RU2016106270A - Новые селективные векторы и способы селекции эукариотических клеток-хозяев - Google Patents

Новые селективные векторы и способы селекции эукариотических клеток-хозяев Download PDF

Info

Publication number
RU2016106270A
RU2016106270A RU2016106270A RU2016106270A RU2016106270A RU 2016106270 A RU2016106270 A RU 2016106270A RU 2016106270 A RU2016106270 A RU 2016106270A RU 2016106270 A RU2016106270 A RU 2016106270A RU 2016106270 A RU2016106270 A RU 2016106270A
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
folate receptor
amino acid
sequence
leucine
seq
Prior art date
Application number
RU2016106270A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2016106270A3 (ru
RU2716977C2 (ru
Inventor
Йехуда Дж. АССАРАФ
Томас ДЖОСТОК
Ханс-Петер КНОПФ
Original Assignee
Новартис Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Новартис Аг filed Critical Новартис Аг
Publication of RU2016106270A publication Critical patent/RU2016106270A/ru
Publication of RU2016106270A3 publication Critical patent/RU2016106270A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2716977C2 publication Critical patent/RU2716977C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Claims (100)

1. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов, содержащие:
a) полинуклеотид, кодирующий мутантный фолатный рецептор в качестве селективного маркера, при этом мутантный фолатный рецептор имеет сниженную аффинность связывания фолата по сравнению с фолатным рецептором дикого типа, и
b) по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид,
при этом когда указанный экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов вводят в клетку-хозяина, интересующий полипептид секретируется из указанной клетки-хозяина.
2. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, отличающиеся тем, что закодированный мутантный фолатный рецептор имеет по меньшей мере одну мутацию в кармане связывания фолата, которая приводит к снижению аффинности связывания фолата по сравнению с фолатным рецептором дикого типа.
3. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, отличающиеся тем, что закодированный мутантный фолатный рецептор представляет собой мутантный фолатный рецептор альфа.
4. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 3, имеющие одну или более из следующих характеристик:
a) закодированный мутантный фолатный рецептор содержит аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аминокислотная последовательность мутантного фолатного рецептора имеет по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к снижению аффинности связывания фолата по сравнению со зрелым человеческим фолатным рецептором альфа дикого типа (SEQ ID NO 1);
b) мутантный фолатный рецептор имеет по меньшей мере одну замену в аминокислотном положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислотному положению, выбранному из положений 49, 104 и 166 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора дикого типа; и/или
c) мутантный фолатный рецептор имеет замену в аминокислотном положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1).
5. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, отличающиеся тем, что мутантный фолатный рецептор имеет сниженную аффинность связывания для 6S диастереоизомера 5-метилтетрагидрофолата по сравнению с фолатным рецептором дикого типа и/или мутантный фолатный рецептор имеет сниженную аффинность связывания для фолиевой кислоты по сравнению с фолатным рецептором дикого типа.
6. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 4 c), отличающиеся тем, что закодированный мутантный фолатный рецептор имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа, заменен аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа в положении 49, заменен лейцином.
7. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, отличающиеся тем, что закодированный мутантный фолатный рецептор имеет следующие характеристики:
a) зрелый мутантный фолатный рецептор содержит следующую последовательность
IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA (SEQ ID NO 9)
где Xaa не является аланином и где, необязательно, Xaa является аминокислотой, выбранной из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или является лейцином;
или
b) зрелый мутантный фолатный рецептор содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 9, и при этом Xaa не является аланином в указанном мутантном фолатном рецепторе, при этом аффинность связывания фолата у указанного мутантного фолатного рецептора снижена по сравнению с последовательностью зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа, где Xaa является аланином (смотри SEQ ID NO 1), и при этом, необязательно, Xaa является аминокислотой, выбранной из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или является лейцином.
8. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, отличающиеся тем, что закодированный мутантный фолатный рецептор имеет следующие характеристики:
a) он содержит последовательность
IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS (SEQ ID NO 13)
где Xaa является лейцином;
или
b) он содержит аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 13, где Xaa является лейцином, и при этом аффинность связывания указанного мутантного фолатного рецептора для 6S диастереоизомера 5-метилтетрагидрофолата снижена по сравнению с последовательностью зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа, где Xaa является аланином (смотри SEQ ID NO 1).
9. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, которые дополнительно содержат полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, участвующий в метаболизме фолата, при этом, необязательно, полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, кодирует дигидрофолатредуктазу.
10. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, содержащие:
a) экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий мутантный фолатный рецептор, при этом закодированный мутантный фолатный рецептор имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа в указанном положении, заменен лейцином;
b) по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид; и
c) экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий дигидрофолатредуктазу в качестве селективного маркера.
11. Клетка-хозяин, жизнеспособность которой зависит от поглощения фолатов, содержащая
a) введенный полинуклеотид, кодирующий мутантный фолатный рецептор, имеющий сниженную аффинность связывания фолата по сравнению с фолатным рецептором дикого типа, в качестве селективного маркера,
и
b) по меньшей мере один введенный полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид,
при этом указанный интересующий полипептид секретируется из указанной клетки-хозяина.
12. Клетка-хозяин по п. 11, отличающаяся тем, что мутантный фолатный рецептор имеет одну или более из следующих характеристик:
a) он имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа, заменен аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа в положении 49, заменен лейцином;
b) зрелый мутантный фолатный рецептор содержит:
(i) следующую последовательность
IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA (SEQ ID NO 9)
где Xaa не является аланином и где, необязательно, Xaa является аминокислотой, выбранной из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или является лейцином;
или
(ii) зрелый мутантный фолатный рецептор содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 9, и при этом Xaa не является аланином в указанном мутантном фолатном рецепторе, при этом аффинность связывания фолата у указанного мутантного фолатного рецептора снижена по сравнению с последовательностью зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа, где Xaa является аланином (смотри SEQ ID NO 1), и при этом, необязательно, Xaa является аминокислотой, выбранной из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или является лейцином.
c) он содержит:
(i) последовательность
IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS (SEQ ID NO 13)
где Xaa является лейцином;
или
(ii) аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 13, где Xaa является лейцином, и при этом аффинность связывания указанного мутантного фолатного рецептора для 6S диастереоизомера 5-метилтетрагидрофолата снижена по сравнению с последовательностью зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа, где Xaa является аланином (смотри SEQ ID NO 1).
13. Клетка-хозяин по п. 12, содержащая экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов, содержащие:
a) экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий мутантный фолатный рецептор, при этом закодированный мутантный фолатный рецептор имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа в указанном положении, заменен лейцином;
b) по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид; и
c) экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий дигидрофолатредуктазу в качестве селективного маркера.
14. Клетка-хозяин по п. 11, имеющая одну или более из следующих характеристик:
a) она представляет собой клетку млекопитающего;
b) она представляет собой клетку грызуна;
c) она представляет собой клетку CHO;
d) она экспрессирует эндогенный фолатный рецептор;
e) она содержит введенный полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, участвующий в метаболизме фолата, который, необязательно, представляет собой дигидрофолатредуктазу; и/или
f) введенные полинуклеотиды стабильно интегрированы в геном.
15. Способ селекции по меньшей мере одной клетки-хозяина, способной экспрессировать интересующий полипептид с желаемым выходом, включающий
a) получение множества клеток-хозяев по п. 11;
b) культивирование указанного множества клеток-хозяев в селективной культуральной среде, содержащей фолат в ограниченной концентрации;
и
c) получение по меньшей мере одной клетки-хозяина, экспрессирующей интересующий полипептид.
16. Способ по п. 15, имеющий одну или более из следующих характеристик:
i) выполняют один или более циклов селекции, включающих этапы b) и c);
ii) после этапа c) клетки культивируют в культуральной среде, содержащей не ограниченную концентрацию фолата, а затем вновь культивируют в соответствии с этапом b) и получают в соответствии с этапом c);
iii) выполняют один или более дополнительных этапов селекции до и/или после выполнения этапа b) и/или c), при этом указанные один или более дополнительных этапов селекции выбирают из селекции на основе метода проточной цитометрии и селекции на один или более дополнительных селективных маркеров, введенных в клетку-хозяина;
iv) клетки-хозяева стабильно трансфицированы; и/или
v) выбранные клетки-хозяева рекомбинантно экспрессируют и секретируют молекулу иммуноглобулина.
17. Способ получения интересующего полипептида, включающий
a) культивирование клетки-хозяина по п. 11 в условиях, допускающих экспрессию и секрецию интересующего полипептида;
b) выделение интересующего полипептида из среды для культивирования клеток, и
c) необязательно, обработку выделенного интересующего полипептида.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что клетка-хозяин содержит введенный полинуклеотид, кодирующий мутантный фолатный рецептор, имеющий сниженную аффинность связывания фолата по сравнению с фолатным рецептором дикого типа, в качестве селективного маркера,
при этом указанный мутантный фолатный рецептор имеет одну или более из следующих характеристик:
a) он имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа, заменен аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа в положении 49, заменен лейцином;
b) зрелый мутантный фолатный рецептор содержит:
(i) следующую последовательность
IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA (SEQ ID NO 9)
где Xaa не является аланином и где, необязательно, Xaa является аминокислотой, выбранной из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или является лейцином;
или
(ii) зрелый мутантный фолатный рецептор содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 9, и при этом Xaa не является аланином в указанном мутантном фолатном рецепторе, при этом аффинность связывания фолата у указанного мутантного фолатного рецептора снижена по сравнению с последовательностью зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа, где Xaa является аланином (смотри SEQ ID NO 1), и при этом, необязательно, Xaa является аминокислотой, выбранной из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или является лейцином.
c) он содержит:
(i) последовательность
IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS (SEQ ID NO 13)
где Xaa является лейцином;
или
(ii) аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 13, где Xaa является лейцином, и при этом аффинность связывания указанного мутантного фолатного рецептора для 6S диастереоизомера 5-метилтетрагидрофолата снижена по сравнению с последовательностью зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа, где Xaa является аланином (смотри SEQ ID NO 1).
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что клетка-хозяин содержит экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов, содержащие:
a) экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий мутантный фолатный рецептор, при этом закодированный мутантный фолатный рецептор имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа в указанном положении, заменен лейцином;
b) по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид; и
c) экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий дигидрофолатредуктазу в качестве селективного маркера.
20. Способ по п. 17, отличающийся тем, что клетка-хозяин имеет одну или более из следующих характеристик:
a) она представляет собой клетку млекопитающего;
b) она представляет собой клетку грызуна;
c) она представляет собой клетку CHO;
d) она экспрессирует эндогенный фолатный рецептор;
e) она содержит введенный полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, участвующий в метаболизме фолата, который, необязательно, представляет собой дигидрофолатредуктазу; и/или
f) введенные полинуклеотиды стабильно интегрированы в геном.
RU2016106270A 2013-07-31 2014-07-29 Новые селективные векторы и способы селекции эукариотических клеток-хозяев RU2716977C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361860439P 2013-07-31 2013-07-31
US61/860,439 2013-07-31
PCT/IB2014/063517 WO2015015419A1 (en) 2013-07-31 2014-07-29 Novel selection vectors and methods of selecting eukaryotic host cells

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2016106270A true RU2016106270A (ru) 2017-08-31
RU2016106270A3 RU2016106270A3 (ru) 2018-04-27
RU2716977C2 RU2716977C2 (ru) 2020-03-17

Family

ID=51383909

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016106270A RU2716977C2 (ru) 2013-07-31 2014-07-29 Новые селективные векторы и способы селекции эукариотических клеток-хозяев

Country Status (19)

Country Link
US (1) US11807855B2 (ru)
EP (3) EP3412684B1 (ru)
JP (1) JP6576924B2 (ru)
KR (1) KR102288233B1 (ru)
CN (2) CN112029791A (ru)
AU (1) AU2014297966B2 (ru)
BR (1) BR112016001182A2 (ru)
CA (1) CA2918117C (ru)
DK (2) DK3412684T3 (ru)
ES (2) ES2920510T3 (ru)
HU (1) HUE058885T2 (ru)
IL (1) IL243352B (ru)
LT (2) LT3412684T (ru)
MX (1) MX369109B (ru)
PL (2) PL3412684T3 (ru)
PT (2) PT3412684T (ru)
RU (1) RU2716977C2 (ru)
SG (1) SG11201510625TA (ru)
WO (1) WO2015015419A1 (ru)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5801207B2 (ja) 2009-02-27 2015-10-28 ノバルティス アーゲー ２種類の選択マーカーを含む発現ベクター系
LT3412684T (lt) 2013-07-31 2022-07-11 Novartis Ag Nauji atrankos vektoriai ir eukariotinių ląstelių šeimininkių atrankos metodai
EP3521435A1 (en) 2018-02-06 2019-08-07 Bayer AG A high stringency selection system for protein expression in proline-auxotrophic cells
US20210356377A1 (en) * 2018-09-07 2021-11-18 Medimmune, Llc Methods Of Cell Selection
KR20220064983A (ko) 2019-09-18 2022-05-19 노파르티스 아게 Nkg2d 융합 단백질 및 이의 용도
EP4247857A1 (en) 2020-11-23 2023-09-27 Novartis AG Expression technology for antibody constructs
WO2022229854A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 Novartis Ag Hypersialylating cells
WO2023122567A1 (en) * 2021-12-21 2023-06-29 Absci Corporation Fola selection assay to identify strains with increased soluble target protein expression

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4771036A (en) 1986-02-10 1988-09-13 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method and ophthalmic composition for the prevention and reversal of cataracts
JP2585532B2 (ja) 1986-05-10 1997-02-26 三井東圧化学株式会社 動物細胞の形質転換体及びそれを得る方法並びにその形質転換体を用いてｔ−ＰＡを生産する方法
DE69128037T2 (de) 1990-11-13 1998-05-07 Immunex Corp Bifunktionelle wählbare fusionsgene
ATE199023T1 (de) 1991-03-29 2001-02-15 Genentech Inc Methoden zur selektion von rekombinanten wirtszellen welche hohe mengen von einem gewünschten protein exprimieren
AU6953394A (en) 1993-05-21 1994-12-20 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
US5439808A (en) 1993-07-23 1995-08-08 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis
US5830698A (en) 1997-03-14 1998-11-03 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
US6106825A (en) 1997-05-07 2000-08-22 University Of Florida Entomopoxvirus-vertebrate gene delivery vector and method
FR2784030B1 (fr) 1998-10-02 2002-12-20 Inst Nat Sante Rech Med Utilisation de bloqueurs des canaux calciques et/ou cgmp-dependants pour le traitement de pathologies de la retine
FR2823221B1 (fr) 2001-04-06 2004-04-02 Univ Pasteur Sequences associees a la degenerescence retinienne et applications
DE10256083A1 (de) 2002-11-29 2004-08-12 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung von heterologen Genprodukten und Selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante Zellen
US7384744B2 (en) 2002-11-29 2008-06-10 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products
BRPI0408246A (pt) * 2003-03-11 2006-03-01 Applied Research Systems vetores de expressão que compreendem o promotor ie2 do mcmv
EP1716233B1 (en) 2004-01-30 2009-08-26 Maxygen Holdings Ltd. Regulated stop codon readthrough
WO2007096399A2 (en) 2006-02-21 2007-08-30 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US20060275794A1 (en) 2005-03-07 2006-12-07 Invitrogen Corporation Collections of matched biological reagents and methods for identifying matched reagents
JP4870208B2 (ja) 2006-05-17 2012-02-08 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー ポリペプチド産生細胞
ES2585502T3 (es) 2007-12-21 2016-10-06 Novartis Ag Vector de expresión en mamíferos
AU2008340017B2 (en) * 2007-12-21 2012-04-05 Novartis Ag Organic compounds
JP5788796B2 (ja) 2008-08-28 2015-10-07 ノバルティス アーゲー 終止コドンのリードスルーによるポリペプチドアイソフォームの細胞表面提示
JP5748223B2 (ja) 2008-09-10 2015-07-15 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ニューロン生存因子およびその使用
JP5801207B2 (ja) 2009-02-27 2015-10-28 ノバルティス アーゲー ２種類の選択マーカーを含む発現ベクター系
DK2401383T3 (da) 2009-02-27 2013-12-16 Novartis Ag Fremgangsmåder til udvælgelse af eukaryote celler, som udtrykker et heterologt protein
CN102030754B (zh) * 2009-09-28 2013-07-10 中国科学院微生物研究所 非病毒载体及其制备方法与应用
LT3412684T (lt) 2013-07-31 2022-07-11 Novartis Ag Nauji atrankos vektoriai ir eukariotinių ląstelių šeimininkių atrankos metodai

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016525366A (ja) 2016-08-25
EP4095153A1 (en) 2022-11-30
CN112029791A (zh) 2020-12-04
DK3412684T3 (da) 2022-07-04
JP6576924B2 (ja) 2019-09-18
EP3027646A1 (en) 2016-06-08
CN105593239B (zh) 2020-10-16
PT3027646T (pt) 2018-10-16
CA2918117C (en) 2023-01-24
MX369109B (es) 2019-10-29
ES2920510T3 (es) 2022-08-04
PL3027646T3 (pl) 2019-03-29
CN105593239A (zh) 2016-05-18
LT3412684T (lt) 2022-07-11
LT3027646T (lt) 2018-09-25
EP3027646B1 (en) 2018-06-27
BR112016001182A2 (pt) 2017-08-29
MX2016001396A (es) 2016-05-05
RU2016106270A3 (ru) 2018-04-27
AU2014297966A1 (en) 2016-01-28
DK3027646T3 (en) 2018-09-24
WO2015015419A1 (en) 2015-02-05
SG11201510625TA (en) 2016-02-26
AU2014297966B2 (en) 2017-10-26
EP3412684B1 (en) 2022-04-06
IL243352A0 (en) 2016-03-31
IL243352B (en) 2018-06-28
ES2689136T3 (es) 2018-11-08
CA2918117A1 (en) 2015-02-05
KR20160030524A (ko) 2016-03-18
RU2716977C2 (ru) 2020-03-17
US20160177318A1 (en) 2016-06-23
KR102288233B1 (ko) 2021-08-10
PT3412684T (pt) 2022-06-27
US11807855B2 (en) 2023-11-07
HUE058885T2 (hu) 2022-09-28
PL3412684T3 (pl) 2022-08-08
EP3412684A1 (en) 2018-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2016106270A (ru) Новые селективные векторы и способы селекции эукариотических клеток-хозяев
JP2016525366A5 (ru)
HRP20190970T1 (hr) Polipeptidi koji sadrže neglikozilirani fc
RU2016144409A (ru) Снижение превращения никотина в норникотин в растениях
JP2013530689A5 (ru)
RU2007141683A (ru) Вариантная форма урат-оксидазы и ее использование
FI3536797T3 (fi) Siirtogeenin tehostettu ilmentäminen ja prosessointi
GB201201178D0 (en) Novel enzymes
MX2013013644A (es) Peptidos de transito al cloroplasto y metodos de uso.
WO2006007373A3 (en) Polynucleotides encoding mature ahasl proteins for creating imidazolinone-tolerant plants
RU2010108308A (ru) Способ получения гетерогенных белков
RU2016123135A (ru) Отличные от человека животные, содержащие гуманизированный ген индуцирующего пролиферацию лиганда
RU2011142793A (ru) Полученная из микроорганизма протеаза усовершенствованного типа, обеспечивающая свертывание молока
RU2014145441A (ru) Векторы
EP2589658A4 (en) PARTICLE POLYPEPTIDE OF THE REIC / DKK-3 PROTEIN
PH12017502080A1 (en) Epidermal growth factor receptor variant iii-mesothelin fusions and methods of using the same
RU2014144881A (ru) Способ экспрессии полипептидов с применением модифицированных нуклеиновых кислот
JP2020509755A5 (ru)
RU2015105052A (ru) Выделение мутантов белка доставки лекарственного средства, усиливающих направленную миграцию
RU2014129220A (ru) Новый аттенуированный полиовирус: pv-1 mono-cre-x
JP2017525368A5 (ru)
WO2015077538A8 (en) Nucleotide sequence encoding homeobox-leucine zipper protein hat22 (hd-zip protein 22) from corchorus olitorius and corchorus capsularis and methods of use
CN105418740A (zh) 菠萝功能着丝粒抗原多肽及其应用
JP2016158578A5 (ru)
JP2009513150A5 (ru)