KR20110119837A - 2종의 선택 마커를 포함하는 발현 벡터 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 (a) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 혼입시키기 위한 삽입 부위; (b) 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (c) 제1 선택 마커 (sm I)과 상이한 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합에 관한 것이며, 여기서 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받고, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)는 폴레이트 대사에 관련된다. 또한, 적합한 숙주 세포, 선택 방법, 및 폴리펩티드를 고수율로 생산하는 방법이 제공된다.

Description

2종의 선택 마커를 포함하는 발현 벡터 시스템 {EXPRESSION VECTOR SYSTEM COMPRISING TWO SELECTION MARKERS}
"신규 선택 벡터, 및 진핵 숙주 세포의 선택 방법"
발명의 분야
본 발명은 관심 대상의 산물을 발현하는 숙주 세포, 특히 포유동물 숙주 세포를 선택하기에 적합한 신규 선택 시스템에 관한 것이다. 상기 선택 시스템은 2종 이상의 선택 마커 (sm I 및 sm II) (여기서, 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받음)의 사용을 기초로 한다. 본 발명은 적합한 발현 벡터, 숙주 세포, 및 관심 대상의 산물을 고수율로 발현하는 숙주 세포를 선택하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 폴리펩티드를 고수율로 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
관심 대상의 산물, 예컨대 재조합 펩티드 및 단백질을 대량으로 클로닝하고 발현시키는 능력은 점점 더 중요해지고 있다. 단백질을 높은 수준으로 정제하는 능력은, 예를 들어 단백질 약제를 생산하기 위해 인간 제약 및 생명공학 분야에서, 뿐만 아니라 예를 들어 단백질을 결정화시켜 그의 3차원 구조의 결정을 가능케 하기 위해 기초 연구 세팅에서 중요하다. 달리 대량으로 수득하기 어려운 단백질을 숙주 세포 내에서 과다발현시키고, 후속적으로 단리 및 정제할 수 있다.
재조합 단백질의 생산을 위한 발현 시스템의 선택은 관심 대상의 단백질의 세포 성장 특성, 발현 수준, 세포내 및 세포외 발현, 번역-후 변형 및 생물학적 활성, 뿐만 아니라 치료 단백질의 생산에서 조절 문제 및 경제적 고려사항을 비롯한 수많은 요인에 의존한다. 다른 발현 시스템, 예컨대 박테리아 또는 효모에 비해 포유동물 세포의 주요 이점은 적절한 단백질 폴딩, 복잡한 N-연결된 글리코실화 및 정확한 O-연결된 글리코실화, 뿐만 아니라 광범위한 다른 번역-후 변형을 수행하는 능력이다. 기재된 이점으로 인해, 진핵 및 특히 포유동물 세포는 현재 복잡한 치료 단백질, 예컨대 모노클로날 항체를 생산하기 위해 선택되는 발현 시스템이다.
고발현 숙주 세포 (또한 고생산자로도 불림)를 수득하기 위한 가장 통상적인 접근은 제1 단계로서 관심 대상의 산물을 발현시키기 위한 적절한 발현 벡터를 생성한다. 발현 벡터는 숙주 세포에서 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진하고, 재조합 세포주를 생성하기 위한 하나 이상의 선택 마커를 제공한다. 통상적으로, 포유동물 발현 벡터의 핵심 요소는 확고한 전사 활성 능력이 있는 구성적이거나 유도가능한 프로모터; 안정한 세포주의 제조 및 유전자 증폭을 위한, 통상적으로 코작(Kozak) 서열을 포함하는 최적화된 mRNA 가공 및 번역 신호, 번역 종결 코돈, mRNA 절단 및 폴리아데닐화 신호, 전사 종결인자 및 선택 마커를 포함하며; 또한 박테리아에서의 벡터 증식을 위한 원핵 복제원점 및 선택 마커가 발현 벡터에 의해 제공될 수 있다.
최근 몇 년 동안 개발의 초점은 숙주 및 특히 포유동물 세포에서의 유전자 발현을 위한 개선된 벡터의 설계에 집중되고 있었다. 그러나, 이용가능한 벡터의 과잉에도 불구하고, 포유동물 세포에서 고수율을 갖는 확고한 폴리펩티드/단백질 생산은 여전히 과제로 남아 있다.
관심 대상의 산물을 고수율로 발현하는 고생산 세포주를 수득하기 위한 확립된 한 절차는 숙주 세포의 안정한 형질감염이다. 그러나, 게놈으로의 안정한 통합은 희귀한 사건이고, 안정하게 형질감염된 세포 중 단지 작은 하위세트만이 고생산자이다.
선택 마커 및 선택 시스템은 관심 대상의 산물을 고수율로 발현하는 숙주 세포를 수득하기 위해 유전 공학, 재조합 DNA 기술, 및 재조합 산물의 생산에 널리 이용된다. 각각의 시스템은 또한 안정하게 형질감염된 클론을 생성 및 확인하는 데 유용하다. 각각의 선택 마커 및 선택 시스템을 이용하는 일차적 목표는, 선택 성장 조건에 노출되었을 때 관심 대상의 재조합 산물을 높은 수준으로 생산할 수 있는 세포의 확인을 가능케 하는 선택 유전자를 도입시키는 것이다. 예를 들어, 산물 발현의 수율을 증가시키는 것은, 예를 들어 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 또는 글루타민 신테타제 (GS)와 같은 효소가 결여된 세포주를 이들 선택 마커 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 발현 벡터, 및 DHFR을 억제하는 메토트렉세이트 (MTX) 및 GS를 억제하는 메티오닌 술폭사민 (MSX)과 같은 작용제와 함께 사용하는 유전자 증폭에 의해 달성될 수 있다. 또한, 각각의 선택 마커의 더 민감성인 돌연변이 형태가 야생형 세포와 함께 사용될 수 있다. 강한 프로모터의 제어 하에 있는 재조합 유전자, 및 선택 마커, 예컨대 DHFR 또는 GS를 코딩하는 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여, 각각 DHFR + (플러스) 또는 GS + (플러스) 형질감염체가 우선 수득되고, 이어서 점진적으로 증가하는 농도의 MTX 또는 MSX 중에서 형질감염체를 성장시킴으로써 유전자 증폭이 달성된다. 이러한 선택 압력을 제공하는 목적은 선택 마커 및 그에 따라 관심 대상의 산물을 고수율로 발현하는 세포를 단리하는 것이다.
따라서, 높은 엄격도의 선택 시스템은 형질감염된 집단으로부터 고생산 세포를 풍부화시키는 데 결정적이다. 선택 시스템의 엄격도가 높을수록 선택 과정 후에 저생산자의 수가 더 적어지고, 매우 희귀한 초고생산 클론을 발견할 기회가 더 많아진다.
본 발명의 목적은 관심 대상의 산물을 고수율로 생산하는 숙주 세포, 뿐만 아니라 적합한 발현 벡터 및 숙주 세포를 선택하기 위한 엄격한 선택 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명은 관심 대상의 산물을 고수율로 발현하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 시스템, 및 각각의 산물, 특히 폴리펩티드의 생산에 관한 것이다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명은 적어도
(a) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 혼입시키기 위한 삽입 부위;
(b) 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 제1 선택 마커 (sm I)과 상이한 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
(여기서, 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받고, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)는 폴레이트 대사에 관련됨)
를 포함하는, 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 적어도
(a) 관심 대상의 산물을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
(b) 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
(c) 제1 선택 마커 (sm I)과 상이한 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드
(여기서, 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받고, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)는 폴레이트 대사에 관련됨)
를 포함하는 숙주 세포, 특히 포유동물 숙주 세포에 관한 것이다.
또한,
(a) 적어도
(i) 관심 대상의 산물을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
(ii) 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
(iii) 제1 선택 마커 (sm I)과 상이한 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드
(여기서, 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받고, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)는 폴레이트 대사에 관련됨)
를 포함하는 다수의 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)에 대해 선택적인 성장 조건 하에 상기 다수의 숙주 세포를 배양하고, 그로 인해 관심 대상의 산물을 발현하는 숙주 세포를 수득하는 단계
를 포함하는, 관심 대상의 산물을 발현할 수 있는 하나 이상의 숙주 세포를 선택하기 위한 방법이 제공된다.
또한, 한계 농도의 폴레이트 및 항폴레이트제를 포함하는, 본 발명에 따른 선택 방법에 사용될 수 있는 선택 배양 배지가 제공된다. "선택 배양 배지"는 숙주 세포의 선택에 유용한 세포 배양 배지이다.
본 발명은 또한 관심 대상의 산물의 발현을 가능케 하는 조건 하에 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 본 발명의 교시에 따라 선택된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 관심 대상의 산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 제1 선택 마커 (sm I)을 제2 선택 마커 (sm II) (제1 선택 마커 (sm I)과 상이함)와 조합하여 사용하는 것에 관한 것이다. 관심 대상의 산물을 발현하는 진핵, 특히 포유동물 숙주 세포를 선택하는 데 있어서, 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받는다. 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)는, 바람직하게는 세포 생존율 또는 세포 증식에 필수적인 동일 또는 합동 대사 과정 또는 경로에 관련된다. 바람직하게는, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)는 폴레이트 대사에 관련된다.
2종의 선택 마커 (sm I) 및 (sm II) (여기서, 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받고, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)는 둘 다 세포 생존율 또는 세포 증식에 필수적인 동일한 대사 경로에 관련됨)를 사용하는 본 발명의 전략은 매우 엄격한 선택 조건을 초래한다. 이는 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)가 둘 다 폴레이트 메카니즘에 관련되는 바람직한 실시양태를 기초로 하여 본원에서 설명될 것이다. 폴레이트 대사는 세포 생존 및 세포 성장을 위해 결정적인 필수 대사 경로이다. 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성이 다른 선택 마커의 활성에 영향을 미치고, 선택 마커가 둘 다 폴레이트 대사에 관련되기 때문에, 폴레이트 대사는 선택 배양 조건 하에서 단지 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)가 둘 다 충분한 양으로 발현되고 그에 따라 수용자 숙주 세포에서 고수율로 발현되는 경우에만 효과적으로 기능한다. 그로 인해, 숙주 세포에 대한 선택 압력은 현저히 증가된다.
선택 마커 (sm II)의 활성이 어떻게 선택 마커 (sm I)의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받는지를 또한 설명하는 바람직한 실시양태에서, 선택 마커 (sm I)은 폴레이트를 숙주 세포에 혼입시키는 수송체 폴리펩티드이거나, 또는 이를 포함한다. 선택 마커 (sm II)는 선택 마커 (sm I)에 의해 혼입된 폴레이트 또는 상기 반입된 폴레이트로부터 수득 또는 생성된 후속 산물을 기질로서 가공하는 촉매 폴리펩티드이다. 각각의 촉매 폴리펩티드의 바람직한 예로는 DHFR이 있다. 이러한 실시양태에서, 폴레이트 수송체 (sm I)이 충분한 양의 폴레이트를 숙주 세포에 혼입시키는 경우에, 제2 선택 마커 (sm II)는 더 높은 효율 또는 더 높은 교체율로 작동하는 것으로 여겨진다. 이론에 얽매이지 않으면서, 제1 선택 마커 (sm I)로서의 폴레이트 수송체의 강한 발현은, 숙주 세포가 배양 배지로부터 해당 세포로 더 많은 폴레이트를 반입하게 하고 그에 따라 숙주 세포가 배양 배지의 낮은 폴레이트 농도를 견디게 하는 것으로 여겨진다. 폴레이트 수송체 (sm I)의 강한 발현은, 촉매 폴리펩티드 (sm II)를 위한 충분한 기질 (또는 상기 기질의 전구체)이 숙주 세포로 반입되어 촉매 폴리펩티트 (sm II)를 위해 이용가능하게 되도록 한다. 따라서, 촉매 폴리펩티드 (sm II)의 활성이 충분한 양의 폴레이트가 폴레이트 수송체 (sm I)에 의해 숙주 세포로 반입되는지에 의존하기 때문에, 촉매 폴리펩티드 (sm II)의 활성은 폴레이트 수송체 (sm I)의 활성에 의해 영향을 받는다. 따라서, 숙주 세포가 제1 선택 마커 (sm I)을 강하게 발현하고, 그에 따라 폴레이트 대사를 유지하기 위해 충분한 양의 폴레이트를 세포로 반입하는 경우에는, 심지어 배양 배지 중 폴레이트의 농도가 매우 낮을지라도 세포 생존율이 유지/증가된다. 폴레이트 수송체 (sm I)의 활성으로 인해, 촉매 폴리펩티드 (sm II)를 위한 기질의 이용가능성이 증가된다. 선택 배양 배지는 촉매 폴리펩티드 (sm II)의 억제제, 예를 들어 그의 실제 기질의 경쟁자를 포함할 수 있다. 촉매 폴리펩티드 (sm II)를 강하게 발현하는 세포는, 특히 높은 기질 농도에서 상기 억제제의 더 높은 농도를 견디고, 여기서 상기 농도는 선택 마커 (sm I)로서 사용되는 폴레이트 수송체의 활성에 적어도 부분적으로 의존적이다. 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)가 둘 다 강하게 발현되는 경우에, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)의 활성/기능성의 이러한 연결성은, 숙주 세포의 생존율 및/또는 성장 속도가 선택 배양 조건 하에 상당히 증가되는 효과를 갖는다. 선택 배양 조건에도 불구하고 세포 생존 및 성장을 가능케 하기에 충분한 폴레이트 대사를 유지할 수 있는 숙주 세포가 생존/증식한다.
본 발명에 따른 발현 시스템의 고유한 설계는 형질감염된 숙주 세포 집단으로부터 고생산 세포의 풍부화를 가능케 하는 매우 엄격한 선택 시스템을 제공한다. 본 발명에 따른 선택 시스템의 이러한 높은 엄격도는 선택 후의 집단에서 저생산자의 수를 낮추고, 매우 희귀한 초고생산 클론을 발견할 기회를 증가시킨다. 이는 세포 집단 생존 선택의 생산성을 증가시킨다. 실시예는 본 발명에 따른 선택 시스템을 이용하여 수득된 숙주 세포가 관심 대상의 산물을 고수율로 생산한다는 것을 보여준다. 또한 개별 생산자 클론의 평균 생산성이 증가된다. 따라서, 본 발명에 따른 선택 시스템은 적은 스크리닝 노력으로 고생산자 클론을 발견할 기회를 증가시킨다.
상기 가정은 근본적 메카니즘의 현재의 이해를 반영하지만, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II) (둘 다 폴레이트 대사에 관련됨)를 사용하는 경우 선택 압력에서 관찰된 의존성/증가에 대한 다른 설명이 있을 수 있으므로, 굳어진 것은 아니다. 더욱이, 상세한 설명에서 또한 개괄된 것처럼, 본 발명의 일반적 원리는 또한 다른 대사 과정 또는 경로, 및 다른 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)에 적용가능하다. 그러나, 선택 압력을 증가시키기 위해 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성이 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받는다는 것, 및 특히 그에 의존적이라는 것이 중요하다. 따라서, 본 출원의 다른 목적, 특징, 장점 및 측면은 하기 상세한 설명 및 첨부된 청구범위로부터 당업자에게 분명해질 것이다. 그러나, 하기 상세한 설명, 첨부된 청구범위 및 구체적 실시예는 본 출원의 바람직한 실시양태를 나타내지만, 단지 예시할 의도로 주어지는 것임이 이해되어야 한다. 개시된 발명의 취지 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형은, 하기 내용을 읽음으로써 쉽게 당업자에게 분명해질 것이다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 적어도
(a) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 혼입시키기 위한 삽입 부위;
(b) 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 제1 선택 마커 (sm I)과 상이한 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
(여기서, 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받음)
를 포함하는, 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합이 제공된다.
도입된 폴리뉴클레오티드에 의해 발현된 "선택 마커" (sm)는 적절한 선택 배양 조건 하에서 상기 선택 마커를 발현하는 숙주 세포의 선택을 가능케 한다. 선택 마커는 바람직하게는 생체분자, 특히 폴리펩티드이다. 적합한 선택 마커가 하기에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따른 "벡터"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 단편을 보유할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. 벡터는 핵산, 구체적으로는 폴리뉴클레오티드의 단편을 숙주 세포 내로 전달하는, 분자 캐리어와 유사한 기능을 한다. 이것은 그 속에 혼입된 폴리뉴클레오티드를 적절하게 발현시키기 위한 조절 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 세포에 도입될 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 관심 대상의 산물 또는 선택 마커를 코딩함)는 벡터의 발현 카세트(들)에 삽입되어 그로부터 발현될 수 있다. 본 발명에 따른 벡터는 원형 또는 선형(화된) 형태로 존재할 수 있고, 벡터 단편을 또한 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 외래 핵산 단편의 이동을 가능케 하는 인공 염색체 또는 유사한 각각의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"폴리뉴클레오티드"는 통상적으로 하나의 데옥시리보스 또는 리보스로부터 또 다른 데옥시리보스 또는 리보스에 연결된 뉴클레오티드의 중합체이며, 문맥에 따라서는 DNA뿐만 아니라 RNA를 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 어떠한 크기 제한도 포함하지 않고, 또한 변형, 특히 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"도입된 폴리뉴클레오티드"는, 예를 들어 재조합 기술, 예컨대 형질감염을 이용하여 숙주 세포에 도입된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 숙주 세포는 도입된 폴리뉴클레오티드에 상응하는, 구체적으로는 이와 동일한 내생 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 도입은, 예를 들어 숙주 세포의 게놈에 통합 (안정한 형질감염)될 수 있는 적합한 벡터를 형질감염시킴으로써 달성될 수 있다. 숙주 세포로의 폴리뉴클레오티드 도입을 가능케 하는 적합한 벡터가 하기에 상세히 기재되어 있다. 도입된 폴리뉴클레오티드가 게놈에 삽입되지 않는 경우에, 도입된 폴리뉴클레오티드는 이후 단계에서, 예를 들어 세포가 유사분열을 겪을 때 상실될 수 있다 (일시적 형질감염). 적합한 벡터는 또한 게놈에 통합되지 않고, 예를 들어 에피좀 복제에 의해 숙주 세포에서 유지될 수도 있다. 그러나, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입시키기 위한 다른 기술들이 또한 선행 기술에서 공지되어 있으며, 이는 하기에 더욱 상세히 기재되어 있다.
"관심 대상의 산물"은 상기 숙주 세포에서 발현될 산물을 지칭한다. 관심 대상의 산물은, 예를 들어 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 RNA일 수 있다. 바람직하게는, 관심 대상의 산물은 폴리펩티드, 특히 이뮤노글로불린 분자이다. 예가 하기 기재되어 있다.
"폴리펩티드"는 펩티드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산 중합체를 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리펩티드에는 단백질 (예를 들어, 50개 초과의 아미노산을 가짐) 및 펩티드 (예를 들어, 2 내지 49개의 아미노산을 가짐)를 비롯한 임의의 길이의 폴리펩티드가 포함된다. 폴리펩티드에는 임의의 활성 또는 생물활성의 단백질 및/또는 펩티드가 포함된다. 적합한 예가 하기 개괄되어 있다.
특징 "선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성이 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받는다"는 특히, 한 선택 마커의 활성이 다른 선택 마커의 활성, 구체적으로는 기능에 의해 영향을 받고/거나 적어도 어느 정도는 직접적으로 또는 간접적으로 그에 의존함 (및 임의로 그 반대의 경우도 가능함)을 의미한다. 이와 관련하여 "활성"은 특히, 선택 압력에 대한 내성을 제공, 촉진 및/또는 증가시키는 선택 마커의 임의의 기능 또는 작용을 나타내고, 이에는 촉매 활성, 교체율, 동역학적 반응 속도 및/또는 선택 마커의 수송 속도가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)의 의존성/상호작용은 선택 배양 조건 하에서 숙주 세포에 대한 선택 압력을 상당히 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 선택 마커 (sm I) 및 선택 마커 (sm II)는 세포 생존율 또는 증식에 필수적인 동일 또는 합동 대사 과정 또는 경로에 관련된다. 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)의 적합한 예 및 대사 과정 및 경로가 하기 상세히 기재되어 있다.
후속적으로, 본 발명자들은 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합의 실시양태 및 장점을 기재한다. 적절한 경우, 본 발명자들은 관심 대상의 산물을 발현하는 숙주 세포를 선택함에 있어 상기 발현 벡터(들)의 사용과 관련하여 이들 장점을 기재한다.
본 발명의 교시에 따르면, 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 선택 마커 둘 다에 대해 선택적인 배양 조건 하에서 다른 선택 마커의 활성에 의해 영향을 받고, 따라서 적어도 부분적으로 그에 의존적이다. 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)의 이러한 상호작용으로 인해, 숙주 세포에 대한 선택 압력이 증가된다. 그의 고유한 설계로 인해, 형질감염된 숙주 세포 집단으로부터 고생산 세포의 풍부화를 가능케 하는 매우 엄격한 선택 시스템이 제공된다. 본 발명에 따른 선택 시스템의 이러한 높은 엄격도는 선택 후의 집단에서 저생산자의 수를 낮추고, 매우 희귀한 초고생산 클론을 발견할 기회를 증가시킨다.
바람직한 실시양태에 따르면, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)는 둘 다, 바람직하게는 세포 생존율 및/또는 증식에 필수적인 동일한 대사 과정 (예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드의 합성)에 관련된다. 따라서, 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합이 수용자 숙주 세포에 도입되는 경우에, 상기 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)의 활성/존재는 선택 배양 조건과 함께 수용자 숙주 세포의 동일한 대사 과정에 영향을 미치거나 이를 공격한다. 따라서, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)의 활성은 상기 대사 과정 내에서 서로 영향을 미치고, 그로 인해 숙주 세포에 대한 선택 압력을 증가시킨다. 선택 배양 조건에도 불구하고, 세포 생존 및 성장을 가능케 하기 위해 상기 대사 과정을 충분히 유지할 수 있는 숙주 세포가 선택 배양 조건 하에 생존/증식한다. 생존/성장은 상기 숙주 세포가 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)를 둘 다 발현하고, 그에 따라 도입된 발현 벡터(들)을 고수율로 발현하는 경우에 촉진된다. 그로 인해, 관심 대상의 산물을 또한 고수율로 발현하는 숙주 세포가 선택된다.
"대사 과정"은 특히 세포 생존율 및/또는 세포 증식에 필수적인 숙주 세포 내의 과정을 나타낸다. 대사 과정의 예로는 핵산 합성 또는 폴리펩티드 합성이 있다. "대사 경로"는 특히 대사 과정의 하위군을 지칭하며, 세포 내에서 발생하는 규정된 일련의 화학 반응을 나타낸다. 각각의 경로에서, 제1의 화학물질은 화학 반응에 의해 변형된다. 대사 경로의 고전적인 예로는 뉴클레오티드 합성 (핵산 합성의 대사 과정에 속함), 특히 퓨린 또는 피리미딘 생합성 또는 아미노산의 합성 (폴리펩티드 합성의 대사 과정에 속함)이 있다. 또한 종종 상호 의존적이며 따라서 연결되어 있는 여러 수준의 대사 경로가 있다. 따라서, 이들 용어는 종종 중첩되는 개별적인 대사 경로 및 또한 대사 과정으로서 오히려 기능적으로 이해될 것이다.
한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I) 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)는
a) 핵산 합성 및/또는 폴리펩티드 합성,
b) 뉴클레오티드 합성 및/또는 아미노산 합성, 및
c) 폴레이트 대사
로부터 선택된 대사 과정 또는 경로에 관련된다.
언급된 대사 과정/경로는 숙주 세포의 세포 생존율을 유지하기 위해 및/또는 숙주 세포의 증식을 위해 중요하다. 따라서, 이들은 본 발명에 따른 선택 시스템을 위해 적합한 작업 지점이다. 따라서, 이들 대사 경로는 선택 마커 (sm I) 및 선택 마커 (sm II)로서 그 속에 포함된 적절한 선택 마커, 및 상기 마커를 발현하는 숙주 세포의 선택을 가능케 하는 적합한 선택 조건을 선택하기에 매우 적합하다. 각각의 대사 경로, 뿐만 아니라 적합한 숙주 세포 및 적합한 선택 조건에 관련된 적합한 선택 마커는 선행 기술에서 공지되어 있고, 하기 기재되어 있으며, 따라서 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I) 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)는 진핵 선택 마커이다. "진핵 선택 마커"는 상기 선택 마커를 포함, 구체적으로는 발현하는 진핵 숙주 세포의 선택을 가능케 한다. 상기 진핵 선택 마커는 대사 선택 마커일 수 있고, 따라서 세포의 대사 과정 또는 경로, 예를 들어 핵산 또는 폴리펩티드 합성에 관련된 마커일 수 있다.
또한, 제1 선택 마커 (sm I) 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)는 증폭가능한 선택 마커일 수 있다. 증폭가능한 선택 마커는 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택을 가능케 하고, 유전자 증폭을 촉진한다. 각각의 증폭가능한 선택 마커의 예는 선행 기술 (예컨대, DHFR 및 GS)에서 공지되어 있다.
제1 선택 마커 (sm I) 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)는 촉매 폴리펩티드 또는 수송체 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 수많은 적합한 각각의 선택 마커가 존재하며, 이는 하기 상세히 설명될 것이다.
한 실시양태에 따르면, 제2 선택 마커 (sm II)는,
(a) 제1 선택 마커 (sm I)에 의해 숙주 세포에 혼입된 화합물 또는 상기 혼입된 화합물로부터 수득된 후속 산물인 기질, 및/또는
(b) 제1 선택 마커 (sm I)의 활성에 의해 수득된 기질 또는 그의 전구체
를 가공하는 촉매 폴리펩티드이다.
따라서, 선택 마커 (sm II)로서 사용되는 상기 촉매 폴리펩티드는 제1 선택 마커 (sm I)의 활성에 의해 숙주 세포로 반입된 기질을 가공할 수 있다. 이것은 또한 제1 선택 마커 (sm I)의 활성에 의해 생산된 기질을 가공할 수 있다. 예를 들어, 제1 선택 마커 (sm I)에 의해 숙주 세포에 혼입된 상기 화합물은 또한 제2 선택 마커 (sm II)에 의해 가공된 실제 기질의 전구체일 수 있다. 따라서, 촉매 폴리펩티드 (sm II)는 또한 제1 선택 마커 (sm I)의 활성에 의해 숙주 세포에 혼입된 화합물로부터 수득된 후속 산물인 기질을 가공할 수 있다. 동일 내용이, 선택 마커 (sm I)이 수송체 폴리펩티드 대신에 촉매 폴리펩티드인 경우에 적용된다.
이론에 얽매이지 않으면서, 이러한 실시양태에서, 제2 선택 마커 (sm II)의 활성은 두 마커 모두에 대해 선택적인 배양 조건 하에서 제1 선택 마커 (sm I)의 활성에 강하게 의존하는 것으로 가정된다. 제2 선택 마커 (sm II)를 위한 기질의 존재 및/또는 양은 선택 마커 (sm I)의 적절한 발현/활성에 적어도 어느 정도는 의존한다. 제1 선택 마커 (sm I)의 강한 과다발현은 제2 선택 마커 (sm II)를 위한 기질의 더 높은 이용가능성으로 이어진다. 기질의 더 높은 이용가능성은 제2 선택 마커의 활성 (예를 들어, 교체율)을 증가시킨다. 그러나, 선택 마커 (sm I)이 충분한 수율로 발현되지 않는 경우에는 선택 마커 (sm II)를 위한 기질이 생성되지 않거나 더 적게 생성되어, 선택 마커 (sm II)의 활성 또한 따라서 감소된다.
한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I)은 제2 선택 마커 (sm II)의 기질 또는 기질의 전구체인 화합물을 배양 배지로부터 숙주 세포로 도입/혼입시키는 역할을 하는 수송체 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 상기 화합물은 세포 생존율 및/또는 증식에 필수적이다. 이러한 실시양태에서, 제1 선택 마커 (sm I)이 충분한 양의 상기 화합물을 숙주 세포에 혼입시키는 경우에, 제2 선택 마커 (sm II)는 더 높은 효율 또는 교체율로 작동하는 것으로 여겨진다. 이론에 얽매이지 않으면서, 제1 선택 마커 (sm I)의 강한 과다발현은 숙주 세포가 배양 배지로부터 해당 세포로 더 많은 상기 화합물을 반입하게 하고, 따라서 숙주 세포가 배양 배지 중 상기 화합물의 더 낮은 농도를 견디게 하는 것으로 여겨진다. 이는 또한 숙주 세포에서 상기 화합물 및 그에 따라 제2 선택 마커 (sm II)의 기질 (또는 상기 기질의 전구체)의 더 높은 이용가능성으로 이어진다. 동일한 원리가, 제1 선택 마커 (sm I)이 제2 선택 마커 (sm II)에 의해 가공/이용되는 기질 또는 기질의 전구체를 생산하는 촉매 폴리펩티드인 경우에 적용된다. 상기 가정은 근본적 메카니즘의 현재의 이해를 반영하지만, 선택 압력에서 관찰된 의존성/증가에 대한 다른 설명이 있을 수 있으므로, 굳어진 것은 아니다.
선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 다른 선택 마커의 활성에 영향을 미치며, 둘 모두는 동일 또는 합동 대사 과정 또는 경로, 예를 들어 뉴클레오티드 합성 또는 폴레이트 대사를 표적으로 하고, 따라서 이는 선택 마커가 둘 다 충분한 양으로 발현되고 그에 따라 숙주 세포에서 고수율로 발현되는 경우에 선택 배양 조건 하에 더 효과적으로 기능을 한다. 이는 대단히 엄격한 선택 조건을 초래한다.
한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I)은 제2 선택 마커 (sm II)의 상류에서 작동한다. 이는, 예를 들어 동일 또는 합동 대사 경로 내에서, 제1 선택 마커 (sm I)이 예를 들어 상기 경로의 초기에 작동하고, 제2 선택 마커 (sm II)가 선택 마커 (sm I)의 하류에서 작동할 수 있음을 의미한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I)은 수송체 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 특히, "수송체 폴리펩티드"는 한 구획으로부터 또 다른 구획으로, 특히 배양 배지로부터 숙주 세포로의 화합물의 이동을 매개하는 폴리펩티드이다. 적합한 수송체 폴리펩티드의 예에는 수용체 폴리펩티드, 채널 및 캐리어가 포함된다.
수송체 폴리펩티드로서, 상기 선택 마커 (sm I)은 바람직하게는 숙주 세포의 세포 생존율 또는 증식에 관련되고/거나 필수적인 화합물을 숙주 세포에 반입시킨다. 따라서, 세포 생존율 또는 증식은 상기 화합물의 숙주 세포로의 반입에 적어도 부분적으로 의존한다. 수송체 폴리펩티드 (sm I)과 함께 사용되는 제2 선택 마커 (sm II)는 바람직하게는, 이것이 예를 들어 반입된 화합물 또는 그의 후속 산물을 사용하기 때문에, 제1 선택 마커 (sm I)의 수송체 활성에 의존하거나 그에 의해 영향을 받는 대사 경로 또는 과정에 관련된 효소이다. 이러한 실시양태에서, 상기 제2 선택 마커 (sm II)의 활성 및 특히 교체율은, 상기 화합물을 숙주 세포에 반입시키는 수송체 폴리펩티드 (sm I)의 활성에 적어도 부분적으로 의존한다. 이러한 실시양태와 관련하여, 수송체 폴리펩티드 (sm I)에 의해 숙주 세포에 반입되는 한계 농도의 상기 화합물을 포함하는 선택 배양 배지가 사용될 수 있다.
"한계 농도"는 숙주 세포에 대한 선택 압력을 제공하는 선택 배양 배지 중 상기 화합물의 농도를 지칭한다. 따라서, 상기 화합물은 선택 배양 배지에 풍부하게 포함되지 않으며, 그로 인해 숙주 세포에 대한 선택 압력을 제공한다. 따라서, 선택 배양 배지는 수송체 폴리펩티드 (sm I)에 의해 세포에 혼입/수송되는 상기 화합물을 예를 들어 박탈당할 수 있고, 구체적으로는 그의 적은 양을 함유할 수 있다.
따라서, 숙주 세포가 제1 선택 마커 (sm I)을 과다발현하고, 그에 따라 관계된 대사 경로를 유지하기 위해 충분한 양의 상기 화합물을 세포에 반입하는 경우에는, 심지어 배양 배지 중 상기 화합물의 농도가 매우 낮을지라도 세포 생존율이 유지/증가된다. 수송체 폴리펩티드 (sm I)의 발현 및 그에 따른 활성이 증가되면, 제2 선택 마커 (sm II)를 위한 기질의 이용가능성이 증가된다. 제2 선택 마커 (sm II)가 촉매 폴리펩티드인 경우에, 선택 배양 배지는 상기 제2 선택 마커 (sm II)의 억제제, 예를 들어 제2 선택 마커 (sm II)의 실제 기질의 경쟁자를 포함할 수 있다. 제2 선택 마커 (sm II)를 강하게 과다발현하는 세포는, 특히 높은 기질 농도에서 상기 억제제의 더 높은 농도를 견딘다 (이는 선택 마커 (sm I)의 활성에 적어도 부분적으로 의존적임). 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)가 둘 다 강하게 발현되는 경우에, 이는 숙주 세포의 생존율이 선택 조건 하에 상당히 증가되는 효과를 갖는다. 그로 인해, 관심 대상의 산물의 발현 속도가 증가된다. 따라서, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)의 활성/기능성의 연결성은 고발현 및 또한 초고발현 세포 클론의 선택을 가능케 하는 매우 엄격한 선택 조건을 초래한다. 동일한 원리가, 제1 선택 마커 (sm I)이 제2 선택 마커 (sm II)를 위한 기질의 생산/생성에 관련된 효소인 경우에 적용된다 (상기 참조).
바람직한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I) 및 제2 선택 마커 (sm II)는 폴레이트 대사에 관련된다. 본 발명에 따른 폴레이트는, 예를 들어 산화된 폴레이트 (즉, 폴산) 또는 환원된 폴레이트, 또는 이들의 유도체일 수 있다. 일반적으로, 폴레이트는 이러한 폴레이트가 숙주 세포, 특히 포유동물 숙주 세포로 흡수될 수 있을 것인 한, 본 발명 내에서 유용하다. 산화된 폴레이트, 즉 폴산, 뿐만 아니라 폴산의 환원된 유도체 (환원된 폴레이트 또는 테트라히드로폴레이트 (THF)로 알려져 있음)는 진핵, 특히 포유동물 세포에서 퓨린, 티미딜레이트 및 특정 아미노산 생합성을 위한 필수 보조인자 및/또는 조효소인 B-9 비타민 군이다. THF 보조인자는 특히 DNA 복제 및 그에 따른 세포 증식에 결정적이다. 특히, THF 보조인자는 퓨린 및 티미딜레이트, 아미노산의 신생 생합성, 뿐만 아니라 DNA의 CpG 섬 메틸화를 비롯한 메틸 기 대사를 포함하는 일련의 상호 연결된 대사 경로에서 1-탄소 단위의 공여자로서의 기능을 한다. 특히, 10-포르밀-THF (10-CHO-THF)를 비롯한 THF 보조인자는 퓨린의 신생 생합성에 관련된 2개의 주요 신생 포르밀트랜스퍼라제 반응에서 1-탄소 단위를 제공한다. 산화된 폴레이트의 바람직한 예로는 폴산이 있다. 환원된 폴레이트의 바람직한 예로는 5-메틸-테트라히드로폴산, 5-포르밀-테트라히드로폴산, 10-포르밀-테트라히드로폴산 및 5,10-메틸렌-테트라히드로폴산이 있다.
그 자신의 폴레이트를 합성하는 대부분의 원핵생물, 식물 및 진균과는 대조적으로, 포유동물 및 다른 진핵생물 종은 THF 보조인자 생합성이 결여되어 있고, 따라서 외생 공급원, 통상적으로 배양 배지로부터 이들을 수득하여야 한다. 3종의 독립적인 수송 시스템이 포유동물 세포에서 폴레이트 및 항폴레이트제의 흡수를 매개하는 것으로 현재 알려져 있다:
a) 환원된 폴레이트 보조인자의 주된 세포 수송 시스템은 환원된 폴레이트 캐리어 (RFC)이다. RFC (용질 캐리어 패밀리 19 구성원 1, SLC19A1로도 알려져 있음)는 매우 높은 세포내 수준으로 축적되는 것으로 알려져 있는 유기 포스페이트, 예컨대, 아데닌 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 티아민 모노- 및 피로포스페이트를 교환함으로써 환원된 폴레이트의 오르막 수송을 매개하는 양방향성의 촉진성 캐리어로서의 기능을 하는, 편재하여 발현되는 약 85 kDa의 막 당단백질이다. RFC는 산화된 폴레이트인 폴산에 대해서는 단지 매우 낮은 수송 친화성 (Kt = 200 내지 400 μM)만을 제공하면서, 류코보린 (5-포르밀-THF; Kt = 1 μM)을 비롯한 THF 보조인자에 대해서는 높은 친화성을 나타낸다.
b) 폴레이트 흡수의 또 다른 경로는 최근에 클로닝된 양성자-커플링된 폴레이트 수송체 (PCFT, SLC46A로도 알려져 있음)이다. PCFT는 RFC와는 독립적으로 발현되는 것으로 보이며, 산성 pH (5.5)에서 최적으로 기능을 하며, 산화된 것 (예를 들어, 폴산) 및 THF 보조인자 (즉, 환원된 폴레이트) 둘 다, 뿐만 아니라 MTX를 비롯한 다양한 친수성 항폴레이트제의 유입을 매개한다. 산성 pH (5.5)에서 폴레이트 및 항폴레이트제의 최적 수송을 보여주지만 생리적 pH (7.4)에서는 그렇지 않은 PCFT는 상부 소장에서의 폴레이트 및 항폴레이트제 둘 다의 흡수에서 핵심 역할을 갖는다.
c) 제3 수송 경로는 폴레이트 수용체 (FR)를 포함한다. FR은 별개의 3개의 유전자 FR 알파, FR 베타 및 FR 감마에 의해 코딩되는 고-친화성 폴레이트-결합 당단백질이다. FR 알파는 또한 성인 폴레이트 결합 단백질 또는 FDP로서, 폴레이트 수용체1 또는 FOLR (마우스에서는 folbp1)로서, 및 난소암-관련 항원 또는 MOv 18로서 알려져 있다. FR 베타는 또한 FOLR2 (태아)로서, 및 FBP/PL-1 (태반)로서 알려져 있다. FR 감마는 또한 FOLR3 으로서, 및 FR-G (문헌 [M. D. Salazar and M. Ratnam, Cancer Metastasis Rev. 2007 26(1), pp.141-52.]에 의해 검토됨)로서 알려져 있다. 그 특징이 잘 규명되어 있는 성숙 FR은 약 70 내지 80％의 아미노산 동일성을 갖는 상동성 단백질이며, 이는 229 내지 236개의 아미노산 뿐만 아니라, 2 내지 3개의 N-글리코실화 부위를 함유한다. FR 알파 및 FR 베타는 막-결합된, 특히 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI)-앵커링된 세포 표면 당단백질인 반면, FR 감마에는 GPI 앵커가 결여되어 있으며, 이는 분비된 단백질이다. FR 알파 및 FR 베타는 폴산 (Kd=0.1 내지 1 nM), 5,10-디데아자테트라히드로폴산 (DDATHF; 로메트렉솔; 기질로서 [3H]폴산을 사용하여, Ki=0.4 내지 1.3 nM) 및 BGC945 (환원된 폴레이트 캐리어가 아닌, 오직 FR 알파만을 통해 특이적으로 수송되는, 시클로펜타[g]퀴나졸린계의 티미딜레이트 신타제 억제제임)에 대해서는 높은 친화성 (Kd=1 nM)을 나타내지만, MTX에 대해서는 훨씬 더 낮은 친화성 (Kd >100 nM)을 나타낸다. 폴레이트 및 항폴레이트제의 FR-의존성 흡수는 고전적인 수용체-매개 세포내 이입의 메카니즘을 통해 진행된다.
한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I)은 배양 배지로부터 숙주 세포로 하나 이상의 폴레이트를 반입시키는 수송체 폴리펩티드이다. 일반적으로, 폴레이트는 이러한 폴레이트가 제1 선택 마커 (sm I)에 의해 숙주 세포, 특히 포유동물 숙주 세포로 흡수될 수 있을 것인 한, 본 발명 내에서 유용하다.
한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I)은 환원된 폴레이트 캐리어 (RFC) 또는 그의 기능적 변이체 또는 단편이거나, 또는 이들을 포함한다. RFC는 환원된 폴레이트, 예컨대 5-메틸-THF 및 5-포르밀-THF의 세포로의 흡수를 위한 주요 수송체의 역할을 하는, 편재하여 발현되는 막 당단백질이다. 그러나, RFC는 산화된 폴레이트인 폴산에 대해서는 매우 낮은 친화성을 나타낸다. 따라서, RFC의 발현이 결여되거나 게놈 RFC 유전자좌가 결실된 세포는, 5-포르밀-THF와 같은 환원된 폴레이트가 성장 배지로부터 점차 박탈되고, 그로 인해 세포가 상기 폴레이트 수송체를 증가된 수준으로 발현하게 하는 조건 하에서 선택 마커 유전자 RFC ((sm I)로서)의 형질감염을 위한 수용자로서의 역할을 할 수 있다.
실시예 섹션에 또한 상세히 기재되어 있는 바람직한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I)은 폴레이트 수송체 폴리펩티드이거나, 또는 이를 포함하고, 바람직하게는 기능적 폴레이트 수용체이다. 폴레이트 수용체 또는 그의 기능적 변이체 또는 단편의 사용은 RFC 선택 시스템의 사용에 대해 여러 장점을 갖는다. 내생 FR 유전자좌가 녹아웃되거나, 또는 표적화된 녹아웃 또는 기능 손실 돌연변이에 의해 불활성화된 세포를 사용할 필요가 없다. 또한, RFC는 폴산에 대해 불량한 수송 친화성을 가지며, 따라서 상기 산화된 폴레이트는 선택을 위한 배양 배지에서 사용될 수 없다. 그러나, 폴산은 폴레이트 수용체에 의해 가공될 수 있다. 또한, RFC가 폴레이트의 강력한 반입 및 반출을 동등하게 나타내는 양방향성 폴레이트 수송체인 반면에, 폴레이트-수용체 기반 선택 시스템은 단방향성 폴레이트 흡수 시스템이다. 따라서, 폴레이트 수용체의 사용은 여러 중요한 장점을 갖는다. 그러나, 이것은 또한 선택 마커로서 RFC와 함께 사용될 수 있다.
각각의 폴레이트 수용체는 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합을 통해 관심 대상의 산물을 생산하도록 의도된 진핵 세포에 도입될 수 있다. 제1 선택 마커 (sm I)로서 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 (폴리펩티드와 같은) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 이어서, 세포를 한계 농도의 폴레이트를 함유하는 선택 배지 중에서 성장시킨다. 배양 배지 중 폴레이트의 농도가 낮을수록 적용되는 선택 조건은 더 엄격해진다. 바람직하게는, 제1 선택 마커 (sm I)이 폴레이트 수용체이거나 이를 포함하는 경우에, 제2 선택 마커 (sm II)는 폴레이트 및/또는 폴레이트로부터 수득된 후속 산물인 기질을 가공하는 촉매 폴리펩티드이다. 따라서, 도입된 폴레이트 수용체를 과다발현하는 세포는 세포 성장, DNA 복제 및 그에 따른 세포 증식을 유지하기 위한 충분한 양의 폴레이트를 흡수할 수 있다. 상기 효과는, 제2 선택 마커 (sm II)의 활성이 제1 선택 마커 (sm I)의 활성, 여기서는 폴레이트 수용체의 수송체 활성에 의존적이거나 그에 의해 영향을 받는다는 사실로 인해 추가로 개선된다 (상기 참조). 이는 단지 도입된 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)를 강하게 과다발현하고 그에 따라 관심 대상의 산물을 과다발현하는 세포만이 생존하는 효과를 갖는다. 이러한 접근법은 선택된 실시양태에 따라, 내생 폴레이트 수용체 (FR) 유전자의 사전 결실 (비록 이것이 가능한 실시양태를 구성할지라도)을 요구하지 않는다.
본 발명에 따라 사용되는 발현 벡터를 수단으로 하여 진핵 숙주 세포에 도입된 폴레이트 수용체는 본 발명 내에서 기능적인 한, 즉, 사용되는 진핵 세포와 상용성인 한, 임의의 종으로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물 종으로부터 유래된 폴레이트 수용체, 예를 들어 설치류로부터 유래된 폴레이트 수용체, 또는 가장 바람직하게는 인간 폴레이트 수용체가 사용될 것이다.
일반적으로, 진핵 숙주 세포에 도입되고 선택 마커로서 사용되는 폴레이트 수송체, 특히 폴레이트 수용체는 숙주 세포의 내생 폴레이트 수용체에 대해 상동성이거나 이종성일 수 있다. 상동성인 경우에, 이는 숙주 세포와 동일한 종으로부터 유래된 것일 것이며, 예를 들어 숙주 세포의 내생 폴레이트 수용체와 동일한 것일 수 있다. 이종성인 경우에, 이는 숙주 세포 외의 또 다른 종으로부터 유래된 것일 것이며, 따라서 숙주 세포의 내생 폴레이트 수용체와 상이한 것일 수 있다. 전형적으로, 선택 마커로서 사용되는 도입된 폴레이트 수송체, 바람직하게는 수용체는 숙주 세포에 대해 이종성일 것이다. 예를 들어, 인간-유래 폴레이트 수용체는 설치류 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포에 대한 선택 마커로서 사용될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 폴레이트 수용체는 기능적 막-결합 폴레이트 수용체이다. 상기 수용체는 폴레이트 또는 그의 유도체를 진핵 세포로 단방향성 반입 또는 흡수할 수 있는 기능적 막-결합 수용체일 수 있다. 막 결합된 폴레이트 수용체는 상기 개괄된 바와 같이 임의의 종으로부터 유래된 것일 수 있다.
제1 선택 마커 (sm I)로서 사용되는 기능적 막-결합 폴레이트 수용체는 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 수용체 베타, 폴레이트 수용체 감마, 서열 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 폴레이트 수용체, 및 상기한 것들의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 이것은 인간 폴산 수용체 알파 또는 그의 기능적 변이체이다.
기능적 변이체는 생리학적 방식으로 기능적인, 즉, 숙주 세포 (이는 특히 진핵, 및 바람직하게는 포유동물 숙주 세포임)에 의해 폴레이트를 흡수하고 세포의 폴레이트 대사를 통해 세포의 생존율에 기여할 수 있는 폴레이트 수용체의 유도체를 포함한다. 예를 들어, 폴레이트 수용체의 변이체 형태는 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 부가와 같은 하나 이상의 아미노산 돌연변이(들)을 포함할 수 있다. 또한, 상기 용어 변이체는 각각의 폴레이트 수용체를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
바람직하게는, 폴레이트 수용체는 인간 폴레이트 수용체 알파, 인간 폴레이트 수용체 베타, 또는 이들의 기능적 변이체이다. 하기 아미노산 서열 (서열 1, 1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 나타냄)을 갖거나 포함하는 인간 폴레이트 수용체 알파가 가장 바람직하다:
Figure pct00001
또 다른 바람직한 실시양태는 하기 아미노산 서열 (서열 2, 1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 나타냄)을 갖거나 포함하는 인간 폴레이트 수용체 베타에 관한 것이다:
Figure pct00002
대안에서, 자연적으로 막-결합형이 아닌 폴레이트 수용체는 제1 선택 마커 (sm I)로서 사용된다. 이러한 막-비결합 수용체는 막-결합형이 되기 위해 변경될 수 있다. 예를 들어, 막 앵커가 제공될 수 있고/거나 상기 폴레이트 수용체가 막-비결합 폴레이트 수용체 및 또 다른 폴리펩티드의 막횡단 영역을 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 마찬가지로, 당업자가 쉽게 이용할 수 있는 다른 변이체가 사용될 수 있다. 이와 관련하여 바람직한 예는 가용성 폴레이트 수용체 감마, 바람직하게는 인간 가용성 폴레이트 수용체 감마를 기초로 할 것이다. 그의 가장 바람직한 실시양태에서, 인간 가용성 폴레이트 수용체 감마는 하기 아미노산 서열 (서열 3, 1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 나타냄)을 갖거나 포함할 것이다:
Figure pct00003
상기 수용체는 돌연변이되거나 또는 달리 유전적으로 변경, 유도체화 또는 변형되어, 본 발명의 문맥 내에서 폴레이트를 흡수할 수 있는 기능적 막-결합 폴레이트 수용체를 형성할 수 있다.
상기한 것으로부터 분명하게 된 것처럼, 선택 마커(들) (sm I) 및/또는 (sm II)는 핵산 합성 및/또는 폴레이트 대사에 관련된 촉매 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I)은 핵산 합성에 관련되고/거나 필수적인 화합물을 숙주 세포에 혼입시키는 수송체이거나 이를 포함하고, 제2 선택 마커 (sm II)는 핵산 합성, 예를 들어 뉴클레오티드의 생성에 관련된 촉매 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 제2 선택 마커 (sm II)는 핵산 합성, 특히 폴레이트 대사에 관련된 촉매 폴리펩티드, 바람직하게는 효소이다. 이는 제1 선택 마커 (sm I)이 폴레이트를 숙주 세포 내로 수송하고, 예를 들어 폴레이트 수용체인 경우에 특히 유용하다.
핵산 합성의 과정에서, 제1 효소인 글리신아미드 리보뉴클레오티드 트랜스포르밀라제 (GARTF)는 퓨린의 이미다졸 고리의 형성에 관련된 반면, 5-아미노이미다졸-4-카르복스아미드 리보뉴클레오티드 트랜스포르밀라제 (AICARTF)에 의해 매개되는 더 하류의 반응은 퓨린 중간체 이노신 5'-모노포스페이트 (IMP)를 생산한다. 후자는 AMP 및 GMP의 조절된 생합성을 위한 주요 전구체로서의 역할을 한다. 또한, 5,10-메틸렌-THF (5,10-CH2-THF)는 효소 티미딜레이트 신타제 (TS)를 위한 결정적인 보조인자로서의 기능을 하는 또 다른 중요한 THF 조효소이다. TS는 5,10-메틸렌-THF (5,10-CH2-THF)를 사용한 dUMP로부터의 티미딘 모노포스페이트 (dTMP)의 형성을 촉매화하며, 그로 인해 디히드로폴산을 제공한다. 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)는 디히드로폴산 (DHF)의 테트라히드로폴산 (THF)으로의 NADP-의존성 환원을 촉매화한다. 이어서, THF는 각각 퓨린 및 티미딜레이트의 신생 생합성에 사용되는 10-포르밀-THF 및 5,10-메틸렌-THF로 상호 전환된다. 상기 반응은 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (SHMT)에 의해 촉매화된다. DHF는 따라서 5,10-메틸렌-THF-의존성 반응에서 dUMP의 dTMP로의 전환을 촉매화하는 티미딜레이트 신타제 (TS)의 촉매 활성의 부산물이다. 따라서, DHFR은 DNA 복제에 필요한 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 생합성에 필수적인 THF 보조인자의 재순환을 위해 결정적이다.
어느 정도 폴레이트-의존성인 기재된 효소는 DNA 복제에 필수적인 퓨린 및 티민 뉴클레오티드의 신생 생합성의 주요 매개자이고, 이들이 동일한 대사 과정, 즉 핵산 합성에 관련되기 때문에, 제1 선택 마커 (sm I) 및/또는 (sm II)로서 적합하다.
한 실시양태에 따르면, 제2 선택 마커 (sm II)는 폴레이트, 폴레이트의 유도체 및/또는 폴레이트의 가공에 의해 수득될 수 있는 산물 (예컨대, DHF 또는 THF), 또는 상기한 것들의 기능적 변이체 또는 유도체인 기질을 가공한다. 각각의 기질은 핵산의 생산을 위해 중요하다. 바람직하게는, 상기 제2 선택 마커 (sm II)는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 또는 DHFR의 하류에서 또는 구체적으로는 그와 관련하여 작동하는 효소 (예컨대, TS 및 SHMT)이거나 이를 포함한다. 이러한 실시양태는 선택 마커 (sm I)이 폴레이트 수송체인 경우에 특히 적합하다.
본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 몇몇 적합한 DHFR 효소 및 그에 따른 유전자가 당업계에 공지되어 있다. DHFR은 야생형 DHFR 또는 그의 기능성 변이체 또는 유도체일 수 있다. 용어 "변이체" 또는 "유도체"는 각각의 DHFR 효소의 아미노산 서열에 관하여 하나 이상의 아미노산 서열 교체 (예를 들어 결실, 치환 또는 부가)를 갖는 DHFR 효소, DHFR 효소 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 추가의 구조 및/또는 기능을 제공하도록 변형된 DHFR 효소, 뿐만 아니라 여전히 하나 이상의 DHFR 효소 기능을 갖는 상기한 것들의 기능적 단편을 포함한다. 예를 들어, DHFR 효소는 예를 들어 야생형 DHFR 효소 및/또는 발현되는 경우에는 숙주 세포에 의해 내생적으로 발현된 DHFR 효소보다 항폴레이트제, 예컨대 MTX에 대해 더 민감성이거나 덜 민감성인 선택 마커 (sm II)로서 사용될 수 있다. DHFR 효소는 본 발명 내에서 기능적인 한, 즉, 사용되는 숙주 세포와 상용성인 한, 임의의 종으로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, MTX에 대하여 주된 내성을 갖는 돌연변이 마우스 DHFR은 형질감염된 세포에서 높은 수준의 MTX-내성 획득을 현저히 증진시키는 우성 선택 마커로서 광범위하게 사용되어 왔다. 바람직하게는, DHFR 효소는 DHFR + (플러스) 숙주 세포에서 내생적으로 발현된 DHFR 효소보다 DHFR 억제제, 예컨대 MTX에 덜 영향받기 쉬운 선택 마커로서 사용된다.
한 실시양태에 따르면, 인트론 또는 그의 단편은 DHFR 유전자의 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에 위치한다. 이는 구축물의 발현/증폭 속도에 있어서 유리한 효과를 갖는다. DHFR 발현 카세트에 사용된 인트론은 DHFR 유전자의 더 작은 비기능적 변이체를 유발한다 (문헌 [Grillari et al., 2001, J. Biotechnol. 87, 59-65]). 그로 인해 DHFR 유전자의 발현 수준이 저하되고, 따라서 선택 시스템의 엄격도를 추가로 증가시킬 수 있다. 따라서, 숙주 세포는 DHFR 효소를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드 (DHFR 코딩 서열의 3'에 위치하는 인트론을 포함함)를 포함할 수 있다. 인트론을 사용하여 DHFR 유전자의 발현 수준을 감소시키는 대안적인 방법이 EP 0 724 639에 기재되어 있으며, 또한 이용될 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I)은 폴산 수용체이고, 제2 선택 마커는 야생형 DHFR 효소 및/또는 숙주 세포에 의해 내생적으로 발현된 DHFR 효소보다 MTX에 덜 민감성인 DHFR 변이체이다. 상기 DHFR 변이체는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같이 인트론을 또한 포함한다. 각각의 마커 조합은 DHFR + (플러스) 세포와 조합하여 특히 바람직하다.
본 발명의 교시는 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터 및/또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합의 다양한 실시양태를 이용하여 수행될 수 있다. 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 각각의 폴리뉴클레오티드를 혼입시키기 위한 삽입 부위, 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 임의로 추가의 선택 마커와 같은 추가의 벡터 요소가 동일한 발현 벡터 또는 별개의 발현 벡터 상에 위치할 수 있다.
예를 들어, 적어도 상기 기재된 모든 결정적인 요소, 즉, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 각각의 폴리뉴클레오티드를 혼입시키기 위한 삽입 부위), 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것은 숙주 세포에 도입될 단 하나의 발현 벡터만을 필요로 한다는 장점을 갖는다. 또한, 이들이 게놈에 함께 통합될 것이므로, 특히 안정한 발현 세포주를 확립하는 경우에 모든 요소가 동등하게, 또는 적어도 유사한 속도로 숙주 세포에 의해 발현될 기회가 더 많아진다.
그러나, 형질감염을 위해 각각의 폴리뉴클레오티드가 상이한 발현 벡터 상에 위치하는 2 또는 3종 이상의 발현 벡터의 조합을 사용하는 것 또한 가능하고, 본 발명의 범주 내에 있다. 이어서, 발현 벡터의 상기 조합은 숙주 세포로 형질감염된다. 2종 이상의 발현 벡터의 조합을 사용하는 경우에, 바람직하게는 관심 대상의 산물을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (또는 관심 대상의 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 삽입 부위) 및 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II) 중 하나 이상이 동일한 발현 벡터에 배열되는 세팅이 이용된다. 이는 특히, 발현 벡터의 조합이 안정한 발현 세포주를 확립하기 위해 사용되는 경우에, 관심 대상의 산물의 발현에 대한 선택 마커 (sm I) 및/또는 (sm II)의 발현의 밀접한 연결성을 보증하기 위한 것이다. 다른 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)는 상기 발현 벡터 조합의 분리된 발현 벡터 상에 위치할 수 있다. 따라서 다른 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)를 포함하는 상기 분리된 발현 벡터는 관심 대상의 산물을 코딩하는 추가의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 각각의 세팅은, 예를 들어 이뮤노글로불린 분자를 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 그러나, 모든 폴리뉴클레오티드 (관심 대상의 산물, (sm I) 및 (sm II)를 코딩함)가 분리된, 따라서 개별적인 발현 벡터 상에 위치하는 것 또한 본 발명의 교시 내에 있다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 발현 벡터는 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한, 그러나 아직 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 삽입 부위를 포함한다. 각각의 "비어있는" 발현 벡터는 관심 대상의 목적 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하고, 그로 인해 관심 대상의 산물을 발현하기 위해 숙주 세포에 혼입될 수 있는 즉시 사용가능한 발현 벡터를 수득하기 위해 사용될 수 있다. 혼입은 적절한 클로닝 방법을 이용함으로써, 예를 들어 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위해 제한 효소를 이용함으로써 달성될 수 있다. 상기 목적을 위해, 발현 벡터는 예를 들어 모든 리딩 프레임에 사용될 수 있는 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함할 수 있다. 삽입 부위의 예로서 각각의 다중 클로닝 부위가 발현 카세트 내에 위치할 수 있다. 각각의 "비어있는" 발현 벡터는, 발현 벡터가 관심 대상의 목적 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 쉽게 의도된 용도에 적합화될 수 있기 때문에, 다양한 관심 대상의 산물을 발현하기 위한 유용한 도구를 제공한다.
발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합은 추가의 벡터 요소를 추가로 포함한다. 예를 들어, 관심 대상의 추가의 산물을 코딩하는 하나 이상의 추가의 폴리뉴클레오티드가 제공될 수 있다. 이러한 실시양태는 특히 이뮤노글로불린 분자를 발현시키기에 적합하다. 추가로 유용한 일반적 벡터 요소는 선행 기술에 공지되어 있고, 복제 기점, 추가의 선택 마커, 다양한 숙주 세포에서의 발현 또는 시험관내 발현을 위한 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합은 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 중 적어도 기능적 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 및 이뮤노글로불린 분자의 경쇄 중 적어도 기능적 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 2종 이상의 발현 벡터의 조합이 사용되는 경우에, 동일한 발현 벡터 상에 또는 상이한 발현 벡터 상에 위치할 수 있다. 한 발현 벡터가 적어도 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 적어도 이뮤노글로불린 분자의 경쇄 중 적어도 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 이뮤노글로불린 분자의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 다른 발현 벡터가 적어도 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 적어도 상기 이뮤노글로불린 분자의 경쇄 중 적어도 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 이뮤노글로불린 분자의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 2종 이상의 발현 벡터의 조합을 사용하는 것도 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 각각의 세팅은 또한 실시예에 기재되어 있다. 숙주 세포가 상기 폴리뉴클레오티드를 발현하면, 기능적 이뮤노글로불린 분자가 수득된다. 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 중 적어도 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이뮤노글로불린 분자의 경쇄 중 적어도 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 또한 하기 기재된 바와 같이 동일한 발현 카세트 또는 상이한 발현 카세트에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합은 하나 이상의 선택 마커(들)을 코딩하는 하나 이상의 추가 폴리뉴클레오티드(들)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가의 마커(들)은 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)와 같이 동일 또는 합동 대사 과정에 관련될 수 있다. 그러나, 이것은 또한 상이한 대사 경로에 관련될 수도 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 시스템을 하나 이상의 상이한 선택 시스템(들) (예를 들어, 항생제 내성 선택 시스템, 예컨대 neo/G418)과 함께 이용하는 동시-선택이 성능을 추가로 개선하기 위해 적용될 수 있다. 진핵 숙주 세포의 선택을 가능케 하는 추가의 진핵 선택 마커 외에, 또한 원핵 선택 마커가 사용될 수 있다. "원핵 선택 마커"는 적절한 선택 조건 하에 원핵 숙주 세포에서의 선택을 가능케 하는 선택 마커이다. 각각의 원핵 선택 마커의 예로는 항생제, 예컨대 예를 들어 암피실린, 카나마이신, 테트라시클린 및/또는 클로람페니콜에 대한 내성을 제공하는 마커가 있다.
관심 대상의 산물을 발현시키기 위해 사용되는 벡터는 통상적으로 발현 카세트의 요소로서 전사를 추진하기에 적합한 전사 제어 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 중지 또는 종결 신호를 함유한다. 목적 산물이 단백질인 경우에, 바람직하게는, 예를 들어 리보좀을 보충하기에 적합한 5' 캡 구조로 이어지는 5' 비번역 영역, 및 번역 과정을 종결시키는 종결 코돈과 같은 적합한 번역 제어 요소가 벡터에 포함된다. 특히, 선택 마커 유전자로서의 역할을 하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적절한 프로모터 내에 존재하는 전사 요소의 제어 하에 전사될 수 있다. 선택 마커 유전자의 생성된 전사체 및 관심 대상의 산물의 생성된 전사체는 실질적인 수준의 단백질 발현 (즉, 번역) 및 적절한 번역 종결을 용이하게 하는 기능적 번역 요소를 보유한다. 혼입된 폴리뉴클레오티드의 발현을 적절하게 일으킬 수 있는 기능적 발현 단위는 또한 본원에서 "발현 카세트"로서 지칭된다. 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들), 및 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 바람직하게는 발현 카세트에 포함된다. 예를 들어, 각각의 상기 폴리뉴클레오티드(들)이 상이한 발현 카세트에 포함될 수 있는 몇몇 실시양태가 적합하다. 그러나, 각각의 폴리뉴클레오티드 중 2종 이상이 하나의 발현 카세트에 포함되는 것도 또한 본 발명의 범주 내에 있다.
따라서, 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합은 발현 카세트의 요소로서 하나 이상의 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서 요소를 포함할 수 있다. 이들 두 조절 요소 사이의 물리적인 경계가 항상 명확한 것은 아니지만, 용어 "프로모터"는 통상적으로 RNA 폴리머라제 및/또는 임의의 관련된 인자가 결합하고 그곳에서 전사가 개시되는 핵산 분자 상의 부위를 지칭한다. 인핸서는 일시적으로, 뿐만 아니라 공간적으로 프로모터 활성을 증진시킨다. 수많은 프로모터가 광범위한 세포형에서 전사 활성을 갖는다. 프로모터는 구성적으로 기능하는 부류, 및 유도 또는 탈억제에 의해 조절되는 부류의 2가지 부류로 분류될 수 있다. 둘 모두가 본 발명의 교시와 관련하여 적합하다. 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 생산을 위해 사용되는 프로모터는 강력해야 하고, 바람직하게는 광범위한 세포형에서 활성이어야 한다.
수많은 세포형에서 발현을 추진하는 강한 구성적 프로모터에는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 인간 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터, SV40 및 라우스 육종(Rous Sarcoma) 바이러스 프로모터, 및 뮤린 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터, EF1a가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 프로모터 및/또는 인핸서가 CMV 및/또는 SV40으로부터 수득되는 경우에, 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 우수한 결과가 달성된다. 전사 프로모터는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, EF1알파 프로모터, RSV 프로모터, BROAD3 프로모터, 뮤린 로사 26 프로모터, pCEFL 프로모터 및 β-액틴 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태는 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 별개의 전사 프로모터의 제어 하에 있는 것인 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 숙주 세포, 특히 진핵 숙주 세포에서 필수적인 폴리뉴클레오티드의 발현, 특히 전사를 촉진할 수 있는 프로모터가 적합할 것이다. 폴리뉴클레오티드로부터 발현을 추진하는 별개의 전사 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I) 및/또는 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진하기 위해서보다는 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진하기 위해서 더 강한 프로모터 및/또는 인핸서가 사용된다. 이러한 배열은 선택 마커를 위해서보다는 관심 대상의 산물을 위해 더 많은 전사체가 생성되는 효과를 갖는다. 이종성 산물을 생산하기 위한 개별 세포 수용량이 비제한적이지 않고, 따라서 관심 대상의 산물로 집중되어야 하기 때문에, 관심 대상의 산물의 생산이 선택 마커의 생산에 대해 우세한 것이 유리하다. 또한, 선택 과정은 단지 발현 세포주 확립의 초기 단계에서만 일어나고, 그 다음에는 변함없이 관심 대상의 산물을 생산한다. 따라서, 관심 대상의 산물의 발현/생산에 세포의 자원을 집중시키는 것이 유리하다. 또한, 선택 마커(들) (sm I) 및/또는 (sm II)를 발현시키기 위해 관심 대상의 폴리펩티드에 비해 덜 강력한 프로모터를 사용하는 것은 선택 압력을 추가로 증가시킨다.
한 실시양태에 따르면, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진하는 프로모터는 CMV 프로모터이고, 선택 마커 (sm I) 및/또는 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진하는 프로모터는 SV40 프로모터이다. CMV 프로모터는 포유동물 발현을 위해 이용가능한 가장 강력한 프로모터 중 하나인 것으로 알려져 있고, 매우 우수한 발현 속도를 유발한다. 이것은 SV40 프로모터보다 현저히 더 많은 전사체를 제공하는 것으로 간주된다.
추가 실시양태에 따르면, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 전사 프로모터의 제어 하에 있다. 적합한 프로모터는 상기 기재되어 있다. 이러한 실시양태에서, 하나의 긴 전사체가 상기 전사 프로모터의 제어 하에 있는 각각의 발현 카세트로부터 수득된다. 한 실시양태에 따르면, 하나 이상의 IRES 요소가 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 기능적으로 위치한다. 그로 인해, 분리된 번역 산물이 상기 전사체로부터 수득된다는 것이 보증된다.
발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합은 발현 카세트의 요소로서 적절한 전사 종결 부위를 포함할 수 있다. 상류 프로모터로부터 제2 전사 단위를 통해 계속되는 전사가 하류 프로모터의 기능을 억제할 수 있기 때문에, 이러한 현상은 프로모터 차단 또는 전사 간섭으로 알려져 있다. 이러한 사건은 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 보고되어 왔다. 두 전사 단위 사이에 전사 종결 신호가 적절히 위치하는 것이 프로모터 차단을 방지할 수 있다. 전사 종결 부위는 잘 특성화되어 있고, 그의 발현 벡터에의 도입은 유전자 발현에 대해 여러 유익한 효과를 갖는 것으로 나타났다.
바람직하게는, 사용되는 숙주 세포는 진핵, 특히 포유동물 숙주 세포이다. 대부분의 진핵 발생기 mRNA는 1차 전사체의 절단 및 연결된 폴리아데닐화 반응을 포함하는 복잡한 과정 동안에 첨가되는 폴리A 꼬리를 그의 3' 말단에 소유한다. 폴리A 꼬리는 mRNA 안정성 및 이동성을 위해 유리하다. 따라서, 본 발명에 따른 벡터의 발현 카세트는 통상적으로 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 소 성장 호르몬 (bgh), 마우스 베타-글로빈, SV40 초기 전사 단위 및 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자로부터 유래된 것을 비롯하여, 포유동물 발현 벡터에 사용될 수 있는 몇몇 효과적인 폴리A 신호가 있다. 그러나, 합성 폴리아데닐화 부위도 또한 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Levitt et al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025]를 기초로 한 프로메가(Promega)의 pCI-neo 발현 벡터 참조). 폴리아데닐화 부위는 SV40폴리A 부위, 예컨대 SV40 후기 및 초기 폴리A 부위 (예를 들어, 문헌 [Subramani et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 854-864]에 기재된 바와 같은 플라스미드 pSV2-DHFR 참조), 합성 폴리A 부위 (예를 들어, 문헌 [Levitt et al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025]를 기초로 한 프로메가의 pCI-neo 발현 벡터 참조) 및 bgh 폴리A 부위 (소 성장 호르몬)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트는 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태는 진핵, 특히 포유동물 숙주 세포가 발현을 위해 사용되는 경우에 특히 적합하다. 고등 진핵세포로부터의 대부분의 유전자는 RNA 가공 동안에 제거되는 인트론을 함유한다. 각각의 구축물은 트랜스제닉 시스템에서 인트론이 결여된 동일한 구축물보다 더 효율적으로 발현된다. 통상적으로, 인트론은 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에 위치하지만, 3' 말단에도 또한 위치할 수 있다. 따라서, 인트론은 발현 카세트(들)에 포함되어 발현 속도를 증가시킬 수 있다. 상기 인트론은 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서 요소(들), 및 발현될 폴리펩티드의 오픈 리딩 프레임의 5' 말단 사이에 위치할 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 몇몇 적합한 인트론이 선행 기술에서 공지되어 있다.
한 실시양태에 따르면, 관심 대상의 산물을 발현시키기 위한 발현 카세트에 사용되는 인트론은 합성 인트론, 예컨대 SIS 또는 RK 인트론이다. RK 인트론은, 바람직하게는 관심 대상의 유전자의 ATG 개시 코돈 앞에 위치하는 강력한 합성 인트론이다. RK 인트론은 CMV 프로모터의 인트론 공여자 스플라이스 부위, 및 마우스 IgG 중쇄 가변 영역의 수용자 스플라이스 부위로 구성된다 (예를 들어, 문헌 [Eaton et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347], [Neuberger et al., 1983, EMBO J. 2(8), 1373-1378] 참조; 이것은 pRK-5 벡터 (BD 파밍겐(PharMingen))로부터 수득될 수 있음).
본 발명에 따른 발현 벡터 또는 벡터 조합은 그의 원형 형태로 숙주 세포에 형질감염될 수 있다. 수퍼코일 벡터 분자는 통상적으로 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제의 활성으로 인해 핵 내에서 선형 분자로 전환될 것이다. 그러나, 형질감염 전의 발현 벡터의 선형화는 종종 안정한 형질감염의 효율을 개선한다. 이는 또한 발현 벡터가 형질감염 전에 선형화되는 경우에, 선형화 지점이 제어될 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에 따르면, 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합은 형질감염 전에 벡터(들)의 선형화를 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 예정된 제한 부위를 포함한다. 상기 제한 부위가 벡터가 개방/선형화되는 위치를 결정하여, 구축물이 진핵, 특히 포유동물 세포의 게놈으로 통합될 때 발현 카세트의 순서/배열을 결정하기 때문에, 상기 선형화 제한 부위를 지능적으로 배치하는 것이 유리하다. 벡터가, 예를 들어 몇몇 상이한 산물/폴리펩티드의 발현을 위한 도구로서 의도된 표준 발현 벡터로서 사용되는 경우에, 낮은 절단 빈도를 갖는 효소를 위한 다수의 인식 부위를 포함하는 선형화 제한 부위를 제공하는 것이 유리하다. 바람직하게는, 선형화를 위해 선택된 제한 효소는 벡터의 적절한 선형화를 위해 효소가 한 번만 절단하는 것을 보증하기 위해 관심 대상의 산물, 선택 마커를 위한 발현 카세트 또는 다른 벡터 백본 서열 내에서는 절단하지 않아야 한다. 낮은 절단 빈도를 갖는 제한 효소를 위한 다수의 인식 부위를 포함하는 선형화 제한 부위를 제공함으로써, 사용자는 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내에서의 제한을 확실하게 방지하기 위해 제공된 선택사항으로부터 선형화를 위한 적합한 제한 효소를 선택할 수 있다. 그러나, 상기 개괄된 바와 같이, 추가의 제한 부위가 돌연변이될 수 있거나 또는 부분적인 제한효소 분해가 수행될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 선형화되었을 때, 증폭가능한 진핵 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5'에 위치하도록 선형화 부위가 배열된다. 상기 배열은 유전자 증폭을 위해 유리하다. 원핵 선택 마커가 추가로 사용되는 경우에, 상기 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3'에 위치한다. 이는 원핵 선택 마커 유전자가 3'에 위치하여 선형화된 벡터 핵산의 "포유동물" 부분의 "바깥쪽"에 있는 효과를 갖는다. 원핵 서열이 포유동물 세포에서 증가된 메틸화 또는 다른 침묵 효과를 유발할 수 있기 때문에, 원핵 유전자가 아마도 진핵, 특히 포유동물 발현을 위해 유리하지 않을 것이므로, 상기 배열이 바람직하다.
발현 벡터는 선행 기술에서 공지된 다른 선택 시스템을 갖는 본 발명에 따른 선택 방법의 조합을 가능케 하기 위해 부가 요소를 포함할 수 있다. 선행 기술에서 공지된 한 확립된 선택 방법은 유동세포계수법, 특히 형광 활성화 세포 분리 (FACS)의 사용을 기초로 한다. 유동세포계수법을 사용하는 선택 방법은 다수의 세포가 신속히 스크리닝될 수 있다는 장점을 갖는다. 고생산 세포 클론을 확인하는 데 특히 유용한 한 선택 방법에서, 관심 대상의 산물의 일부, 예를 들어 항체는 막 결합된 융합 폴리펩티드로서 발현된다. 그로 인해, 산물의 일부는 세포 표면 상에 융합 폴리펩티드로서 제시된다. 제조되는 융합 폴리펩티드의 양이 전반적인 발현 속도와 관련된 것처럼, 숙주 세포는 세포 표면 상에 제시된 융합 폴리펩티드의 양을 기초로 한 유동세포계수법을 통해 선택될 수 있다. 이는 고생산 숙주 세포의 신속한 선택을 가능케 한다. 본 발명에 따른 선택 시스템이 유동세포계수법의 이용을 기초로 하는 각각의 선택 방법과 유리하게 조합될 수 있다는 것이 발견되었다. FACS를 이용한 효율적인 선택을 가능케 하기 위해, 바람직하게는 특별한 발현 카세트가 관심 대상의 산물을 발현시키기 위해 이용된다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합은, 발현된 관심 대상의 산물의 일부가 막횡단 앵커를 포함하도록 설계된 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 발현 카세트를 포함한다. 몇몇 선택사항이 해당 결과를 달성하기 위해 존재한다.
한 실시양태에 따르면, 상기 발현 카세트는 적어도
(a) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
(b) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및
(c) 막 앵커 및/또는 막 앵커에 대한 신호를 코딩하는 정지 코돈 하류의 추가의 폴리뉴클레오티드
를 포함한다.
상기 발현 카세트의 설계는 번역 연속-판독(read-through) 과정 (정지 코돈이 "누출성"임)을 통해 관심 대상의 산물의 일부가 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 생산되는 효과를 갖는다. 결과로서, 상기 융합 폴리펩티드는 세포 표면 상에 제시되고, 막-앵커링된 융합 폴리펩티드를 높은 수준으로 제시하는 세포가 유동세포계수법, 바람직하게는 FACS에 의해 선택될 수 있다. 그로 인해, 높은 발현 속도를 갖는 숙주 세포가 선택된다. 상기 정지 코돈 기반 기술의 세부내용 및 바람직한 실시양태가 WO2005/073375 및 PCT/EP2009/006246에 기재되어 있다. 이것은 본 개시내용으로 인용된다.
대안적 실시양태에 따르면, 상기 발현 카세트는 적어도
(a) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
(b) 5' 스플라이스 공여자 부위 및 3' 스플라이스 수용자 부위를 포함하고 인-프레임 번역 정지 코돈 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 인트론, 및
(c) 막 앵커 및/또는 막 앵커에 대한 신호를 코딩하는 상기 인트론 하류의 폴리뉴클레오티드
를 포함한다.
상기 발현 카세트의 설계는 전사 및 전사체 가공을 통해 발현 카세트로부터 2종 이상의 상이한 성숙 mRNA (mRNA-POI) 및 (mRNA-POI-앵커)가 수득되는 효과를 갖는다. mRNA-POI의 번역은 관심 대상의 산물을 초래한다. mRNA-POI-앵커의 번역은 관심 대상의 산물 및 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드를 초래한다. 결과로서, 상기 융합 폴리펩티드는 다시 세포 표면에 제시되고, 막-앵커링된 융합 폴리펩티드를 높은 수준으로 제시하는 세포는 유동세포계수법, 바람직하게는 FACS에 의해 선택될 수 있다. 그로 인해, 높은 발현 속도를 갖는 숙주 세포가 선택된다. 상기 인트론 기반 기술의 세부내용 및 바람직한 실시양태가 WO2007/131774에 기재되어 있다. 이것은 본 개시내용으로 인용된다.
관심 대상의 산물로서의 항체의 발현을 위해 특히 유용한 바람직한 실시양태에 따르면, 막 앵커는 이뮤노글로불린 막횡단 앵커이다. 다른 적합한 막 앵커 및 이뮤노글로불린 막횡단 앵커의 바람직한 실시양태가 WO2007/131774, WO2005/073375 및 PCT/EP2009/006246에 기재되어 있다.
또한, 적어도
(a) 관심 대상의 산물을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
(b) 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
(c) 제1 선택 마커 (sm I)과 상이한 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
(여기서, 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받음)
를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
한 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 상기 세부내용 및 청구범위에 기재된 바와 같은 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합을 포함한다. 본 발명자들은 상기 개시내용을 인용한다.
또한, 숙주 세포는 하기 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다:
숙주 세포는, 바람직하게는 진핵 숙주 세포이다. 상기 진핵 세포는, 바람직하게는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 진균 세포 및 식물 세포는 폴레이트에 대해 독립영양적이다 (즉, 이러한 세포는 그의 세포 생존능, 즉 세포 성장 및 증식에 필요한 그 자신의 폴레이트를 자율적으로 합성할 수 있음). 본 발명은 특히 폴레이트에 대해 영양요구성이거나 영양요구성이 될 수 있는 이러한 진균 및 식물 세포를 포함한다. 이는 예를 들어, 유전자 조작에 기인하는 것일 수 있다 (즉, 세포가 이제 그의 세포 생존능에 필요한 충분한 양의 폴레이트를 합성할 수 없음). 예를 들어, 적절한 대상 경로를 통해 폴레이트를 내생적으로 생합성하는 이러한 진균 또는 식물 세포의 능력은, 예를 들어 적절한 표적 유전자의 유전자 파괴 또는 유전자 침묵, 또는 핵심 효소의 억제 등에 의해 불활성화될 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 상기 포유동물 세포는, 바람직하게는 설치류 세포, 인간 세포 및 원숭이 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 설치류 세포가 특히 바람직하며, 이는 바람직하게는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, 마우스 3T3 섬유모세포 세포 및 SP2/0 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 특히 바람직한 설치류 세포는 CHO 세포이다. 또한, 인간 세포가 바람직하며, 이는 바람직하게는 HEK293 세포, MCF-7 세포, PerC6 세포 및 HeLa 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가로 원숭이 세포가 바람직하며, 이는 바람직하게는 COS-1, COS-7 세포 및 베로(Vero) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
숙주 세포 및 혼입된 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)는 상용성일 것이며, 이는 숙주 세포와 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)의 선택된 조합이 선택 배양 조건 하에 각각의 마커를 발현하는 숙주 세포의 선택을 가능케 한다는 것을 의미한다. 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)의 발현은 선택 배양 조건 하에서 선택의 이점을 제공할 것이다. 따라서, 바람직하게는 선택 성장 조건 하에 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)에 의해 선택에 영향받기 쉬운 숙주 세포가 선택된다. 예를 들어, 특정 효소가 선택 마커 (sm I) 및/또는 (sm II)로서 사용되는 경우에, 숙주 세포는 각각의 효소를 내생적으로 발현하지 않을 수 있거나, 또는 적어도 세포가 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드의 충분한 발현 없이도 선택 배양 조건 하에 적절히 기능/성장하도록 상기 효소를 충분한 양으로 또는 충분한 활성을 갖도록 발현하지는 않을 수 있다. 따라서, 숙주 세포가 도입된 선택 마커 및 그에 따라 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 선택 성장 조건에서 생존하기 위한 충분한 수율로 발현하는 경우에만, 숙주 세포가 충분한 비율로 생존/증식할 수 있다. 적합한 숙주 세포의 선택/설계는 선택된 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)에 의존한다. 적합한 숙주 세포는 선행 기술에서 공지되어 있거나, 또는 예를 들어 유전 공학 (예를 들어, 돌연변이유발, 유전자 녹아웃, 유전자 침묵 등)에 의해 적절한 세포주를 개발함으로써 생성될 수 있다. 이들 원리는 선행 기술에서 널리 공지되어 있고, 따라서 여기서 상세하게 설명될 필요는 없다.
예를 들어, DHFR 유전자가 결여된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포) (예를 들어, 표적화된 게놈 결실에 의함, 또한 DHFR - 숙주 세포로도 불림)는 뉴클레오티드가 없는 배지에서 선택 마커 유전자로서의 DHFR 유전자의 형질감염을 위한 수용자로서 이용될 수 있다. 그러나, 적절한 선택 배양 조건이 이용된다면, DHFR 선택을 수행할 때 DHFR을 내생적으로 발현하는 숙주 세포 (DHFR + (플러스) 숙주 세포)를 사용하는 것도 또한 가능하다. 이러한 경우에, 바람직하게는 DHFR 효소는 DHFR + (플러스) 숙주 세포에 의해 발현된 내생 DHFR 효소보다 MTX에 덜 민감성인 선택 마커 (sm II)로서 이용된다. 이종성 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 제2 선택 마커 (sm II)로서 DHFR 유전자를 포함하는 본 발명에 따른 발현 벡터를 사용하여 형질감염시킨 후, 세포에 DHFR 억제제 농도의 점진적인 증가를 적용시킬 수 있다. 한 예로는 강력한 DHFR 억제제인 항폴레이트제, 예컨대 MTX가 있다 (Kd=1 pM). 배지 중 항폴레이트제, 예컨대 MTX의 존재는 세포가 생존하기 위해 DHFR를 증가된 수준으로 생산하도록 강요한다. 다회의 선택 라운드에서, 선택 마커 DHFR은 이를 달성하기 위해 중요한 유전자 증폭을 빈번히 겪는다. 선행 기술은 충분한 유전자 증폭을 달성하고 그에 따라 관심 대상의 산물의 생산을 증가시키기 위해, 오히려 높은 항폴레이트제/MTX 농도를 이용하여야 한다. 항폴레이트제가 독성이고, 숙주 세포를 변경시킬 수 있기 때문에 이는 단점이다. 동일 또는 합동 대사 경로 (바람직하게는, 폴레이트 대사)에 관련된 2종의 선택 마커 (sm I 및 sm II)를 조합하는 본 발명의 신규 접근법은, 낮은 억제제 (예를 들어, MTX) 수준에서도 선택 엄격도가 이미 상당히 증가된다는 장점을 갖는다. 따라서, 본 발명의 교시를 이용하면 매우 엄격한 선택 조건을 제공하기 위해 선행 기술의 접근법에 비해 더 적은 억제제 및 그에 따라 독성 작용제가 필요하다.
선택 마커 (sm I) 및 (sm II), 뿐만 아니라 이들의 조합에 대한 적합한 예는 상기 상세히 기재되어 있고; 본 발명자들은 상기 개시내용을 인용한다.
관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 숙주 세포에 안정하게 도입될 수 있다. 안정한 도입, 구체적으로는 형질감염은 발현 세포주의 확립, 및 특히 관심 대상의 산물의 대규모 및 그에 따른 산업적 생산을 위해 유리하다.
관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 숙주 세포에 포함된 동일한 발현 벡터 상에 또는 분리된 발현 벡터 상에 위치할 수 있다. 이들 실시양태를 고려한 세부내용이 상기 기재되어 있고; 본 발명자들은 상기 개시내용을 인용한다.
한 실시양태에 따르면, 사용된 숙주 세포의 세포 생존율 또는 증식 속도는 제1 선택 마커 (sm I)에 의해 숙주 세포에 혼입되는 화합물 (예컨대 예를 들어, 폴레이트)의 흡수에 의존적일 수 있다. 상기 개괄된 바와 같이, 제1 선택 마커 (sm I)은 화합물을 상기 숙주에 반입시킬 수 있는 수송체 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 상기 상세히 기재된 한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I)은 하나 이상의 폴레이트를 숙주 세포에 반입시키고, 바람직하게는 이는 상기 기재된 바와 같이 폴레이트 수용체이다. 이러한 실시양태는 DHFR을 제2 선택 마커 (sm II)로서 사용하는 경우에 특히 잘 작용한다. 바람직한 실시양태에 따르면, 제1 선택 마커 (sm I)은 폴산 수용체이고, 제2 선택 마커는 야생형 DHFR 효소보다 MTX에 덜 민감성인 DHFR 변이체이다. 각각의 마커 조합은 DHFR + (플러스) 세포와 조합하여 특히 바람직하다. 이러한 경우에, 바람직하게는 DHFR 효소는 DHFR + (플러스) 숙주 세포에 의해 발현된 내생 DHFR 효소보다 MTX에 덜 민감성인 선택 마커 (sm II)로서 이용된다. 세부내용은 상기 및 하기 기재되어 있다.
한 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 하나 이상의 내생 기능적 막-결합 폴레이트 수용체의 전체 활성이 결여되어 있다. 각각의 세포주는, 예를 들어 녹아웃 세포주를 생성하기 위해 선택/스크리닝 과정을 통하여 또는 유전 공학 기술에 의해 수득될 수 있다. 따라서, 예를 들어 하나 이상의 내생 기능적 막-결합 폴레이트 수용체를 포함하는 내생 단방향성 기능적 폴레이트 수송 시스템에서 전체 활성이 결여되어 있는 (즉, 약화되어 있는) 숙주 세포가 또한 제공된다. 예를 들어, 이러한 약화는 예를 들어 점 돌연변이, 유전자 파괴 등에 의해 해당 내생 폴레이트 수송 시스템, 예를 들어 내생 기능적 막-결합 폴레이트 수용체의 임의의 유형의 돌연변이유발에 의해 제공될 수 있다. 약화는 부분적이거나 전면적일 수 있다. 후자의 경우에, 본 발명에 따른 진핵 세포는 내생 기능적 단방향 작용성 폴레이트 수송 시스템, 예를 들어 내생 기능적 막-결합 폴레이트 수용체를 포함하지 않는다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 숙주 세포는, 예를 들어 상기 기재된 발현 벡터, 특히 하나 이상의 내생 기능적 막-결합 폴레이트 수용체(들)을 통해 상기 숙주 세포에 도입된 이종성 기능적 막-결합 폴레이트 수용체 외에도 하나 이상의 내생 기능적 단방향 작용성 폴레이트 수송 시스템을 포함한다. 본원에 기재된 선택 시스템이 심지어 이러한 내생 단방향 작용성 폴레이트 수송 시스템의 존재 하에, 즉, 이러한 내생 시스템이 유지되는 경우에도 이용될 수 있다는 것이 본 발명의 장점이다. 이는, 내생 시스템이 유지되고 그에 따라 기능적인 경우에, 비-선택적인 조건 하에서 관심 대상의 산물의 후속적인 생산을 위한 각각의 숙주 세포의 사용이 취급하기 더 쉽기 때문이다.
따라서, 추가의 바람직한 실시양태는 적어도 하나의 내생 단방향 작용성 폴레이트 수송 시스템을 포함하는 본 발명의 숙주 세포에 관한 것이고, 여기서 이러한 내생 단방향 작용성 폴레이트 수송 시스템은 바람직하게는 적어도 하나의 내생 기능적 막-결합 폴레이트 수용체를 포함한다. 그의 바람직한 실시양태에서, 내생 기능적 막-결합 폴레이트 수용체는 폴레이트 수용체 알파 및 폴레이트 수용체 베타로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 적합한 조합으로는, DHFR + (플러스) 숙주 세포에서 내생적으로 발현된 DHFR 효소보다 DHFR 억제제, 예컨대 MTX에 덜 영향받기 쉬운 제2 선택 마커 (sm II)로서의 돌연변이 DHFR과 조합된 제1 선택 마커 (sm I)로서의 폴레이트 수용체의 선택이 있다. 상기 숙주 세포는 또한 상기 개괄된 바와 같이 RFC+ (플러스)일 수 있다.
또한, 적어도
(a) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(b) 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 제1 선택 마커 (sm I)과 상이한 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(여기서, 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받음)
를 상기 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 숙주 세포를 생산하는 방법이 제공된다.
폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터를 진핵, 예컨대 포유동물 숙주 세포를 비롯한 숙주 세포에 도입하기 위한, 선행 기술에서 공지된 몇몇 적절한 방법이 있다. 각각의 방법에는 인산칼슘 형질감염, 전기천공, 리포펙션(lipofection), 유전자총(biolistic)- 및 중합체-매개 유전자 이동법이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 종래의 랜덤 통합 기반 방법 또한 재결합 매개 접근법이, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 게놈 내로 이동시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 재조합 방법은 트랜스진의 방향성 삽입을 매개할 수 있는 부위 특이적 리콤비나제, 예컨대 Cre, Flp 또는 ΦC31 (예를 들어, 문헌 [Oumard et al., Cytotechnology (2006) 50: 93 - 108] 참조)의 사용을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상동성 재조합의 메카니즘이 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 데 사용될 수 있다 (문헌 [Sorrell et al., Biotechnology Advances 23 (2005) 431 - 469] 참조). 재조합 기반 유전자 삽입은 숙주 세포에 이동/도입되는 이종성 핵산에 포함될 요소의 수를 최소화하는 것을 가능케 한다. 예를 들어, 단지 나머지 요소 (예를 들어, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)만이 숙주 세포에 이동/형질감염될 필요가 있도록, 이미 프로모터 및 폴리A 부위 (외생 또는 내생)를 제공하는 삽입 유전자좌가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 적합한 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합의 실시양태, 뿐만 아니라 적합한 숙주 세포가 상기 상세히 기재되어 있고; 본 발명자들은 상기 개시내용을 인용한다.
적합한 선택 마커 (sm I) 및 (sm II), 뿐만 아니라 이들의 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 상기 상세히 기재되어 있고; 본 발명자들은 상기 개시내용을 인용한다. 한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합은 숙주 세포에 도입된다. 발현 벡터 및 발현 벡터의 조합은 상기 및 청구범위에 상세히 기재되어 있다.
(a) 적어도
(i) 관심 대상의 산물을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
(ii) 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
(iii) 제1 선택 마커 (sm I)과 상이한 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
(여기서, 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받음)
를 포함하는 다수의 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)에 대해 선택적인 조건 하에서 상기 다수의 숙주 세포를 배양하고, 그로 인해 관심 대상의 산물을 발현하는 숙주 세포를 수득하는 단계
를 포함하는, 관심 대상의 산물을 발현할 수 있는 하나 이상의 숙주 세포를 선택하는 방법이 또한 제공된다.
본원에 사용된 용어 "선택하는" 또는 "선택"은, 특히 본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 조합을 혼입시킨 숙주 세포를 선택 및 그에 따라 수득하기 위해 선택 마커 및 선택 배양 조건을 이용하는 과정을 지칭한다. 그로 인해, 성공적으로 형질감염된 숙주 세포는 형질감염된 숙주 세포의 집단으로부터 단리 및/또는 풍부화될 수 있다.
본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 조합을 성공적으로 혼입시키지 않은 숙주 세포는 선택 배양 조건 하에 사멸하거나, 또는 본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 조합을 성공적으로 혼입시킨 숙주 세포에 비해 성장이 감쇠된다. 선택 동안, 본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 조합을 성공적으로 혼입시킨 숙주 세포는 형질감염된 숙주 세포의 집단으로부터 풀(pool)로서 풍부화될 수 있다. 또한, 개별 숙주 세포는 선택 동안에 (예를 들어, 클론 선택에 의해) 형질감염된 숙주 세포의 집단으로부터 단리될 수 있다. (예를 들어, FACS 분류 또는 한계 희석에 의해) 형질감염된 숙주 세포를 성공적으로 수득하기 위한 선택 절차의 적합한 실시양태는 선행 기술에서 널리 공지되어 있고, 따라서 상세한 설명이 필요하지 않다.
특히 선택 마커 (sm I) 및 (sm II), 및 이들의 조합의 선택에 관하여 적합한 숙주 세포 및 구체적 실시양태가 상기 상세히 기재되어 있다. 본 발명자들은 상기 개시내용을 인용한다.
사용된 숙주 세포 및 그에 따라 선택된 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)에 따라, 성장 조건은 숙주 세포에 선택 압력을 가하기 위해 적합화된다. 예를 들어, 선택 배양 배지는 선택 마커 (sm I) 및/또는 (sm II)로서 선택된 촉매 폴리펩티드를 위한 적합한 억제제를 포함할 수 있다. 예를 들어 항폴레이트제, 예컨대 MTX가, DHFR이 선택 마커 (sm II)로서 사용되는 경우에 DHFR의 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 사용된 배양 배지 중 상기 억제제의 농도 (이는 또한 점차 증가될 수 있음)에 따라, 선택 조건의 엄격도가 증가된다. 또한, 선택 압력을 유지하기 위해, 배양 배지는 선택 마커 (sm I) 및/또는 (sm II)의 활성을 무시하게 할 만큼 충분한 양의 대사물을 포함해서는 안 된다. 예를 들어, DHFR이 선택 마커 (sm II)로서 이용되는 경우에, 선택 배양 배지가 관련된 뉴클레오티드를 포함하지 않는 것이 유리하다. 상기 선택 전략을 방해하는 일반 대사물은 제어, 예를 들어 회피될 것이다.
또한, 제1 선택 마커 (sm I)이 수송체 폴리펩티드인 경우에, 선택 배양 배지는 제1 선택 마커 (sm I)이 숙주 세포 내로 폴레이트를 수송하는 경우에 제1 선택 마커 (sm I)에 의해 반입된 세포 성장에 필수적인 상기 화합물, 예를 들어 폴레이트를 한계 농도로 포함하여야 한다. 이러한 선택 조건을 선택하는 원리는 선행 기술에서 공지되어 있고, 또한 실험적으로 결정될 수 있고, 따라서 상세한 설명이 필요하지 않다. 현탁 세포를 빠르게 성장시키기에 특히 적합한 폴레이트 및 항폴레이트제의 적합한 농도가 또한 본원에 기재되어 있다.
선택 마커 (sm I) 및 (sm II)를 위한 선택 조건은 동시에 적용될 수 있다. 이는 선택 압력을 증가시키고, 최적 조건이 이용되는 경우에 하나의 선택 단계를 절약함으로써 더 빠른 선택 절차를 가능케 한다. 이는 적합한 세포주를 수득하기 위한 시간을 감소시킨다. 예를 들어, 선택 마커 조합 폴레이트 수용체/DHFR을 위해, 감소된 양의 폴레이트를 포함하고 DHFR의 억제제를 포함하는 성장 배지가 이용될 수 있다. 적합한 억제제는 항폴레이트제, 예컨대 예를 들어 MTX이다.
(sm I) 및 (sm II) 외에 추가의 선택 마커가 사용되는 경우에, 상기 선택 마커를 위한 선택 조건은 선택 마커 (sm I) 및/또는 (sm II)를 위한 선택 조건을 적용하기 전에 (예를 들어, 사전-선택 단계에서), 또는 적용함과 동시에 적용될 수 있다. 예를 들어, 추가의 선택 마커로서 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (neo)가 사용되는 경우에, 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합을 혼입시킨 세포를 선택하기 위해 세포는 우선, 예를 들어 G418을 함유하는 배지 중에서 성장할 수 있다. 상기 제1 배지는 또한 이미 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II) 중 적어도 하나에 대해 선택적일 수 있다. 이후에, 선택 마커 (sm I) 및/또는 (sm II)를 위한 선택 조건이 적용된다. 상기 절차는 선택 마커 (sm I) 및/또는 (sm II) 중 하나가 증폭가능한 선택 마커인 경우에 특히 유용하다.
상기 개괄된 바와 같이, 바람직하게는, (sm I)은 폴레이트 수송체, 특히 폴레이트 수용체이고, 따라서 본 발명의 한 실시양태는 세포 배양 배지 중 폴레이트의 제한된 이용가능성을 기초로 한다. 시스템은 특히 세포 생존율이 폴레이트의 흡수에 따라 좌우되는 진핵 세포에 광범위하게 적용가능할 것이다. 이러한 실시양태는 재조합 산물을 높은 수준으로 안정하게 과다발현하는 숙주 세포, 특히 진핵, 예를 들어 포유동물 세포 클론의 선택, 스크리닝 및 확립을 가속시키기 위해 이용될 수 있다. 추가로, 및 다른 공지된 선택 시스템과 대조적으로, 예를 들어 내생 유전자(들)을 돌연변이시키거나 녹아웃시킴으로써 제공되는 변형된 세포에 대한 어떠한 필수적인 필요 (이것이 때때로 가능할지라도)도 없다. 예를 들어, FR 알파가 류코보린에 대한 RFC의 친화력 (Kt = 1 μM)보다 더 높은 친화력을 FA에 대해 나타내고 (KD=0.1 nM), 단일 방향 경로를 통해 세포 내로 폴산을 수송하므로, 본 발명은 특히 성장 배지로부터의 점진적인 폴레이트 (예를 들어, 폴산) 박탈을 통해, 현저히 개선된 우성 대사성 선택 마커로서의 FR 알파 및 다른 폴레이트 수용체의 용도를 제공한다. 상기 폴레이트-기반 선택은 배양된 포유동물 세포에서 표적 단백질의 가속화되고, 안정하고, 높은 수준의 과다발현에 잘 적합화된 우수한 전략이다.
바람직하게는 공통 또는 합동 대사 과정 또는 경로에 관련된 2종의 어느 정도 상호의존적인 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)를 사용하는 본 발명의 전략은, 하나의 대사 경로를 표적으로 하는 선택 조건의 부가/상승 효과로 인해 매우 높은 엄격도가 얻어진다는 장점을 갖는다. 따라서, 선택에서 생존하는 세포 집단의 생산성은 현저하게 증가된다. 실시예는 선택 방법 후에 수득된 숙주 세포가 관심 대상의 산물을 고수율로 생산한다는 것을 보여주었다. 또한, 개별 숙주 세포의 평균 생산성이 증가된다. 따라서, 더 적은 스크리닝 노력으로 고생산자 클론을 발견할 기회가 향상된다. 따라서, 본 발명에 따른 선택 시스템은 선행 기술에서 사용된 선택 시스템에 비해 월등하다. 특히 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)로서의 DHFR 효소와 함께 폴레이트 수용체 사용의 바람직한 조합의 경우에, 각각의 선택 마커의 단독 사용에 비해 더 높은 생산성을 갖는 숙주 세포가 수득된다. 따라서, 선택 조건의 더 높은 엄격도로 인해, 선택 절차는 최적화된다.
최적 세포 배양 조건이 이용되는 경우에, 본 발명에 따른 선택 방법은 또한, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)에 대한 선택이 하나의 선택 단계에서 수행될 수 있기 때문에, 선행 기술에서 공지된 통상적인 선택 전략보다 더 빠르고 효율적으로 수행될 수 있다.
상기 방법은,
(c) 관심 대상의 산물을 목적 수율로 발현하는 하나 이상의 숙주 세포를 선택하는 단계
를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝/선택 절차의 결과로서 수득된 세포는 일반적으로 원래의 세포 집단의 선택되지 않은 세포로부터 단리될 것이고 풍부화될 수 있다. 이들은 개별 세포로서 단리 및 배양될 수 있다. 그러나, 풍부화된 집단을 이용하는 것도 또한 가능하다. 수득된 숙주 세포는 또한, 임의로 추가의 정량 또는 정성 분석을 위한 1회 이상의 추가 선택 라운드에 사용될 수 있거나, 또는 예를 들어 단백질 생산을 위한 세포주의 개발에 사용될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 상기 기재된 바와 같이 선택된 생산성 숙주 세포의 풍부화된 집단은 관심 대상의 폴리펩티드를 우수한 수율로 생산하기 위한 집단으로서 직접 이용된다.
바람직하게는, 관심 대상의 산물을 안정하게 발현하는 숙주 세포가 선택된다. 안정한 형질감염/발현의 장점은 상기 상세히 기재되어 있다. 본 발명자들은 상기 개시내용을 인용한다.
선택을 위한 방법의 가장 바람직한 실시양태에서, 다수의 숙주 세포는 본 발명에 따른, 즉, 본원에 개시된 바와 같은 숙주 세포를 포함한다. 본 발명자들은 특히 적합한 선택 마커 (sm I) 및 (sm II), 및 이들의 조합에 대한 상기 상세히 설명된 개시내용을 인용한다.
특히 숙주 세포 및 발현 벡터, 각각 발현 벡터의 조합에 관한 추가의 바람직한 실시양태가 상기 상세히 기재되어 있다. 본 발명자들은 상기 개시내용을 인용한다.
바람직하게는, 제1 선택 마커 (sm I)은 숙주 세포 내로 폴레이트를 수송할 수 있는 수송체/수용체이다. 본 발명에 따른 선택 시스템의 이러한 실시양태는 형질감염 이전에 내생 폴레이트 수용체 알파, 베타 또는 감마 유전자의 게놈 결실 또는 약화를 요구하지 않고, 따라서 심지어 일부 내생 폴레이트 수용체 유전자 발현이 존재하는 경우에도 임의의 수용자 세포에 적용될 수 있다 (상기 참조). 상기 주요 장점은, 폴레이트 수용체 알파 형질감염 후에 세포가 성장 배지로부터의 폴레이트 (예를 들어, 폴산)의 갑작스럽고 심각한 박탈에 노출될 수 있다는 사실을 기초로 한다. 결과적으로, 단지 상당한 양의 폴레이트 수용체 알파 선택 마커를 발현하는 형질감염된 세포만이 충분한 폴레이트를 수송하여 DNA 복제 및 세포 증식을 유지할 수 있다. 이는 내생 폴레이트 수용체 알파 유전자의 발현에 있어서 어떠한 유의한 상승도 존재하지 않는 경우에 일어난다. 추가로, 본 발명에 따른 선택 시스템의 이러한 실시양태에서는 내생 RFC의 증가된 발현을 비롯한 폴레이트 흡수의 대안적 경로의 증가된 발현을 통한 선택 압력의 완화에 기인한 선택 엄격성의 상실로부터 피해를 입지 않는다. 상기 중요한 장점은, 폴레이트 수용체 알파가 폴산에 대해 탁월한 친화성 (Kd=0.1 nM)을 갖는 반면, RFC는 폴산에 대해 극히 낮은 친화성 (Km=0.2 내지 0.4 mM)을 나타낸다는 사실에 기인한다.
(sm II)가 DHFR, 또는 핵산 합성 경로 또는 특히 폴레이트 대사의 또 다른 효소인 경우에, 선택 배양 배지는 선택 조건을 제공하기 위해 각각의 효소의 억제제, 예를 들어 항폴레이트제, 예컨대 예를 들어 MTX를 추가로 함유한다.
하나 이상의 선택 단계에 사용되는 선택 배양 배지는 하나 이상의 유형의 폴레이트를 포함할 수 있다. 선택 배양 배지에 한계 농도로 포함된 폴레이트는 숙주 세포에 흡수될 수 있고, 숙주 세포에 의해 가공될 수 있다. 숙주 세포에 의해 가공되지 않을 폴레이트 및 특히 폴레이트의 유도체는 선택 압력에 기여하지 않을 것이고, 따라서 한계 농도에 기여하지 않을 것이다. 선택 배양 배지는 하기 특징 중 하나 이상을 가질 수 있다:
(a) 이것은 폴레이트를 한계 농도로, 바람직하게는 약 500 nM 이하, 약 250 nM 이하, 약 150 nM 이하, 약 100 nM 이하, 약 75 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 25 nM 이하, 약 15 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 또는 약 2.5 nM까지의 농도로 포함하며, 여기서 상기 폴레이트는 바람직하게는 폴산이고/거나;
(b) 이것은 폴산을 약 500 nM 이하, 약 250 nM 이하, 약 150 nM 이하, 약 100 nM 이하, 약 75 nM 이하, 및 바람직하게는 약 50 nM 이하의 농도로 포함하고/거나;
(c) 이것은 DHFR 억제제를 포함하고/거나;
(d) 이것은 항폴레이트제를 포함하고/거나;
(e) 이것은 항폴레이트제를 약 500 nM 이하, 약 350 nM 이하, 약 200 nM 이하, 바람직하게는 약 150 nM 이하의 농도로 포함하고/거나;
(f) 이것은 항폴레이트제로서 MTX를 포함하고/거나;
(g) 이것은 MTX를 약 350 nM 이하, 200 nM 이하, 바람직하게는 약 150 nM 이하의 농도로 포함하고/거나;
(h) 이것은 폴산을 100 nM까지, 바람직하게는 50 nM까지의 농도, 및 항폴레이트제의 20배까지의 당량몰 농도로 포함한다.
폴레이트 및 특히 폴산의 바람직한 농도는,
(a) 약 500 nM 내지 100 pM;
(b) 약 250 nM 내지 1 nM; 바람직하게는 약 250 nM 내지 2.5 nM, 또는 약 250 nM 내지 5 또는 10 nM;
(c) 약 150 nM 내지 1 nM; 바람직하게는 약 150 nM 내지 2.5 nM, 또는 150 nM 내지 5 또는 10 nM;
(d) 약 100 nM 내지 1 nM; 바람직하게는 약 100 nM 내지 2.5 nM, 또는 약 100 nM 내지 5 또는 10 nM;
(e) 약 75 nM 내지 1 nM; 바람직하게는 약 75 nM 내지 2.5 nM, 또는 약 75 nM 내지 5 또는 10 nM;
(f) 약 50 nM 내지 1 nM; 바람직하게는 약 50 nM 내지 2.5 nM, 또는 약 50 nM 내지 5 또는 10 nM;
(g) 약 50 nM 내지 12.5 nM; 및
(h) 약 25 nM 내지 2.5 nM, 또는 약 25 nM 내지 5 nM
로부터 선택된다.
항폴레이트제 및 특히 MTX의 바람직한 농도는,
(a) 약 500 nM 내지 5 nM;
(b) 약 350 nM 내지 5 nM;
(c) 약 200 nM 내지 5 nM;
(d) 약 100 nM 내지 10 nM;
(e) 약 50 nM 내지 10 nM; 및
(f) 약 50 nM
로부터 선택된다.
상기 기재된 폴레이트 및 항폴레이트제의 바람직한 농도 및 농도 범위는 서로 조합될 수 있다. 한 실시양태에서, 약 12.5 nM 내지 50 nM의 폴레이트가 10 nM 내지 100 nM의 항폴레이트제 농도와 함께 사용된다. 기재된 바와 같이, 바람직하게는 폴산은 폴레이트로서, 및 MTX는 항폴레이트제로서 사용된다.
또한, 사용된 폴레이트 및 항폴레이트제 농도가 서로에게 영향을 미칠 수 있다는 것이 또한 발견되었다. 따라서, 폴레이트 및 항폴레이트제의 절대 농도 외에, 또한 비율이 적합한 선택 조건을 제공하기 위한 인자일 수 있다. 항폴레이트제 (바람직하게는, MTX)의 농도는 폴레이트 (바람직하게는, 폴산) 농도의 약 20배까지일 수 있다. 항폴레이트제 (바람직하게는, MTX) 농도는 폴레이트 (바람직하게는, 폴산) 농도의 약 10배일 수 있다. 바람직하게는, 선택 배양 배지는 1:10 내지 10:1의 농도 비율로, 바람직하게는 1:5 내지 5:1의 농도 비율로 폴레이트 및 항폴레이트제를 포함한다. 매우 우수한 결과가, 대략 당량몰 농도의 폴레이트 및 항폴레이트제가 사용되는 경우에 얻어진다. 실시예에 의해 나타낸 바와 같이, 이들 비율은 고생산 숙주 세포를 수득하기 위한 매우 적합한 선택 배양 조건을 제공한다. 본 발명이 본 발명의 방법에 따른 숙주 세포 선택에 적합한 각각의 선택 배양 배지를 또한 제공하기 때문에, 상기 기재된 선택 배양 배지는 또한 본 발명의 개별적인 요소를 구성한다.
상기 기재된 농도는 상업적 생산 세포주를 위한 바람직한 표현형인 현탁 세포를 빠르게 성장시키기에 특히 적합하다. 그러나, 상이한 세포주는 상이한 폴산 소모 특성을 가질 수 있다. 또한, 한계 농도는 사용되는 폴레이트 및 항폴레이트제에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 한계 농도의 폴레이트, 특히 폴산 및 항폴레이트제, 특히 MTX, 뿐만 아니라 적합한 폴산 대 MTX 비율은 선택된 숙주 세포 및 폴레이트, 각각 항폴레이트제에 따라 상이할 수 있다. 그러나, 적합한 농도는 당업자에 의해 실험적으로 쉽게 결정될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 형질감염 및/또는 선택 전에 폴레이트 무함유 배양 배지 중에서 또는 한계 농도의 폴레이트를 포함하는 배양 배지에서 사전-배양된다. 폴레이트의 적합한 한계 농도는 상기 기재되어 있다. 바람직하게는, 숙주 세포를 사전-배양하기 위한 상기 배양 배지는 폴레이트, 특히 폴산을 50 nM 이하의 농도로 포함한다.
상기에 개괄된 바와 같이, 본 발명에 따른 선택 방법은 선행 기술에서 공지된 유동세포계수법 기반 선택 방법과 조합될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 유동세포계수법을 포함하는 선택 단계는 관심 대상의 산물을 고수율로 발현하는 숙주 세포를 선택하기 위해 숙주 세포가 본 발명의 방법에 따라 선택된 후에 수행된다. 상기 목적을 위해, 바람직하게는 적어도 관심 대상의 산물의 일부는 숙주 세포의 세포 표면에 제시되는 막 앵커링된 융합 폴리펩티드로서 발현된다. 제시된 융합 폴리펩티드의 양을 기초로 하여, 관심 대상의 산물을 고수율로 발현하는 숙주 세포를 유동세포계수법을 이용하여, 바람직하게는 FACS을 이용하여 선택할 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 따라서
a) 적어도,
aa) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
bb) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및
cc) 막 앵커 및/또는 막 앵커에 대한 신호를 코딩하는 정지 코돈 하류의 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 발현 카세트; 또는
b) 적어도,
aa) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
bb) 5' 스플라이스 공여자 부위 및 3' 스플라이스 수용자 부위를 포함하고 인-프레임 번역 정지 코돈 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 인트론, 및
cc) 막 앵커 및/또는 막 앵커에 대한 신호를 코딩하는 상기 인트론 하류의 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 발현 카세트
로부터 발현된다.
이들 발현 카세트의 설계에 관한 세부내용은 상기 논의되었다. 이것은 각각의 개시내용에 인용된다. 선택을 위해, 숙주 세포는 적어도 관심 대상의 산물의 일부가 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되는 것인 관심 대상의 산물의 발현을 가능케 하도록 배양되며, 여기서 상기 융합 폴리펩티드가 상기 숙주 세포의 표면 상에 제시되고, 하나 이상의 숙주 세포가 세포 표면 상에 제시된 융합 폴리펩티드의 양을 기초로 하여 선택된다. 상기 논의된 바와 같이, 숙주 세포는 바람직하게는 유동세포계수법, 특히 FACS를 이용하여 선택된다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 선택 방법과 각각의 유동세포계수법 기반 선택 접근법의 조합은 매우 유리하였고, 매우 우수한 발현 속도를 갖는 숙주 세포가 확인되었다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 한계 농도의 폴레이트, 및 항폴레이트제를 포함하는 선택 배양 배지를 제공한다. 상기 개괄된 바와 같이, 한계 농도의 선택 배양 배지 중에 포함된 폴레이트는 숙주 세포에 흡수될 수 있고, 숙주 세포에 의해 가공될 수 있다. 숙주 세포에 의해 가공되지 않을 폴레이트, 및 특히 폴레이트의 유도체는 선택 압력에 기여하지 않을 것이고, 따라서 한계 농도에 기여하지 않을 것이다. 상기 선택 배양 배지는 바람직하게는 본 발명의 기재된 선택 방법과 관련하여 사용되는 선택 배양 배지에 대해, 특히 배지 중에 포함된 폴레이트 및 항폴레이트제의 농도 및 바람직한 실시양태에 관하여 상기 기재된 특징 중 하나 이상을 갖는다. 또한, 장점은 상기 상세히 개괄되었다. 이것은 또한 여기서 적용되는 상기 개시내용에 인용된다. 상기 선택 배양 배지는 본 발명의 선택 시스템과 함께 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 숙주 세포 및/또는 본 발명의 교시에 따른 숙주 세포를 관심 대상의 산물의 발현을 가능케 하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 관심 대상의 산물을 생산하는 방법이 제공된다.
관심 대상의 산물, 특히 폴리펩티드를 생산하기 위해 본 발명에 따른 숙주 세포를 사용하는 것은, 관심 대상의 산물이 매우 높은 수율로 생산될 수 있다는 장점을 갖는다. 이는 특히, 발현을 위해 적절한 숙주 세포를 선택하기 위한 본 발명에 따른 선택 방법을 수행하는 경우에 그러하다. 따라서, 본 발명은 관심 대상의 폴리펩티드를 생산하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 적합한 숙주 세포는 상기 기재되어 있고; 본 발명자들은 상기 개시내용을 인용한다.
발현된 관심 대상의 산물은 숙주 세포를 파열시킴으로써 수득될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 발현, 예를 들어 배양 배지로 분비될 수 있고, 그로부터 수득될 수 있다. 또한, 각각의 방법의 조합이 가능하다. 그로 인해 산물, 특히 폴리펩티드는 고수율로 효율적으로 생산되고 수득/단리될 수 있다. 수득된 산물은 또한 관심 대상의 산물을 목적하는 품질로 생산하기 위해 추가의 가공 단계, 예컨대 예를 들어 정제 및/또는 변형 단계에 적용될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 상기 숙주 세포는 혈청-무함유 조건 하에 배양된다.
관심 대상의 산물을 생산하는 방법은 하기 단계 중 적어도 하나를 포함할 수 있다:
- 상기 세포 배양 배지로부터 및/또는 상기 숙주 세포로부터 관심 대상의 산물을 단리하는 단계; 및/또는
- 단리된 관심 대상의 산물을 가공하는 단계.
본 발명에 따라 생산된 관심 대상의 산물, 예를 들어 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해 회수되고, 추가로 정제, 단리 및/또는 변형될 수 있다. 예를 들어, 산물은 원심분리, 여과, 한외-여과, 추출 또는 침전을 비롯한 (이에 제한되지 않음) 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다. 정제는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 배제), 전기영동 절차 (예를 들어, 정제용 등전점 포커싱), 차등적 용해도 (예를 들어, 황산암모늄 침전) 또는 추출을 비롯한 (이에 제한되지 않음) 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 수행될 수 있다.
관심 대상의 산물은 전사, 번역 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 유전자 정보의 임의의 다른 발현 사건에 의해 생산될 수 있는 임의의 생물학적 산물일 수 있다. 이러한 점에서, 산물은 발현 산물일 것이다. 관심 대상의 산물은 폴리펩티드 및 핵산, 특히 RNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 산물은 제약상 또는 치료학적으로 활성인 화합물, 또는 검정 등에 사용될 연구용 도구일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 산물은 폴리펩티드, 바람직하게는 제약상 또는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드, 또는 진단 또는 다른 검정 등에 사용될 연구용 도구이다. 폴리펩티드는 따라서 임의의 특정 단백질 또는 단백질 군으로 제한되지 않으며, 그 반대로 본원에 기재된 방법에 의해 선택 및/또는 발현하기를 원하는, 임의의 크기, 기능 또는 기원의 임의의 단백질일 수 있다. 따라서, 몇몇 상이한 관심 대상의 폴리펩티드가 발현/생산될 수 있다. 용어 폴리펩티드는 펩티드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리펩티드에는 단백질 (예를 들어, 50개 초과의 아미노산을 가짐) 및 펩티드 (예를 들어, 2 내지 49개의 아미노산)를 비롯하여, 임의 길이의 폴리펩티드가 포함된다. 폴리펩티드에는, 예를 들어 생물활성 폴리펩티드, 예컨대 효소 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 프로테아제, 키나제, 포스파타제), 수용체 단백질 또는 펩티드, 수송체 단백질 또는 펩티드, 살균 및/또는 내독소-결합 단백질, 구조 단백질 또는 펩티드, 면역 폴리펩티드, 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 백신 등을 비롯하여, 임의의 활성 또는 생물활성의 단백질 및/또는 펩티드가 포함된다. 상기 폴리펩티드는 펩티드 호르몬, 인터류킨, 조직 플라스미노겐 활성화제, 시토카인, 이뮤노글로불린, 특히 항체 또는 그의 기능적 항체 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 가장 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 분자 또는 항체, 또는 그의 기능적 단편, 예를 들어 키메라, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 인간화된 항체이다. 이러한 항체는 진단용 항체, 또는 제약상 또는 치료학적으로 활성인 항체일 수 있다.
또한, 상기 및 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되는 산물이 제공된다. 상기 산물은 바람직하게는 폴리펩티드, 특히 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편이다.
본 발명의 추가 측면은 관심 대상의 산물을 발현할 수 있는 숙주 세포를 선택하기 위한, 제1 선택 마커 (sm I)과 상이한 제2 선택 마커 (sm II)와 조합하여 제1 선택 마커 (sm I)의 용도에 관한 것이며, 여기서 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성은 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받는다.
제1 선택 마커 (sm I) 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)는 하기 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다:
(a) 제1 선택 마커 (sm I) 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)는
(aa) 핵산 합성 및/또는 폴리펩티드 합성;
(ab) 뉴클레오티드 합성 및/또는 아미노산 합성; 및
(ac) 폴레이트 대사
로부터 선택된 대사 과정 또는 경로에 관련되고/거나;
(b) 제1 선택 마커 (sm I) 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)는 촉매 폴리펩티드 또는 수송체 폴리펩티드이고/거나;
(c) 제2 선택 마커 (sm II)는
(ca) 제1 선택 마커 (sm I)에 의해 숙주 세포에 반입된 화합물, 또는 상기 혼입된 화합물로부터 수득된 후속 산물인 기질, 및/또는
(cb) 제1 선택 마커 (sm I)의 활성에 의해 생산된 기질, 또는 그의 전구체
를 가공하는 촉매 폴리펩티드이고/거나;
(d) 제1 선택 마커 (sm I)은 제2 선택 마커 (sm II)의 상류에서 작동하고/거나;
(e) 제1 선택 마커 (sm I)은 세포 생존율 및/또는 증식에 관련되고/거나 필수적인 화합물을 숙주 세포에 반입시키는 수송체 폴리펩티드이거나 이를 포함하고/거나;
(f) 제1 선택 마커 (sm I)은 하나 이상의 폴레이트를 숙주 세포 내로 수송하거나 혼입시키고/거나;
(g) 제1 선택 마커 (sm I)은 기능적 막-결합 폴레이트 수용체이거나 이를 포함하고/거나;
(h) 제2 선택 마커 (sm II)는 폴레이트 및/또는 폴레이트로부터 수득된 후속 산물인 기질을 가공하는 촉매 폴리펩티드이고/거나;
(i) 제1 선택 마커 (sm I)은 하기 특성:
(ia) 폴레이트 수용체는 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 수용체 베타, 폴레이트 수용체 감마 및 상기한 것들의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나,
(ib) 폴레이트 수용체는 인간 폴레이트 수용체 또는 그의 기능적 변이체이고/거나,
(ic) 폴레이트 수용체는 인간 폴레이트 수용체 알파 또는 그의 기능적 변이체이고/거나,
(id) 폴레이트 수용체는 서열 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 폴레이트 수용체 또는 상기한 것의 기능적 변이체임;
중 하나 이상을 갖는 폴레이트 수용체이거나 이를 포함하는, 기능적 막-결합 폴레이트 수용체이고/거나:
(j) 선택 마커(들) (sm I) 및/또는 (sm II)는 핵산 합성 및/또는 폴레이트 대사에 관련된 촉매 폴리펩티드, 바람직하게는 DHFR 또는 그의 기능적 변이체 또는 단편이거나 이를 포함하고/거나;
(k) 제1 선택 마커 (sm I)은 핵산 합성에 관련되고/거나 필수적인 화합물을 숙주 세포에 혼입시키는 수송체 폴리펩티드이거나 이를 포함하고, 제2 선택 마커 (sm II)는 핵산 합성에 관련된 촉매 폴리펩티드이고/거나;
(l) 제1 선택 마커 (sm I) 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)는 진핵 선택 마커이고/거나;
(m) 제1 선택 마커 (sm I) 및/또는 제2 선택 마커 (sm II)는 증폭가능한 선택 마커이다.
이들 실시양태의 세부내용, 조합 및 장점이 상기 기재되어 있다. 본 발명자들은 상기 개시내용을 인용한다. 폴레이트 수송체, 예컨대 폴레이트 수용체와 DHFR 또는 그의 기능적 변이체 또는 유도체가 특히 바람직하다.
본원에 언급된 텍스트 및 문서의 전문이 본원에 참조로 포함되고, 따라서 본 개시내용의 일부를 형성한다.
하기 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서 본 발명을 예시하는 역할을 한다. 특히, 본 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 것이다.
실시예
일반적으로, 적합한 물질, 예컨대 시약은 당업자에게 익숙하고, 시판되며, 제조업체의 설명서에 따라 사용될 수 있다. 본 실시예를 기재된 설명에 따라 수행하였다.
1. 실시예 1 - 선택
CHO 세포에서의 동시-형질감염 실험을, 동일한 관심 대상의 단백질 (모노클로날 항체)을 위한, 그러나 상이한 선택 마커의 조합을 위한 동일 발현 카세트를 갖는 벡터를 사용하여 수행하였다. 상기 실험은 세포 배양 배지 중 MTX 및 한계 폴산 농도의 조합된 선택이 관심 대상의 산물, 여기서는 이뮤노글로불린 분자를 고도로 과다발현하는 세포 집단의 생성을 가능케 하고, 이들 집단의 생산성이 DHFR 또는 폴산 수용체 알파 (FolR)를 단독으로 대사 선택 마커로서 사용하는 전략에 비해 더 높다는 것을 입증하였다.
1.1. 물질 및 방법
1.1.1. 벡터 구축:
벡터 I은 DHFR (dhfr + (플러스) 세포주를 위한 돌연변이체) 발현 카세트를 함유한다. 진핵 세포, 특히 CHO 세포에서의 발현에 적합한 상기 플라스미드 벡터 (벡터 I)는 다음을 포함한다:
(i) IgG1 유형의 분비성 재조합 인간 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트, 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 발현 카세트. 재조합 항체의 발현은 CMV 프로모터 및 표준 (SV40) 폴리아데닐화 신호의 제어 하에 있음;
(ii) 선택 마커 유전자 (sm II)로서 DHFR (MTX에 대해 더 낮은 민감성을 갖는 돌연변이된 형태)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 별개의 발현 카세트. DHFR의 발현은 SV40 프로모터 및 표준 (SV40) 폴리아데닐화 신호의 제어 하에 있음.
플라스미드 벡터 (벡터 II)는 DHFR 대신에 제1 선택 마커 (sm I)로서 인간 폴산 수용체 알파를 포함한다. 따라서, 두 벡터 모두는 G418 내성 유전자 (neo)를 함유하지만, 상이한 추가의 마커, 즉 DHFR 또는 인간 폴산 수용체 알파를 함유한다. 벡터 I 및 벡터 II는 하기 주요 요소를 포함한다:
Figure pct00004
1.1.2. CHO-세포의 형질감염 및 선택:
세포 배양, 형질감염 및 스크리닝을 통상적인 배양 배지 중에서 현탁 성장 CHO 세포를 사용하여 진탕 플라스크에서 수행하였다. 숙주 세포에서 세포내 폴산 저장소를 감소시키고 사전-배양 배지로부터 선택 배지로의 폴산의 동시-이동을 방지하기 위해, 형질감염 및 선택 전에 폴산 무함유 배지 또는 감소된 폴산 함량 (예를 들어, 50 nM)을 갖는 폴산 배지로 세포를 통과시켰다.
세포를 전기천공에 의해 벡터 I 및 벡터 II로 동시-형질감염시켰다. 세포 생존율에 따라, 형질감염 24 내지 48시간 후에 G418 및 10 nM 폴산 함유 선택 배지를 세포에 첨가하여 제1 선택 단계를 시작하였다. 세포가 80％ 초과의 생존율로 복구되자마자, 100 nM MTX 및 10 nM 폴산을 함유하는 G418 무함유 배지로 세포를 통과시켜 제2 선택 단계를 적용시켰다. 세포가 더 엄격한 조건 하에 복구되지 않는 경우에, 폴산 농도를 20 nM로, 및 후속적으로 100 nM로 증가시킬 수 있다. 여전히 어떠한 성장도 볼 수 없지만 증가하는 생존율을 볼 수 있는 해당 풀에서, 세포를 11.3 μM 폴산을 함유하고 MTX를 함유하지 않는 배양 배지로 이동시켰다. 상기 이동 후, 성장하기 시작한 동시-형질감염된 세포 집단을 추가 분석을 위해 증량시켰다.
1.1.3. 풀 생산성의 측정:
선택된 세포 집단의 생산성을, G418과 MTX 없이 11.3 μM 폴산을 함유하는 배지 중에서의 과다성장시킨 진탕 플라스크 회분식 배양물을 통해, 제1 및 최종 선택 단계 후에 분석하였다.
회분식 배양물을 50 ml 작업 부피로 진탕 플라스크 125에 시딩하고, 진탕기 캐비넷 (습윤화되지 않음)에서 150 rpm 및 10％ CO2 하에 배양하였다. 세포의 생존율은 검정을 시작할 때 >90％여야 한다. 시딩 세포 밀도는 대략 2x105 c/ml였다. 역가 측정을 제13일에 수행하였다. 세포 배양 상청액의 항체가를 배양을 시작한지 13일 후에 단백질-A HPLC에 의해 측정하였다.
1.2. 결과
DHFR 및 FolR을 선택 마커로서 사용하는 선택 전략의 효능을 입증하기 위해, DHFR (벡터 I) 및 FolR (벡터 II)을 코딩하는 벡터, 및 동일한 모노클로날 항체의 동시-형질감염을 수행하였다. 두 벡터 모두는 또한 G418 내성 유전자를 함유하였다 (상기 참조).
1.2.1. 제1 선택 단계:
우선, 형질감염된 세포 집단을 G418을 첨가하고 폴산 농도를 10 nM로 감소시킴으로써 선택하였다. 상기 초기 사전-선택 단계는 형질감염되지 않은 세포를 사멸시키는 것을 돕고, 동시에 제2 선택 단계에서 더 엄격한 선택 조건을 적용시키기 전에 세포가 이들의 세포내 폴산 저장소를 소모하도록 강요한다. 이들 제1 선택 조건 하에서, 통상적으로 모든 형질감염된 세포 집단이 복구되었고, 생산성을 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 평가하였다. G418 및 10 nM 폴산 함유 배지 중에서 선택된 형질감염된 세포를 진탕 플라스크 회분식 배양물에서 분석하였다. 배양 제13일에, 배양 배지의 샘플을 취하고, 단백질-A HPLC에 의해 항체 함량에 대해 분석하였다. 표 1은 각각의 실시예에서 얻은 생산성 결과를 요약한다:
<표 1>
Figure pct00005
모든 세포 집단은 항체를 생산하였다. DHFR 벡터 (벡터 I)과 함께 FolR 벡터 (벡터 II)로 형질감염된 세포는 선택에 대해 통상적인 선행 기술 방법 (예를 들어, DHFR 단독)보다 더 높은 평균 생산성으로 응답하였다. 배양 배지 중의 제한된 폴산 함량은 FolR을 과다발현하는 세포의 성장을 촉진하였다.
1.2.2. 제2 선택 단계:
선택 엄격도를 증가시키기 위해, 다음 단계는 G418을 제거하고, 배양 배지에 100 nM MTX를 첨가하고, 폴산 농도를 10 nM에서 유지하는 것이었다. 이들 조건 하에, 모든 형질감염된 집단의 세포의 생존율은 극적으로 하락하였고, 낮은 수준에 머물렀다. 추가로, 어떠한 세포 성장도 통상적으로 검출되지 않았다. 선택 압력은 폴산 함량을 우선 20 nM로, 이어서 100 nM로 증가시킴으로써 감소시킬 수 있다. 생산성 평가를 위해 선택된 집단의 성장을 촉진시키기 위해, 회복된 생존 세포를 MTX가 없고 11.3 μM 폴산을 함유하는 배지로 이동시켰다. 이중 형질감염으로부터 이미 부분적으로 회복된 한 풀을 개별적으로, 및 100 nM 폴산을 함유하는 배지 중에서 유지한 반면, 각각의 벡터 조합의 다른 풀들은 세포 밀도를 증가시키고 그로 인해 생존 기회를 증가시키기 위해 합하였다. 이중 형질감염된 세포는 빠른 성장으로 응답하였고, 이를 추가로 증량시키고 생산성을 분석하였다. 표 2는 결과를 보여준다:
<표 2>
Figure pct00006
G418 및 10 nM 폴산 선택된 세포 집단을, 100 nM MTX를 첨가하고 폴산 농도를 계단식으로 증가시킴으로써 추가로 선택하였다. 최종적으로, 세포를 MTX 무함유 및 11.3 μM 폴산 함유 배지로 이동시키고, 복구된 집단을 진탕 플라스크 회분식 배양물에서 분석하였다. 배양 제13일에, 배양 배지의 샘플을 취하고, 단백질-A HPLC에 의해 항체 함량에 대해 분석하였다.
상기 선택 과정 후에 이중 형질감염된 세포 집단의 생산성은 놀라울 만큼 높았다. 제1 선택 단계에 비해, 항체가는 풀 1의 경우에 대략 20배 (1 g/L 초과에 도달함), 합한 풀 2 내지 5의 경우에는 10배 증가하였다. 또한, 예를 들어 선택 마커로서 G418과 함께 DHFR을 단독으로 사용하는 훨씬 더 집중적으로 최적화된 선택 절차와 비교하여, 본 발명에 따른 벡터 조합을 사용한 이중 선택 후에 밝혀진 생산성이 훨씬 더 높았다. 동일한 항체에 대해 DHFR/G418 조합을 사용한 이전 실험은 상당히 낮은 풀 역가를 초래하였다.
따라서, DHFR 및 FolR을 선택 마커로서 사용하는 조합된 선택은 관심 대상의 단백질을 고도로 과다발현하는 세포를 생성하였다. 상기 조합은 또한 선행 기술 선택 시스템 (예를 들어, DHFR/G418)에 비해 월등하다.
2. 실시예 2: 선택 조건의 최적화
2.1. 형질감염, 선택 및 클론 특성화
2.1.1. 형질감염 및 선택:
선택 조건의 최적화를 위해, 폴산 및 MTX 농도의 추가의 조합을 2개의 순차적인 선택 단계에서 시험하였다. 우선, 0.8 g/L G418을 함유하는 배지 중에서, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM 및 11.3 μM (기준)의 폴산 농도를 2.5 nM, 5 nM 또는 10 nM MTX와, 또는 MTX 없이 조합하였다. 제2 선택 단계에서 이들 조건 하에 복구된 세포 집단을 제1 선택 단계에서와 같이 G418이 없고 동일한 폴산 농도를 갖지만 10배 더 높은 MTX 농도를 갖는 배지로 이동시켰다. 기준 세포를 DHFR 선택 표준 프로토콜에 따라 500 nM MTX를 함유하는 배지로 이동시켰다.
2.1.2. 클로닝 및 클론 특성화
96-웰 플레이트에 웰당 0.5개 세포의 밀도로 시딩한 세포를 사용한 한계 희석에 의해 클로닝을 수행하였다. 후속적으로, 생산성 스크리닝을 위해 세포를 우선 24-웰 플레이트로 증량시키고, 이어서 진탕 플라스크로 증량시켰다.
클론의 생산성을 다양한 포맷을 이용하여 회분식 및 유가식 실험에서 분석하였다. 초기 스크리닝은 세포를 진탕 24-웰 플레이트에 시딩함으로써 24-웰 플레이트 회분식 검정법으로 수행하였다. 세포 배양 상청액 중의 항체가를 배양을 시작한지 10일 후에 정량적 단백질 A-HPLC에 의해 측정하였다. 최고 생산성 클론을 회분식 및 유가식 모드로 진탕 플라스크 모델에서 분석하였다. 11.3 μM 폴산을 함유하는 배양 배지 중의 회분식 배양물을 100 mL 또는 50 mL 작업 부피로 진탕 플라스크 (500 mL 또는 250 mL 용량)에 시딩하고, 진탕기 캐비넷 (습윤화되지 않음)에서 150 rpm, 36.5℃ 및 10％ CO2 하에 배양하였다. 세포의 생존율은 검정을 시작할 때 >90％였다. 시딩 세포 밀도는 2x105 c/mL였다. 항체가, 세포 수 및 생존율을 규정된 배양 시점에 측정할 수 있었다. 유가식 실험은 4x105 c/mL의 출발 세포 밀도를 이용하고 7x106 c/mL 초과의 생존 세포 밀도에서 출발하여 공급물을 주기적으로 첨가하는 것을 제외하고는, 동일한 조건을 이용하여 수행하였다. 클론 안정성은 대략 매 2주마다 진탕 플라스크 회분식 모델을 이용하여 생산성을 측정하면서 19주까지의 기간에 걸쳐 세포를 배양함으로써 평가하였다.
2.2. 결과:
2.2.1. 제1 선택 단계
형질감염된 세포를 12.5 nM 내지 50 nM 범위의 폴산 농도에서 2.5 nM 내지 10 nM의 MTX 농도와 조합하여 제1 선택 단계에서 선택하였다. 기준으로서, 또한 11.3 μM 폴산 (FA)을 시험하였다. 제1 선택 단계 후에 얻은 생산성을 표 3에 요약하였다.
<표 3>
Figure pct00007
최고의 생산성은 10 nM MTX를 사용한 선택 후에 얻어진 것으로 밝혀졌다. 벡터 I 및 벡터 II로 동시-형질감염된 세포는 놀라울 만큼 많은 양의 산물 (887 mg/L까지)을 생산하였다. 이는 DHFR 단독으로 형질감염된 세포 (dhfr 단독 기준)의 생산성보다 유의하게 더 많다.
2.2.2. 제2 선택 단계:
세포를 G418 무함유 배지로 이동시키고, 제1 선택 단계의 폴산 농도를 유지하지만 MTX 농도를 10배 증가시킴으로써 복구된 집단에 제2 선택 단계를 적용시켰다. 이들 조건 하에 복구된 세포 집단에 대해 생산성을 분석하였다. 결과를 표 4에 요약하였다.
<표 4>
Figure pct00008
놀랍게도, 적절한 선택 조건 하에서, 벡터 I 및 벡터 II로 형질감염된 세포 및 그에 따라 본 발명에 따른 조합은 단독으로 벡터 I로 형질감염된 세포에 비해 훨씬 더 높은 생산성 (1.5 g/L까지)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이는 선택 마커로서의 DHFR 및 FolR의 조합이 고도로 증가된 선택 엄격도를 제공한다는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명은 선행 기술에 비해 상당한 개선을 제공한다.
2.2.3. 클론 생산성의 비교
선택 후에 동시-형질감염된 풀로부터 한계 희석 클로닝에 의해 클론을 생성하였다. 24 웰 플레이트 스크리닝에서 확인된 최고 생산성 클론을 진탕 플라스크로 추가로 증량시켰다. 과다성장 진탕 플라스크 회분식 검정에서 생산성을 분석하고, 이전 실험에서 개별 벡터를 사용하여 얻은 상위 클론의 결과와 비교하였다.
<표 5>
Figure pct00009
선택 마커로서 dhfr 및 folR을 함유하는 벡터를 동시-형질감염시키고, 형질감염된 세포를 한계 폴산 농도 + MTX 하에 선택하여, 최고 생산성 클론을 수득하였다.
2.2.4. 클론 생산 안정성 분석
상위 10개의 dhfr/folR 동시-형질감염되고 선택된 클론의 클론 생산 안정성을 바이알 해동으로부터 시작하여 19주의 기간에 걸쳐 측정하고, 첫 번째 생산성 평가는 해동 후 제5주에 하였다. 세포를 50 nM 폴산 및 50 nM MTX의 선택 조건 하에 배양하였다. 생산성 검정을 11.3 μM 폴산을 함유하는 배양 배지를 사용하여 수행하였다.
<표 6>
Figure pct00010
분석된 10개의 클론 중 8개는 19주에 걸쳐 높은 생산 안정성을 보였고, 10개의 클론 모두는 12주에 걸쳐 충분한 안정성을 보였다.
3. 실시예 3 - 조합 벡터 및 FACS 분류를 이용한 선택
3.1. 벡터 구축:
하나의 백본 상에 선택 마커 DHFR 및 FolR을 함유하는 벡터 III을 생성하였고, 이는 또한 FACS 분류를 이용한 추가의 선택을 가능케 한다. 상기 벡터 III은 "누출성" 정지 코돈 및 이뮤노글로불린 막횡단 앵커를 포함하는 항체 중쇄를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함한다. 본 명세서에서 상기 개괄된 바와 같이, 발현 카세트의 상기 설계는 (번역 연속 판독 과정으로 인해) 항체의 일부가 숙주 세포의 세포 표면에 앵커링되는 융합 단백질로서 생산되는 효과를 갖는다. 벡터 III은 하기 주요 요소를 포함한다:
Figure pct00011
상기 DHFR/FolR-FACS 벡터 (벡터 III)를, 제2 선택 마커로서 neo 유전자를 함유하는 DHFR-FACS 기준 벡터 (벡터 IV)와 비교하였다. 벡터 IV는 하기 주요 요소를 포함한다:
Figure pct00012
또한, 2종의 발현 벡터 및 FACS 분류를 이용한 동시-형질감염 실험을 위해, DHFR 유전자를 포함하지 않지만 neo 유전자 및 huFolR를 포함하는 벡터 V를 고안하였다. 벡터 V는 하기 주요 요소를 포함한다:
Figure pct00013
3.2. 선택, 클로닝 및 클론 특성화:
조합 벡터 III으로 형질감염된 세포를 12.5 nM 폴산 및 5 nM MTX를 함유하는 배지 중에서 선택하였다. 기준 벡터로 감염된 세포를 12.5 nM 폴산, 5 nM MTX 및 0.8 g/L G418을 함유하는 배지 중에서 선택하였다. FACS 풍부화 주기 후에 적용된 제2 선택 단계에서, MTX 농도를 50 nM로 증가시키면서, 폴산 농도를 일정하게 유지하고, G418을 제거하였다. 복구된 세포 집단 (풀)을 진탕 플라스크 회분식 배양물에서 생산성에 대해 스크리닝하였다.
세포의 FACS 분석, 풍부화 및 클로닝
세포의 표지: 형질감염된 풀당 2x10E7개 세포를 원심분리하고, 냉각된 PBS 5 mL로 세척하고, 냉각된 PBS 1 mL 중에 재현탁시켰다. 적합한 양의 FITC 표지된 항-IgG 항체를 세포에 첨가하고, 암실에서 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포를 실온에서 PBS 5 mL로 2회 세척하고, PBS 1 mL 중에 재현탁시키고, 여과하고, 분석용 FACS 튜브에 분배하고, 분류하고, 클로닝하였다. FACSDiva 소프트웨어를 사용하는 자동 세포 침착 유닛 (Automatic Cell Deposition Unit; ACDU)이 장착된 FACSAria (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))을 이용하여 세포 분류를 수행하였다. 488 nm로 조정된 저출력의 공랭식 고체 레이저 (코헤런트® 사파이어 ™(Coherent® Sapphire ™) 고체)를, 2차 항체에 결합된 플루오레세인 염료를 여기시키기 위해 사용하였다. 상대적 FITC 형광 강도를 530/30 BP 필터를 통해 E 검출기 상에서 측정하였다. 최대 강도의 FITC 형광 세포의 5％를 블록에서 또는 96 웰 플레이트에서 단세포로서 게이팅하고 분류하였다.
클론은 FACS 풍부화된 풀로부터의 한계 희석에 의해, 또는 풍부화되거나 풍부화되지 않은 풀로부터의 FACS 클로닝에 의해 생성하였다.
항체 생산 및 클론 안정성의 측정
클론의 생산성을 다양한 포맷을 이용하여 회분식 및 유가식 실험에서 분석하였다. 진탕 24-웰 플레이트에 세포를 시딩하여 24-웰 플레이트 회분식 검정에서 초기 스크리닝을 수행하였다. 세포 배양 상청액 중의 항체가를 배양을 시작한지 10일 후에 정량적 단백질 A-HPLC에 의해 측정하였다. 최고 생산성 클론을 후속적으로 회분식 및 유가식 모드로 진탕 플라스크 모델에서 분석하였다. 배양 배지 내에 11.3 μM 폴산을 함유하는 회분식 배양물을 100 mL 또는 50 mL 작업 부피로 진탕 플라스크 (500 mL 또는 250 mL 용량)에 시딩하고, 진탕기 캐비넷 (습윤화되지 않음)에서 150 rpm, 36.5℃ 및 10％ CO2 하에 배양하였다. 세포의 생존율은 검정을 시작할 때 >90％여야 한다. 시딩 세포 밀도는 2x105 c/mL였다. 항체가, 세포 수 및 생존율을 규정된 배양 시점에 측정할 수 있었다. 유가식 실험은 4x105 c/mL의 출발 세포 밀도를 이용하고 7x106 c/mL 초과의 생존 세포 밀도에서 출발하여 공급물을 주기적으로 첨가하는 것을 제외하고는, 동일한 조건을 이용하여 수행하였다. 클론 안정성은 대략 매 2주마다 진탕 플라스크 회분식 모델을 이용하여 생산성을 측정하면서 19주까지의 기간에 걸쳐 세포를 배양함으로써 평가하였다.
3.3. 결과:
DHFR/FolR 조합 벡터 (벡터 III)로 형질감염된 5개의 세포 집단, 및 기준 벡터 (벡터 IV)로 형질감염된 3개의 세포 집단을 상기 기재된 바와 같이 생성 및 선택하였다. 진탕기 플라스크 회분식 배양물에서 복구된 세포 풀의 생산성을 표 5에 요약하였다.
<표 7>
Figure pct00014
DHFR/FolR 조합 벡터 (벡터 III)의 사용은 단지 하나의 선택 단계 후에 이미 놀라울 만큼 우수한 생산성을 유발하였다.
FACS 풍부화 주기, 및 10배 증가된 MTX 농도와 함께 제2 선택 단계를 적용시켜 풀을 추가로 가공하였다. 다시, 조합 벡터가 동시-형질감염 접근과 마찬가지로 우수하게 작용하는 매우 높은 풀 생산성을 얻었다 (표 8 참조).
<표 8>
Figure pct00015
FACS 풍부화된 풀로부터 한계 희석에 의해 클론을 생성하고, 1차 스크리닝을 위해 24-웰 플레이트로 증량시켰다. 최고 생산자를 진탕 플라스크로 추가로 증량시켰다. 진탕 플라스크 회분식 배양물에서 생산성을 분석하고, FACS 클로닝에 의한 dhfr 기준 벡터를 사용한 이전 실험에서 수득된 상위 클론의 결과와 비교하였다.
진탕 플라스크 회분식 모델에서 조합 벡터 III으로 형질감염된 클론의 생산성은, 단지 DHFR 유전자만을 포함하는 기준 벡터 IV로 형질감염된 클론에 비해 유의하게 높았다 (표 9 참조).
<표 9>
Figure pct00016
벡터 III으로 형질감염된 클론을, 저온보존된 바이알을 해동시키고 진탕 플라스크 회분식 모델에서 생산성을 모니터링하여, 클론 생산 안정성에 대해 추가로 분석하였다. 해동 후 제5주부터 해동 후 제19주까지 생산성을 모니터링하고, 저온보존 전의 생산성과 비교하였다. 높은 폴산 함량 (11.3 μM)을 갖는 배지 중에서 진탕 플라스크 회분식 배양을 수행하는 동안, 클론을 선택 조건 하에 배양하였다.
<표 10>
Figure pct00017
12개의 분석된 클론 중 단 하나만이 19 주의 기간에 걸쳐 생산성에서 25％ 초과의 손실을 보여주었고, 다른 모두는 높은 생산 안정성을 보여주었다.
IV. 실시예 4 - 형질감염된 CHO 세포를 사용한 폴리펩티드의 대규모 생산
폴리펩티드의 대규모 생산은, 예를 들어 웨이브(wave), 유리 또는 스테인리스 스틸 생물반응기에서 수행할 수 있었다. 상기 목적을 위해 세포를 통상적으로 단일 냉동 바이알, 예를 들어 마스터 세포 은행(Master Cell Bank)으로부터의 바이알로부터 출발하여 증량시켰다. 세포를 해동시키고 여러 단계를 통해 증량시켰다. 상이한 규모의 생물반응기에 적절한 양의 세포를 접종시켰다. 세포 밀도는 생물반응기에 공급액 및 첨가제를 첨가함으로써 증가시킬 수 있었다. 세포는 장시간 동안 높은 생존율로 유지되었다. 1 리터당 수백 밀리그램 내지 1 리터당 수 그램 범위의 반응기 내의 산물 농도가 대규모로 달성되었다. 친화성, 이온 교환, 소수성 상호작용 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있는, 표준 크로마토그래피 방법에 의해 정제를 수행할 수 있었다. 생물반응기의 크기는 최종 규모로 수천 리터의 부피까지 가능하다 (또한 예를 들어, 문헌 [F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11, 2004, 1393-1398] 참조).
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> Novel selection vectors and methods of selecting eukaryotic host cells <130> 51 438 K <150> EP 09 153 995.7 <151> 2009-02-27 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val 1 5 10 15 Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu 20 25 30 Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly 35 40 45 Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala 50 55 60 Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr 65 70 75 80 Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys 85 90 95 Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn 100 105 110 Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg 115 120 125 Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu 130 135 140 Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp 145 150 155 160 Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln 165 170 175 Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile 180 185 190 Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg 195 200 205 Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu 210 215 220 Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala 225 230 235 240 Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu 245 250 255 Ser <210> 2 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Trp Lys Trp Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Val Cys Val Ala 1 5 10 15 Thr Met Cys Ser Ala Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met 20 25 30 Asp Ala Lys His His Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His 35 40 45 Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr 50 55 60 Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp 65 70 75 80 Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln 85 90 95 Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln 100 105 110 Gln Val Asn Gln Thr Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp Val Pro Leu 115 120 125 Cys Lys Glu Asp Cys Gln Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His 130 135 140 Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val 145 150 155 160 Asn Lys Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe 165 170 175 Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys 180 185 190 Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe 195 200 205 Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala 210 215 220 Ala Ala Met His Val Asn Ala Gly Glu Met Leu His Gly Thr Gly Gly 225 230 235 240 Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Gln Leu Trp Leu Leu Gly 245 250 255 <210> 3 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Met Ala Trp Gln Met Met Gln Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val 1 5 10 15 Thr Ala Ala Gly Ser Ala Gln Pro Arg Ser Ala Arg Ala Arg Thr Asp 20 25 30 Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Thr Gln Pro Ser 35 40 45 Pro Glu Asp Glu Leu Tyr Gly Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala 50 55 60 Cys Cys Thr Ala Ser Thr Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg 65 70 75 80 Leu Tyr Asn Phe Asn Trp Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Thr Cys 85 90 95 Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Ser Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn 100 105 110 Leu Gly Pro Trp Ile Arg Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg 115 120 125 Ile Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu 130 135 140 Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp 145 150 155 160 Asn Trp Thr Ser Gly Ile Asn Glu Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Ser 165 170 175 Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu 180 185 190 Trp Ser His Ser Phe Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg 195 200 205 Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu 210 215 220 Val Ala Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Met Asn Ala Gly Ala Pro Ser Arg 225 230 235 240 Gly Ile Ile Asp Ser 245

Claims (21)

  1. 적어도
    (a) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 혼입시키기 위한 삽입 부위;
    (b) 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (c) 제1 선택 마커 (sm I)과 상이한 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
    를 포함하고, 여기서 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성이 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받고, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)가 폴레이트 대사에 관련된 것인, 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합.
  2. 제1항에 있어서, 제1 선택 마커 (sm I)이 폴레이트 수송체이고, 제2 선택 마커 (sm II)가 폴레이트, 폴레이트의 유도체 및/또는 폴레이트의 가공에 의해 수득될 수 있는 산물인 기질을 가공하는 것인, 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 선택 마커 (sm I)이 폴레이트 수송체이고, 제2 선택 마커 (sm II)가 DHFR, 또는 그의 기능적 변이체 또는 유도체인, 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 선택 마커 (sm I)이 폴산 수용체이고, 제2 선택 마커가 야생형 DHFR 효소 및/또는 숙주 세포에 의해 내생적으로 발현된 DHFR 효소보다 MTX에 덜 민감성인 DHFR 변이체인, 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 선택 마커 (sm I)이 인간 폴레이트 수용체 또는 그의 기능적 변이체이거나, 또는 이를 포함하고/거나, 제1 선택 마커가 서열 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖거나 포함하는 폴레이트 수용체 또는 상기한 것의 기능적 변이체인, 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가, 적어도
    (a) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
    (b) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 하류의 하나 이상의 정지 코돈, 및
    (c) 막 앵커 및/또는 막 앵커에 대한 신호를 코딩하는, 정지 코돈 하류의 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 발현 카세트에 포함되는 것인, 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합.
  7. 적어도
    (a) 관심 대상의 산물을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
    (b) 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
    (c) 제1 선택 마커 (sm I)과 상이한 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드
    를 포함하고, 여기서 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성이 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받고, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)가 폴레이트 대사에 관련된 것인, 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합이 도입된 숙주 세포.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, CHO 세포, 바람직하게는 DHFR + (플러스) 세포인 숙주 세포.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 선택 마커 (sm I)이 폴산 수용체이고, 제2 선택 마커 (sm II)가 야생형 DHFR 효소 및/또는 숙주 세포에 의해 내생적으로 발현된 DHFR 효소보다 MTX에 덜 민감성인 DHFR 변이체인, DHFR+ (플러스) 세포인 숙주 세포.
  11. 적어도
    (a) 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (b) 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (c) 제1 선택 마커 (sm I)과 상이한 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
    를 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포에 도입시키는 단계를 포함하고, 여기서 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성이 다른 선택 마커의 활성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받고, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)가 폴레이트 대사에 관련된 것인, 상기 숙주 세포를 생산하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합을 숙주 세포에 도입시키는 방법.
  13. (a) 적어도
    (i) 관심 대상의 산물을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 제1 선택 마커 (sm I)을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드;
    (iii) 제1 선택 마커 (sm I)과 상이한 제2 선택 마커 (sm II)를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드
    를 포함하고, 여기서 선택 마커 (sm I) 또는 (sm II)의 활성이 다른 선택 마커의 활성에 적어도 부분적으로 의존하고, 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)가 폴레이트 대사에 관련된 것인 다수의 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b) 선택 마커 (sm I) 및 (sm II)에 대해 선택적인 조건 하에 상기 다수의 숙주 세포를 배양하고, 그로 인해 관심 대상의 산물을 발현하는 숙주 세포를 수득하는 단계
    를 포함하는, 관심 대상의 산물을 발현할 수 있는 하나 이상의 숙주 세포를 선택하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    (c) 관심 대상의 산물을 발현하는 하나 이상의 숙주 세포를 선택하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 다수의 숙주 세포가 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 포함하는 것인 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 선택 단계에서 한계 농도의 폴레이트 및 항폴레이트제를 포함하는 선택 배양 배지를 사용하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 선택 배양 배지가 500 nM 이하, 바람직하게는 100 nM 이하의 농도의 폴레이트를 포함하고/거나, 선택 배양 배지가 500 nM 이하의 농도, 바람직하게는 200 nM 이하의 농도의 항폴레이트제를 포함하는 것인 방법.
  18. (a) 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 및/또는
    (b) 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 선택된 숙주 세포
    를 관심 대상의 산물의 발현을 가능케 하는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 관심 대상의 산물을 생산하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    (a) 상기 세포 배양 배지로부터 및/또는 상기 숙주 세포로부터 관심 대상의 산물을 단리하는 단계; 및/또는
    (b) 단리된 관심 대상의 산물을 가공하는 단계
    중 적어도 하나를 포함하는 방법.
  20. 500 nM 이하의 농도의 항폴레이트제 및 500 nM 이하의 한계 농도의 폴레이트를 포함하는 선택 배양 배지.
  21. 제20항에 있어서, 200 nM 이하의 농도의 항폴레이트제 및/또는 100 nM 이하의 한계 농도의 폴레이트를 포함하는 선택 배양 배지.
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