ES2689136T3

ES2689136T3 - Nuevos vectores de selección y métodos de selección de células hospedadoras eucariotas

Info

Publication number: ES2689136T3
Application number: ES14753158.6T
Authority: ES
Inventors: Yehuda G. Assaraf; Thomas Jostock; Hans-Peter Knopf
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2018-11-08
Anticipated expiration: 2034-07-29
Also published as: CN105593239B; CN105593239A; LT3412684T; CA2918117A1; EP4095153A1; JP6576924B2; IL243352A0; US11807855B2; MX369109B; PL3027646T3; KR102288233B1; EP3027646A1; EP3412684B1; US20160177318A1; JP2016525366A; WO2015015419A1; DK3027646T3; RU2016106270A; CN112029791A; DK3412684T3

Abstract

Un vector de expresión o una combinación de al menos dos vectores de expresión que comprende: a) un polinucleótido que codifica un receptor de folato mutado como marcador seleccionable, en el que el receptor de folato mutado es un receptor de folato unido a membrana funcional que tiene una disminución de la afinidad de unión al folato en comparación con el receptor de folato de tipo silvestre, en el que el receptor de folato mutado codificado es un receptor de folato mutado alfa que comprende una sustitución de alanina a leucina en la posición estructuralmente correspondiente o por homología de la secuencia de aminoácidos al aminoácido 49 de la secuencia del receptor de folato humano alfa de tipo silvestre maduro mostrada como SEQ ID NO: 1; y b) al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, en el que, cuando dicho vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión se introduce en una célula hospedadora, el polipéptido de interés es secretado por dicha célula hospedadora.

Description

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seleccionable. Cuanto menor sea la concentración de folato en el medio de selección, mayor es la productividad resultante de las células seleccionadas. No se observa una dependencia respectiva de la misma manera cuando se usa el receptor de folato de tipo silvestre como marcador seleccionable. Esta dependencia lineal con la dosis facilita un control más fiable y la optimización de las condiciones de selección. Este hallazgo también fue completamente inesperado.

Por lo tanto, la selección novedosa basada en folato descrita en el presente documento que se basa en el uso de un receptor de folato mutado como marcador seleccionable que se ha comparado con el correspondiente receptor de folato de tipo silvestre en la que la afinidad de unión disminuida de folato es una excelente estrategia que está bien adaptada para la selección acelerada de células estables que expresan un polipéptido recombinante de interés con alto rendimiento. Los resultados beneficiosos descritos en el presente documento pueden lograrse a bajas concentraciones de folato en el medio de cultivo celular, e incluso en ausencia de una selección de fármaco citotóxico como se usa rutinariamente en otros diversos sistemas de selección.

Vector de expresión y combinación de vectores de expresión

De acuerdo con un primer aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de expresión o una combinación de al menos dos vectores de expresión que comprenden:

a) un polinucleótido que codifica un receptor de folato mutado como marcador seleccionable, en el que el receptor de folato mutado tiene una disminución de la afinidad de unión al folato en comparación con el receptor de folato de tipo silvestre; y

b) al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés,

en el que cuando dicho vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión se introduce en una célula hospedadora, el polipéptido de interés es secretado por dicha célula hospedadora.

Un "vector" de acuerdo con la presente divulgación, en particular, se refiere a un polinucleótido capaz de transportar al menos un fragmento de polinucleótido. Un vector funciona como un vehículo molecular que entrega polinucleótidos en una célula hospedadora. Un vector de expresión puede comprender al menos un casete de expresión que comprenda secuencias reguladoras para la expresión adecuada de un polinucleótido incorporado en el mismo. Los polinucleótidos (por ejemplo, que codifican el polipéptido de interés o un marcador seleccionable) que se introducirán en la célula se pueden insertar en el/los casete/s de expresión del vector con el fin de ser expresados a partir del mismo. Cuando se introduce en una célula hospedadora, un casete de expresión, entre otras cosas, es capaz de dirigir la maquinaria celular para transcribir un polinucleótido incorporado que codifica un polipéptido de interés en ARN, que es entonces, por lo general, procesado adicionalmente, y finalmente traducido en el polipéptido de interés. El vector puede estar presente en forma circular o lineal(izada). El término "vector" también comprende cromosomas artificiales, vectores víricos o polinucleótidos respectivos similares que permitan la transferencia de fragmentos de ácido nucleico foráneo.

Un “polinucleótido” es un polímero de nucleótidos los cuales son usualmente ligados de una desoxirribosa o ribosa a otra, y se refiere a ADN, así como a ARN, dependiendo del contexto. El término "polinucleótido" no comprende ninguna restricción de tamaño.

Posteriormente, se describen realizaciones del vector de expresión y la combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con la presente divulgación. El polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado y el polinucleótido que codifica un polipéptido de interés pueden estar ubicados en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión separados si se usa una combinación de al menos dos vectores de expresión. Si se usa una combinación de al menos dos vectores de expresión, en la que un vector de expresión comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido de interés y el otro vector de expresión comprende el polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado, dicha combinación es cotransfectada en las mismas células hospedadoras para permitir la selección. Respectivas estrategias de cotransfección son bien conocidas por el experto y también se describen en los ejemplos. Posteriormente, se describen realizaciones y ventajas específicas predominantemente en conjunción con la realización en la que ambos polinucleótidos se encuentran en el mismo vector de expresión. Sin embargo, dicha divulgación mutatis mutandis que aplica a la realización, en la que se usa una combinación de al menos dos vectores de expresión que son cotransfectados en las células. Cuando sea apropiado, se describen ventajas asociadas con el vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión en conjunción con el uso de dicho/s vector/es de expresión para la selección de células hospedadoras que expresan el polipéptido de interés con alto rendimiento.

Receptor de folato mutado

Un "receptor de folato", como se usa en el presente documento, se refiere a un receptor que es funcional y, por lo

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tanto, capaz de importar o absorber un folato o derivado del mismo en una célula eucariota, en particular, una célula de mamífero. Preferentemente, el receptor de folato es capaz de la importación o absorción unidireccional de folato

: o derivado del mismo en una célula hospedadora eucariota, en particular, una célula de mamífero. Además, un receptor de folato como se usa en el presente documento está unido a membrana. Por lo tanto, los receptores de folato descritos en el presente documento son receptores de folato funcionales unidos a membrana. Esto se aplica al receptor de folato mutado, así como al receptor de folato de tipo silvestre. El anclaje a la membrana puede lograrse, por ejemplo, mediante un anclaje de transmembrana o un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Se prefiere un anclaje GPI, ya que se corresponde con el entorno natural de un receptor de folato. Los receptores de folato (FR) son glicoproteínas de unión a folato de alta afinidad. Están codificados por tres genes distintos FR alfa, FR beta y FR gamma. FR alfa también se conoce como la Proteína de Unión a Folato Adulta o FDP, como Receptor de Folato 1 o FOLR (en ratones folbp1), y como Antígeno Asociado a Cáncer de Ovario. FR beta también se conoce como FOLR2 (fetal) y como FBP / PL-1 (placenta). FR gamma también se conoce como FOLR3 y como FR-G (revisado por M. D Salazar y M. Ratnam, Cancer Metastasis Rev. 2007 26(1), pág.141-152). Los FR maduros, que están bien caracterizados, son proteínas homólogas con ~70-80 % de identidad de aminoácidos, y contienen 229 a 236 aminoácidos, así como de dos a tres sitios de N-glicosilación. FR alfa y beta FR son proteínas unidas a membrana. FR alfa y FR beta son glicoproteínas de superficie celular ancladas a GPI, mientras que FR gamma carece de un anclaje de GPI y es una proteína secretada. Sin embargo, se puede alterar genéticamente para incluir un dominio de transmembrana o un anclaje GPI. Dicha forma alterada de un FR gamma que incluye un anclaje a membrana también se considera como receptor de folato de tipo silvestre si es capaz de la importación o absorción de un folato

: o derivado del mismo en una célula eucariota tal como se ha descrito anteriormente. FR alfa y FR beta muestran una alta afinidad por el ácido fólico (Kd = 0,1-1 nM), ácido 5,10-didesazatetrahidrofólico (DDATHF; lometrexol; Ki = 0,4 a 1,3 nM usando ácido fólico[3H] como un substrato) y BGC945 (que es un inhibidor de la timidilato sintasa basado en ciclopenta[g]quinazolina transportado específicamente únicamente a través de FR alfa y no a través del vehículo de folato reducido) (Kd = 1 nM), pero una afinidad mucho menor para MTX (Kd> 100 nM). La absorción del folato y antifolatos dependiente de FR procede a través de un mecanismo clásico de la endocitosis mediada por el receptor.

Un "receptor de folato mutado que tiene una disminución de la afinidad de unión al folato en comparación con el receptor de folato de tipo silvestre" o expresiones similares usadas en el presente documento, en particular, se refieren a un receptor de folato mutado que comparado con el receptor de folato de tipo silvestre correspondiente tiene una afinidad de unión reducida con al menos una folato seleccionado de entre el grupo de folatos reducidos y folatos oxidados. Dicha expresión, en particular, se refiere a los receptores de folato mutados que tienen en comparación con el correspondiente receptor de folato de tipo silvestre una disminución de la afinidad de unión al folato a un folato específico. La afinidad de unión al folato a otros folatos, es decir, folatos diferentes de dicho ácido folato específico, puede ser alterada. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado que tiene una afinidad de unión al folato disminuida comprende al menos una mutación que en comparación con el correspondiente receptor de tipo silvestre, disminuye la afinidad de unión a al menos un folato seleccionado entre el grupo de folatos reducidos y folatos oxidados. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado muestra en comparación con el correspondiente receptor de folato de tipo silvestre una afinidad de unión disminuida a un folato reducido. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado muestra en comparación con el correspondiente receptor de folato de tipo silvestre, una afinidad de unión reducida con el diastereoisómero 6S de 5metiltetrahidrofolato. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado tiene un valor CI50 para un folato reducido, de preferencia al diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato, que es al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces o por lo menos 55 veces mayor que el valor CI50 del receptor de folato de tipo silvestre correspondiente. Debido al valor de CI50 significativamente mayor, tiene una afinidad de unión significativamente reducida con dicho folato reducido en comparación con el receptor de folato de tipo silvestre. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado muestra una unión reducida a ácido fólico.

La al menos una mutación que resulta en una disminución de la afinidad de unión al folato puede ser, por ejemplo, una sustitución, eliminación o inserción de aminoácidos. De acuerdo con una realización, la al menos una mutación está presente en el bolsillo de unión de folato putativo. De acuerdo con una realización, dicha mutación es una sustitución en el bolsillo de unión de folato putativo.

El receptor de folato mutado que se usa de acuerdo con la presente divulgación como marcador seleccionable tiene una afinidad de unión a folato disminuida en comparación con el correspondiente receptor de folato de tipo silvestre. Como se ha descrito anteriormente y como se muestra por los ejemplos, es ventajoso usar un receptor de folato mutado que tenga en comparación con el correspondiente receptor de folato de tipo silvestre al menos una afinidad de unión reducida con el diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato. Una disminución de la afinidad de unión al folato puede lograrse mediante la introducción de una o más mutaciones en la secuencia de tipo silvestre. Los ejemplos adecuados se describen a continuación. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que debido a la afinidad de unión al folato reducida, las células transfectadas con el/los vector/es de expresión de acuerdo con la presente divulgación necesitan expresar más del receptor de folato mutado para lograr una tasa de absorción del folato suficiente con el fin de sobrevivir bajo condiciones selectivas de privación de folato. Por lo tanto, también el polipéptido de interés se expresa a un nivel superior por la población superviviente. Como se muestra en los ejemplos, cuando se usa el receptor de folato mutado como se describe en el presente documento como marcador seleccionable, la productividad aumenta si la concentración de folato en el medio de cultivo selectivo se reduce. No

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una sustitución de la alanina presente en la posición 49 de la secuencia del receptor de folato maduro de tipo silvestre alfa (véase SEQ ID NO. 1) por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico. Preferentemente, la alanina en la posición 49 se sustituye por leucina. Dicho receptor de folato mutado muestra, en comparación con el correspondiente receptor de folato de tipo silvestre, una afinidad de unión reducida al diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato y características mejoradas como marcador seleccionable.

De acuerdo con una realización, el primer polinucleótido codifica un receptor de folato mutado, en la que dicho receptor de folato mutado tiene las siguientes características:

a) el receptor de folato mutado maduro comprende la siguiente secuencia:

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en la que Xaa no es alanina y en la que, preferentemente, Xaa es un aminoácido seleccionado a partir de leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico, y en la que Xaa es más preferentemente leucina; o

b) el receptor de folato mutado maduro comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 % o 15 al menos 98 % o al menos 99 % con secuencia mostrada como SEQ ID NO 9, y en la que Xaa no es alanina en dicho receptor de folato mutado y, preferentemente, Xaa es un aminoácido seleccionado de leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico, y más preferentemente, Xaa es leucina, y en la que la afinidad de unión a folato de dicho receptor de folato mutado se reduce en comparación con la secuencia del receptor de folato humano de tipo silvestre maduro alfa en la que Xaa es alanina (véase SEQ ID NO 1). De acuerdo con una 20 realización, dicho receptor de folato mutado muestra en comparación con el correspondiente receptor de folato de tipo silvestre, una afinidad de unión reducida con el diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado resultante muestra además o alternativamente una unión reducida al ácido fólico. El receptor de folato mutado de acuerdo con b) puede ser visto como una variante funcional de a) y puede comprender una o más mutaciones adicionales de aminoácidos en comparación con el

25 receptor de folato mutado de acuerdo con a). Por ejemplo, puede comprender una o más sustituciones adicionales, eliminaciones y/o adiciones de uno o más aminoácidos, siempre y cuando la función como receptor de folato no se elimine. También se incluyen las proteínas de fusión, que comprenden una secuencia respectiva del receptor de folato mutado.

Como se ha analizado anteriormente, preferentemente, Xaa es leucina. Como se muestra en los ejemplos, la

30 mutación de la alanina comprendida en la posición 49 de la secuencia de tipo silvestre del receptor de folato alfa frente a la leucina proporciona un receptor de folato mutado que se ha comparado con las características superiores de secuencia de tipo silvestre correspondientes como un marcador seleccionable. Como se muestra por los ejemplos, las células que comprenden como marcador seleccionable un receptor de folato mutado que porta una mutación en la posición correspondiente a la posición 49 de la secuencia de tipo silvestre madura del receptor de

35 folato alfa muestran, después de la selección, una alta productividad del polipéptido de interés que es a menudo incluso considerablemente más alta que la productividad que se logra cuando se usa el receptor de folato de tipo silvestre correspondiente como marcador seleccionable y que también es superior a la productividad que se logra con otras formas del receptor mutado. Además, las células se recuperan más rápido de la selección. Estas ventajas importantes hacen del receptor de folato mutado A49L particularmente adecuado como marcador seleccionable.

40 Dicho receptor de folato mutado alfa se describe y se caracteriza en Shen et al., 1997. Allí, se mostró que dicha versión mutada muestra una afinidad de unión reducida al diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato como puede verse por el valor de CI50 (nM) que aumenta desde el receptor de folato de tipo silvestre alfa (2,9) en casi 60 veces a (179,0).

El receptor de folato mutado está unido a membrana y puede comprender, por ejemplo, un anclaje GPI o un anclaje

45 de transmembrana. Como se ha descrito anteriormente, el receptor de folato alfa y beta están anclados de manera natural por un anclaje GPI a la membrana celular. Cuando se usa un anclaje GPI para el anclaje de membrana, el polinucleótido de codificación debe proporcionar la secuencia señal apropiada para la fijación de un anclaje GPI. Las secuencias de señal adecuadas para el anclaje de GPI se conocen en la técnica anterior y también se han descrito anteriormente. Como se ha explicado anteriormente, las respectivas secuencias señal de anclaje GPI se

50 proporcionan en el extremo C-terminal y se pueden usar en conjunción con la presente divulgación.

De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado prematuro comprende la secuencia líder del receptor

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inmunoglobulina y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido de interés codifica la otra cadena de la molécula de inmunoglobulina. De acuerdo con una realización, el vector de expresión o la combinación de al menos dos vectores de expresión comprende al menos un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina o un fragmento funcional del mismo y al menos un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica la cadena ligera de una molécula de inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma. Dichos polinucleótidos pueden estar situados en el mismo o en diferentes vectores de expresión en caso de que se use una combinación de al menos dos vectores de expresión. Tras la expresión de dichos polinucleótidos en la célula hospedadora transfectada, se obtiene una molécula de inmunoglobulina funcional y se secreta desde la célula hospedadora.

Los vectores de expresión usados para la expresión de productos recombinantes de interés, por lo general, contienen como elementos de un casete expresión, elementos de control transcripcionales adecuados para promover la transcripción tales como por ejemplo promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, señales que detienen o terminan la transcripción como elemento de un casete de expresión. Preferentemente, se incluyen elementos de control de la traducción adecuados tales como, por ejemplo, regiones no traducidas 5' que conducen a estructuras de caperuza 5' para el reclutamiento de ribosomas y codones de parada para terminar el proceso de traducción. Los productos de la transcripción resultantes del/de los gen/es marcador/es seleccionable/s y aquel del polipéptido de interés albergan elementos de traducción funcionales que facilitan niveles sustanciales de expresión de la proteína (es decir, la traducción) y terminación de la traducción apropiada. Una unidad de expresión funcional, capaz de conducir adecuadamente la expresión de un polinucleótido incorporado también se conoce como un "casete de expresión" en el presente documento. El/los polinucleótido/s que codifica/n el polipéptido de interés que se va a secretar y los polinucleótidos que codifican el/los marcador/es seleccionable/s como se describe en el presente documento se componen preferentemente de un casete de expresión. Varias realizaciones son adecuadas, por ejemplo, cada uno de dicho/s polinucleótido/s puede estar comprendido en un casete de expresión separado. Sin embargo, al menos dos de los respectivos polinucleótidos también pueden estar comprendidos en un casete de expresión. De acuerdo con una realización, al menos un elemento de sitio interno de entrada ribosomal (IRES) está funcionalmente situado entre los polinucleótidos que se expresan a partir del mismo casete de expresión. De este modo, se garantiza que los productos de traducción separados se obtienen a partir de dicho producto de transcripción. Las respectivas tecnologías de expresión basadas en IRES y otros sistemas bi-y policistrónicos son bien conocidos y, por lo tanto, no necesitan describirse más detalladamente en el presente documento.

Como se ha descrito, el vector de expresión o la combinación de vectores de expresión de acuerdo con la presente divulgación pueden comprender al menos un promotor y/o elemento promotor/potenciador como elemento de un casete de expresión. Los promotores se pueden dividir en dos clases, los que funcionan constitutivamente y los que están regulados por inducción o desrepresión. Ambos son adecuados en conjunción con las presentes enseñanzas. Los promotores usados para la producción de alto nivel de proteínas en células de mamíferos deben ser fuertes y preferentemente activos en una amplia gama de tipos de células. Los promotores constitutivos fuertes que dirigen la expresión en muchos tipos de células incluyen, pero sin limitación, el promotor tardío principal de adenovirus, promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano, el SV40 y el promotor del virus del sarcoma de Rous, y el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa murina, EF1a. De acuerdo con una realización, el promotor y/o potenciador se obtiene bien sea a partir de CMV y/o SV40. Los promotores de la transcripción se pueden seleccionar del grupo que consiste en un promotor SV40, un promotor CMV, un promotor EF1alfa, un promotor RSV, un promotor BROAD3, un promotor rosa 26 murino, un promotor pCEFL y un promotor β-actina.

De acuerdo con una realización, el al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, el polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado y/o el polinucleótido que codifica un segundo marcador seleccionable están bajo el control de promotores de la transcripción separados. Los promotores separados de transcripción que promueven la expresión desde los polinucleótidos pueden ser iguales o diferentes.

De acuerdo con una realización, un promotor más fuerte y/o potenciador se usa para impulsar la expresión de al menos un polinucleótido que codifica el polipéptido de interés que para impulsar la expresión del polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado y/o uno o más marcadores seleccionables adicionales. Esta disposición tiene el efecto de que se genera más transcripción para el polipéptido de interés que para los marcadores seleccionables. Es ventajoso que la producción del polipéptido de interés sea dominante frente a la producción de los marcadores seleccionables, ya que la capacidad celular individual para producir productos heterólogos no es ilimitada y, por lo tanto, debe enfocarse al polipéptido de interés. Además, el proceso de selección solo se produce en las etapas iniciales del establecimiento de una estirpe celular de expresión, que luego produce constantemente el polipéptido de interés. Por lo tanto, es ventajoso enfocar los recursos de las células para la expresión/producción del polipéptido de interés. Además, si se usa un promotor menos fuerte para expresar el marcador seleccionable en comparación con el usado para expresar el polipéptido de interés se aumenta aún más la presión de selección sobre las células hospedadoras transfectadas.

De acuerdo con una realización, el promotor que dirige la expresión del/ de los polinucleótido/s que codifican el polipéptido de interés es un promotor de CMV y el promotor que dirige la expresión del polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado es un promotor SV40. El promotor de CMV es conocido por ser uno de los promotores

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Vector: Selección Título de anticuerpos monoclonales (mg/l)

FA 45 nM: 6,9

FA 35 nM: 10,1

Sin ADN: FA 50 nM 8,2

FA 45 nM: 8,3

FA 35 nM: 6,4

FA 25 nM: 6,7

V-wtFRalpha: FA 50 nM 7,1

FA 45 nM: 8,6

FA 35 nM: 9

FA 25 nM: 7

FA 15 nM: 24

V-mutFRalpha: FA 50 nM 9,4

FA 45 nM: 11

FA 35 nM: 13,9

FA 25 nM: 17,2

FA 15 nM: 22,1

FA 5 nM: 26,6

El anticuerpo expresado a partir de los vectores de expresión introducidos se pudo detectar en todas las poblaciones celulares. Como también se determinaron bajas cantidades de anticuerpo en las combinaciones que no fueron transfectadas con el ADN, solo se determinaron valores de más de 9 mg/l como significativos. La población de referencia en MTX 125 nM (sistema de selección DHFR/MTX convencional) produjo 28 mg/l. Los resultados de las 5 cuatro poblaciones de células transfectadas con V-wtFRalpha estaban a las concentraciones más altas de ácido fólico en el intervalo de referencia. Sin embargo, cuando se redujo la concentración de ácido fólico en el medio de cultivo a 15 nM, la expresión de anticuerpo fue aproximadamente igualmente alta (24 mg/l) que con el control de referencia V-DHFRref en MTX 125 nM (28 mg/l). Esto confirma el hallazgo anterior de que el receptor de folato de de tipo silvestre puede servir como marcador de selección y lograr una eficiencia comparable al sistema DHFR/MTX

10 establecido, a pesar de no usarse agentes tóxicos para la selección. Las combinaciones de células que fueron transfectadas con V-mutFRalpha mostraron un aumento lineal en el título del anticuerpo, que era dependiente de la concentración de ácido fólico en el medio de cultivo. Cuanto menor fue la concentración de ácido fólico en el medio de cultivo, más alta fue la tasa de expresión del anticuerpo resultante.

Por lo tanto, el uso del receptor de folato mutado de acuerdo con la divulgación como marcador de selección tiene 15 ventajas frente al uso de un receptor de folato de de tipo silvestre como marcador de selección.

Como el número de transgenes integrados tiene una influencia importante en la tasa de expresión, el número de copias de los elementos más importantes, a saber, las cadenas ligeras y pesadas (LC, HC) del anticuerpo expresado, así como el número de copias del receptor de folato (mutado o de de tipo silvestre) se determinó usando PCR cuantitativa basándose en el ADN genómico de las combinaciones de células.

20 Con respecto al título medido del anticuerpo, el número de copias puede proporcionar indirectamente una visión con respecto a la cuestión de si el lugar de la integración en el genoma era responsable de una expresión fuerte o débil. El análisis de PCR cuantitativo tal como se realiza en el presente documento proporciona un valor medio de los números de copias del transgén, ya que no hay clones de células individuales; sin embargo, se analizó una población de diferentes células que sobrevivieron a la selección. (

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Tabla 5: Determinación del número de copias mediante PCR cuantitativa

número de copias por genoma haploide (corregido con proporción de folato)

número de copias
número de copias

HC: LC FRα/FRα*

CHO precursora: Medio completo 0,0 0,0 1,48

V-DHFRref: MTX 125 nM 2,26 2,27 1,33

FA 35 nM: 5,50 6,82 1,45

sin ADN: FA 25 nM 0,00 0,00 1,66

V-wtFRalpha: FA 50 nM 0,40 0,38 1,95

FA 45 nM: 0,89 0,90 2,48

FA 35 nM: 1,00 0,99 2,83

FA 25 nM: 0,25 0,25 1,66

FA 15 nM: 0,88 0,75 2,62

V-mutFRalpha: FA 50 nM 1,65 1,98 2,32

FA 45 nM: 2,99 2,99 3,02

FA 35 nM: 2,47 2,86 2,91

FA 25 nM: 3,20 4,02 3,11

FA 15 nM: 5,42 6,83 4,56

FA 5 nM: 6,20 7,33 5,18

La Tabla 5 muestra los resultados del análisis PCR cuantitativo de transfectantes V-wtFRalpha y V-mutFRalpha después de la selección. A partir de las combinaciones de control, se analizó una combinación que había sobrevivido a la mayor rigurosidad de selección (V-DHFRref: MTX 125 nM, ácido fólico 35 nM, sin ADN: ácido fólico 5 25 nM). Además, las células no transfectadas cultivadas con CHO sin presión de selección se analizaron como control negativo. La Tabla 5 muestra el número de copias para la cadena ligera y la cadena pesada, así como el número de copias para el receptor de folato que se usó como marcador de selección. Los valores se refieren al tamaño teórico del genoma de las células CHO. La Tabla 5 muestra que en las células CHO no transfectadas, como se esperaba, no se pudieron determinar secuencias de anticuerpo. Además, únicamente se determinaron las copias

10 del receptor fólico alfa de tipo silvestre endógeno. El control de referencia V-DHFRref seleccionado con MTX 125 nM muestra en promedio una integración doble de los transgenes de anticuerpos. Al mirar la población V-DHFRref seleccionada con ácido fólico 35 nM, se puede ver una integración mucho mayor de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo. Se detectaron 5,5 copias de la cadena pesada y 6,8 copias de la cadena ligera. El número de copias de los genes FR alfa es comparable a las células CHO parentales y es atribuible a los alelos endógenos.

15 Las combinaciones que se transfectaron con V-wtFRalpha mostraron sólo algunas copias de HC y LC en comparación con los controles con V-DHFRref. No se observaron diferencias dependientes de la concentración. El número de copias del receptor de folato se aumentó de 50 nM a 35 nM de ácido fólico en 2,8 copias, pero después se disminuyó a 25 nM. Además, la combinación que fue seleccionada con ácido fólico 15 nM había incorporado en promedio 2,6 copias de las cadenas de anticuerpos. En contraste, las combinaciones de células transfectadas con

20 V-mutFRalpha mostraron un aumento casi lineal en las copias de genes de las cadenas de anticuerpo que eran en paralelo a la reducción del ácido fólico en el medio de selección. Por lo tanto, cuanto menor fue la concentración de ácido fólico en el medio de selección, se detectó un mayor número de copias de los genes de LC y HC en las células seleccionadas. El número de copias del gen del receptor de folato alfa mutado mostraron una tendencia comparable. La combinación que fue seleccionada usando ácido fólico 5n M que tenía aproximadamente tres veces más copias

25 del anticuerpo integrado que el control de referencia V-DHFRref seleccionado con MTX 125 nM.

Ejemplo 3: Clonación de células individuales

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Claims

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