ES2587630T3 - Sistema de vector de expresión que comprende dos marcadores de selección - Google Patents

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Abstract

Un vector de expresión o una combinación de al menos dos vectores de expresión, que comprende al menos: (a) un polinucleótido que codifica un producto de interés o un sitio de inserción para incorporar un polinucleótido que codifica un producto de interés; (b) un polinucleótido que codifica un primer marcador de selección (sm I); (c) un polinucleótido que codifica un segundo marcador de selección (sm II), el cual difiere del primer marcador de selección (sm I), en donde la actividad del marcador de selección (sm I) o (sm II) está al menos parcialmente influenciada por la actividad del otro marcador de selección y en donde los marcadores de selección (sm I) y (sm II) están involucrados en el metabolismo de folato y en donde el primer marcador de selección (sm I) es un transportador de folato y el segundo marcador de selección (sm II) es DHFR o una variante funcional de la misma.

Description

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células hospedadoras sobreviven/proliferan en condiciones de cultivo selectivas que, a pesar de que las condiciones de cultivo selectivas, pueden mantener el proceso metabólico suficientemente activo para permitir la supervivencia y el crecimiento celular. La supervivencia/el crecimiento se promueve si las células hospedadoras expresan ambos marcadores de selección (sm I) y (sm II) y, por consiguiente, los vectores de expresión introducidos con un alto rendimiento. De esta manera, se seleccionan células hospedadoras que también expresen el producto de interés, con un alto rendimiento.
Un “proceso metabólico” describe en particular un proceso en la célula hospedadora, el cual es esencial para la viabilidad celular y/o la proliferación celular. Los ejemplos de los procesos metabólicos son la síntesis de ácidos nucleicos o la síntesis de polipéptidos. Una “vía metabólica” se refiere en particular a un subgrupo de un proceso metabólico y describe una serie definida de reacciones químicas que se presentan dentro de una célula. En cada vía, un producto químico principal se modifica mediante reacciones químicas. Un ejemplo clásico de una vía metabólica es la síntesis de nucleótidos (perteneciente al proceso metabólico de la síntesis de ácidos nucleicos), en particular la biosíntesis de purina o pirimidina o la síntesis de aminoácidos (perteneciente al proceso metabólico de la síntesis de polipéptidos). Hay varios niveles de vías metabólicas, que con frecuencia son también interdependientes y, por consiguiente, están conectadas. Por consiguiente, estos términos se deben entender más bien funcionalmente como las vías metabólicas individuales y también los procesos metabólicos con frecuencia se traslapan.
El primer marcador de selección (sm I) y el segundo marcador de selección (sm II) están implicados en el metabolismo del folato.
El metabolismo del folato es importante para mantener la viabilidad celular de la célula hospedadora y/o para la proliferación de las células hospedadoras. Por lo tanto, el metabolismo del folato es un punto funcional adecuado para el sistema de selección de acuerdo con la presente invención. Por lo tanto, esta vía metabólica es muy adecuada para seleccionar los marcadores de selección adecuados, (sm I) y (sm II) tal como se describe en el presente documento y condiciones de selección adecuadas que permitan la selección de células hospedadoras que expresen dichos marcadores. Se conocen en la técnica anterior marcadores de selección adecuados involucrados en las vías metabólicas respectivas, así como células hospedadoras adecuadas y condiciones de selección adecuadas y se describen a continuación y, por lo tanto, pueden usarse conjuntamente con la presente invención.
De acuerdo con una realización, el primer marcador de selección (sm I) y/o el segundo marcador de selección (sm II) es un marcador de selección eucariótico. Un “marcador de selección eucariótico” permite la selección de las células hospedadoras eucarióticas, que comprende, respectivamente, expresar ese marcador de selección. El marcador de selección eucariótico puede ser un marcador de selección metabólico y, por consiguiente, un marcador que está involucrado en un proceso o vía metabólica de la célula, por ejemplo, síntesis de ácidos nucleicos o de polipéptidos.
El segundo marcador de selección (sm II) que es DHFR o una variante funcional de la misma, es un marcador de selección amplificable. Un marcador de selección amplificable permite la selección de células hospedadoras que contienen al vector y promueve la amplificación génica.
El primer marcador de selección (sm I) y/o el segundo marcador de selección (sm II) puede ser un polipéptido catalítico o un polipéptido transportador. Existen muchos marcadores de selección adecuados respectivos que se puede utilizar en conjunto con la presente invención y se explicarán con detalle más adelante.
El segundo marcador de selección (sm II), que es DHFR o una variante funcional de la misma, es un polipéptido catalítico que procesa un sustrato que es un compuesto que se incorpora por el primer marcador de selección (sm I), que es un transportador de folato, hacia el interior de la célula hospedadora o un producto posterior obtenido a partir de dicho compuesto incorporado.
Por consiguiente, el marcador de selección (sm II) procesa un sustrato que se importa hacia el interior de la célula hospedadora por la actividad del primer marcador de selección (sm I). Dicho compuesto que se incorpora dentro de la célula hospedadora por el primer marcador de selección (sm I) también puede ser un precursor del sustrato real que se procesa por el segundo marcador de selección (sm II). Por lo tanto, el polipéptido catalítico (sm II) también puede procesar que es un producto posterior obtenido a partir del compuesto que se incorpora en la célula hospedadora por la actividad del primer marcador de selección (sm I).
Sin quedar ligados a la teoría, se asume que la actividad del segundo marcador de selección (sm II) depende fuertemente de la actividad del primer marcador de selección (sm I) en condiciones de cultivo selectivas para ambos marcadores. La presencia y/o la cantidad de sustrato para el segundo marcador de selección (sm II) depende al menos hasta cierto grado de la expresión/actividad apropiada del marcador de selección (sm I). La fuerte sobreexpresión del primer marcador de selección (sm I) conduce a una disponibilidad más alta de sustrato para el segundo marcador de selección (sm II). La mayor biodisponibilidad del sustrato aumenta la actividad del segundo marcador de selección (por ejemplo, el índice de renovación). Sin embargo, si el marcador de selección (sm I) no se
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para la biosíntesis regulada de AMP y GMP. Adicionalmente, el 5,10-metilen-THF (5,10-CH2-THF), es otra coenzima de THF importante que funciona as un co-factor crucial para la enzima de timidilato sintasa (TS). La timidilato sintasa (TS) cataliza la formación de monofosfato de timidina (dTMP) a partir de dUMP utilizando 5,10-metilen-THF (5,10-CH2-THF), proporcionando de esta manera el ácido dihidrofólico. La dihidrofolato reductasa (DHFR) cataliza la reducción dependiente de NADP del ácido dihidrofólico (DHF) hasta el ácido tetrahidrofólico (THF). THF se interconvierte entonces hasta 10-formil-THF y 5,10-metilen-THF, que se utilizan en la biosíntesis de novo de purinas y timidilato, respectivamente. Esta reacción es catalizada por la hidroxi-metil-transferasa de serina (SHMT). El ácido dihidrofólico (DHF) es, por consiguiente, el subproducto de la actividad catalítica de la timidilato sintasa (TS) que cataliza la conversión de dUMP hasta dTMP en una reacción dependiente de 5,10-metilen-THF. Por consiguiente, la dihidrofolato reductasa (DHFR) es crucial para el reciclaje de los co-factores de THF, que son esenciales para la biosíntesis de los nucleótidos de purina y pirimidina que son necesarios para la replicación del ADN.
Las enzimas descritas, las cuales son hasta cierto grado dependientes de folato, son los mediadores clave de la biosíntesis de novo de los nucleótidos de purina y timina esenciales para la replicación del ADN.
El segundo marcador de selección (sm II) procesa un sustrato que es un folato, un derivado de folato y/o un producto que se puede obtener mediante el procesamiento de folato, tal como DHF o THF o una variante funcional o un derivado de los anteriores. Los sustratos respectivos son importantes para la producción de ácidos nucleicos. Dicho segundo marcador de selección (sm II) es o comprende la dihidrofolato reductasa (DHFR). Esto es en particular adecuado ya que el marcador de selección (sm I) es un transportador de folato.
En la técnica anterior se conocen varias enzimas DHFR adecuadas y, de conformidad con lo mismo, los genes, que se pueden utilizar en conjunto con la presente invención. La DHFR puede ser una DHFR de tipo silvestre o una variante funcional o derivado de la misma. El término una “variante" o "derivado” incluye enzimas DHFR que tienen uno o más intercambios de las secuencias de aminoácidos (por ejemplo, supresiones, sustituciones o adiciones) con respecto a la secuencia de aminoácidos de la enzima DHFR respectiva, proteínas de fusión, las cuales comprenden una enzima DHFR o un fragmento funcional de la misma y enzimas DHFR que se han modificado para proporcionar una estructura y/o función adicional, así como fragmentos funcionales de las anteriores, que todavía tengan al menos una función de una enzima DHFR. Por ejemplo, una enzima DHFR se puede utilizar como un marcador de selección (sm II) es decir, por ejemplo, más o menos sensible para los anti-folatos, tal como MTX, que la enzima DHFR de tipo silvestre y/o la enzima DHFR endógenamente expresada por la célula hospedadora si se expresa. La enzima DHFR se puede derivar a partir de cualquier especie, siempre que sea funcional dentro de la presente invención, es decir, compatible con la célula hospedadora utilizada. Por ejemplo, una dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón mutante con una mayor resistencia a MTX se ha utilizado extensamente como un marcador de selección dominante que mejora notoriamente la adquisición de la resistencia a MTX de alto nivel en las células transfectantes. Preferentemente, una enzima DHFR se utiliza como marcador de selección, el cual es menos susceptible a un inhibidor de la DHFR, tal como MTX, que la enzima DHFR endógenamente expresada en una célula hospedadora DHFR+ (positiva).
De acuerdo con una realización, se coloca un intrón o un fragmento del mismo en el extremo 3' del marco de lectura abierta del gen de DHFR. Esto tiene efectos convenientes sobre el índice de expresión/amplificación de la construcción. El intrón utilizado en el casete de expresión de la DHFR conduce a una variante no funcional más pequeña del gen de DHFR (Grillari y colaboradores, 2001, J. Biotechnol. 87, 59-65). De esta manera, disminuye el nivel de expresión del gen de DHFR, y, por consiguiente, se incrementa adicionalmente la rigurosidad del sistema de selección. Por consiguiente, la célula hospedadora puede comprender un polinucleótido introducido que codifica una enzima DHFR, comprendiendo este polinucleótido un intrón que se localiza en 3’ de la secuencia que codifica la DHFR. Los métodos alternativos que hacen uso de un intrón para reducir el nivel de expresión del gen de DHFR se describen en el documento EP0 724 639 y también se podrían utilizar.
De acuerdo con una realización preferida, el primer marcador de selección (sm I) es un receptor de ácido fólico y el segundo marcador de selección es una variante de la DHFR que es menos sensible a MTX que la enzima DHFR de tipo silvestre y/o la enzima DHFR endógenamente expresada por la célula hospedadora. Esta variante de la DHFR preferentemente también comprende un intrón como se describe anteriormente. Se prefiere en particular una combinación del marcador respectivo en combinación con las células DHFR+ (positivas).
La enseñanza de la presente invención se puede llevar a cabo utilizando diferentes realizaciones de vectores de expresión y/o combinaciones de al menos dos vectores de expresión como se describe en el presente documento. El polinucleótido que codifica un producto de interés o el sitio de inserción para incorporar un polinucleótido respectivo, el polinucleótido que codifica un primer marcador de selección (sm I) y/o el polinucleótido que codifica un segundo marcador de selección (sm II) y opcionalmente elementos de vectores adicionales, tales como marcadores de selección adicionales, se pueden localizar sobre los mismos vectores de expresión o sobre vectores de expresión separados.
Por ejemplo, la utilización de un vector de expresión, el cual comprende al menos todos los elementos decisivos descritos anteriormente, es decir, el polinucleótido que codifica el producto de interés (o un sitio de inserción para
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superficie celular y se pueden seleccionar las células que exhiban altos niveles de polipéptido de fusión anclado a membrana mediante citometría de flujo, preferentemente mediante FACS. De esta manera, se seleccionan las células hospedadoras que tengan un alto índice de expresión. Los detalles y las realizaciones preferidas de esta tecnología basada en el codón de paro se describen en los documentos WO2005/073375 y PCT/EP2009/006246. Se hace referencia a esta divulgación.
De acuerdo con una realización alternativa, el casete de expresión comprende al menos:
(a)
el polinucleótido que codifica el producto de interés,
(b)
un intrón, el cual comprende un sitio donador de empalme 5' y un sitio aceptor de empalme 3' y que comprende un codón de paro de traducción dentro del marco y una señal de poliadenilación, y
(c)
un polinucleótido corriente abajo de este intrón que codifica un ancla de membrana y/o una señal para un ancla de membrana.
Este diseño del casete de expresión tiene el efecto de que, a través de la transcripción y del procesamiento de la transcripción, se obtienen al menos dos ARNm maduros diferentes (ARNm-POI) y (ARNm-POI-ANCLA) a partir del casete de expresión. La traducción del ARNm-POI da como resultado el producto de interés. La traducción del ARNm-POI-ANCLA da como resultado un polipéptido de fusión, el cual comprende el producto de interés y un ancla de membrana. Como un resultado, este polipéptido de fusión nuevamente se exhibe sobre la superficie celular y se pueden seleccionar las células que exhiban altos niveles de polipéptido de fusión anclado a membrana mediante citometría de flujo, preferentemente FACS. De esta manera, se seleccionan las células hospedadoras que tengan un alto índice de expresión. Los detalles y las realizaciones preferidas de esta tecnología basada en los intrones se describen en el documento WO2007/131774. Se hace referencia a esta divulgación.
De acuerdo con una realización preferida, la cual es particularmente útil para la expresión de anticuerpos como el producto de interés, el ancla de membrana es un ancla transmembrana de inmunoglobulina. Otras anclas de membrana adecuadas y las realizaciones preferidas de un ancla transmembrana de inmunoglobulina, se describen en los documentos WO2007/131774, WO2005/073375 y PCT/EP2009/006246.
También se proporciona una célula hospedadora, la cual comprende al menos:
(a)
un polinucleótido introducido que codifica un producto de interés;
(b)
un polinucleótido introducido que codifica un primer marcador de selección (sm I);
(c)
un polinucleótido introducido que codifica un segundo marcador de selección (sm II), el cual difiere del primer marcador de selección (sm I);
en donde la actividad del marcador de selección (sm I) o (sm II) está al menos parcialmente influenciada por la actividad del otro marcador de selección, en donde los marcadores de selección (sm I) o (sm II) están implicados en el metabolismo de folato y en donde el primer marcador de selección (sm I) es un transportador de folato y el segundo marcador de selección (sm II) es DHFR o una variante funcional de la misma.
De acuerdo con una realización, la célula hospedadora comprende un vector de expresión o la combinación de al menos dos vectores de expresión, como se describe con detalle anteriormente y en las reivindicaciones. Los presentes inventores hacen referencia a la divulgación anterior.
Adicionalmente, la célula hospedadora puede tener al menos una de las siguientes características:
La célula hospedadora es preferentemente una célula hospedadora eucariótica. Esta célula eucariótica se selecciona preferentemente a partir del grupo que consiste en una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de planta y una célula de hongo. Las células de hongos y las células de plantas pueden ser prototróficas para los folatos (es decir, estas células pueden sintetizar de una manera autónoma sus propios folatos necesarios para su viabilidad celular, es decir, para su crecimiento y proliferación celular). La presente invención abarca en particular las células de hongos y plantas que son o pueden llegar a ser auxotróficas para los folatos. Esto puede ser, por ejemplo, debido a la manipulación genética, es decir, las células ahora son incapaces de sintetizar cantidades suficientes de los folatos necesarios para su viabilidad celular. Por ejemplo, se puede inactivar la capacidad de las células de hongos o de plantas para biosintetizar de una manera endógena los folatos, por ejemplo, por medio de una vía metabólica apropiada, por ejemplo, mediante la alteración genética o el silenciamiento genético de los genes objetivo apropiados o mediante la inhibición de las enzimas clave, etc. Preferentemente, la célula hospedadora es una célula de mamífero. Esta célula de mamífero preferentemente se selecciona a partir del grupo que consiste en una célula de roedor, una célula humana y una célula de mono. En particular se prefiere una célula de roedor, que preferentemente se selecciona a partir del grupo que consiste en una célula CHO, una célula BHK, una célula NS0, una célula de fibroblasto 3T3 de ratón y una célula SP2/0. Una célula de roedor más particularmente preferida es una célula CHO. También se prefiere una célula humana, la cual, preferentemente, se selecciona a partir del grupo que consiste en una célula HEK293, una célula MCF-7,
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utilizados en la técnica anterior. En particular para la combinación preferida del uso de un receptor de folato en conjunto con una enzima DHFR como marcadores de selección (sm I) y (sm II), se obtienen células hospedadoras que tienen una productividad más alta comparándose con el uso de los marcadores de selección respectivos solos. Por consiguiente, debido a la rigurosidad más alta de las condiciones de selección, se optimiza el procedimiento de selección.
El método de selección de acuerdo con la presente invención también se puede llevar a cabo más rápido y más eficientemente que las estrategias de selección convencionales conocidas en la técnica anterior, debido a que se puede llevar a cabo la selección para los marcadores de selección (sm I) y (sm II) en un paso de selección, si se utilizan condiciones de cultivo celular óptimas.
El método puede comprender adicionalmente un paso de:
(c) seleccionar al menos una célula hospedadora que exprese el producto de interés con el rendimiento deseado.
Las células obtenidas como un resultado del procedimiento de rastreo/selección riguroso de la presente invención en general se aislarán y se pueden enriquecer a partir de las células no seleccionadas de la población de células original. Se pueden aislar y cultivar como células individuales. Sin embargo, también es posible utilizar una población enriquecida. Las células hospedadoras obtenidas también se pueden utilizar en una o más rondas de selección adicionales, opcionalmente para el análisis cualitativo o cuantitativo adicional o se pueden utilizar, por ejemplo, en el desarrollo de una línea celular para la producción de proteínas. De acuerdo con una realización, una población enriquecida de células hospedadoras productoras seleccionadas como se describe anteriormente, se utiliza directamente como la población para la producción del polipéptido de interés con un buen rendimiento.
Preferentemente, se selecciona una célula hospedadora que exprese establemente el producto de interés. Las ventajas de una transfección/expresión estable se describen con detalle anteriormente. Los presentes inventores hacen referencia a la divulgación anterior.
En una realización muy preferida del método para la selección, la pluralidad de células hospedadoras comprende las células hospedadoras de acuerdo con la presente invención, es decir, como se dan a conocer en la presente. Nos referimos a la descripción anteriormente detallada, en particular a los marcadores de selección adecuados (sm I) y (sm II) y a las combinaciones de los mismos.
Otras realizaciones preferidas en particular con respecto a las células hospedadoras y al vector de expresión, respectivamente, combinación de vectores de expresión, se describen con detalle anteriormente. Los presentes inventores hacen referencia a la divulgación anterior.
El primer marcador de selección (sm I) es un transportador/receptor que es capaz de transportar folato hacia dentro de la célula hospedadora. Esta realización del sistema de selección de acuerdo con la presente invención no requiere de una supresión genómica o de la atenuación de los genes del receptor de folato endógeno alfa, beta o gamma, antes de la transfección y, por consiguiente, se puede aplicar a cualquier célula receptora, incluso cuando esté presente algo de la expresión genética del receptor de folato endógeno (véase anteriormente). Esta ventaja clave se basa en el hecho de que, en seguida de la transfección del receptor de folato alfa, las células se pueden exponer a una privación abrupta y severa de folatos (por ejemplo, ácido fólico) a partir del medio de cultivo. En consecuencia, solamente las células transfectantes que expresen cantidades significativas del marcador de selección del receptor de folato alfa pueden transportar suficiente folato para sostener la replicación del ADN y la proliferación celular. Esto se presenta en ausencia de cualquier elevación significativa en la expresión del gen del receptor de folato endógeno alfa. Adicionalmente, esta realización del sistema de selección de acuerdo con la presente invención no sufre de pérdida de rigurosidad de la selección debido al alivio de la presión selectiva por medio de un aumento en la expresión de las rutas alternativas de absorción de folato, incluyendo el aumento en la expresión del portador de folato reducido (RFC) endógeno. Esta importante ventaja se debe al hecho de que, mientras que el receptor de folato alfa tenga una afinidad sobrante por el ácido fólico (Kd = 0,1 nM), el portador de folato reducido (RFC) exhibe una afinidad extremadamente pobre por el ácido fólico (Km = 0,2-0,4 mM).
Ya que (sm II) es la DHFR o una variante funcional de la misma, el medio de cultivo selectivo contiene adicionalmente un inhibidor de una enzima respectiva, por ejemplo, anti-folatos, tales como, por ejemplo, MTX, con el objeto de proporcionar las condiciones selectivas.
El medio de cultivo selectivo que se utiliza en al menos un paso de selección puede comprender uno o más tipos de folato. El folato comprendido en el medio de cultivo selectivo en una concentración limitante es capaz de absorberse en y de ser procesado por, la célula hospedadora. Los folatos y en particular los derivados de folato que no serían procesados por la célula hospedadora no contribuirían a la presión de selección y, por consiguiente, no contribuirían a la concentración limitante. El medio de cultivo selectivo puede tener una o más de las siguientes características:
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Este Vector de DHFR/FolR-FACS (VECTOR III) se compara con un vector de referencia de DHFR-FACS que contiene el gen neo como el segundo marcador de selección (VECTOR IV). El VECTOR IV comprende los siguientes elementos principales:
ELEMENTOS DEL VECTOR IV
Promotor/potenciador de CMV
Intrón-RK
Polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo
Un sitio Poli de SV40
Promotor/potenciador de CMV
Intrón-RK
Polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo
Codón de paro (que se filtra)
Polinucleótido que codifica el ancla transmembrana de inmunoglobulina incluyendo el dominio citoplásmico
Un sitio Poli de SV40
Potenciador/promotor de SV40
Gen de resistencia a la neomicina
Un sitio Poli sintético
Un gen de resistencia a la ampicilina
Promotor SV40
Polinucleótido que codifica la DHFR (mutante)
Fragmento de intrón de SV40
Un sitio Poli de SV40
Adicionalmente, para los experimentos de co-transfección utilizando dos vectores de expresión y la clasificación FACS, se crea el VECTOR V, el cual no comprende ningún gen de DHFR, pero sí el gen neo y el huFolR. El VECTOR V comprende los siguientes elementos principales:
ELEMENTOS DEL VECTOR V
Promotor/potenciador de CMV
Intrón-RK
Polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo
Un sitio Poli de SV40
Promotor/potenciador de CMV
Intrón-RK
Polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo
Codón de paro (que se filtra)
Polinucleótido que codifica el ancla transmembrana de inmunoglobulina incluyendo el dominio citoplásmico
Un sitio Poli de SV40
Potenciador/promotor de SV40
Gen de resistencia a la neomicina
Un sitio Poli sintético
Un gen de resistencia a la ampicilina
Promotor SV40
huFolR
Un sitio Poli de SV40
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  1. imagen1
    imagen2
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