养的培养物上清中的抗体浓度(mAb)[mg/L]
载体转染和选择条件 mAbmg/L
V-mutFRalpha/V-DHFRref-FA/MTX[nM]:50/50(细胞池1) 17.7
V-mutFRalpha/V-DHFRref-FA/MTX[nM]:50/50(细胞池2) 25.6
V-mutFRalpha/V-DHFRref-FA/MTX[nM]:50/50(细胞池3) 21.5
V-mutFRalpha/V-DHFRref-FA/MTX[nM]:50/100(细胞池1) 35.8
V-mutFRalpha/V-DHFRref-FA/MTX[nM]:50/100(细胞池2) 15.4
V-mutFRalpha/V-DHFRref-FA/MTX[nM]:12.5/50(细胞池1) 34.4
V-mutFRalpha/V-DHFRref-FA/MTX[nM]:12.5/50(细胞池2) 24.7
V-mutFRalpha/V-DHFRref-FA/MTX[nM]:12.5/50(细胞池3) 5.9
V-DHFRref-G418-MTX(细胞池1) 55
V-DHFRref-G418-MTX(细胞池2) 21
V-DHFRref-G418-MTX(细胞池3) 57.2
由表8可见，DHFR参照方法的细胞池在3个选择步骤(0.8mg/ml G418- 500nM MTX-1μM MTX)后产生多至58mg/l的抗体效价。根据用 V-mutFRalpha/V-DHFRref的共转染，细胞在选择后转至完全培养基时，几乎所有细胞池存活。源自50/50选择培养基的V-mutFRalpha/V-DHFRref池产生多至25mg/l的效价，细胞池-50/100和12.5/50细胞群产生多至36mg/l的效价。
3个连续选择周期用于DHFR参照方法，因为G418选择之后是2个MTX 选择周期(500nM和1μM MTX)。因此，当用细胞培养基中极限浓度叶酸和 MTX执行2个选择周期时，额外测试表达率能否增加。由此，用极限浓度叶酸和MTX(涉及所用浓度，见上)执行第一选择周期后，细胞转至完全培养基以能够恢复。之后，细胞在第二选择周期中再次暴露于相同选择性培养基并因而暴露于相同的选择压力。结果如表9所示。
表9：实施2次选择周期后分批培养的培养物上清中的抗体浓度(mAb)[mg/L]
Figure BDA0002675710410000541
Figure BDA0002675710410000551
表9显示当转染有V-mutFRalpha/V-DHFRref的细胞在35-38天后再次暴露于选择压力时，所述细胞显示极高的显著增长，产量从21到670mg/l。这是30倍的抗体效价增加。同样，50/50选择培养基中的其它细胞群在重复选择压力下的产量比完全培养基中培养的培养物高20倍。此外，执行3个选择周期的所得结果显著优于DHFR参照方法(见表8)。因此，此选择原理产生极高的表达效价，其中用含极限浓度叶酸盐和叶酸拮抗剂的选择性培养基执行2 个选择周期，其具有在非选择性培养基中的中间培养步骤。
实施例5：单细胞克隆
为产生有稳定载体表达的细胞系，根据实施例4所得的细胞群在选择完成后克隆。选择后，多克隆转染池50/50在6x96孔板中克隆，使用完全培养基(因而在克隆期间不维持选择压力)和选择培养基(因而在克隆期间维持选择压力) 中的有限稀释。克隆成功生长后，克隆在大于70％融合下转至24孔板并在分批培养10天后就抗体产率进行测试。克隆V-mutFRalpha/V-DHFRref共转染和选择群时获得的结果示于图5。如图5所示，完全培养基和选择培养基中的 V-mutFRalpha/V-DHFRref细胞克隆，从6x96孔板产生65个克隆(完全培养基有55个，含50nM FA/50nM MTX的选择培养基有10个)。克隆按最高到最低表达水平排列(取决于培养基)。从完全培养基的克隆中分离最高生产克隆并在24孔批次内生成450mg/l。250ml摇瓶(共50ml)中，初始细胞池达到670mg/l的效价。
作为参照，先前的G418-MTX选择后进行DHFR载体V-DHFRref的有限稀释克隆。各结果获自先前实验并在类似条件下进行。克隆在选择培养基中进行，从而在克隆期间维持选择压力。结果如表10所示。
表10：克隆V-DHFRref转染的参照池
Figure BDA0002675710410000561
Figure BDA0002675710410000571
在此，进行渐进式G-418 500nM MTX 1μM-MTX选择。表10显示选择培养基(1μMMTX)中细胞群终点稀释的结果。克隆按最高到最低表达水平排列。此参照的最高生产克隆在20孔批次中达到51mg/l。获得大范围的细胞产率，然而其大部分在9mg/l阈值以下。
图5和表10所示结果显示用V-mutFRalpha/V-DHFRref共转染产生显著更高产率，此外，分离的高生产细胞克隆数显著增加。多于50％分离自所选多克隆群的克隆达到高于300mg/l的效价。最高选择严格性下的共转染在 V-mutFRalpha、V-DHFRref(不同选择方法)和V-mutFRalpha/V-DHFRref的最高生产细胞克隆内实现9倍的抗体浓度增加。结果如表11所示。
表11：最高生产克隆的概述
V-mutFRalpha/V-DHFRref(50/50) 449.3
V-mutFRalpha(5nM FA) 42.1
V-DHFRref(125nM MTX) 28.4
V-DHFRref(250nM MTX) 41.6
V-DHFRref(1μM MTX) 51
表11显示克隆后进行选择的最高生产者的抗体浓度(mAb[mg/L])。可以看出，共转染V-mutFRalpha/V-DHFRref和在含极限浓度叶酸且额外含叶酸拮抗剂的选择培养基中选择提供最佳结果。
上述结果显示用含限制量叶酸盐(这里是叶酸)的选择培养基时，基于突变叶酸受体用作选择性标记物的选择使成功转染的细胞能存活。用突变叶酸受体α作为选择标记物的选择比用野生型叶酸受体α作为选择标记物时更快。由于野生型叶酸受体α与叶酸的结合亲和性高(KD＝0.1nM)，选择压力远低于耐受的叶酸阈值浓度，该浓度下未转染DNA的细胞也能存活。这也反映在所测抗体浓度上。转染有突变叶酸受体的细胞能在所有测试的选择性培养基中存活。此外，观察到相对均匀的生长。在3个最高浓缩培养基中，细胞能在12 天后传代；在3个叶酸浓度最低的培养基中，第16天实现恢复。这些情况下，细胞上的选择压力与野生型叶酸受体作比较，甚至进一步增加。由于突变叶酸受体过表达与目标蛋白表达相关，所测抗体效价与选择培养基的叶酸浓度成反比。
实施例6：用dhfr、野生型FolR和FolR A49L作为选择性标记物转染载体
此实施例中，测试不同选择条件并作比较。CHO细胞转染有载体 V-DHFRref、V-wtFRalpha和V-mutFRalpha(A49L突变体)。选择培养基中的极限浓度叶酸用于对宿主细胞产生选择压力，本文也称为叶酸去除。
细胞培养、转染和筛选用化学限定培养基内的悬浮生长CHO细胞在摇瓶中完成。细胞通过电穿孔(核转染)转染。对于基于叶酸去除的选择，细胞在转染前3天传代到无叶酸培养基，并在无叶酸培养基中转染以减少内部叶酸存贮。根据细胞活力，通过向细胞加入选择性培养基，在转染后24-48h开始选择。V-wtFRalpha和V-mutFRalpha转染细胞用6种不同叶酸浓度(11700,150, 50,5,0.5和0nM)选择，而在V-DHFRref转染细胞的情况下，测试6种不同 MTX浓度作为参照(2000,1000,500,250,125和0nM)。
细胞在选择后恢复到高于80％的活力后，分析存活细胞群产率。通过含 11.7μM叶酸的完全培养基中的过生长摇瓶的分批培养物分析选择后的所选细胞群产率。将分批培养物接种到工作容积为50ml的摇瓶(125)并在柜式摇床中以150rpm和10％CO2培养。试验开始时，细胞活力必须>90％。接种细胞密度是2x105c/ml。在第13天进行效价测定。培养开始后13天，通过蛋白 A HPLC测定细胞培养物上清中的抗体效价。
此实验结果如下所述。为评价2种叶酸受体变体在极限叶酸浓度下的选择严格性，测试范围为11700nM(参照培养基，完全培养基)-0nM的多种叶酸浓度以选择抗体过表达的细胞。平行地，用参照DHFR载体测试不同MTX浓度以比较性能。所有转染的细胞群都能恢复。0nM叶酸下的细胞群可能包含从预培养基遗留的一些叶酸痕迹。这些剩余叶酸量显然足以促进细胞亚群的存活。然而，需要后续加入含叶酸的培养基以恢复这些细胞群。产率如上所述评价。表12概括了产率结果。
表12：选择后的细胞群产率
Figure BDA0002675710410000591
表12显示在不同叶酸或MTX浓度选择的转染细胞的结果，该结果是通过在摇瓶分批培养物中分析的。培养第13天时，取培养基样品并通过蛋白A HPLC分析抗体含量。发现所有细胞群生成抗体。用V-wtFRalpha的情况下，在5nM叶酸时选择达到最大产率。该叶酸浓度低于上面实验观察到的浓度，且可能归因于此实施例中一些叶酸遗留自初始培养基。这还解释在0nM叶酸达到的恢复和生产率。用野生型叶酸受体时，进一步的叶酸减少未引起产率更高。相反，用V-mutFRalpha的情况下，选择中用最低叶酸浓度达到更高产率。用突变体获得的产率显著高于野生型叶酸受体获得的产率，且也显著高于用 DHFR/MTX获得的产率。
此外，分析选择期间的细胞恢复时，发现转染有V-mutFRalpha的细胞在极低叶酸浓度下恢复明显更快，尤其是<25nM。因此，上述更快恢复速度也在此试验中被证实。
上述实施例1-6证明用本发明教导所获得的优势，其中突变叶酸受体用于选择。例如，上述实施例中，参照群(DHFR)检测到28mg/l的抗体分泌， V-wtFRalpha转染细胞在最高存活选择严格性获得24mg/l且V-mutFRalpha转染细胞获得26.6mg/l。因此，各实验测定的生产率处于类似范围内，显示野生型叶酸受体α以及突变叶酸受体α作为选择性标记物获得与被视作“黄金标准”的已建立DHFR/MTX选择系统相当的结果。此外，比较选择所需时间段时，发现用如本发明所提供的基于突变叶酸受体的选择系统使明显更快的选择成为可能。甚至转染有V-wtFRalpha载体的细胞在15nM叶酸和25nM叶酸中需要的恢复期比相同浓度下的V-mutFRalpha转染细胞(16天)长，其显示20 天，相较参比对照(DHFR)具有明显优势，而参比对照(DHFR)在此时仍处于危机中。因此，与DHFR/MTX系统相比，用本发明所述叶酸受体变体能节约细胞系发育中选择期的时间，且也快于基于野生型的选择系统。结果还表明用突变叶酸受体为细胞提供在所测选择性培养基中相较使用野生型叶酸受体的优势，因为细胞在较大叶酸浓度窗口下存活且特别能在较低叶酸浓度下存活，从而允许更严格的选择条件。此外，用突变叶酸受体时选择危机的恢复显著早于转染有野生型叶酸受体的细胞的情形。结果显示如本文所述使用突变叶酸受体具有重要优势。
另外，实验还显示就突变叶酸受体而言的明显优势，所述实验中，针对叶酸受体和DHFR(作为选择性标记物)的双重选择用含极限浓度叶酸盐且额外含叶酸拮抗剂的选择培养基进行。叶酸受体突变显然在所述双重选择压力下对细胞生长产生积极作用。不受理论约束地，突变体中对叶酸拮抗剂如MTX的亲和性可能降低，以致纳入细胞的MTX更少。此外，为使细胞能在第一轮选择后恢复，发现重复选择并在2个选择周期之间将细胞转入完全培养基内是有利的。细胞再转入选择培养基后，富集整合2个载体到其基因组并因而能在双重选择压力下存活的细胞是可能的。发现产率相较完全培养基增加多至20-30 倍。这是显著优势。相较标准G418/MTX多步式选择后的参比对照，仍观察到 6-13倍的产率增加。因此，本发明所述选择系统相比现有技术中的选择系统具有明显优势，前者中突变叶酸受体与DHFR联用。另外，使用此双重选择策略，能挑出50％以上的效价高于300mg/l的高生产克隆。因此，搜索高生产克隆更为便捷，这是相比现有筛选技术尤其是用于工业蛋白生产目的的显著进步。
根据本发明用作选择标记物的突变叶酸受体非常有利，因为转染的细胞群在生长危机下的存活快于参照选择系统。此外，转染有突变叶酸受体的细胞群在不同选择性培养基中选择后，显示受体和抗体表达与叶酸浓度成反比。该相关性可以用基因组DNA(拷贝数)以及RNA水平的分子生物分析显示。另外，发现用DHFR/MTX共选择时，如本文所述使用突变叶酸受体非常有利。所用对照(单一转染FRwt、FRmut和DHFR)在叶酸去除与MTX严格组合的致命效果下无法存活。虽然一些共转染细胞群被挑除，但是此选择系统的高严格性也具有效果。然而，通过加入叶酸作为中间步骤并进行第二轮选择，用 FRmut/DHFR的双重选择原理时，通过共转染原则获得极佳结果。显示此方法允许更快和更便捷筛选最佳生产(最高)克隆。单细胞克隆最高生产细胞群(50 ml培养体积中的670mg/l)产生约50％的生成超过300mg/l的高生产细胞克隆恢复。相较单一转染和参照，克隆共转染群获得240mg/l的平均产率，产率增加40倍。在24孔批次中的最高生产细胞克隆达到450mg/l。这些结果证实本发明基于突变叶酸受体作为选择标记物，对现有选择系统有巨大贡献。
实施例7：转染含2种选择性标记物的表达载体
此实施例中，CHO细胞转染(核转染)有表达载体，所述载体包括含编码突变人叶酸受体α的多核苷酸的表达盒(A49L突变体-mutFRalpha，见上) 以及含编码DHFR的多核苷酸的表达盒(V-mutFRalpha/DHFRref)。因此，2 种选择性标记物mutFRalpha和DHFR在同一表达载体上。此外，表达载体包括含编码抗体轻链的多核苷酸的表达盒以及含编码抗体重链的多核苷酸的表达盒。在这个实验中，表达不同于先前实施例的抗体。测试用50nM叶酸(FA)和不同MTX浓度的5种不同选择条件。选择培养基如下表13所概括。选择后，所选细胞池转至完全培养基并在摇瓶分批培养物中生长。培养第13天，取培养基样品并通过蛋白A HPLC分析抗体含量。结果如表13所示。
表13：用不同选择条件通过表达载体V-mutFRalpha/DHFRref获得的产率
Figure BDA0002675710410000611
Figure BDA0002675710410000621
可以看出，用含突变叶酸受体和DHFR作为选择性标记物的表达载体 V-mutFRalpha/DHFRref时，低至5nM的MTX浓度提供显著选择优势。这证实了突变叶酸受体与DHFR联用于选择的优势，其也在其它实施例中显示。抗体产率显著增加，此外，考虑到MTX是毒剂，在选择期间使用更低浓度的 MTX是明显有利的。
实施例8：通过简化预处理亲代CHO细胞来转染
为测试是否能在过程中避免细胞离心/洗涤步骤，用含50nM极限浓度叶酸的培养基培养获自在完全培养基或有50nM叶酸的培养基中冷冻保存的细胞的亲代CHO细胞。在此培养基中数次传代后，用核转染方法和编码单克隆抗体的表达载体V-mutFRalpha/DHFRref转染细胞。此转染和后续培养用有50nM 叶酸的相同培养基完成。接着，转染后48小时，通过向培养物加入10nM MTX 来增加选择压力。从选择中恢复的培养物产率用完全培养基在摇瓶分批培养物中评价。结果示于表14。如表14所示，这种转染和选择过程的简化操作获得与先前实施例过程(如表13)差不多的产率。
表14：用不同选择条件通过表达载体V-mutFRalpha/DHFRref获得的细胞池产率
Figure BDA0002675710410000622
序列表
<110> 诺华股份有限公司（Novartis AG）
<120> 选择真核宿主细胞的选择载体和方法
<130> PAT055303-CN-PCTD
<150> US 61/860,439
<151> 2013-07-31
<160> 13
<170> PatentIn 3.5 版
<210> 1
<211> 205
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys
1 5 10 15
His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys
20 25 30
Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu
35 40 45
Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys
50 55 60
Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys
65 70 75 80
Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp
85 90 95
Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu
100 105 110
Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys
115 120 125
Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys
130 135 140
Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro
145 150 155 160
Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn
165 170 175
Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala
180 185 190
Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala
195 200 205
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala Ala Trp Pro Phe Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu Ser
20 25
<210> 3
<211> 257
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val
1 5 10 15
Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu
20 25 30
Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly
35 40 45
Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala
50 55 60
Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr
65 70 75 80
Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys
85 90 95
Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn
100 105 110
Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg
115 120 125
Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu
130 135 140
Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp
145 150 155 160
Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln
165 170 175
Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile
180 185 190
Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg
195 200 205
Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu
210 215 220
Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala
225 230 235 240
Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu
245 250 255
Ser
<210> 4
<211> 203
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met Asp Ala Lys His His
1 5 10 15
Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Asp Gln Cys Ser Pro
20 25 30
Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr Ser Gln Glu Leu His
35 40 45
Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp Asp His Cys Gly Lys
50 55 60
Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asn Gln Thr
85 90 95
Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys
100 105 110
Gln Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His Thr Cys Lys Ser Asn
115 120 125
Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val Asn Lys Cys Pro Ala
130 135 140
Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Pro Thr Pro Ala Ala
145 150 155 160
Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser
165 170 175
Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Ser Ala Gln Gly
180 185 190
Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala
195 200
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Ala Ala Met His Val Asn Ala Gly Glu Met Leu His Gly Thr Gly Gly
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Gln Leu Trp Leu Leu Gly
20 25 30
<210> 6
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Met Val Trp Lys Trp Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Val Cys Val Ala
1 5 10 15
Thr Met Cys Ser Ala Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met
20 25 30
Asp Ala Lys His His Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His
35 40 45
Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr
50 55 60
Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp
65 70 75 80
Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln
85 90 95
Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln
100 105 110
Gln Val Asn Gln Thr Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp Val Pro Leu
115 120 125
Cys Lys Glu Asp Cys Gln Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His
130 135 140
Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
Asn Lys Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe
165 170 175
Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys
180 185 190
Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe
195 200 205
Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala
210 215 220
Ala Ala Met His Val Asn Ala Gly Glu Met Leu His Gly Thr Gly Gly
225 230 235 240
Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Gln Leu Trp Leu Leu Gly
245 250 255
<210> 7
<211> 223
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
Gln Pro Arg Ser Ala Arg Ala Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met
1 5 10 15
Asn Ala Lys His His Lys Thr Gln Pro Ser Pro Glu Asp Glu Leu Tyr
20 25 30
Gly Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr
35 40 45
Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp
50 55 60
Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Thr Cys Lys Arg His Phe Ile Gln
65 70 75 80
Asp Ser Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Arg
85 90 95
Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asn Val Pro Leu
100 105 110
Cys Lys Glu Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr
115 120 125
Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Ile
130 135 140
Asn Glu Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Ser Thr Phe Glu Ser Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Phe Lys
165 170 175
Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe
180 185 190
Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Lys Phe Tyr Ala
195 200 205
Ala Ala Met Asn Ala Gly Ala Pro Ser Arg Gly Ile Ile Asp Ser
210 215 220
<210> 8
<211> 245
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Met Asp Met Ala Trp Gln Met Met Gln Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val
1 5 10 15
Thr Ala Ala Gly Ser Ala Gln Pro Arg Ser Ala Arg Ala Arg Thr Asp
20 25 30
Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Thr Gln Pro Ser
35 40 45
Pro Glu Asp Glu Leu Tyr Gly Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala
50 55 60
Cys Cys Thr Ala Ser Thr Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg
65 70 75 80
Leu Tyr Asn Phe Asn Trp Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Thr Cys
85 90 95
Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Ser Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn
100 105 110
Leu Gly Pro Trp Ile Arg Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg
115 120 125
Ile Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu
130 135 140
Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp
145 150 155 160
Asn Trp Thr Ser Gly Ile Asn Glu Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Ser
165 170 175
Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu
180 185 190
Trp Ser His Ser Phe Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg
195 200 205
Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu
210 215 220
Val Ala Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Met Asn Ala Gly Ala Pro Ser Arg
225 230 235 240
Gly Ile Ile Asp Ser
245
<210> 9
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟突变叶酸受体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> Xaa 是除 Ala之外的任意氨基酸
<400> 9
Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys
1 5 10 15
His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys
20 25 30
Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu
35 40 45
Xaa His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys
50 55 60
Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys
65 70 75 80
Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp
85 90 95
Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu
100 105 110
Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys
115 120 125
Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys
130 135 140
Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro
145 150 155 160
Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn
165 170 175
Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala
180 185 190
Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala
195 200 205
<210> 10
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val
1 5 10 15
Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg
20 25
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Met Val Trp Lys Trp Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Val Cys Val Ala
1 5 10 15
Thr Met Cys Ser Ala
20
<210> 12
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Met Asp Met Ala Trp Gln Met Met Gln Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val
1 5 10 15
Thr Ala Ala Gly Ser Ala
20
<210> 13
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变叶酸受体
<400> 13
Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys
1 5 10 15
His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys
20 25 30
Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu
35 40 45
Leu His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys
50 55 60
Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys
65 70 75 80
Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp
85 90 95
Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu
100 105 110
Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys
115 120 125
Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys
130 135 140
Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro
145 150 155 160
Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn
165 170 175
Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala
180 185 190
Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala
210 215 220
Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu Ser
225 230

Claims (26)

1.一种表达载体或至少2个表达载体的组合，所述载体包括：
a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的多核苷酸，其中所述突变叶酸受体是功能性膜结合叶酸受体，且所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少，所编码的突变叶酸受体衍生自哺乳动物的突变叶酸受体α且在结构上对应于或通过氨基酸序列同源性对应于SEQ ID NO:1所示成熟野生型人叶酸受体α序列的第49位氨基酸处包含氨基酸取代，其中存在于该野生型序列中的丙氨酸被氨基酸取代导致叶酸结合亲和力降低；
b)至少一种编码目标多肽的多核苷酸，
其中当向宿主细胞引入所述表达载体或至少2个表达载体的组合时，自所述宿主细胞分泌目标多肽。
2.如权利要求1所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，存在于所述野生型序列第49位处的丙氨酸被选自下组的氨基酸取代：亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和天冬氨酸。
3.如权利要求1所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，存在于所述野生型序列第49位处的丙氨酸被亮氨酸取代。
4.如权利要求1所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，所编码的突变叶酸受体：
a)是衍生自人的是突变叶酸受体α；或
b)是衍生自人的是突变叶酸受体α，其中在结构上对应于或通过氨基酸序列同源性对应于SEQ ID NO:1所示成熟野生型人叶酸受体α的第49位氨基酸处的丙氨酸被选自下组的氨基酸取代：亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和天冬氨酸。
5.如权利要求1所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，所编码的突变叶酸受体具有以下特征：
成熟的突变叶酸受体包括以下序列：
Figure FDA0002675710400000021
其中Xaa是选自下组的氨基酸：亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和天冬氨酸，或为亮氨酸。
6.如权利要求1所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，所编码的突变叶酸受体包括以下序列：
Figure FDA0002675710400000022
其中Xaa是亮氨酸。
7.如权利要求1-6中任一项所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其额外包括编码参与叶酸代谢的选择性标记物的多核苷酸。
8.如权利要求7所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，所述编码选择性标记物的多核苷酸编码二氢叶酸还原酶。
9.如权利要求7所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其包括：
a)含编码突变叶酸受体的多核苷酸的表达盒，其中所编码的突变叶酸受体包括在结构上对应于或通过氨基酸序列同源性对应于SEQ ID NO:1所示成熟野生型人叶酸受体α序列第49位氨基酸的位置处的丙氨酸被亮氨酸取代；
b)至少一个含编码目标多肽的多核苷酸的表达盒；和
c)含编码二氢叶酸还原酶作为选择性标记物的多核苷酸的表达盒。
10.如权利要求1-6中任一项所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其中所述突变叶酸受体相较野生型叶酸受体，对5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性降低；和/或，所述突变叶酸受体相较野生型叶酸受体对叶酸的结合亲和力降低。
11.如权利要求7所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其中所述突变叶酸受体相较野生型叶酸受体，对5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性降低；和/或，所述突变叶酸受体相较野生型叶酸受体对叶酸的结合亲和力降低。
12.活力取决于叶酸摄取的宿主细胞，包括
a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的引入多核苷酸，所述突变叶酸受体是功能性膜结合叶酸受体，且所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少，所编码的突变叶酸受体衍生自哺乳动物的突变叶酸受体α且在结构上对应于或通过氨基酸序列相同性对应于SEQ ID NO:1所示成熟野生型人叶酸受体α的第49位氨基酸处包含氨基酸取代，其中存在于该野生型序列中的丙氨酸被氨基酸取代从而导致叶酸结合亲和力降低；
和
b)至少一种编码目标多肽的引入多核苷酸
其中所述目标多肽分泌自活力取决于叶酸盐摄入的所述宿主细胞，且其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
13.如权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于，所述突变叶酸受体具有一种或多种如权利要求2-6和10中任一项所定义的特征。
14.如权利要求13所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞包括如权利要求1-11中任一项所定义的表达载体或至少2个表达载体的组合。
15.如权利要求12-14中任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞具有一种或多种以下特征：
a)表达内源叶酸受体；
b)包括引入的多核苷酸，所述多核苷酸编码参与叶酸代谢的选择性标记物；和/或
c)引入多核苷酸稳定整合入基因组内。
16.如权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是啮齿类动物细胞。
17.如权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
18.如权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括引入的多核苷酸，所述多核苷酸编码参与叶酸代谢的选择性标记物，所述选择性标记物为二氢叶酸还原酶。
19.生成如权利要求12-18中至少一项所述的宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括向活力取决于叶酸摄取的宿主细胞引入
a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的多核苷酸，所述突变叶酸受体是功能性膜结合叶酸受体，且所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少，所编码的突变叶酸受体衍生自哺乳动物的突变叶酸受体α且在结构上对应于或通过氨基酸序列同源性对应于SEQ ID NO:1所示成熟野生型人叶酸受体α的第49位氨基酸处包含氨基酸取代，其中存在于该野生型序列中的丙氨酸被氨基酸取代从而导致叶酸结合亲和力降低；
和
b)至少一种编码目标多肽的多核苷酸，其中自所述宿主细胞分泌目标多肽。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，如权利要求1-11中一或多项所述的表达载体或至少2个表达载体的组合被引入宿主细胞，和/或所述突变叶酸受体具有权利要求2-6和10中任一项所定义的一个或多个特征。
21.一种选择至少一个能以所需产率表达目标多肽的宿主细胞的方法，包括
a)提供多个如权利要求12-18中一或多项所述的宿主细胞；
b)在含极限浓度叶酸盐的选择性培养基中培养所述多个宿主细胞，所述浓度为2000nM或更低；
和
c)获得至少一个表达目标多肽的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述方法具有一种或多种以下特征：
i)进行一个或多个包括步骤b)和c)的选择周期；
ii)步骤c)后，在含非极限浓度叶酸盐的培养基中培养细胞，随后再次根据步骤b)培养并根据步骤c)获得；
iii)在实施步骤b)和/或c)之前和/或之后进行一个或多个额外选择步骤，其中所述一个或多个额外选择步骤选自基于流式细胞术的选择和针对引入宿主细胞的一或多个额外选择性标记物的选择；
iv)宿主细胞稳定转染；和/或
v)所选宿主细胞重组表达且分泌免疫球蛋白分子。
23.一种生成目标多肽的方法，包括
a)在允许目标多肽表达和分泌的条件下培养如权利要求12-18中至少一项所述的宿主细胞和/或如权利要求21或22选定的宿主细胞；以及
b)从细胞培养基中分离目标多肽。
24.如权利要求23所述的方法，其还包括加工分离的目标多肽。
25.多核苷酸用于选择活力取决于叶酸摄取的细胞的应用，所述多核苷酸编码以下作为选择性标记物：
a)突变叶酸受体，包括以下序列
Figure FDA0002675710400000051
其中Xaa不是丙氨酸且其中所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较其中Xaa是丙氨酸的SEQ ID NO：1所示对应野生型叶酸受体减少，其中Xaa是选自下组的氨基酸：亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和天冬氨酸；
或
b)突变叶酸受体，所含氨基酸序列与SEQ ID NO 9所示序列有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，且其中所述突变叶酸受体内的Xaa不是丙氨酸，其中Xaa是选自下组的氨基酸：亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和天冬氨酸，且其中所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较其中Xaa是丙氨酸的SEQ ID NO：1所示成熟野生型人叶酸受体α序列减少。
26.多核苷酸用于选择活力取决于叶酸摄取的细胞的应用，所述多核苷酸编码以下作为选择性标记物：
a)突变叶酸受体，包括以下序列
Figure FDA0002675710400000052
其中Xaa是亮氨酸；
或
b)突变叶酸受体，所含氨基酸序列与SEQ ID NO：9所示序列有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，且其中根据b)的所述突变叶酸受体内的Xaa是亮氨酸。
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