JP2012518992A - 2種類の選択マーカーを含む発現ベクター系 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)目的産物をコードするポリヌクレオチド、あるいは目的産物をコードするポリヌクレオチドを組入れるための挿入部位と、
(b)第一の選択マーカー(smI)をコードするポリヌクレオチドと、
(c)第一の選択マーカー(smI)とは異なる第二の選択マーカー(smII)をコードするポリヌクレオチドと、
を含む発現ベクターまたは少なくとも2種類の発現ベクターの組み合わせであって、
選択マーカー(smI)または(smII)の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受け、選択マーカー(smI)および(smII)が葉酸代謝に関与する発現ベクターまたは少なくとも2種類の発現ベクターの組み合わせに関連する。
(a)目的産物をコードする導入ポリヌクレオチドと、
(b)第一の選択マーカー(smI)をコードする導入ポリヌクレオチドと、
(c)第一の選択マーカー(smI)とは異なる第二の選択マーカー(smII)をコードする導入ポリヌクレオチドと、
を含む宿主細胞、特に哺乳類宿主細胞であって、
選択マーカー(smI)または(smII)の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受け、選択マーカー(smI)および(smII)が葉酸代謝に関与する、宿主細胞、特に哺乳類宿主細胞に関する。
(a)少なくとも
(i)目的産物をコードする導入ポリヌクレオチドと、
(ii)第一の選択マーカー(smI)をコードする導入ポリヌクレオチドと、
(iii)第一の選択マーカー(smI)とは異なる第二の選択マーカー(smII)をコードする導入ポリヌクレオチドと、
を含む複数の宿主細胞を提供するステップであって、
選択マーカー(smI)または(smII)の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受け、選択マーカー(smI)および(smII)が葉酸代謝に関与する、複数の宿主細胞を提供するステップと、
(b)選択マーカー(smI)および(smII)に選択的な培養条件下で前記複数の宿主細胞を培養し、これによって目的産物を発現する宿主細胞を得るステップと、
を含む、目的産物を発現することのできる少なくとも1個の宿主細胞を選抜するための方法が提供される。
(a)目的産物をコードするポリヌクレオチド、あるいは目的産物をコードするポリヌクレオチドを組入れるための挿入部位と、
(b)第一の選択マーカー(smI)をコードするポリヌクレオチドと、
(c)第一の選択マーカー(smI)とは異なる第二の選択マーカー(smII)をコードするポリヌクレオチドと、
を含む発現ベクターまたは少なくとも2種類の発現ベクターの組み合わせであって、
選択マーカー(smI)または(smII)の活性が他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受ける、発現ベクターまたは少なくとも2種類の発現ベクターの組み合わせが提供される。
(a)核酸合成および/またはポリペプチド合成、
(b)ヌクレオチド合成および/またはアミノ酸合成ならびに
(c)葉酸代謝、
から選択された代謝過程または経路に関与する。
(a)第一の選択マーカー(smI)によって宿主細胞に取り込まれた化合物または前記取り込まれた化合物から得られるその後生じる産物である基質および/または
(b)第一の選択マーカー(smI)の活性によって得られる基質またはその前駆物質
を加工する触媒ポリペプチドである。
(a)目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
(b)目的産物をコードするポリヌクレオチド下流の少なくとも1個の終止コドンと、
(c)膜アンカーおよび/または膜アンカーのシグナルをコードする、終止コドン下流のさらに別のポリヌクレオチドと、
を含む。
(a)目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
(b)5’スプライスドナー部位および3’スプライスアクセプター部位を含み、インフレーム翻訳終止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含むイントロンと、
(c)膜アンカーおよび/または膜アンカーのシグナルをコードする、前記イントロン下流のポリヌクレオチドと、
を含む。
(a)目的産物をコードする導入ポリヌクレオチドと、
(b)第一の選択マーカー(smI)をコードする導入ポリヌクレオチドと、
(c)第一の選択マーカー(smI)とは異なる第二の選択マーカー(smII)をコードする導入ポリヌクレオチドと、
を含む宿主細胞であって、
選択マーカー(smI)または(smII)の活性が、他方の選択マーカー活性によって少なくとも部分的に影響を受ける宿主細胞もまた提供される。
(a)目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
(b)第一の選択マーカー(smI)をコードするポリヌクレオチドと、
(c)第一の選択マーカー(smI)とは異なる第二の選択マーカー(smII)をコードするポリヌクレオチドと、
を導入するステップを含む、上述の宿主細胞を作製するための方法であって、
選択マーカー(smI)または(smII)の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受ける方法もまた提供される。
(i)目的産物をコードする導入ポリヌクレオチドと、
(ii)第一の選択マーカー(smI)をコードする導入ポリヌクレオチドと、
(iii)第一の選択マーカー(smI)とは異なる第二の選択マーカー(smII)をコードする導入ポリヌクレオチドと、
を含む、複数の宿主細胞を提供するステップであって、
選択マーカー(smI)または(smII)の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受けるステップと、
(b)選択マーカー(smI)および(smII)に選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養、したがって目的産物を発現する宿主細胞を得るステップと、
を含む、目的産物を発現することのできる少なくとも1個の宿主細胞を選抜するための方法もまた提供される。
(c)目的産物を所望の収率で発現する少なくとも1個の宿主細胞を選抜するステップ
を追加的に含むことができる。
(a)好ましくは約500nM以下、約250nM以下、約150nM以下、約100nM以下、約75nM以下、約50nM以下、約25nM以下、約15nM以下、約10nM以下、約5nM以下または最大約2,5nMの濃度である、限界濃度の葉酸塩、好ましくは葉酸を含むこと、および/または
(b)約500nM以下、約250nM以下、約150nM以下、約100nM以下、約75nM以下、好ましくは約50nM以下の濃度の葉酸を含むこと、および/または
(c)DHFR阻害剤を含むこと、および/または
(d)葉酸代謝拮抗剤を含むこと、および/または
(e)約500nM以下、約350nM以下、約200nM以下、好ましくは約150nM以下の濃度の葉酸代謝拮抗剤を含むこと、および/または
(f)葉酸代謝拮抗剤としてMTXを含むこと、および/または
(g)約350nM以下、200nM以下、好ましくは約150nM以下の濃度のMTXを含むこと、および/または
(h)最大100nM、好ましくは最大50nMの濃度の葉酸、そして葉酸代謝拮抗剤の最大20倍の等モル濃度の葉酸を含むこと
のうち1または複数を有することができる。
(a)約500nM〜100pM、
(b)約250nM〜1nM、好ましくは約250nM〜2,5nMまたは約250nM〜5もしくは10nM、
(c)約150nM〜1nM、好ましくは約150nM〜2,5nMまたは約150nM〜5もしくは10nM、
(d)約100nM〜1nM、好ましくは約100nM〜2,5nMまたは約100nM〜5もしくは10nM、
(e)約75nM〜1nM、好ましくは約75nM〜2,5nMまたは約75nM〜5もしくは10nM、
(f)約50nM〜1nM、好ましくは約50nM〜2,5nMまたは約50nM〜5もしくは10nM、
(g)約50nM〜12.5nMおよび
(h)約25nM〜2.5nMまたは約25nM〜5nM
から選択される。
(a)約500nM〜5nM、
(b)約350nM〜5nM、
(c)約200nM〜5nM、
(d)約100nM〜10nM、
(e)約50nM〜10nMおよび
(f)約50nM
から選択される。
a)少なくとも
aa)目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
bb)目的産物をコードするポリヌクレオチド下流の少なくとも1個の終止コドンと、
cc)膜アンカーおよび/または膜アンカーのシグナルをコードする、終止コドン下流のポリヌクレオチドと、
を含む発現カセット
または
b)少なくとも
aa)目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
bb)5’スプライスドナー部位および3’スプライスアクセプター部位を含み、インフレーム翻訳終止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含むイントロンと、
cc)膜アンカーおよび/または膜アンカーのシグナルをコードする、前記イントロン下流のポリヌクレオチドと、
を含む発現カセット
から発現する。
− 目的産物を前記細胞培養培地からおよび/または前記宿主細胞から単離するステップおよび/または
− 単離された目的産物を加工するステップ
のうち少なくとも一方を含むことができる。
(a)第一の選択マーカー(smI)および/または第二の選択マーカー(smII)は、
(aa)核酸合成および/もしくはポリペプチド合成と、
(ab)ヌクレオチド合成および/もしくはアミノ酸合成と、
(ac)葉酸代謝と、
から選択された代謝過程または経路に関与する、ならびに/または
(b)第一の選択マーカー(smI)および/もしくは第二の選択マーカー(smII)は、触媒ポリペプチドまたはトランスポーターポリペプチドである、ならびに/または
(c)第二の選択マーカー(smII)は、
(ca)第一の選択マーカー(smI)によって宿主細胞へと移入された化合物または前記取り込まれた化合物から得られるその後の産物である基質、および/もしくは
(cb)第一の選択マーカー(smI)の活性によって生成された基質またはその前駆物質
を加工する触媒ポリペプチドである、ならびに/または
(d)第一の選択マーカー(smI)は、第二の選択マーカー(smII)の上流で作用する、ならびに/または
(e)第一の選択マーカー(smI)は、細胞生存および/または増殖に関与するおよび/もしくは必須の化合物を宿主細胞に移入するトランスポーターポリペプチドである、あるいはそれを含む、ならびに/または
(f)第一の選択マーカー(smI)は、少なくとも1種類の葉酸塩を宿主細胞に輸送する/取り込む、ならびに/または
(g)第一の選択マーカー(smI)は、機能的膜結合型葉酸レセプターである、あるいはそれを含む、ならびに/または
(h)第二の選択マーカー(smII)は、葉酸塩および/もしくは葉酸塩から得られたその後の産物のいずれかである基質を加工する触媒ポリペプチドである、ならびに/または
(i)第一の選択マーカー(smI)は、次の特性
(ia)葉酸レセプターは、葉酸レセプターα、葉酸レセプターβ、葉酸レセプターγおよび前述の機能的変異体からなる群から選択される、および/もしくは
(ib)葉酸レセプターは、ヒト葉酸レセプターまたはその機能的変異体である、および/もしくは
(ic)葉酸レセプターは、ヒト葉酸レセプターαまたはその機能的変異体である、および/もしくは
(id)葉酸レセプターは、配列番号1、2もしくは3または前述の機能的変異体のアミノ酸配列を有するまたは含む葉酸レセプターである
のうち、1または複数を有する葉酸レセプターである、あるいはそれを含む機能的膜結合型葉酸レセプターである、ならびに/または
(j)選択マーカー(単数または複数)(smI)および/もしくは(smII)は、核酸合成および/もしくは葉酸代謝に関与する触媒ポリペプチド、好ましくはDHFRまたはその機能的変異体もしくは断片である、あるいはそれを含む、ならびに/または
(k)第一の選択マーカー(smI)は、核酸合成に関与するおよび/もしくは必須の化合物を宿主細胞に組入れるトランスポーターポリペプチドである、あるいはそれを含み、第二の選択マーカー(smII)は、核酸合成に関与する触媒ポリペプチドである、ならびに/または
(l)第一の選択マーカー(smI)および/もしくは第二の選択マーカー(smII)は、真核生物の選択マーカーである、ならびに/または
(m)第一の選択マーカー(smI)および/もしくは第二の選択マーカー(smII)は、増幅可能な選択マーカーである
のうち、少なくとも一特性を有することができる。
CHO細胞における同時トランスフェクション実験は、同一目的タンパク質(モノクローナル抗体)の同一発現カセットを有するが、選択マーカーの異なる組み合わせのベクターを用いて行われる。この実験は、細胞培養培地におけるMTXと限定的な葉酸濃度を組み合わせた選抜によって、目的産物、この場合は免疫グロブリン分子を高度に過剰発現する細胞集団が作製されること、またこれら集団の生産性が、DHFRまたは葉酸レセプターα(FolR)を代謝選択マーカーとして単独で用いる戦略と比べてより高いことを示す。
1.1.1.ベクター構築
ベクターIは、DHFR(dhfr+(プラス)細胞系の変異型)発現カセットを含む。真核生物細胞、特にCHO細胞における発現に適した前記プラスミドベクター(ベクターI)は、次のエレメントを有する。
(i)IgG1型の分泌性組換えヒト抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび軽鎖をコードする発現カセットを含む発現カセット。組換え抗体の発現は、CMVプロモーターおよび標準的な(SV40)ポリアデニル化シグナルの制御下に置かれる。
(ii)DHFR(MTXに対してより低い感受性を有する変異型)をコードするポリヌクレオチドを選択マーカー遺伝子(smII)として含む別個の発現カセット。DHFRの発現は、SV40プロモーターおよび標準的な(SV40)ポリアデニル化シグナルの制御下に置かれる。
細胞培養、トランスフェクションおよびスクリーニングは、従来の培地中で浮遊成長しているCHO細胞を用いてシェイカーフラスコで行われる。宿主細胞における細胞内葉酸貯蔵を低減させるため、そして前培養培地から選抜培地への葉酸の同時移動を防ぐため、細胞は、トランスフェクションおよび選抜の前に、葉酸を含まない培地または葉酸含有量を低下させた培地(例えば、50nM)へと継代される。
第一および最終選抜ステップの後、11.3μM葉酸を含み、G418およびMTXを含まない培地において過成長したシェイカーフラスコのバッチ培養物から、選抜された細胞集団の生産性を解析する。
DHFRおよびFolRを選択マーカーとして用いる選抜戦略の有効性を示すため、DHFR(ベクターI)やFolR(ベクターII)と共に同一モノクローナル抗体をコードするベクターの同時トランスフェクションが行われる。両方のベクターは、G418耐性遺伝子も含む(上述を参照)。
先ず、G418を添加し、葉酸濃度を10nMに低減させることによって、トランスフェクトされた細胞集団が選抜される。この最初の前選抜ステップは、第二の選抜ステップにおいてよりストリンジェントな選抜条件が適用される前に非トランスフェクト細胞を死滅させるのに有用であり、同時に細胞に自身の細胞内葉酸蓄積を消費させる。トランスフェクトされた全細胞集団はこれらの第一の選抜条件下で回復し、通常、材料と方法に記載されている通り生産性が評価される。G418および10nM葉酸含有培地において選抜されたトランスフェクトされた細胞は、シェイカーフラスコバッチ培養において解析される。培養13日目に、培地のサンプルを採取し、プロテインA HPLCによって抗体含有量を解析する。表1は、各事例において得られた生産性の結果をまとめたものである。
選抜ストリンジェンシーを上げるために、次のステップは、G418を除去するためのものであるが、100nM MTXを培地に添加して葉酸濃度を10nMに維持するためのものである。これらの条件下で、トランスフェクトされた全集団における細胞の生存率は劇的に低下し、低レベルを維持する。さらに、通常、細胞成長は検出されない。葉酸含有量を先ず20nMに、続いて100nMに増加させることによって選択圧を低下させてよい。生産性評価のために選抜された集団の成長を促進させるため、回復した生細胞を、MTXを含まないが11.3μM葉酸を含む培地に移すことができる。すでに二重トランスフェクションから部分的に回復した1プールは別個に100nM葉酸を含む培地で維持し、それに対し各ベクターの組み合わせによる他のプールは細胞密度を増やすよう組み合わせ、これによって生存確率を上げる。速い成長で応答する二重トランスフェクトされた細胞をさらに増殖させ、生産性を解析する。表2は結果を示す。
2.1.トランスフェクション、選抜およびクローン特性評価
2.1.1.トランスフェクションおよび選抜
選抜条件の最適化のため、二連続選抜ステップにおいて葉酸およびMTX濃度の追加的な組み合わせを試験する。先ず、0.8g/L G418を含む培地において、12.5nM、25nM、50nMおよび11.3μM(参照)の葉酸濃度を、2.5nM、5nMもしくは10nM MTXまたはMTXなしと組み合わせる。第二の選抜ステップにおいてこれらの条件下で回復した細胞集団を、G418を含まず第一の選抜ステップと同じ葉酸濃度を含むが10倍高いMTX濃度の培地に移す。DHFR選抜標準プロトコールに従って、参照細胞を500nM MTXを含む培地に移す。
1ウェル当たり0.5細胞の密度で96ウェルプレートに細胞を播種することにより限界希釈法によってクローニングを行う。その後、生産性スクリーニングのために先ず24ウェルプレートで、続いてシェイカーフラスコで細胞を増殖させる。
2.2.1.第一の選抜ステップ
トランスフェクトされた細胞は、第一の選抜ステップにおいて2.5nMから10nMのMTX濃度と組み合わせた12.5nMから50nMの範囲の葉酸濃度で選抜される。参照として、11.3μM葉酸(FA)も試験される。第一の選抜ステップの後に得られた生産性を表3にまとめる。
G418を含まない培地に細胞を移し、第一の選抜ステップの葉酸濃度は維持しつつMTX濃度を10倍に増加させることによって、回復した集団に第二の選抜ステップが適用される。これらの条件下で回復した細胞集団の生産性を解析する。結果を表4にまとめる。
選抜の後、同時トランスフェクトしたプールから、限界希釈クローニングによってクローンを作製する。24ウェルプレートのスクリーニングにおいて同定された最も高度に産生するクローンをシェイカーフラスコでさらに増殖させる。過成長したシェイカーフラスコバッチアッセイにおいて生産性を解析し、以前の実験の個々のベクターから得られた上位クローンの結果と比較する。
dhfr/folRで同時トランスフェクトして選抜した上位10クローンのクローン生産安定性は、バイアルの解凍から19週間の期間にわたって測定し、最初の生産性評価は解凍5週間後に行う。50nM葉酸および50nM MTXの選抜条件下で細胞を培養する。生産性アッセイは、11.3μM葉酸を含む培地で行う。
3.1.ベクター構築
FACS選別を用いたさらなる選抜をも可能にする、選択マーカーDHFRおよびFolRを一骨格に含むベクターIIIを作製する。前記ベクターIIIは、「リーキー」終止コドンおよび免疫グロブリン膜貫通アンカーを含む、抗体重鎖を発現するための発現カセットを含む。本明細書において上に概説されている通り、発現カセットのこの設計により、抗体の一部が宿主細胞の細胞表面に繋留された融合タンパク質として生成されるという効果(翻訳読み過ごしプロセスのため)が得られる。ベクターIIIは、次の主要なエレメントを含む。
組み合わせベクターIIIでトランスフェクトした細胞を、12.5nM葉酸および5nM MTXを含む培地において選抜する。参照ベクターでトランスフェクトした細胞を、12.5nM葉酸、5nM MTXおよび0.8g/L G418を含む培地において選抜する。FACS濃縮サイクル後の第二の選抜ステップにおいて、MTX濃度を50nMに増加させる一方、葉酸濃度は一定に維持し、G418を除去する。シェイカーフラスコバッチ培養において、回復した細胞集団(プール)を生産性に対してスクリーニングする。
細胞の標識:トランスフェクトされたプール当たり2×10E7細胞を遠心分離し、5mLの冷却したPBSで洗浄し、1mLの冷PBSで再懸濁する。適量のFITC標識抗IgG抗体(サプライヤー)を細胞に添加し、氷上で30分間、暗所でインキュベートする。その後、細胞を室温で5mLのPBSで2回洗浄し、1mLのPBSで再懸濁し、ろ過し、解析、選別およびクローニングのためFACSチューブに分注する。Automatic Cell Deposition Unit(ACDU)を備えるFACSAria(Becton Dickinson)によって、FACSDivaソフトウエアを用いて細胞選別を行う。488nmに調整した低出力空冷式固体レーザー(Coherent(登録商標)Sapphire(商標)固体)を用いて、二次抗体と結合したフルオレセイン染色試薬を励起する。相対的なFITC蛍光強度は、530/30BPフィルターを通してE検出器で測定する。最もFITC蛍光の高い細胞の5パーセントをゲート制御して細胞塊か単一細胞のいずれかとして96ウェルプレートに選別する。
異なる型式を用いたバッチおよびフェドバッチ実験においてクローンの生産性を解析する。振盪式24ウェルプレートに細胞を播種することによって、24ウェルプレートバッチアッセイにおいて最初のスクリーニングを行う。細胞培養物上清における抗体価は、培養開始10日後に定量的プロテインA−HPLCによって決定する。次に、バッチおよびフェドバッチモードのシェイカーフラスコモデルにおいて最も高度に産生するクローンを解析する。11.3μM葉酸を含む培地におけるバッチ培養物を、シェイカーフラスコ(500mLまたは250mL容量)に100mLまたは50mL作業容量で播種し、シェイカーキャビネット(加湿なし)内で150rpm、36.5℃、10%CO2で培養する。細胞の生存率は、アッセイ開始時には>90%となるべきである。播種細胞密度は、2×105c/mLである。抗体価、細胞数および生存率は、画定された培養時点において決定することができる。フェドバッチ実験は、同一条件を用いるが、4×105c/mLの出発細胞密度で、生細胞密度が7×106c/mLを超えたら栄養の定期的な添加を開始して行う。シェイカーフラスコバッチモデルを用いてほぼ2週間毎に生産性を測定しつつ、19週間までの期間にわたり細胞を培養することによって、クローン安定性を評価する。
DHFR/FolR組み合わせベクター(ベクターIII)でトランスフェクトした5つの細胞集団、参照ベクター(ベクターIV)でトランスフェクトした3つの細胞集団を、上述の通り作製、選抜する。シェイカーフラスコバッチ培養における回復した細胞プールの生産性を表5にまとめる。
ポリペプチドの大量生産は、例えばウエーブ(wave)、ガラス製またはステンレススチール製バイオリアクターにおいて行うことができる。この目的のため、通常単一の凍結バイアル、例えばMaster Cell Bank由来のバイアルから開始して細胞を増殖させる。細胞を解凍し、数ステップを経て増殖させる。異なる規模のバイオリアクターに適量の細胞を接種する。バイオリアクターに栄養液および添加剤を添加することによって、細胞密度を増加させてよい。細胞を高い生存率で長時間維持する。大量生産において、リアクター内に1リットル当たり数百ミリグラムから1リットル当たり最大数グラムの範囲の産物濃度が達成される。標準的なクロマトグラフィー手順によって精製を行うことができ、これはアフィニティー、イオン交換、疎水性相互作用または分子ふるいクロマトグラフィーステップを含むことができる。バイオリアクターのサイズは、最終的なスケールで最大数千リットル容量となることができる(例えば、F.Wurm、Nature Biotechnology Vol.22、11、2004、1393〜1398も参照)。
Claims (21)
- 少なくとも
(a)目的産物をコードするポリヌクレオチド、あるいは目的産物をコードするポリヌクレオチドを組入れるための挿入部位と、
(b)第一の選択マーカー(smI)をコードするポリヌクレオチドと、
(c)第一の選択マーカー(smI)とは異なる第二の選択マーカー(smII)をコードするポリヌクレオチドと、
を含む発現ベクターまたは少なくとも2種類の発現ベクターの組み合わせであって、
選択マーカー(smI)または(smII)の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受け、選択マーカー(smI)および(smII)が葉酸代謝に関与する発現ベクターまたは少なくとも2種類の発現ベクターの組み合わせ。 - 第一の選択マーカー(smI)が葉酸トランスポーターであり、第二の選択マーカー(smII)が、葉酸塩、葉酸塩の誘導体および/または葉酸塩の加工によって得られる産物である基質を加工する、請求項1に記載の発現ベクターまたは少なくとも2種類の発現ベクターの組み合わせ。
- 第一の選択マーカー(smI)が葉酸トランスポーターであり、第二の選択マーカー(smII)がDHFRまたはその機能的変異体もしくは誘導体である、請求項1または2に記載の発現ベクターまたは少なくとも2種類の発現ベクターの組み合わせ。
- 第一の選択マーカー(smI)が葉酸レセプターであり、第二の選択マーカーが、野生型DHFR酵素および/または宿主細胞によって内因性発現されるDHFR酵素よりもMTX感受性が低いDHFR変異体である、請求項1から3の少なくとも一項に記載の発現ベクターまたは少なくとも2種類の発現ベクターの組み合わせ。
- 第一の選択マーカー(smI)が、ヒト葉酸レセプターもしくはその機能的変異体であるまたはそれを含む、および/または第一の選択マーカーが、配列番号1、2もしくは3または前述の機能的変異体のアミノ酸配列を有するまたは含む葉酸レセプターである、請求項1から4の少なくとも一項に記載の発現ベクターまたは少なくとも2種類の発現ベクターの組み合わせ。
- 少なくとも
(a)目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
(b)目的産物をコードするポリヌクレオチド下流の少なくとも1個の終止コドンと、
(c)膜アンカーおよび/または膜アンカーのシグナルをコードする、終止コドン下流のポリヌクレオチドと、
を含む発現カセットに目的産物をコードするポリヌクレオチドが含まれる、請求項1から5の一項に記載の発現ベクターまたは少なくとも2種類の発現ベクターの組み合わせ。 - 少なくとも
(a)目的産物をコードする導入ポリヌクレオチドと、
(b)第一の選択マーカー(smI)をコードする導入ポリヌクレオチドと、
(c)第一の選択マーカー(smI)とは異なる第二の選択マーカー(smII)をコードする導入ポリヌクレオチドと、
を含む宿主細胞であって、
選択マーカー(smI)または(smII)の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受け、選択マーカー(smI)および(smII)が葉酸代謝に関与する宿主細胞。 - 請求項1から6の少なくとも一項に記載の発現ベクターまたは少なくとも2種類の発現ベクターの組み合わせが前記宿主細胞に導入されている、請求項7に記載の宿主細胞。
- CHO細胞、好ましくはDHFR+(プラス)細胞である、請求項7または8に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞がDHFR+(プラス)細胞であり、第一の選択マーカー(smI)が葉酸レセプターであり、第二の選択マーカー(smII)が、野生型DHFR酵素および/または宿主細胞によって内因性発現されるDHFR酵素よりもMTX感受性が低いDHFR変異体である、請求項7から9の一項に記載の宿主細胞。
- 少なくとも
(a)目的産物をコードするポリヌクレオチドと、
(b)第一の選択マーカー(smI)をコードするポリヌクレオチドと、
(c)第一の選択マーカー(smI)とは異なる第二の選択マーカー(smII)をコードするポリヌクレオチドと、
を前記宿主細胞に導入するステップを含む、請求項7から10の少なくとも一項に記載の宿主細胞を作製するための方法であって、
選択マーカー(smI)または(smII)の活性が、他方の選択マーカーの活性によって少なくとも部分的に影響を受け、選択マーカー(smI)および(smII)が葉酸代謝に関与する、方法。 - 請求項1から6の少なくとも一項に記載の発現ベクターまたは発現ベクターの組み合わせが宿主細胞に導入される、請求項11に記載の方法。
- (a)少なくとも
(i)目的産物をコードする導入ポリヌクレオチドと、
(ii)第一の選択マーカー(smI)をコードする導入ポリヌクレオチドと、
(iii)第一の選択マーカー(smI)とは異なる第二の選択マーカー(smII)をコードする導入ポリヌクレオチドと、
を含む複数の宿主細胞を提供するステップであって、
選択マーカー(smI)または(smII)の活性が、他方の選択マーカーの活性に少なくとも部分的に依存し、選択マーカー(smI)および(smII)が葉酸代謝に関与する、複数の宿主細胞を提供するステップと、
(b)選択マーカー(smI)および(smII)に選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養し、これによって目的産物を発現する宿主細胞を得るステップと、
を含む、目的産物を発現することのできる少なくとも1個の宿主細胞を選抜するための方法。 - (c)目的産物を発現する少なくとも1個の宿主細胞を選抜するステップ
を追加的に含む、請求項13に記載の方法。 - 複数の宿主細胞が請求項7から10の少なくとも一項に記載の宿主細胞を含む、請求項13または請求項14に記載の方法。
- 限界濃度の葉酸塩と、葉酸代謝拮抗剤とを含む選抜培地が少なくとも一選抜ステップにおいて用いられる、請求項13から15の少なくとも一項に記載の方法。
- 選抜培地が500nM以下、好ましくは100nM以下の濃度の葉酸塩を含む、および/または選抜培地が500nM以下の濃度、好ましくは200nM以下の濃度の葉酸代謝拮抗剤を含む、請求項16に記載の方法。
- 目的産物を発現させる条件下で、
(a)請求項7から10の少なくとも一項に記載の宿主細胞および/または
(b)請求項13から17の少なくとも一項に従って選抜された宿主細胞
を培養するステップを含む、目的産物を生産するためのプロセス。 - 次のステップ、
(a)目的産物を前記細胞培養培地からおよび/または前記宿主細胞から単離するステップ、および/または
(b)単離された目的産物を加工するステップ
のうち少なくとも1つを含む、請求項18に記載のプロセス。 - 500nM以下の濃度の葉酸代謝拮抗剤および500nM以下の限界濃度の葉酸塩を含む選抜培地。
- 200nM以下の濃度の葉酸代謝拮抗剤および/または100nM以下の限界濃度の葉酸塩を含む、請求項20に記載の選抜培地。
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