KR20160030524A - 신규한 선택 벡터 및 진핵 숙주 세포의 선택 방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 a) 선택가능 마커로서 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 b) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물에 관한 것이고, 상기 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물은 숙주 세포 내로 도입되고, 관심 있는 폴리펩티드는 상기 숙주 세포로부터 분비된다. 또한, 적절한 숙주 세포, 선택 방법 및 폴리펩티드를 고수율로 생산하는 방법이 제공된다.

Description

신규한 선택 벡터 및 진핵 숙주 세포의 선택 방법{NOVEL SELECTION VECTORS AND METHODS OF SELECTING EUKARYOTIC HOST CELLS}
본 개시내용은 관심 있는 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 특히 포유동물 숙주 세포의 선택을 위한 선택가능 마커로서 돌연변이된 폴레이트 수용체 (mutated folate receptor)의 용도를 기초로 한 신규한 선택 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 관심 있는 재조합 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 숙주 세포를 선택하기 위한 적절한 발현 벡터, 숙주 세포 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 고수율로 재조합 폴리펩티드를 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다.
다량의 관심 있는 생성물, 예컨대 재조합 펩티드 및 단백질을 클로닝하고 발현하는 능력의 중요성은 증가하여 왔다. 높은 수준의 단백질을 정제하는 능력은 예를 들어 단백질 제약물질의 생산을 위한 인간 제약 및 생명공학 분야에서 및 예를 들어 그의 3차원 구조의 결정을 허용하는 단백질의 결정화를 위한 기본적인 연구 설정에서 중요하다. 다른 방법으로는 다량으로 얻는 것이 어려운 단백질은 숙주 세포에서 과다발현된 후, 단리 및 정제될 수 있다.
재조합 단백질의 생산을 위한 발현 시스템의 선택은 세포 성장 특징, 관심 있는 단백질의 발현 수준, 세포내 및 세포외 발현, 번역후 변형 및 생물학적 활성, 및 치료 단백질의 생산에 대한 규제 문제 및 경제적 고려사항을 비롯한 많은 인자에 따라 결정된다. 다른 발현 시스템, 예컨대 박테리아 또는 효모에 비해 포유동물 세포의 가장 중요한 이점은 적절한 단백질 폴딩 (folding), 복잡한 N-연결된 글리코실화 및 진정한 O-연결된 글리코실화, 및 광범위한 다른 번역후 변형을 수행하는 능력이다. 설명된 이점 때문에, 진핵, 특히 포유동물 세포가 복잡한 치료 단백질, 예컨대 모노클로날 항체의 생산을 위해 현재 선택되는 발현 시스템이다.
고 발현 숙주 세포 (고 생산자로도 불림)를 얻기 위한 가장 통상적인 방법은 제1 단계로서 관심 있는 폴리펩티드를 발현하기 위한 적절한 발현 벡터를 생성한다. 발현 벡터는 숙주 세포에서 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하고, 재조합 세포주를 생성하기 위한 적어도 하나의 선택가능 마커를 제공한다.
관심 있는 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 고 생산 세포주를 얻기 위한 확립된 한 절차는 숙주 세포의 안정한 형질감염이다. 이어서, 관심 있는 폴리펩티드는 배양 배지 내로 분비되고, 그로부터 다량 얻을 수 있다. 그러나, 게놈 내로의 안정한 통합은 드문 사건이고, 안정적으로 형질감염된 세포의 단지 작은 하위세트만이 고 생산자이다.
선택가능 마커 및 선택 시스템은 관심 있는 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 숙주 세포를 얻기 위해 널리 사용된다. 또한, 각각의 시스템은 안정적으로 형질감염된 클론을 생성하고 확인하기 위해서도 유용하다. 각각의 선택가능 마커 및 선택 시스템을 사용하는 1차 목표는 선택적 성장 조건에 노출시에 관심 있는 재조합 생성물을 고수준으로 생산할 수 있는 세포의 확인을 허용하는 선택가능 유전자를 도입하는 것이다. 확립된 선택가능 마커는 예를 들어 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 또는 글루타민 합성효소 (GS)를 포함한다.
또 다른 선택 시스템은 환원된 폴레이트 운반체 선택 시스템에 기반한다. 환원된 폴레이트 운반체 (RFC)는 환원된 폴레이트, 예컨대 5-메틸-THF 및 5-포르밀-THF의 흡수를 위한 주요 수송체로서 기능하는 전체적으로 (ubiquitously) 발현되는 막 당단백질이다. 그러나, RFC는 산화된 폴레이트, 즉 엽산에 대해 매우 불량한 친화도를 보인다. 따라서, RFC 발현이 결여되거나 게놈 RFC 유전자좌가 결실된 세포는 환원된 폴레이트, 예컨대 5-포르밀-THF가 점진적으로 성장 배지로부터 결핍되어 세포가 증가된 수준의 상기 폴레이트 수송체를 발현하도록 만드는 조건 하에 선택가능 마커 유전자 RFC의 형질감염을 위한 수여체 (recipient)로서 기능할 수 있다. RFC 선택 시스템에는 다음과 같은 몇몇 단점이 존재한다: a) 표적화된 낙아웃 또는 기능 상실 돌연변이에 의해 내인성 RFC 유전자좌가 낙아웃 (knockout)되었거나 불활성화된 RFC-null 수여체 세포를 사용하여야 한다, b) RFC는 엽산에 대한 극히 불량한 수송 친화도를 갖고, 따라서 상기 산화된 폴레이트는 선택을 위해 사용될 수 없고, c) 일방향 폴레이트 흡수 시스템인 폴레이트-수용체 기반 시스템 (하기 참조)과는 달리, RFC는 폴레이트의 동등한 도입 및 방출 능력을 보이는 이방향성 폴레이트 수송체이다. 이것은 폴레이트 결핍 조건 하의 RFC 과다발현이 과다발현된 RFC를 통해 폴레이트를 추가로 방출하는 수여체 세포에 유해할 수 있음을 의미한다.
최근에 제안된 추가의 선택 시스템은 폴레이트 수용체, 예컨대 폴레이트 수용체 알파를 선택가능 마커로서 사용하는 것을 기초로 한다. 이 시스템은 WO2009/080759에 기재되어 있다. 이 시스템은 선택을 위해, 독성 기질이 필요하지 않고, 또한 숙주 세포의 내인성 폴레이트 수용체가 낙아웃될 필요가 없다는 점에서 여러 이점을 갖는다. 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하는 것을 기초로 한 추가의 선택 시스템은 WO 2010/097240에 기재되어 있다.
폴레이트 수용체 및 그의 돌연변이체는 예를 들어 문헌 [Shen et al. "Identification of amino acid residues that determine the differential ligand specificities of folate receptors alpha and beta" (Biochemistry 1997, 36, 6157-6163)]에 기재되어 있다. 의학적 장애와 연관된 폴레이트 수용체 알파의 돌연변이도 설명되어 있다. 폴레이트 수용체 내의 아미노산 위치도 문헌 [Ramamoorthy et al. "In silico analysis of functionally important residues in folate receptors" (Bioinformation 2 (4): 157-162 (2007))]에서 분석되었다.
고 엄격도 선택 시스템은 형질감염된 집단으로부터 고생산 세포를 선택하고 따라서 농축하기 위해 중요하다. 선택 시스템의 엄격도가 높을수록, 선택 과정 후에 저 생산자의 수가 더 적고, 매우 드문 과다생산 클론을 발견할 가능성이 더 높다. 또한, 선행 기술의 방법보다 더 신속하게 고 생산 클론의 획득을 가능하게 하는 선택 시스템의 제공 필요성이 크게 존재한다.
본 발명의 목적은 관심 있는 폴리펩티드를 고수율로 생산하는 숙주 세포를 선택하기 위한 엄격한 선택 시스템, 및 적절한 발현 벡터 및 숙주 세포를 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 상기 언급된 선행 기술의 선택 시스템에 비해 특정 이점을 갖는 신규한 선택 시스템을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 개시내용은 관심 있는 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 숙주 세포를 선택하기에 적절한 선택 시스템에 관한 것이다. 상기 선택 시스템은 돌연변이된 기능적 막 결합된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하는 것을 기초로 한다. 특히, 상기 선택 시스템은 대응하는 야생형의 기능적 막 결합된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하는 선택 시스템보다 더 엄격하고 더 신속한 고 생산자의 선택을 허용한다.
제1 측면에 따르면, 본 개시내용은
a) 선택가능 마커로서 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및
b) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드
를 포함하는, 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물을 제공하고, 상기 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물이 숙주 세포 내로 도입될 때, 관심 있는 폴리펩티드가 상기 숙주 세포로부터 분비된다.
제2 측면에 따르면, 본 발명은
a) 선택가능 마커로서 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드 및
b) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 도입된 폴리뉴클레오티드
를 포함하는, 그의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 숙주 세포에 관한 것이고, 상기 관심 있는 폴리펩티드는 상기 숙주 세포로부터 분비된다.
제3 측면에 따르면, 본 개시내용은 그의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 숙주 세포 내로 적어도
a) 선택가능 마커로서 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및
b) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드
를 도입하는 단계를 포함하고, 상기 관심 있는 폴리펩티드는 상기 숙주 세포로부터 분비되는 것인, 본 발명의 제2 측면에 따른 숙주 세포의 생산 방법에 관한 것이다.
제4 측면에 따르면, 본 개시내용은
a) 제2 측면에 따른 다수의 숙주 세포를 제공하고;
b) 상기 다수의 숙주 세포를 폴레이트를 제한된 농도로 포함하는 선택 배양 배지에서 배양하고;
c) 관심 있는 폴리펩티드를 발현하는 적어도 하나의 숙주 세포를 얻는 것
을 포함하는, 관심 있는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 적어도 하나의 숙주 세포를 선택하는 방법을 제공한다.
제5 측면에 따르면, 본 개시내용은
a) 제2 측면에 따른 숙주 세포 및/또는 제4 측면에 따라 선택된 숙주 세포를 관심 있는 폴리펩티드의 발현 및 분비를 허용하는 조건 하에 배양하고;
b) 관심 있는 폴리펩티드를 세포 배양 배지로부터 단리하고;
c) 임의로 단리된 관심 있는 폴리펩티드를 추가로 처리하는 것
을 포함하는, 관심 있는 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
제6 측면에 따르면, 본 개시내용은 그의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 세포를 선택하기 위한 선택가능 마커로서,
a) 다음 서열을 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체
Figure pct00001
(여기서, Xaa는 알라닌이 아니고, 돌연변이된 폴레이트 수용체의 폴레이트 결합 친화도는 Xaa가 알라닌인 대응하는 야생형 폴레이트 수용체 (서열 1)에 비해 감소됨), 또는
b) 서열 9에 제시된 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체 (여기서, Xaa는 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체에서 알라닌이 아니고, 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체의 폴레이트 결합 친화도는 Xaa가 알라닌인 성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파 서열 (서열 1 참조)에 비해 감소됨)
를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.
제7 측면에 따르면, 본 개시내용은 그의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 세포를 선택하기 위한 선택가능 마커로서,
a) 다음 서열을 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체
Figure pct00002
(여기서, Xaa는 류신임), 또는
b) 서열 9에 제시된 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체 (여기서, Xaa는 b)에 따른 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체에서 류신임)
를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 각각의 돌연변이된 폴레이트 수용체는 매우 효율적이고 엄격한 선택가능 마커이고, 또한 야생형 폴레이트 수용체보다 더 신속하게 각각의 선택가능 마커를 발현하는 숙주 세포의 선택을 허용한다.
본원의 다른 목적, 특징, 이점 및 측면은 다음 설명 및 첨부되는 청구의 범위로부터 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 그러나, 다음 설명, 첨부되는 청구의 범위 및 구체적인 예는 본원의 바람직한 실시양태를 나타내면서, 단지 예시의 목적으로 제시됨을 이해하여야 한다.
도 1 내지 5는 상이한 발현 벡터로 미리 형질감염되고 상이한 선택 조건을 사용하여 얻은 폴리클로날 세포 풀 (pool)로부터 제한 희석에 의해 얻은 개개의 세포 클론의 항체 생산성을 보여준다. 따라서, 선택 후에 얻은 클론의 생산성이 제시된다. 단일 세포 클로닝을 위해, 세포를 완전 배지 (선택 후에 선택 압력을 유지하지 않음) 또는 선택 배지 (선택 후에 선택 압력을 유지함)에서 배양하였다.
도 1: 선택 (125 nM MTX) 후에 V-DHFRref를 갖는 형질감염체의 단일 세포 클로닝.
도 2: 선택 (250 nM MTX) 후에 V-DHFRref를 갖는 형질감염체의 단일 세포 클로닝.
도 3: 선택 (15 nM FA) 후에 V-wtFR알파를 갖는 형질감염체의 단일 세포 클로닝.
도 4: V-mutFR알파 (5 nM)를 갖는 형질감염체의 단일 세포 클로닝. 알 수 있는 바와 같이, 야생형 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용할 때보다 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용할 때보다 고 발현 세포 클론이 얻어졌다. 또한, 발현 속도는 선택가능 마커로서 DHFR을 사용하여 선택할 때 관찰된 것보다 더 높았다.
도 5: V-mutFR알파/V-DHFRref 동시-형질감염된 집단 (50 nM 엽산 (FA)/50 nM MTX)의 단일 세포 클로닝. 알 수 있는 바와 같이, 유의하게 더 많은, 보다 고 발현 세포 클론이 상기 동시-선택 전략을 사용할 때 얻어졌다.
발명의 상세한 설명
놀랍게도 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하는 것을 기초로 한 선택 시스템은 돌연변이된 형태의 폴레이트 수용체를 사용함으로써 상당히 개선될 수 있음이 밝혀졌다. 돌연변이된 선택가능 마커는 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포를 선택하기 위한 주요한 선택가능 마커로 사용될 수 있다. 상기 돌연변이체는 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 조정된 폴레이트 결합 친화도를 갖는다. 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 선택가능 마커로서 중요한 이점을 갖는 것으로 밝혀졌다.
신규한 시스템은 재조합 폴리펩티드를 고수율로 안정적으로 발현하고 분비하는 진핵, 특히 포유동물 세포 클론의 가속된 선택, 스크리닝 및 확립을 위해 사용될 수 있다. 선택은 제한 농도의 폴레이트, 특히 제한 농도의 엽산을 포함하는 배양 배지를 사용하여 수행될 수 있다. 신규한 선택 시스템은 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하는 것과 연관된 일반적인 이점 이외에, 선행 기술에서 이용가능한 선택 시스템에 비해 및 또한 야생형 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하는 것에 비해 다음에서 설명되는 바와 같은 여러 중요한 이점을 보인다:
1. 개선된 신속성 및 성장 특징. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 돌연변이체 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하면, 예를 들어 DHFR을 선택가능 마커로서 사용하는 것을 기초로 한 표준 선택 시스템보다 상당히 더 빠른 선택이 가능하다. 또한, 본 개시내용에 따른 선택 시스템은 또한 야생형 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하는 것을 기초로 한 선택 시스템보다 더 빠르다. 특히, 야생형 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하는 것에 비해, 본 개시내용에 따른 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 포함하는 세포는 매우 낮은 엽산 농도를 포함하는 선택 배양 배지에서 배양할 때보다 더 빠르게 분열하고 회복된다. 이와 같이 달성된 신속성은 선택 주기의 길이를 줄이는 상당히 이로운 점이다. 각각의 성장 이점은 매우 엄격한 선택 조건 및 따라서 매우 제한된 엽산 농도가, 선택가능 마커로서 야생형 폴레이트 수용체로 형질감염된 세포의 성장을 손상시키는 선택 배양 배지에 사용되는 경우에도 관찰된다. 따라서, 본 개시내용에 따른 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용할 때, 보다 엄격한 선택 조건이 사용될 수 있다. 야생형 폴레이트 수용체에 비해 상기 본 개시내용에 따른 돌연변이된 폴레이트 수용체의 이점은 완전히 예상치 못한 것이었다. 폴레이트, 예컨대 바람직하게는 엽산은 배양 배지에 존재하여야 하고, 세포 성장, 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드 생합성, DNA 복제 및 따라서 세포 증식을 유지하기 위해 숙주 세포 내로 효율적으로 도입되어야 한다. 이러한 배경을 고려하여, 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체로 형질감염된 세포는 야생형 폴레이트 수용체로 형질감염된 세포에 비해 성장 이점을 갖지 않을 것으로 예상되었다. 심지어, 선택가능 마커로서 상기 돌연변이체 폴레이트 수용체로 형질감염된 세포는 완전한 폴레이트 결합 친화도를 갖는 야생형 폴레이트 수용체를 내인성으로 발현하는 비형질감염된 세포에 비해 성장 이점을 갖지 않을 수 있다고 가정되었다. 이것은 비형질감염된 세포가 제한 농도의 폴레이트를 포함하는 배양 배지에서 배양될 경우 내인성 폴레이트 수용체의 발현이 증가한다고 알려졌기 때문에 특히 그러하였다 (Zhu et al., Journal of Cellular Biochemistry 81:205-219 (2001)). 따라서, 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체가 야생형 폴레이트 수용체보다 훨씬 우수한 효율적인 선택가능 마커를 제공한다는 것을 본 발명자들이 발견한 것은 매우 놀라운 것이었다.
2. 개선된 엄격도 및 생산성. 선택가능 마커로서 본 개시내용에 따른 돌연변이된 폴레이트 수용체를 포함하는 세포는 놀랍게도 야생형 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 포함하는 세포보다 더 낮은 선택 배양 배지 내의 폴레이트 농도를 견딘다. 이것은 보다 엄격한 선택 조건의 사용을 허용한다. 따라서, 높은 생산 속도를 갖는 세포는 본원에서 설명되는 신규한 선택가능 마커를 사용할 때 더 빨리 얻을 수 있다. 이것은 본 개시내용에 따른 돌연변이된 폴레이트 수용체의 폴레이트 결합 친화도가 야생형에 비해 감소된다는 사실을 고려할 때 전혀 예상치 못한 것이었다.
3. 개선된 신뢰성. 배양 배지 내의 폴레이트 농도에 대한 선형 용량 의존성이 본 개시내용에 따른 선택가능 마커로서 돌연변이된 폴레이트 수용체를 사용할 때 관찰된다. 선택 배지 내의 폴레이트 농도가 낮을수록, 선택된 세포의 생성되는 생산성이 더 높다. 각각의 의존성은 동일한 방식으로 야생형 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용할 때는 관찰되지 않는다. 상기 선형 용량 의존성은 선택 조건의 보다 신뢰할 수 있는 제어 및 최적화를 촉진한다. 상기 발견 역시 완전히 예상치 못한 것이었다.
따라서, 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하는 것을 기초로 한 본원에서 설명되는 신규한 폴레이트-기반 선택은 관심 있는 재조합 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 안정한 세포의 가속된 선택에 매우 적합한 우수한 전략이다. 본원에서 설명되는 유익한 결과는 세포 배양 배지 내의 낮은 폴레이트 농도에서, 심지어 다양한 다른 선택 시스템에서 통상적으로 사용되는 세포독성 약물 선택의 부재하에서도 달성될 수 있다.
발현 벡터 및 발현 벡터의 조합물
제1 측면에 따르면, 본 개시내용은
a) 선택가능 마커로서 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
b) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드
를 포함하는, 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물을 제공하고, 상기 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물은 숙주 세포 내로 도입될 때, 관심 있는 폴리펩티드는 상기 숙주 세포로부터 분비된다.
본 개시내용에 따른 "벡터"는 특히 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 단편을 운반할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 벡터는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 전달하는 분자 운반체처럼 기능한다. 발현 벡터는 그 내에 포함된 폴리뉴클레오티드를 적절하게 발현하기 위한 조절 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어 관심 있는 폴리펩티드 또는 선택가능 마커를 코딩하는)는 그로부터 발현되도록 벡터의 발현 카세트(들) 내에 삽입될 수 있다. 숙주 세포 내로 도입될 때, 발현 카세트는 특히 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 포함된 폴리뉴클레오티드를 RNA로 전사한 후, 이를 대체로 추가로 처리하고 최종적으로 관심 있는 폴리펩티드로 번역하는 세포 기구를 유도할 수 있다. 벡터는 환상 또는 선형(화된) 형태로 존재할 수 있다. 용어 "벡터"는 또한 외래 핵산 단편의 전달을 허용하는 인공 염색체, 바이러스 벡터 또는 유사한 각각의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"폴리뉴클레오티드"는 한 데옥시리보스 또는 리보스로부터 또 다른 데옥시리보스 또는 리보스로 대체로 연결된 뉴클레오티드의 중합체이고, 문맥에 따라 DNA뿐만 아니라 RNA도 나타낸다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 크기 제한을 포함하지 않는다.
이어서, 본 발명자들은 본 개시내용에 따른 발현 벡터 및 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물의 실시양태를 설명한다. 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 발현 벡터 상에 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물이 사용될 경우 별개의 발현 벡터 상에 위치할 수 있다. 하나의 발현 벡터는 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 다른 발현 벡터는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물이 사용될 경우, 상기 조합물은 선택이 가능하도록 동일한 숙주 세포 내로 동시-형질감염된다. 각각의 동시-형질감염 전략은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 또한 실시예에서 설명된다. 이어서, 본 발명자들은 두 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 벡터 상에 위치하는 실시양태와 주로 관려된 구체적인 실시양태 및 이점을 설명한다. 그러나, 상기 개시내용은 필요시 변경하여, 세포 내로 동시-형질감염되는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물이 사용되는 실시양태에 적용된다. 적절한 경우, 본 발명자들은 관심 있는 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 숙주 세포를 선택하기 위한 상기 발현 벡터(들)의 용도와 함께, 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물과 연관된 이점을 설명한다.
돌연변이된 폴레이트 수용체
본원에서 사용되는 "폴레이트 수용체"는 기능적이고 따라서 폴레이트 또는 그의 유도체를 진핵 세포, 특히 포유동물 세포 내로 도입 또는 흡수시킬 수 있는 수용체를 나타낸다. 바람직하게는, 폴레이트 수용체는 폴레이트 또는 그의 유도체를 진핵 숙주 세포, 특히 포유동물 세포 내로 일방향성으로 도입 또는 흡수시킬 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 폴레이트 수용체는 막-결합된다. 따라서, 본원에서 설명되는 폴레이트 수용체는 기능적 막-결합된 폴레이트 수용체이다. 이것은 돌연변이된 및 야생형 폴레이트 수용체 둘 모두에 적용된다. 막 고정은 예를 들어 막횡단 (transmembrane) 앵커 또는 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커에 의해 달성될 수 있다. GPI 앵커는 폴레이트 수용체의 천연 설정에 대응하기 때문에 바람직하다. 폴레이트 수용체 (FR)는 고-친화도 폴레이트-결합 당단백질이다. 이들은 3개의 별개의 유전자 FR 알파, FR 베타 및 FR 감마에 의해 코딩된다. FR 알파는 또한 성인 폴레이트 결합 단백질 또는 FDP로, 폴레이트 수용체1 또는 FOLR (마우스에서 folbp1)로, 및 난소암 연관 항원으로도 알려져 있다. FR 베타는 FOLR2 (태아) 및 FBP/PL-1 (태반)로도 알려져 있다. FR 감마는 FOLR3 및 FR-G로도 알려져 있다 (문헌 [M.D. Salazar and M. Ratnam, Cancer Metastasis Rev. 2007 26(1), pp.141-152]에서 검토됨). 특성이 잘 밝혀진 성숙 FR은 ~70-80% 아미노산 동일성을 갖는 상동성 단백질이고, 229 내지 236개의 아미노산 및 2 내지 3개의 N-글리코실화 부위를 포함한다. FR 알파 및 FR 베타는 막-결합된 단백질이다. FR 알파 및 FR 베타는 GPI-고정된 세포 표면 당단백질인 반면, FR 감마에는 GPI 앵커가 존재하지 않고, 분비된 단백질이다. 그러나, 이것은 막횡단 도메인 또는 GPI 앵커를 포함하도록 유전적으로 변경될 수 있다. 막 앵커를 포함하는 FR 감마의 상기 변경된 형태는 상기 설명된 바와 같이 폴레이트 또는 그의 유도체를 진핵 세포 내로 도입 또는 흡수시킬 수 있다면, 이 역시 야생형 폴레이트 수용체로 간주된다. FR 알파 및 FR 베타는 엽산 (Kd=0.1-1 nM), 5,10-디데아자테트라히드로엽산 (DDATHF; 로메트렉솔; Ki=0.4-1.3 nM, 기질로서 [3H]엽산을 사용) 및 BGC945 (FR알파를 통해서만 특이적으로 수송되고 환원된 폴레이트 운반체를 통해서는 수송되지 않는 시클로펜타[g]퀴나졸린계, 티미딜레이트 신타제 억제제) (Kd=1 nM)에 대해 고 친화도를 보이지만, MTX에 대해서는 훨씬 더 낮은 친화도를 보인다 (Kd >100 nM). 폴레이트 및 항폴레이트제의 FR-의존성 흡수는 수용체-매개된 세포내 이입 (endocytosis)의 전통적인 메카니즘을 통해 진행된다.
본원에서 사용되는 "야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체" 또는 유사한 표현은 특히 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 환원된 폴레이트 및 산화된 폴레이트의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴레이트에 대해 감소된 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 나타낸다. 상기 용어는 특히 특정 폴레이트에 대해 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 나타낸다. 다른 폴레이트, 즉 상기 특정 폴레이트와 상이한 폴레이트에 대한 폴레이트 결합 친화도는 변경되지 않을 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 환원된 폴레이트 및 산화된 폴레이트의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴레이트에 대한 결합 친화도를 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 환원된 폴레이트에 대한 감소된 결합 친화도를 보인다. 한 실시양태에 따르면, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 5-메틸테트라히드로폴레이트의 6S 부분입체 이성질체에 대한 감소된 결합 친화도를 보인다. 한 실시양태에 따르면, 돌연변이된 폴레이트 수용체의 환원된 폴레이트, 바람직하게는 5-메틸테트라히드로폴레이트의 6S 부분입체 이성질체에 대한 IC50 값은 대응하는 야생형 폴레이트 수용체의 IC50 값보다 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 적어도 55배 더 높다. 유의하게 더 높은 IC50 값 때문에, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 상기 환원된 폴레이트에 대해 유의하게 감소된 결합 친화도를 갖는다. 한 실시양태에 따르면, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 엽산에 대한 감소된 결합을 보인다.
감소된 폴레이트 결합 친화도를 유발할 수 있는 적어도 하나의 돌연변이는 예를 들어 아미노산 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 돌연변이는 추정되는 폴레이트 결합 포켓 (pocket)에 존재한다. 한 실시양태에 따르면, 상기 돌연변이는 추정되는 폴레이트 결합 포켓 내의 치환이다.
선택가능 마커로서 본 개시내용에 따라 사용되는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는다. 상기 설명되고 실시예에서 제시되는 바와 같이, 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 5-메틸테트라히드로폴레이트의 6S 부분입체 이성질체에 대해 적어도 감소된 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 사용하는 것이 유리하다. 폴레이트 결합 친화도의 감소는 하나 이상의 돌연변이를 야생형 서열 내로 도입함으로써 달성될 수 있다. 적절한 예는 아래에서 설명된다. 이론에 매이지 않지만, 감소된 폴레이트 결합 친화도 때문에, 본 개시내용에 따른 발현 벡터(들)로 형질감염된 세포는 선택적인 폴레이트 결핍 조건 하에서 생존하기 위해 충분한 폴레이트 흡수 속도를 달성하도록 보다 많은 돌연변이된 폴레이트 수용체를 발현할 필요가 있는 것으로 생각된다. 따라서, 또한 관심 있는 폴리펩티드는 생존 집단에 의해 보다 높은 수준으로 발현된다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 선택가능 마커로서 본원에서 설명되는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 사용할 때, 생산성은 선택 배양 배지 내의 폴레이트 농도가 감소할 때 증가한다. 각각의 상관관계는 야생형 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용할 때 동일한 방식으로 관찰되지 않는다. 또한, 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용할 때, 심지어 선택 배양 배지 내의 폴레이트 농도를 추가로 감소시키고 따라서 형질감염된 세포에 대한 선택 압력을 추가로 증가시키는 것이 가능하다. 이에 의해, 야생형 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하는 선택 시스템보다 우수한 매우 엄격하고 신속한 선택 시스템이 제공된다. 이것은 본 개시내용에 따른 돌연변이된 폴레이트 수용체의 폴레이트 결합 친화도가 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된다는 사실을 고려할 때 예상치 못한 것이었다. 또한, 놀랍게도 돌연변이된 폴레이트 수송체로 형질감염된 세포가 우수한 특징을 보이고 특히 매우 엄격한 선택 조건이 사용된 경우에도 선택 조건으로부터 보다 일찍 회복되는 것을 밝혀졌다.
바람직하게는, 선택가능 마커로서 사용되는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 폴레이트 결합 포켓 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이는 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 폴레이트 결합 친화도가 감소된 효과를 갖는다. 적절한 돌연변이는 아래에서 설명된다. 폴레이트 결합 포켓에 돌연변이를 포함시키는 것은 폴레이트 결합 친화도를 감소시키기 위해 매우 효율적인 방법이다. 도입된 돌연변이된 폴레이트 수용체를 고도로 과다발현하는 세포만이 세포 성장, DNA 복제 및 따라서 세포 증식을 유지하기 위해 충분한 양의 폴레이트를 배양 배지로부터 흡수한다. 놀랍게도, 세포가 선택가능 마커로서 폴레이트에 대한 감소된 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 포함하는 경우에도, 형질감염된 세포는 야생형 폴레이트 수용체로 형질감염된 세포에 비해 또는 통상적인 선택가능 마커, 예컨대 DHFR로 형질감염된 세포에 비해 실질적으로 가속된 성장을 보인다. 상기 가속된 성장은 선택 수행에 필요한 시간을 단축하기 때문에 유의한 이점이다.
본 개시내용에 따라 이용되는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 본 개시내용 내에서 기능성이라면, 즉 이용되는 숙주 세포와 상용성이고 형질감염된 숙주 세포로부터 발현될 때 폴레이트, 특히 엽산을 배양 배지로부터 숙주 세포 내로 도입한다면, 임의의 종의 폴레이트 수용체로부터 유래될 수 있다.
일반적으로, 진핵 숙주 세포 내로 도입되고 선택가능 마커로서 이용되는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 숙주 세포의 내인성 폴레이트 수용체에 동종성이거나 이종성일 수 있다 (내인성 폴레이트 수용체가 존재하는 것이 바람직한 경우). 돌연변이된 폴레이트 수용체가 동종성일 경우, 이것은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 유래될 것이다. 이종성일 경우, 이 수용체는 숙주 세포와 상이한 또 다른 종으로부터 유래될 것이다. 예를 들어, 인간-유래 폴레이트 수용체가 설치류 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포에 대한 선택가능 마커로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 포유동물 종으로부터 유래된, 예를 들어 설치류, 예컨대 마우스, 래트 또는 햄스터로부터, 또는 보다 바람직하게는 인간으로부터 유래된 폴레이트 수용체가 사용된다. 한 실시양태에 따르면, 인간 폴레이트 수용체 알파로부터 유래된 돌연변이된 폴레이트 수용체가 선택가능 마커로서 사용된다.
돌연변이된 폴레이트 수용체는 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 수용체 베타 및 폴레이트 수용체 감마로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 돌연변이된 폴레이트 수용체는 하기 서열 1, 3, 4, 6, 7 및 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 야생형 폴레이트 수용체로부터 유래될 수 있지만, 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체는 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 유발하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 폴레이트 수용체 알파, 특히 인간 폴레이트 수용체 알파로부터 유래된다.
성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파는 하기 아미노산 서열 (서열 1, 1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 제시됨)을 포함한다:
Figure pct00003
폴레이트 수용체 알파는 세포막에 GPI 앵커에 의해 천연적으로 고정된다. GPI 앵커에 대한 신호 서열은 서열 1에 제시되지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 서열 1로부터 유래된 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파는 C-말단에 GPI 앵커 신호를 포함한다. 임의의 적절한 GPI 앵커 신호가 사용될 수 있다. 인간 폴레이트 수용체 알파의 천연 GPI 앵커 신호 서열은 다음과 같다 (서열 2, 1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 제시됨):
Figure pct00004
막 고정은 별법으로 막 앵커, 예를 들어 막횡단 앵커를 사용하여 달성될 수 있다. 이 실시양태에서, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 그의 C-말단에 막 앵커를 포함한다. 적절한 앵커는 관련 기술 분야에 알려져 있다.
서열 1로부터 유래된 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파는 N-말단에 리더 서열을 포함할 수 있다. 돌연변이된 폴레이트 수용체의 기능적 발현을 보장하는 임의의 적절한 리더 서열이 사용될 수 있다.
야생형 인간 폴레이트 수용체 알파의 천연 리더 서열 (N-말단의, 밑줄로 표시) 및 천연 GPI 앵커 신호 서열 (C-말단의, 밑줄로 표시)을 포함하는 전체 아미노산 서열은 다음과 같다 (서열 3, 1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 제시됨):
Figure pct00005
성숙 인간 폴레이트 수용체 베타의 야생형 서열은 하기 아미노산 서열 (서열 4, 1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 제시됨)을 갖는다:
Figure pct00006
폴레이트 수용체 베타는 막에 GPI 앵커에 의해 천연적으로 고정된다. GPI 앵커에 대한 신호 서열은 서열 4에 제시되지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 서열 4로부터 유래된 돌연변이된 폴레이트 수용체 베타는 C-말단에 GPI 앵커 신호를 포함한다. 임의의 적절한 GPI 앵커 신호가 사용될 수 있다. 인간 폴레이트 수용체 베타의 천연 GPI 앵커 신호 서열은 다음과 같다 (서열 5, 1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 제시됨):
Figure pct00007
막 고정은 또한 막 앵커, 예를 들어 막횡단 앵커를 사용하여 달성될 수 있다. 이 실시양태에서, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 그의 C-말단에 막 앵커를 포함한다. 적절한 앵커는 관련 기술 분야에 알려져 있다.
서열 4로부터 유래된 돌연변이된 폴레이트 수용체 베타는 N-말단에 리더 서열을 포함할 수 있다. 돌연변이된 폴레이트 수용체의 기능적 발현을 보장하는 임의의 적절한 리더 서열이 사용될 수 있다.
야생형 인간 폴레이트 수용체 베타의 리더 서열 (N-말단의, 밑줄로 표시) 및 천연 GPI 앵커 신호 서열 (C-말단의, 밑줄로 표시)을 포함하는 전체 아미노산 서열은 다음과 같다 (서열 6, 1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 제시됨):
Figure pct00008
또한, 천연적으로 막-결합되지 않은 폴레이트 수용체가 사용될 수 있다. 상기 비-막 결합된 폴레이트 수용체는 막-결합되도록 변경될 수 있다. 예를 들어, 막 앵커가 제공될 수 있고, 상기 폴레이트 수용체는 폴레이트 수용체 및 또 다른 폴리펩티드의 막 앵커를 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 또한, 서열은 GPI 앵커 신호 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 적절한 GPI 앵커 신호 서열은 상기 설명된 바 있고, 또한 선행 기술에서 알려져 있다. 이에 의해, 폴레이트 수용체는 GPI 앵커에 의해 세포막에 고정될 수 있다. 마찬가지로, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 쉽게 이용가능한 다른 변이체도 사용될 수 있다. 이와 관련하여 바람직한 예는 막 앵커를 포함하도록 유전적으로 변경된 폴레이트 수용체 감마, 바람직하게는 인간 폴레이트 수용체 감마를 기초로 한 돌연변이된 폴레이트 수용체일 것이다. 여기서, 폴레이트 수용체 감마 서열은 감소된 폴레이트 결합 친화도를 보이도록 본 개시내용에 따라 돌연변이될 것이다.
야생형 인간 가용성 폴레이트 수용체 감마는 하기 아미노산 서열 (서열 7, 1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 제시됨)을 갖는다:
Figure pct00009
또한, 서열 7로부터 유래된 돌연변이된 폴레이트 수용체 감마는 N-말단에 리더 서열을 포함할 수 있다. 돌연변이된 폴레이트 수용체의 기능적 발현을 보장하는 임의의 적절한 리더 서열이 사용될 수 있다.
야생형 인간 폴레이트 수용체 감마의 리더 서열 (밑줄로 표시)을 포함하는 전체 아미노산 서열은 다음과 같다 (서열 8, 1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 제시됨):
Figure pct00010
폴레이트 수용체 감마를 기초로 한, 본 개시내용에 따라 돌연변이된 폴레이트 수용체는 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 제공하기 위해 각각의 서열 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이는 폴레이트 결합 포켓 내에 존재한다.
한 실시양태에 따르면, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 폴레이트 수용체 알파 또는 베타로부터 유래된다. 한 실시양태에 따르면, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 폴레이트 수용체 알파 및 베타로부터 유래된 키메라 아미노산 서열을 제공함으로써 얻는다. 폴레이트 수용체 알파 및 베타에서, 리간드 결합에 관여하는 중요한 아미노산 위치는 대응하는 성숙 폴레이트 수용체 아미노산 서열 (예를 들어 서열 1 및 4 참조)을 기준으로 하여, 위치 49, 104 및 166이다 (또한, 문헌 [Ramamoorthy et al., 2007] 참조). 한 실시양태에 따르면, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 대응하는 야생형 서열의 위치 49, 104 및 166으로부터 선택된 아미노산 위치에 구조적으로 또는 아미노산 서열 상동성에 의해 대응하는 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함한다. 또한, 하나 초과의 아미노산이 각각의 위치에서 돌연변이된 폴레이트 수용체에서 치환될 수 있다. 하나 이상의 상기 아미노산 위치에서의 치환은 폴레이트 결합 친화도에 대해 강한 영향을 갖는다. 치환은 바람직하게는 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 돌연변이된 폴레이트 수용체의 폴레이트 결합 친화도를 감소시킨다. 한 실시양태에 따르면, 생성되는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 5-메틸테트라히드로폴레이트의 6S 부분입체 이성질체에 대한 감소된 결합 친화도를 보인다. 한 실시양태에 따르면, 생성되는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 엽산에 대한 감소된 결합을 보인다. 한 실시양태에 따르면, 대응하는 야생형 서열에서 천연적으로 생성되는 아미노산은 비-보존적 아미노산에 의해 치환되고, 상기 치환은 돌연변이된 폴레이트 수용체의 폴레이트 결합 친화도를 감소시킨다. 한 실시양태에 따르면, 대응하는 야생형 서열에서 천연적으로 생성되는 아미노산은 보존적 아미노산에 의해 치환된다. 보존적 교환에서, 아미노산은 유사한 특성을 갖는 군 내의 또 다른 아미노산에 의해 교체된다. 대응하는 기의 예는 다음과 같다:
- 비극성 측쇄를 갖는 아미노산: A, G, V, L, I, P, F, W, M
- 극성 측쇄를 갖는 비하전 아미노산: S, T, G, C, Y, N, Q
- 방향족 측쇄를 갖는 아미노산: F, Y, W
- 양 하전 아미노산: K, R, H
- 음 하전 아미노산: D, E
- 유사한 크기 또는 분자량의 아미노산, 여기서 교체 아미노산의 분자량은 본래 아미노산의 분자량으로부터 최대 +/- 25% (또는 +/- 20%, +/- 15%, +/- 10%) 상이하다.
상기 군은 또한 각각의 측쇄 프로파일을 갖는 변형된 아미노산 및 비-천연 아미노산, 예컨대 예를 들어 양 하전 측쇄를 나타내는 군의 경우에 호모아르기닌을 포함함이 자명하다. 한 실시양태에 따르면, 야생형 서열에서 천연적으로 생성되는 아미노산은 돌연변이된 폴레이트 수용체를 제공하기 위해 천연 L-아미노산에 의해 치환된다.
바람직하게는, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 폴레이트 수용체 알파이다. 이것은 설치류, 예컨대 마우스, 래트 또는 햄스터로부터 유래될 수 있거나 또는 인간 폴레이트 수용체 알파로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 인간 폴레이트 수용체 알파로부터 유래된다. 한 실시양태에 따르면, 본 개시내용에 따라 돌연변이된 폴레이트 수용체는 상기 제시된 서열 1 또는 서열 3을 갖는 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파로부터 유래되지만, 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 야기하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 생성되는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 5-메틸테트라히드로폴레이트의 6S 부분입체 이성질체에 대한 감소된 결합 친화도를 보인다. 실시양태에 따르면, 생성되는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 별법으로 또는 추가로 엽산에 대한 감소된 결합 친화도를 보인다.
바람직하게는, 본 개시내용에 따라 돌연변이된 폴레이트 수용체는 서열 1에 제시된 성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파 서열의 위치 49에 구조적으로 또는 아미노산 서열 상동성에 의해 대응하는 아미노산 위치에 치환을 포함한다. 폴레이트 수용체 알파의 성숙 야생형 서열의 위치 49에서의 돌연변이는 폴레이트 결합 포켓에 돌연변이를 도입하고, 따라서 폴레이트 결합 친화도에 큰 영향을 갖는다. 야생형 서열의 상기 위치 49에서의 알라닌은 인간에서 및 대응하는 마우스 야생형 폴레이트 수용체 알파 서열에서 발견된다. 물론, 본 개시내용에 따라 돌연변이된 폴레이트 수용체는, 돌연변이된 폴레이트 수용체가 기능성이라면 다른 위치에 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 야생형 폴레이트 수용체에 비해 폴레이트 결합 친화도를 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이는 성숙 야생형 폴레이트 수용체 알파 서열의 위치 49에 존재하는 알라닌의 류신, 글라이신, 발린, 이소류신, 히스티딘 및 아스파르트산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산에 의한 치환이다. 바람직하게는 알라닌은 류신에 의해 치환된다. 본 발명자들은 놀랍게도 폴레이트 수용체 알파의 서열 내의 치환 A49L은 대응하는 야생형 폴레이트 수용체 알파에 비해 선택가능 마커로서 우수한 특성을 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파를 제공함을 밝혀내었다. 각각의 A49L 치환을 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 대응하는 야생형 폴레이트 수용체 알파에 비해 폴레이트, 즉 5-메틸테트라히드로폴레이트의 6S 부분입체 이성질체에 대한 감소된 결합 친화도를 보인다. 또한, 실시예에서 제시되는 바와 같이, 인간 폴레이트 수용체 알파의 A49L 돌연변이체는 성공적으로 형질감염된 포유동물 숙주 세포를 확인하고 선택하기 위한 선택 마커로서 사용될 때 유의한 이점을 보인다. 따라서, 이것은 관심 있는 재조합 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 숙주 세포를 확인하기 위한 선택 마커로서 바람직하게 사용된다.
한 실시양태에 따르면, 성숙 돌연변이된 폴레이트 수용체는 인간 폴레이트 수용체 알파의 성숙 야생형 서열 (서열 1)에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하지만, 성숙 돌연변이된 폴레이트 수용체의 아미노산 서열은 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파에 비해 폴레이트 결합 친화도를 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 야생형 폴레이트 수용체에 비해 폴레이트 결합 친화도를 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이는 바람직하게는 성숙 야생형 폴레이트 수용체 알파 서열 (서열 1 참조)의 위치 49에 존재하는 알라닌의 류신, 글라이신, 발린, 이소류신, 히스티딘 및 아스파르트산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산에 의한 치환이다. 바람직하게는, 위치 49의 알라닌은 류신에 의해 치환된다. 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체는 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 5-메틸테트라히드로폴레이트의 6S 부분입체 이성질체에 대한 감소된 결합 친화도, 및 선택가능 마커로서 개선된 특징을 보인다.
한 실시양태에 따르면, 제1 폴리뉴클레오티드는 다음 특징을 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩한다:
a) 성숙 돌연변이된 폴레이트 수용체는 다음 서열을 포함하거나,
Figure pct00011
(여기서, Xaa는 알라닌이 아니고, 바람직하게는, Xaa는 류신, 글라이신, 발린, 이소류신, 히스티딘 및 아스파르트산으로부터 선택되는 아미노산이고, 보다 바람직하게는 Xaa는 류신임); 또는
b) 성숙 돌연변이된 폴레이트 수용체는 서열 9에 제시된 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, Xaa는 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체에서 알라닌이 아니고, 바람직하게는 Xaa는 류신, 글라이신, 발린, 이소류신, 히스티딘 및 아스파르트산으로부터 선택되는 아미노산이고, 보다 바람직하게는 Xaa는 류신이고, 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체의 폴레이트 결합 친화도는 Xaa가 알라닌인 성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파 서열 (서열 1 참조)에 비해 감소된다. 한 실시양태에 따르면, 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체는 대응하는 야생형 폴레이트 수용체에 비해 5-메틸테트라히드로폴레이트의 6S 부분입체 이성질체에 대한 감소된 결합 친화도를 보인다. 한 실시양태에 따르면, 생성되는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 추가로 또는 별법으로 엽산에 대한 감소된 결합을 보인다. b)에 따라 돌연변이된 폴레이트 수용체는 a)의 기능적 변이체로서 보일 수 있고, a)에 따른 돌연변이된 폴레이트 수용체에 비해 하나 이상의 아미노산의 추가의 돌연변이(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이것은 폴레이트 수용체로서의 기능이 제거되지 않는다면, 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 추가의 치환, 결실 및/또는 부가를 포함할 수 있다. 또한, 각각의 돌연변이된 폴레이트 수용체 서열을 포함하는 융합 단백질도 포함된다.
상기 논의된 바와 같이, 바람직하게는, Xaa는 류신이다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 폴레이트 수용체 알파의 야생형 서열의 위치 49에 포함된 알라닌의 류신으로의 돌연변이는 선택가능 마커로서 대응하는 야생형 서열에 비해 우수한 특징을 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 제공한다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 폴레이트 수용체 알파의 성숙 야생형 서열의 위치 49에 대응하는 위치에 돌연변이를 보유하는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 포함하는 세포는 선택 후에, 관심 있는 폴리펩티드의 높은 생산성, 종종 대응하는 야생형 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용할 때 달성되는 생산성보다 훨씬 더 높은 생산성 및 또한 다른 돌연변이된 수용체 형태에서 달성되는 것보다 더 높은 생산성을 보인다. 또한, 세포는 선택으로부터 보다 빠르게 회복된다. 이러한 중요한 이점 때문에, A49L 돌연변이된 폴레이트 수용체는 선택가능 마커로서 특히 적절하다. 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파는 문헌 [Shen et al., 1997]에서 설명되고, 특징이 분석되었다. 여기서, 상기 돌연변이된 형태는 야생형 폴레이트 수용체 알파 (2.9)로부터 (179.0)으로 거의 60배 증가한 IC50 (nM) 값에 의해 알 수 있는 바와 같이 5-메틸테트라히드로폴레이트의 6S 부분입체 이성질체에 대한 감소된 결합 친화도를 보인다고 제시되었다.
돌연변이된 폴레이트 수용체는 막-결합되고, 예를 들어 GPI 앵커 또는 막횡단 앵커를 포함할 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 폴레이트 수용체 알파 및 베타는 GPI 앵커에 의해 세포막에 천연적으로 고정된다. 막 고정을 위해 GPI 앵커를 사용할 때, 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GPI 앵커 부착을 위한 적절한 신호 서열을 제공하여야 한다. GPI 앵커에 대한 적절한 신호 서열은 선행 기술에 알려져 있고, 또한 상기 설명되어 있다. 상기 설명된 바와 같이, 각각의 GPI 앵커 신호 서열은 C-말단부에 제공되고, 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 조기 (premature) 돌연변이된 폴레이트 수용체는 다음에서 제시되는 야생형 기능적 인간 폴레이트 수용체 알파의 리더 서열 (서열 10, 1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 제시됨)을 포함한다:
Figure pct00012
야생형 인간 폴레이트 수용체 베타 및 감마의 리더 서열이 이어서 제시된다 (서열 11 및 12, 1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 제시됨):
Figure pct00013
한 실시양태에 따르면, 제1 폴리뉴클레오티드는 다음 특징을 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩한다:
a) 돌연변이된 폴레이트 수용체는 다음 서열을 포함하거나,
Figure pct00014
(여기서, Xaa는 류신임), 또는
b) 돌연변이된 폴레이트 수용체는 서열 13에 제시된 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 Xaa는 b)에 따른 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체에서 류신이고, 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체의 5-메틸테트라히드로폴레이트의 6S 부분입체 이성질체에 대한 결합 친화도는 Xaa가 알라닌인 성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파 서열 (서열 1 참조)에 비해 감소된다.
관심 있는 폴리펩티드
발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물은 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 발현 벡터 또는 조합물 벡터가 본원에서 설명되는 폴레이트 의존성 숙주 세포, 예컨대 예를 들어 포유동물 세포 내로 도입될 때, 관심 있는 폴리펩티드는 상기 숙주 세포로부터 분비된다. 따라서, 관심 있는 폴리펩티드는 분비된 폴리펩티드이다. 폴리뉴클레오티드는 천연적으로 분비되는 폴리펩티드를 코딩할 수 있거나 또는 적절한 분비 리더 서열을 제공함으로써 분비되도록 변경될 수 있다. 대다수의 분비된 폴리펩티드는 생합성 동안 초기의 전구체 폴리펩티드로부터 절단되는 아미노-말단 리더 펩티드 (분비 리더 서열 또는 신호 펩티드로도 언급됨)를 갖는다. 분비 리더 펩티드는 대체로 5 내지 60개 아미노산의 길이이다. 상기 서열은 분비를 위해 필요하고 충분하다. 분비 리더 서열의 많은 예가 선행 기술에 잘 알려져 있고, 따라서 본원에서 구체적으로 설명될 필요는 없다. 상기 분비 리더 펩티드에 대한 매우 많은 분석은 유의한 아미노산 서열 상동성의 부재 하에 발생하는 통상적인 구조적 모티프 (motif)를 제시하였다 ([Von Heijne, 1981]; [Perlman et al., 1983], [Bird et al., 1990]). 일반적으로, 분비 리더 서열은 양 하전 아미노 말단 (n), 소수성 코어 (h) 및 신호 펩티다제 절단 부위를 규정하는 보다 극성이 큰 카르복시 말단 (c)으로 이루어진다. 소수성 잔기의 결실 또는 친수성 또는 하전 아미노산에 의한 교체에 의한 h 영역의 붕괴는 신호 기능의 상실을 유발하는 반면, "n" 영역에 대한 변경은 거의 영향을 주지 않는다. 카르복시 말단, 또는 절단 영역은 일반적으로 약 6개 아미노산의 길이이다. 상기 영역은 대체로 단백질의 최종 폴딩 및 분비의 달성에 필요한 신호 펩티다제 인식 및 절단에 관여한다.
관심 있는 폴리펩티드는 제약 또는 치료 활성 화합물, 또는 검정에 이용되는 분석 도구 등일 수 있다. 관심 있는 폴리펩티드는 임의의 종류일 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 의미한다. 폴리펩티드는 단백질 (예를 들어 50개 초과의 아미노산을 갖는) 및 펩티드 (예를 들어 2 - 49개의 아미노산)를 포함하는 임의의 길이의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 임의의 활성, 기능 또는 크기의 단백질 및/또는 펩티드를 포함하고, 예를 들어 효소 (예를 들어 프로테아제, 키나제, 포스파타제), 수용체, 수송체, 살박테리아 및/또는 내독소-결합 단백질, 구조 폴리펩티드, 당단백질, 구형 단백질, 면역 폴리펩티드, 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 혈액 인자, 백신 등을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 펩티드 호르몬, 인터류킨, 조직 플라스미노겐 활성제, 시토카인, 이뮤노글로불린, 특히 항체 또는 그의 기능적 항체 단편 또는 변이체 및 Fc-융합 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 본원에서 설명되는 개시내용에 따라 발현되는 관심 있는 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드의 하위단위 또는 도메인, 예컨대 예를 들어 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체일 수 있다. 용어 "관심 있는 폴리펩티드"는 문맥에 따라 상기 개개의 하위단위 또는 도메인 또는 각각의 하위단위 또는 도메인으로 이루어진 최종 단백질을 의미할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 관심 있는 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 분자, 보다 바람직하게는 항체, 또는 그의 하위단위 또는 도메인, 예컨대 예를 들어 항체의 중쇄 또는 경쇄이다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 특히 디술피드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 단백질을 나타낸다. 용어 "항체"는 천연적으로 생성되는 항체 및 모든 재조합 형태의 항체, 예를 들어, 인간화 항체, 완전 인간 항체 및 키메라 항체를 포함한다. 각각의 중쇄는 대체로 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역 (CH)으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 대체로 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 이루어진다. 그러나, 용어 "항체"는 또한 다른 종류의 항체, 예컨대 단일 도메인 항체, 중쇄 항체, 즉 하나 이상의, 특히 2개의 중쇄만으로 이루어진 항체, 및 나노바디 (nanobody), 즉 단일 단량체성 가변 도메인만으로 이루어진 항체를 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 관심 있는 폴리펩티드로서 항체의 하나 이상의 하위단위 또는 도메인, 예를 들어 중쇄 또는 경쇄 또는 그의 기능적 단편 또는 그의 유도체를 코딩할 수 있다. 상기 하위단위 또는 도메인은 동일한 또는 상이한 발현 카세트로부터 발현될 수 있다. 항체의 "기능적 단편 또는 유도체"는 특히 항체로부터 유래되고 항체와 동일한 항원, 특히 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 나타낸다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편 또는 그의 유도체에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 단편 또는 유도체의 예는 다음을 포함한다: (i) 각각의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 제1 불변 도메인으로 이루어지는 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; (iii) 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 도메인 CH1로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암 (arm)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 Fv 단편; (v) 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어지는 Fv 단편인 scFv 단편; (vi) 함께 공유 연결된 2개의 Fv 단편으로 이루어지는 (Fv)2 단편; (vii) 중쇄 가변 도메인; 및 (viii) 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 회합이 분자 내가 아니라 분자 사이에서만 발생할 수 있도록 하는 방식으로 함께 공유 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 멀티바디 (multibody).
추가의 선택가능 마커
한 실시양태에 따르면, 본 개시내용에 따른 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물은 추가의 선택가능 마커를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 선택가능 마커는 적절한 선택 배양 조건 하에 상기 선택가능 마커를 발현하는 숙주 세포의 선택을 허용한다. 선택가능 마커는 선택 조건 하에서 상기 마커의 운반체에게 생존 및/또는 성장 이점을 제공한다. 일반적으로, 선택가능 마커 유전자는 선택제, 예컨대 약물, 예를 들어 항생제 또는 다른 독성제에 대한 내성을 부여하거나, 또는 숙주 세포에서 대사 또는 이화 결함을 보충할 것이다. 이것은 양성 또는 음성 선택 마커일 수 있다. 성공적으로 형질감염된 숙주 세포를 선택하기 위해, 배양 배지는 사용되는 선택가능 마커의 선택을 허용하는 선택제를 포함하는 숙주 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 선택 마커는 숙주 세포가 선택 마커가 결여된 숙주 세포의 생존 및/또는 증식에 필수적인 화합물의 부재 또는 감소 하에서 생존 및 증식할 수 있도록 만든다. 한 실시양태에 따르면, 선택가능 마커는 해당 약물을 수반하는 선택 조건에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 약물 내성 마커이다. 다양한 선택가능 마커 유전자는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, WO 92/08796, WO 94/28143, WO2004/081167, WO2009/080759, WO2010/097240 참조). 선택가능 마커는 한 실시양태에 따르면 증폭가능한 선택가능 마커일 수 있다. 포유동물 세포에 통상 사용되는 선택가능 마커 유전자는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 (APH), 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hyg), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나제 (tk), 글루타민 합성효소, 아스파라긴 합성효소에 대한 유전자, 및 네오마이신 (G418), 푸로마이신, 히그로마이신 및 제오신에 대한 내성을 코딩하는 유전자를 포함한다. 상기 선택가능 마커는 돌연변이된 폴레이트 수용체에 더하여 추가로 사용될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물은 폴레이트 대사에 관여하는 선택가능 마커를 코딩하는 추가의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 선택가능 마커의 활성은 적어도 부분적으로 돌연변이된 폴레이트 수용체의 활성에 영향받는다. 추가의 선택가능 마커의 활성이 적어도 부분적으로 돌연변이된 폴레이트 수용체의 활성에 영향받는다는 특징은 특히 상기 추가의 선택가능 마커의 활성이 돌연변이된 폴레이트 수용체의 활성 또는 기능에 의해 영향받고/받거나 직접 또는 간접적으로 이에 적어도 어느 정도 의존함을 의미한다. 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체 및 추가의 선택가능 마커의 의존성/상호작용은 선택 배양 조건 하에서 숙주 세포에 대한 선택 압력을 상당히 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 추가의 선택가능 마커는 폴레이트, 폴레이트의 유도체 및/또는 폴레이트의 처리에 의해 얻을 수 있는 생성물, 예컨대 DHF 또는 THF 또는 이들의 기능적 변이체 또는 유도체인 기질을 처리하는 효소이다. 각각의 기질은 핵산의 생성에 중요하다. 바람직하게는, 추가의 선택가능 마커는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 또는 DHFR의 하류에서 또는 DHFR과 함께 작용하는 효소, 예컨대 티미딜레이트 신타제 (TS) 및 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (SHMT)이다. 바람직하게는, 추가의 선택가능 마커는 DHFR이다. 또한, DHFR은 융합 단백질의 일부로서 발현될 수 있다.
선택가능 마커의 각각의 조합물, 즉 본 개시내용에 따른 돌연변이된 폴레이트 수용체 및 상기 설명된 바와 같이 폴레이트 대사에 관여하는 추가의 선택가능 마커, 바람직하게는 DHFR의 사용은 형질감염된 숙주 세포 집단으로부터 고 생산 세포를 얻고 농축하기 위한 매우 엄격한 선택 시스템을 제공한다. 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 폴레이트 대사에 관여하는 추가의 선택가능 마커, 예컨대 바람직하게는 DHFR과 조합하여 사용하는 상기 개념 및 관련 이점은 본원에 참고로 포함된 WO 2010/097240에 개시되어 있다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 상기 실시양태에 따른 선택 시스템의 높은 엄격도는 선택 후에 얻은 집단 내의 저 생산자의 수를 감소시키고, 따라서 매우 드문 과생산 클론을 발견할 가능성을 증가시킨다. 또한, 고 생산 세포의 보다 균일한 집단이 선택 후에 얻어지고, 이것은 스크리닝 노력을 감소시킨다. 이것은 고 생산 세포의 단일 세포 클로닝을 단순화한다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 본원에서 설명되는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 상기 설명된 바와 같은 폴레이트 대사에 관여하는 추가의 선택가능 마커, 바람직하게는 DHFR과 조합하여 사용하는 것은 야생형 폴레이트 수용체를 상기 선택가능 마커와 조합하여 사용할 때에 비해 개선된 결과를 유도한다. 따라서, 각각의 선택가능 마커의 조합물을 사용할 때에도, 본 개시내용은 돌연변이된 폴레이트 수용체의 사용 때문에 유의한 이점을 제공한다.
상기 논의된 바와 같이, 추가의 선택가능 마커는 바람직하게는 DHFR 효소이다. 본 개시내용에 따라 선택가능 마커로서 사용될 수 있는 여러 개의 적절한 DHFR 효소 및 그에 따른 유전자는 선행 기술에 알려져 있다. 용어 "디히드로폴레이트 환원효소" 또는 "DHFR"은 야생형 DHFR 및 대응하는 야생형 DHFR 효소의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 서열 교환 (예를 들어 결실, 치환 또는 부가)을 갖는 DHFR 효소, DHFR 효소를 포함하는 융합 단백질, 및 추가의 구조 및/또는 기능을 제공하기 위해 변형된 DHFR 효소, 및 DHFR 효소의 적어도 하나의 기능을 계속 갖는 이들의 기능적 단편을 나타낸다. 상기 실시양태는 선행 기술에 잘 알려져 있고, 따라서 상세하게 설명할 필요가 없다. 예를 들어, DHFR 효소는 야생형 DHFR 효소 및/또는 발현될 경우 숙주 세포에 의해 내인성으로 발현되는 DHFR 효소보다 항폴레이트제, 예컨대 MTX에 대한 감수성이 더 크거나 더 작은 선택가능 마커로서 사용될 수 있다. 각각의 DHFR 효소는 선행 기술에 잘 알려져 있고, 예를 들어 EP 0 246 049 및 다른 문헌에 기재되어 있다. DHFR 효소는 본 발명 내에서 기능성이라면, 즉 이용되는 포유동물 숙주 세포와 상용성이라면, 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, MTX에 대한 큰 내성을 갖는 돌연변이체 마우스 DHFR은 포유동물 세포에서 우세한 선택가능 마커로서 광범하게 사용되어 왔다. DHFR+ (플러스) 숙주 세포 및 따라서 기능적 내인성 DHFR 유전자를 포함하는 숙주 세포에 의해 내인성으로 발현되는 DHFR 효소보다 DHFR 억제제, 예컨대 MTX에 대해 덜 감수성인 DHFR 효소가 선택가능 마커로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 인트론 또는 그의 단편이 DHFR 유전자의 개방 해독 프레임의 3' 말단부에 위치한다. DHFR 발현 카세트에 사용되는 인트론은 DHFR 유전자의 더 작은 비-기능적 변이체를 유도한다 (Grillari et al., 2001, J. Biotechnol. 87, 59-65). 이어서, DHFR 유전자의 발현 수준은 저하되고, 이것은 선택 엄격도를 추가로 증가시킨다. DHFR 유전자의 발현 수준을 감소시키기 위해 인트론을 사용하는 다른 방법이 EP0 724 639에 기재되어 있고, 이 또한 사용될 수 있다.
추가의 선택가능 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드와 동일한 발현 벡터에 위치할 수 있거나 또는 발현 벡터의 조합물이 사용될 경우 별개의 발현 벡터에 위치할 수 있다. 이 경우에, 모든 폴리뉴클레오티드 (돌연변이된 폴레이트 수용체, 관심 있는 폴리펩티드 및 추가의 선택가능 마커를 코딩하는)를 포함하는 발현 벡터의 조합물은 선택을 실행할 수 있도록 숙주 세포 내로 동시-형질감염될 것이다.
바람직한 실시양태에 따르면, 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물은 다음을 포함한다:
- 인간 폴레이트 수용체 알파의 성숙 야생형 서열 (서열 1 참조)의 아미노산 49에 구조적으로 또는 아미노산 서열 상동성에 의해 대응하는 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (상기 돌연변이는 폴레이트 결합 친화도를 야생형 폴레이트 수용체 알파에 비해 감소시키고, 바람직하게는, 상기 위치에서 야생형 서열에 존재하는 알라닌은 류신에 의해 치환됨), 및
- 선택가능 마커로서 야생형 DHFR 효소 및/또는 숙주 세포에 의해 내인성으로 발현되는 DHFR 효소보다 MTX에 대해 덜 감수성인 DHFR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드. 상기 DHFR은 바람직하게는 또한 상기 설명한 인트론을 포함한다. 각각의 마커 조합물은 DHFR+ (플러스) 세포가 숙주 세포로서 사용될 때 특히 바람직하다. DHFR+ (플러스) 세포는 내인성 DHFR을 발현한다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 매우 높은 생산 세포 클론은 각각의 벡터 또는 발현 벡터의 조합물을 사용할 때 효율적으로 분비될 수 있다.
본 개시내용에 따른 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물은 선택가능 마커를 코딩하는 하나 이상의 추가의 폴리뉴클레오티드(들)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가의 선택가능 마커는 돌연변이된 폴레이트 수용체 및 폴레이트 대사에 관여하는 추가의 선택가능 마커, 바람직하게는 DHFR 이외에 추가로 존재할 수 있다.
진핵 숙주 세포의 선택을 허용하는 추가의 진핵 선택가능 마커 이외에, 또한 원핵 선택가능 마커가 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물에 존재할 수 있다. 이것은 예를 들어 원핵세포에서 벡터(들)의 증폭을 허용한다. "원핵 선택가능 마커"는 적절한 선택 조건 하에 원핵 숙주 세포에서의 선택을 허용하는 선택가능 마커이다. 각각의 원핵 선택가능 마커의 예는 항생제, 예컨대 예를 들어 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린 및/또는 클로람페니콜에 대한 내성을 제공하는 마커이다.
발현 벡터(들)의 추가의 벡터 요소 및 실시양태
발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물은 추가로 추가의 벡터 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 상기 설명된 바와 같이 및 발현될 수 있는 폴리펩티드의 설명된 예로부터 분명해지는 바와 같이, 숙주 세포에 의해 생산되고 분비되는 최종 폴리펩티드는 또한 여러 개의 개별적인 하위단위 또는 도메인으로 이루어진 단백질일 수 있다. 각각의 단백질의 바람직한 예는 이뮤노글로불린 분자, 특히 예를 들어 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체이다. 상이한 개별적인 하위단위 또는 도메인으로 이루어진 각각의 단백질을 생산하기 위한 여러 방법이 존재하고, 적절한 벡터 설계가 관련 기술 분야에 알려져 있다. 한 실시양태에 따르면, 상기 단백질의 2개 이상의 하위단위 또는 도메인은 한 발현 카세트로부터 발현된다. 상기 실시양태에서, 하나의 긴 전사체는 단백질의 개별적인 하위단위 또는 도메인의 코딩 영역을 포함하는 각각의 발현 카세트로부터 얻는다. 한 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 IRES 요소 (내부 리보솜 도입 부위)는 개별적인 하위단위 또는 도메인의 코딩 영역들 사이에 기능적으로 위치하고, 각각의 코딩 영역 앞에 분비 리더 서열이 존재한다. 이에 의해, 별개의 번역 생성물이 상기 전사체로부터 얻어지고 최종 단백질이 제대로 조립되고 분비될 수 있도록 보장된다. 각각의 기술은 선행 기술에 알려져 있고, 따라서 본원에서 상세한 설명을 할 필요가 없다.
그러나, 상이한 발현 카세트로부터 개별적인 하위단위 또는 도메인을 발현시키는 것은 본 개시내용의 범위 내에 또한 포함되고, 몇몇 실시양태, 예컨대 항체의 발현의 경우에는 심지어 바람직하다. 한 실시양태에 따르면, 관심 있는 폴리펩티드의 발현을 위해 사용되는 발현 카세트는 일시스트론 (monocistronic) 발현 카세트이다. 바람직하게는, 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물에 포함되는 모든 발현 카세트는 일시스트론이다. 한 실시양태에 따르면, 따라서, 각각의 발현 카세트는 관심 있는 폴리펩티드로서 발현되는 단백질의 하나의 하위단위 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 항체의 경우에, 하나의 발현 카세트는 항체의 경쇄를 코딩하고, 또 다른 발현 카세트는 항체의 중쇄를 코딩한다. 개별적인 발현 카세트로부터 개별적인 하위단위/도메인의 발현 후에, 최종 단백질, 예컨대 항체는 상기 하위단위 또는 도메인으로부터 조립되고, 숙주 세포로부터 분비된다. 상기 실시양태는 이뮤노글로불린 분자, 예컨대 항체의 발현에 특히 적절하다. 이 경우에, 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하고, 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드는 이뮤노글로불린 분자의 다른 사슬을 코딩한다. 한 실시양태에 따르면, 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물은 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트 및 이뮤노글로불린 분자의 경쇄 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 동일한 발현 벡터에 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물이 사용되는 경우에 상이한 발현 벡터에 위치할 수 있다. 형질감염된 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현시에, 기능적 이뮤노글로불린 분자가 얻어지고, 숙주 세포로부터 분비된다.
관심 있는 재조합 생성물의 발현을 위해 사용되는 발현 벡터는 대체로 전사를 유도하기 위해 적절한 전사 제어 요소, 예컨대 예를 들어 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 중지 또는 종결 신호를 발현 카세트의 요소로서 포함한다. 바람직하게는, 적절한 번역 제어 요소, 예를 들어 리보솜 동원을 위한 적절한 5' 캡 (cap) 구조를 유도하는 5' 비번역 영역 및 번역 과정을 종결하기 위한 정지 코돈이 포함된다. 선택가능 마커 유전자(들)의 및 관심 있는 폴리펩티드의 생성되는 전사체는 실질적인 수준의 단백질 발현 (즉, 번역) 및 적절한 번역 종결을 용이하게 하는 기능적 번역 요소를 보유한다. 포함된 폴리뉴클레오티드의 발현을 적절하게 유도할 수 있는 기능적 발현 단위는 본원에서 "발현 카세트"로도 언급된다. 분비되는 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들) 및 본원에서 설명되는 선택가능 마커(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 카세트에 포함되는 것이 바람직하다. 여러 실시양태가 적절하고, 예를 들어 각각의 상기 폴리뉴클레오티드(들)은 별개의 발현 카세트에 포함될 수 있다. 그러나, 적어도 2개의 각각의 폴리뉴클레오티드는 또한 하나의 발현 카세트에 포함될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 내부 리보솜 도입 부위 (IRES) 요소는 동일한 발현 카세트로부터 발현되는 폴리뉴클레오티드들 사이에 기능적으로 위치한다. 이에 의해, 별개의 번역 생성물이 상기 전사체로부터 얻어지는 것이 보장된다. 각각의 IRES 기반 발현 기술 및 다른 이- 및 다중-시스트론 시스템은 잘 알려져 있고, 따라서 본원에서 추가로 설명할 필요가 없다.
설명된 바와 같이, 본 개시내용에 따른 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물은 적어도 하나의 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서 요소를 발현 카세트의 요소로서 포함할 수 있다. 프로모터는 다음 2개의 클래스로 분류될 수 있다: 구성적으로 기능하는 프로모터 및 유도 또는 탈억제 (derepression)에 의해 조절되는 프로모터. 둘 모두 본 개시내용에 따라 사용하기에 적절하다. 포유동물 세포에서 단백질의 고-수준 생산을 위해 사용되는 프로모터는 강력하고 바람직하게는 매우 광범한 세포 종류에서 활성을 보여야 한다. 많은 세포 종류에서 발현을 유도하는 강력한 구성적 프로모터는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 최조기 (immediate early) 프로모터, SV40 및 라우스 육종 (Rous Sarcoma) 바이러스 프로모터, 및 뮤린 (murine) 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터, EF1a를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 프로모터 및/또는 인핸서는 CMV 및/또는 SV40로부터 얻을 수 있다. 전사 프로모터는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, EF1 알파 프로모터, RSV 프로모터, BROAD3 프로모터, 뮤린 로사 (rosa) 26 프로모터, pCEFL 프로모터 및 β-액틴 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 선택가능 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 별개의 전사 프로모터의 제어 하에 존재한다. 폴리뉴클레오티드로부터의 발현을 유도하는 별개의 전사 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 추가의 선택가능 마커의 발현을 유도하기 위한 것보다 더 강력한 프로모터 및/또는 인핸서가 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하기 위해 사용된다. 상기 방식은 선택가능 마커보다 관심 있는 폴리펩티드에 대해 더 많은 전사체가 생성되는 효과를 갖는다. 이종성 생성물을 생산하기 위한 개별적인 세포의 능력은 무제한이 아니고 따라서 관심 있는 폴리펩티드에 집중되어야 하기 때문에, 관심 있는 폴리펩티드의 생산이 선택가능 마커의 생산에 비해 우세한 것이 유리하다. 또한, 선택 과정은 이후에 관심 있는 폴리펩티드를 계속 생산하는 발현 세포주를 확립하는 초기 시기에만 이루어진다. 따라서, 관심 있는 폴리펩티드의 발현/생산에 세포의 자원을 집중하는 것이 유리하다. 또한, 관심 있는 폴리펩티드의 발현을 위해 사용되는 것보다 덜 강력한 프로모터가 선택가능 마커의 발현을 위해 사용될 경우, 형질감염된 숙주 세포에 대한 선택 압력은 보다 증가된다.
한 실시양태에 따르면, 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)의 발현을 유도하는 프로모터는 CMV 프로모터이고, 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 프로모터는 SV40 프로모터이다. CMV 프로모터는 포유동물 발현을 위해 이용가능한 가장 강력한 프로모터 중의 하나로 알려져 있고, 매우 양호한 발현 속도를 유도한다. 이것은 SV40 프로모터보다 유의하게 더 많은 전사체를 제공하는 것으로 간주된다. 그러나, 다른 프로모터도 사용될 수 있다.
추가의 실시양태에 따르면, 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 존재할 경우 선택가능 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 전사 프로모터의 제어 하에 위치한다. 적절한 프로모터는 상기 설명한 바 있다. 상기 실시양태에서, 상기 전사 프로모터의 제어 하의 각각의 발현 카세트로부터 하나의 긴 전사체가 얻어진다. 한 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 IRES 요소는 동일한 발현 카세트로부터 발현되는 폴리뉴클레오티드들 사이에 기능적으로 위치한다.
발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물은 적절한 전사 종결 부위를 발현 카세트의 요소로서 포함할 수 있다. 이것은 상류 프로모터로부터의 전사가 제2 전사 단위를 통해 계속되면 하류 프로모터의 기능을 억제할 수 있기 때문에 (프로모터 폐색 (occlusion) 또는 전사 방해로 알려진 현상) 포함된다. 전사 종결 부위는 특성이 잘 결정되어 있고, 그의 발현 벡터 내로의 도입은 유전자 발현에 대해 유익한 여러 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.
발현 카세트는 폴리아데닐화 부위를 포함할 수 있다. 소 성장 호르몬 (bgh), 마우스 베타-글로빈, SV40 조기 전사 단위 및 단순 포진 (Herpes simplex) 바이러스 티미딘 키나제 유전자으로부터 유래되는 것을 비롯하여 포유동물 발현 벡터에 사용될 수 있는 여러 효율적인 폴리A 신호가 존재한다. 그러나, 합성 폴리아데닐화 부위도 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Levitt el al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025]에 기초한 프로메가 (Promega)의 pCI-neo 발현 벡터 참조). 폴리아데닐화 부위는 SV40 폴리A 부위, 예컨대 SV40 후기 및 초기 폴리-A 부위일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Subramani et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 854-864]에 기재된 플라스미드 pSV2-DHFR), 합성 폴리A 부위 (예를 들어, 문헌 [Levitt el al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025]에 기초한 프로메가의 pCI-neo 발현 벡터) 및 bgh 폴리A 부위 (소 성장 호르몬)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 발현 카세트는 적어도 하나의 인트론을 포함할 수 있다. 대체로, 인트론은 개방 해독 프레임의 5' 말단부에 위치하지만, 3' 말단부에도 위치할 수 있다. 따라서, 인트론은 발현 속도를 증가시키기 위해 발현 카세트(들)에 포함될 수 있다. 상기 인트론은 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서 요소(들)와 발현되는 폴리뉴클레오티드의 개방 해독 프레임의 5' 말단부 사이에 위치할 수 있다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 여러 적절한 인트론이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에 따르면, 관심 있는 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트에 사용되는 인트론은 합성 인트론, 예컨대 SIS 또는 RK 인트론이다. RK 인트론은 CMV 프로모터의 인트론 공여자 스플라이스 (splice) 부위 및 마우스 IgG 중쇄 가변 영역의 수용자 스플라이스 부위로 이루어지고 (예를 들어, 문헌 [Eaton et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347], [Neuberger et al., 1983, EMBO J. 2(8), 1373-1378] 참조); pRK-5 벡터 (비디 파밍겐 (BD PharMingen))로부터 얻을 수 있음), 바람직하게는 관심 있는 유전자의 ATG 출발 코돈의 앞에 위치한다.
본 개시내용에 따른 발현 벡터 또는 벡터 조합물은 그의 환상 형태 또는 선형화된 형태로 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있다. 형질감염 전의 발현 벡터의 선형화는 종종 안정한 형질감염의 효율을 개선한다. 발현 벡터가 형질감염 전에 선형화될 경우, 선형화 지점은 제어될 수 있다. 상기 선형화 부위에 대한 적절한 설계는 예를 들어 WO 2009/080720에 기재되어 있다. 발현 벡터(들)은 또한 원핵 복제 기점을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따른 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물은 돌연변이된 폴레이트 수용체의 사용을 기초로 한 본 개시내용에 따른 선택 방법과 선행 기술에 알려진 다른 선택 시스템의 조합을 허용하는 추가의 요소를 포함할 수 있다.
선행 기술에 알려져 있는 하나의 선택 방법은 고발현 숙주 세포를 선택하기 위한 유동 세포 분석, 특히 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)의 사용을 기초로 한다. 유동 세포 분석을 사용한 선택 방법은 매우 많은 세포가 요구되는 특징적인 발현 수율을 위해 신속하게 스크리닝될 수 있다는 이점을 갖는다. 고생산 세포 클론의 확인에 특히 유용한 한 선택 방법에서, 관심 있는 폴리펩티드, 예를 들어 항체의 일부는 막 결합된 융합 폴리펩티드로서 발현된다. 이에 의해, 생성물의 일부는 세포 표면 상에 융합 폴리펩티드로서 제시된다. 생산된 융합 폴리펩티드의 양은 총 발현 속도와 상관성이 있기 때문에, 숙주 세포는 세포 표면 상에 제시된 융합 폴리펩티드의 양을 기초로 하여 유동 세포 분석을 통해 선택될 수 있다. 이것은 고생산 숙주 세포의 신속한 선택을 허용한다. 본 개시내용에 따른 선택 시스템은 유동 세포 분석의 사용을 기초로 한 각각의 선택 방법과 유리하게 조합될 수 있다. FACS를 사용한 효율적인 선택이 가능하도록, 바람직하게는 관심 있는 폴리펩티드를 발현하기 위해 특수한 발현 카세트가 사용된다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현된 관심 있는 폴리펩티드의 일부가 막횡단 앵커를 포함하도록 설계된 발현 카세트에 포함된다. 그 결과를 달성하기 위한 여러 방법이 존재한다.
한 실시양태에 따르면, 관심 있는 폴리펩티드를 발현하기 위한 상기 발현 카세트는 적어도
(i) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
(ii) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 하류의 적어도 하나의 정지 코돈, 및
(iii) 막 앵커 및/또는 막 앵커에 대한 신호를 코딩하는, 정지 코돈 하류의 추가의 폴리뉴클레오티드
를 포함한다.
상기 설명된 발현 카세트에 포함된 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사는 적어도
(i) 그의 번역이 관심 있는 폴리펩티드를 생성하는 폴리뉴클레오티드;
(ii) 상기 폴리뉴클레오티드의 하류의 적어도 하나의 정지 코돈;
(iii) 막 앵커 및/또는 막 앵커에 대한 신호를 코딩하는, 상기 정지 코돈 하류의 폴리뉴클레오티드
를 순차적으로 포함하는 전사체를 생성한다.
전사체의 일부는 적어도 하나의 정지 코돈의 번역 초과 (read-through)에 의해 관심 있는 폴리펩티드 및 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드로 번역된다. 이러한 발현 카세트의 설계는 번역 초과 과정 (정지 코돈이 "누출됨 (leaky)")을 통해 일부의 관심 있는 폴리펩티드가 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 생산되는 효과를 갖는다. 나머지는 선택된 관심 있는 폴리펩티드로서 발현된다. 융합 폴리펩티드는 세포 표면 상에 제시되고, 높은 수준의 막-고정된 융합 폴리펩티드를 제시하는 세포는 유동 세포 분석, 바람직하게는 FACS에 의해, 예를 들어 적절한 세포 표면 염색 기술을 사용하여 선택될 수 있다. 이에 의해, 높은 발현 속도를 보이는 숙주 세포가 선택된다. 상기 정지 코돈 기반 기술에 대한 상세한 내용 및 바람직한 실시양태는 WO2005/073375 및 WO2010/022961에 설명되어 있다. 이것은 본 개시내용에 참조된다.
한 실시양태에 따르면, 발현 카세트는 (iv) 리포터, 예컨대 예를 들어 GFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 리포터를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 정지 코돈의 하류에 위치한다. 정지 코돈 초과시에, 리포터를 포함하고 따라서 발현된 리포터의 특징, 예컨대 그의 형광을 기초로 하여 유동 세포 분석에 의한 선택을 허용하는 융합 폴리펩티드가 얻어진다. 바람직하게는, 리포터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 막 앵커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치한다.
다른 실시양태에 따르면, 상기 발현 카세트는 적어도
(i) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
(ii) 5' 스플라이스 공여자 부위 및 3' 스플라이스 수용자 부위를 포함하고 인 프레임 (in frame) 번역 정지 코돈 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 인트론 및
(iii) 막 앵커 및/또는 막 앵커에 대한 신호를 코딩하는, 상기 인트론 하류의 폴리뉴클레오티드
를 포함한다.
상기 발현 카세트의 설계는 전사 및 전사체 처리를 통해 적어도 2개의 상이한 성숙 mRNA (mRNA-POI) 및 (mRNA-POI-앵커)가 발현 카세트로부터 얻어진다는 효과를 갖는다. mRNA-POI의 번역은 관심 있는 폴리펩티드를 생성한다. mRNA-POI-앵커의 번역은 관심 있는 폴리펩티드 (POI) 및 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드를 생성한다. 그 결과, 상기 융합 폴리펩티드는 다시 세포 표면 상에 제시되고, 높은 수준의 막-고정된 융합 폴리펩티드를 제시하는 세포는 유동 세포 분석, 바람직하게는 FACS에 의해 선택될 수 있다. 이에 의해, 높은 발현 속도를 보이는 숙주 세포가 선택된다. 상기 인트론에 대한 상세한 내용 및 바람직한 실시양태는 WO2007/131774에 설명되어 있다. 이것은 본 개시내용에 참조된다. 한 실시양태에 따르면, 발현 카세트는 (iv) 리포터, 예컨대 예를 들어 GFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 리포터를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 인트론의 하류에 위치한다. 이에 의해, 리포터를 포함하고 따라서 리포터의 특징, 예컨대 그의 형광을 기초로 하여 유동 세포 분석에 의한 선택을 허용하는 융합 폴리펩티드가 얻어진다. 바람직하게는, 리포터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 막 앵커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치한다. 이에 의해, 리포터는 숙주 세포 내에 위치한다.
한 실시양태에 따르면, 발현 카세트는 약 ≤ 50%, ≤ 25%, ≤ 15%, ≤ 10%, ≤ 5%, ≤ 2.5%, ≤ 1.5%, ≤ 1% 또는 ≤ 0.5% 융합 폴리펩티드가 얻어지도록 구축된다. 나머지 부분은 막 앵커를 포함하지 않는 선택된 폴리펩티드 형태로서 생산된다. 막 앵커는 관심 있는 폴리펩티드의 세포막에 대한 고정을 가능하게 하고 따라서 융합 폴리펩티드가 세포 표면 상에 제시되도록 허용하는 임의의 종류의 것일 수 있다. 적절한 실시양태는 GPI 앵커 또는 막횡단 앵커를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 막횡단 앵커는 융합 폴리펩티드의 세포 표면에 대한 긴밀한 결합을 보장하고 융합 단백질의 이탈 (shedding)을 방지하는 것이 바람직하다. 특히 항체를 관심 있는 폴리펩티드로서 발현할 때, 이뮤노글로불린 막횡단 앵커의 사용이 특히 바람직하다. 다른 막 앵커 및 이뮤노글로불린 막횡단 앵커의 바람직한 실시양태는 WO2007/131774, WO2005/073375 및 WO 2010/022961에 설명되어 있다.
한 실시양태에 따르면, 관심 있는 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 분자, 예컨대 항체이다. 이뮤노글로불린 분자의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이뮤노글로불린 분자의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 발현 카세트에 포함될 수 있거나 또는 바람직하게는 상기 설명된 바와 같이 별개의 발현 카세트에 포함될 수 있다. 관심 있는 폴리펩티드의 일부가 번역 초과 또는 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)에 의해 막-고정된 융합 폴리펩티드로서 생산되는 상기 설명된 바와 같은 발현 카세트 설계를 사용할 때, 상기 발현 카세트 설계는 항체 중쇄의 발현을 위해 사용된다.
숙주 세포
제2 측면에 따르면, 본 개시내용은 적어도
a) 선택가능 마커로서 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드 및
b) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드
를 포함하는, 그의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 숙주 세포를 제공하고, 상기 관심 있는 폴리펩티드는 상기 숙주 세포로부터 분비된다.
"도입된 폴리뉴클레오티드"는 예를 들어 재조합 기술, 예컨대 형질감염의 사용에 의해 숙주 세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 숙주 세포는 도입된 폴리뉴클레오티드에 기능적으로 대응하거나 동일한 내인성 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 도입은 예를 들어 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 또는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 도입되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 사용하여 수행된다. 본 개시내용에 따른 발현 벡터 및 발현 벡터의 조합물의 바람직한 예는 본 개시내용의 제1 측면과 관련하여 상기 설명되었다. 도입은 예를 들어 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있는 적절한 발현 벡터의 형질감염 (안정한 형질감염)에 의해 달성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 내로 삽입되지 않을 경우, 이것은 보다 후기에, 예를 들어 세포가 유사분열을 겪을 때 상실될 수 있다 (일시 형질감염). 적절한 벡터는 또한 예를 들어 에피솜 복제에 의해 게놈 내로 통합되지 않으면서 숙주 세포 내에서 유지될 수 있다. 안정한 형질감염이 관심 있는 폴리펩티드를 산업 규모로 생산하기 위해 적절한 고 발현 세포 클론의 생성을 위해 바람직하다. 폴리뉴클레오티드, 예컨대 발현 벡터를 진핵 숙주 세포 내로 도입하기 위한 여러 적절한 방법이 선행 기술에 알려져 있다. 각각의 방법은 인산칼슘 형질감염, 전기천공, 뉴클레오펙션 (nucleofection), 리포펙션, 바이올리스틱 (biolistic)- 및 중합체-매개 유전자 전달 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 전통적인 무작위 통합 기반 방법 이외에, 재조합 매개 방법도 도입되는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 게놈 내로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 각각의 방법은 선행 기술에 잘 알려져 있기 때문에, 본원에서 상세히 설명할 필요는 없다. 그러나, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 다른 기술이 또한 선행 기술에 알려져 있고, 차래에서 추가로 상세히 설명된다.
한 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 상기 및 청구범위에서 상세히 설명되는 제1 측면에 따른 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물을 포함한다. 본 발명자들은 본원에 적용되는 상기 개시내용을 참고한다. 바람직하게는, 상기 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물은 게놈 내로 안정적으로 통합된다.
본 개시내용에 따른 시스템을 사용한 선택을 허용하기 위해, 숙주 세포의 세포 생존성은 폴레이트 흡수, 바람직하게는 엽산의 흡수에 의존하여야 한다. 적절한 진핵 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 진균 세포 및 식물 세포는 폴레이트에 대해 자가영양성일 수 있다 (즉, 상기 세포는 그의 세포 생존성, 즉 세포 성장 및 증식에 필요한 그 자신의 폴레이트를 자체적으로 합성할 수 있다). 본 개시내용은 폴레이트에 대해 영양요구성이거나 영양요구성으로 된 상기 진균 및 식물 세포를 포함한다. 이것은 예를 들어 유전자 조작 때문일 수 있고, 즉 세포는 그의 세포 생존성에 필요한 충분한 양의 폴레이트를 합성할 수 없다. 바람직하게는, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 모든 포유동물 세포는 폴레이트 흡수에 의존성이고, 따라서 본원에서 설명되는 선택 시스템과 함께 사용될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 포유동물 세포는설치류 세포, 인간 세포 및 원숭이 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다. CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, 마우스 3T3 섬유모세포, 및 SP2/0 세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있는 설치류 세포가 특히 바람직하다. 특히 바람직한 설치류 세포는 CHO 세포이다. 인간 세포가 또한 사용될 수 있고, HEK293 세포, MCF-7 세포, PerC6 세포, CAP 세포 및 HeLa 세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 원숭이 세포는 COS-1, COS-7 세포 및 Vero 세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 숙주 세포에는 적어도 하나의 내인성 폴레이트 수용체의 전체 활성이 결여된다. 각각의 세포주는 예를 들어 낙아웃 세포주를 생성하기 위한 선택/스크리닝 과정 또는 유전 공학 기술을 통해 얻을 수 있다. 따라서, 예를 들어 적어도 하나의 내인성 폴레이트 수용체를 포함하는 내인성 일방향성 기능적 폴레이트 수송 시스템에 전체 활성이 결여된, 즉 약화된 숙주 세포도 제공된다. 상기 약화는 예를 들어 해당 내인성 폴레이트 수송 시스템, 예를 들어 내인성 폴레이트 수용체의 임의의 종류의 돌연변이 유발, 예를 들어 점 돌연변이, 유전자 붕괴 등에 의해 제공될 수 있다. 약화는 부분적이거나 전체적일 수 있다. 이 경우에, 본 개시내용에 따른 숙주 세포는 내인성 기능적 일방향성 기능적 폴레이트 수송 시스템, 예를 들어 내인성 폴레이트 수용체를 포함하지 않는다.
그러나, 바람직한 실시양태에 따르면, 본 개시내용에 따른 숙주 세포는 예를 들어 상기 설명된 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물을 통해 상기 숙주 세포 내로 도입된 돌연변이된 폴레이트 수용체 이외에, 적어도 하나의 내인성 기능적 일방향성 기능적 폴레이트 수송 시스템, 특히 하나 이상의 내인성 폴레이트 수용체(들)을 포함한다. 따라서, 유전적으로 비변경된 세포는 본 개시내용에 따른 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물로 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 설명되는 선택 시스템은 상기 내인성 일방향성 기능적 폴레이트 수송 시스템의 존재 하에서도, 즉 상기 내인성 시스템이 보유되는 경우에도 이용될 수 있다는 것이 본 개시내용의 이점이다. 이것은 폴레이트에 대한 비-선택 조건 하에 발생하는 관심 있는 폴리펩티드의 후속 생산을 위한 각각의 숙주 세포의 사용은, 내인성 시스템이 보유되고 따라서 기능성일 경우 그 취급이 더 용이하기 때문에 유리하다. 상기 설명된 바와 같이, 포유동물 숙주 세포가 바람직하다.
따라서, 적어도 하나의 내인성 일방향성 기능적 폴레이트 수송 시스템을 포함하는 숙주 세포가 또한 제공되고, 여기서 상기 내인성 일방향성 기능적 폴레이트 수송 시스템은 바람직하게는 적어도 하나의 내인성 폴레이트 수용체를 포함한다. 그의 바람직한 실시양태에서, 내인성 폴레이트 수용체는 폴레이트 수용체 알파 및 폴레이트 수용체 베타로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 폴레이트 대사에 관여하는 추가의 선택가능 마커를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 실시양태는 제1 측면과 관련하여 상기 설명되었고, 상기 개시내용을 참고한다. 바람직하게는, 상기 추가의 선택가능 마커는 DHFR이다. 상기 실시양태와 함께, 예를 들어 DHFR 유전자가 결여된 숙주 세포 (예를 들어 CHO 세포) (예를 들어 표적화된 게놈 결실에 의함, DHFR- (마이너스) 숙주 세포로도 불림)는 선택가능 마커로서 DHFR 유전자의 동시-형질감염을 위한 수여체로서 사용될 수 있다. 그러나, DHFR 선택을 수행할 때 DHFR을 내인성으로 발현하는 숙주 세포 (DHFR+ (플러스) 숙주 세포)를 사용하는 것도 가능하고 바람직하다. 이 경우에, 바람직하게는 DHFR+ (플러스) 숙주 세포에 의해 발현되는 내인성 DHFR 효소보다 MTX에 덜 감수성인 DHFR 효소가 선택가능 마커로서 사용된다.
한 실시양태에 따르면, 숙주 세포의 내인성 폴레이트 대사 또는 기구는 형질감염에 의한 폴리뉴클레오티드 도입 전에 유전적으로 변경되지 않는다.
관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 임의로 폴레이트 대사에 관여하는 추가의 선택가능 마커 (이것은 바람직하게는 DHFR임)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 임의로 제1 측면과 관련하여 상기 설명된 바와 같은 추가의 폴리뉴클레오티드가 상기 숙주 세포 내로 안정적으로 도입될 수 있다. 안정한 도입 각각의 형질감염은 발현 세포주의 확립 및 특히 분비된 관심 있는 폴리펩티드, 예컨대 항체의 대규모 생산을 위해 유리하다.
재조합 숙주 세포의 생산 방법
제3 측면에 따르면, 그의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 숙주 세포 내로 적어도
a) 선택가능 마커로서 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및
b) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드
를 도입하는 단계를 포함하고, 상기 관심 있는 폴리펩티드는 상기 숙주 세포로부터 분비되는 것인, 본 발명의 제2 측면에 따른 숙주 세포의 생산 방법이 제공된다.
진핵 숙주 세포, 예컨대 포유동물 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터를 도입하기 위한 적절한 여러 방법이 선행 기술에 알려져 있다. 각각의 방법은 선행 기술에 알려져 있고, 또한 상기 설명되어 있다. 전통적인 무작위 통합 기반 방법 이외에, 재조합 매개 방법도 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 임의로 추가의 선택가능 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (및/또는 추가의 폴리뉴클레오티드)를 숙주 세포 게놈 내로 옮기기 위해 사용될 수 있다. 상기 재조합 방법은 도입유전자의 유도 삽입을 매개할 수 있는 Cre, Flp 또는 ΦC31와 같은 부위 특이적 재조합효소의 사용을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Oumard et al., Cytotechnology (2006) 50: 93 - 108 참조). 별법으로, 상동성 재조합의 메카니즘이 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위해 사용될 수 있다 (문헌 [Sorrell et al., Biotechnology Advances 23 (2005) 431 - 469]에서 검토됨). 재조합 기반 유전자 삽입은 숙주 세포로 옮겨지는/도입되는 이종성 핵산에 포함되는 요소의 수를 최소화하도록 허용한다. 예를 들어, 나머지 요소만이 숙주 세포로 옮겨질/형질감염될 필요가 있도록, 프로모터 및 폴리-A 부위 (외인성 또는 내인성)를 이미 제공하는 삽입 유전자좌가 사용될 수 있다. 관심 있는 폴리펩티드, 돌연변이된 폴레이트 수용체 및 하나 이상의 선택가능 마커 (사용될 경우) 및 이들의 조합물에 대한 상세한 내용은 상기 설명되어 있고; 본 발명자들은 상기 개시내용을 참고한다. 한 실시양태에 따르면, 제1 측면에 따른 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물이 숙주 세포 내로 도입된다. 발현 벡터 및 발현 벡터의 조합물은 상기 및 청구범위에서 상세히 설명된다. 각각의 개시내용을 참고한다. 또한, 그의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 숙주 세포의 적절한 예도 상기 설명되어 있고; 각각의 개시내용을 참고한다.
선택 방법
제4 측면에 따르면, 본 개시내용은
a) 본 개시내용의 제2 측면에 따른 다수의 숙주 세포를 제공하고;
b) 상기 다수의 숙주 세포를 제한된 농도의 폴레이트를 포함하는 선택 배양 배지에서 배양하고;
c) 관심 있는 폴리펩티드를 발현하는 적어도 하나의 숙주 세포를 얻는 것
을 포함하는, 관심 있는 재조합 폴리펩티드를 고수율로 발현할 수 있는 적어도 하나의 숙주 세포를 선택하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "선택하기" 또는 "선택"은 특히 도입되는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 본 개시내용에 따른 발현 벡터 또는 벡터 조합물을 포함하는 숙주 세포를 선택하고 따라서 얻기 위해 선택가능 마커 및 선택 배양 조건을 사용하는 과정을 나타낸다. 성공적으로 형질감염된 숙주 세포는 예를 들어 형질감염된 숙주 세포의 집단으로부터의 단리 및/또는 농축에 의해 얻을 수 있다. 성공적으로 형질감염된 숙주 세포는 선택 조건에서 생존할 수 있고 관심 있는 폴리펩티드를 발현한다. 선택 방법은 생체외 (ex vivo) 방법이다.
본원에서 사용되는 "폴레이트의 제한 농도"는 특히 숙주 세포에 대한 선택 압력을 제공하는 선택 배양 배지 내의 폴레이트(들)의 농도를 나타낸다. 따라서, 폴레이트는 선택 배양 배지에 풍부하게 포함되지 않고, 상기 배양 배지 내의 폴레이트(들)의 제한은 숙주 세포에 대한 선택 압력을 제공한다. 상기 선택 조건 하에서, 기본적으로 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 포함하는 숙주 세포만이 성장하고/하거나 증식한다. 도입되는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물을 성공적으로 포함하지 않고 따라서 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 발현하지 않거나 또는 발현이 낮은 숙주 세포는 제한 농도의 폴레이트를 제공하는 선택 배양 조건 하에 증식 및/또는 성장할 수 없고/없거나, 죽을 수 있다. 이와 반대로, 본 개시내용에 따른 발현 벡터 또는 벡터 조합물을 성공적으로 포함하고 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 고수율로 발현하는 (따라서 동시-도입된 관심 있는 폴리펩티드를 발현하는) 숙주 세포는 선택 압력에 내성을 보이거나 영향을 덜 받고, 따라서 선택 동안 성공적으로 형질감염되지 않은 숙주 세포 또는 세포의 게놈 내로의 통합 부위가 안정한 형질감염의 경우 유리하지 않은 경우 숙주 세포보다 더 크게 성장할 수 있다.
선택 배양 배지에 제한 농도로 포함된 폴레이트는 숙주 세포, 특히 선택가능 마커로서 사용되는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 포함하는 숙주 세포에 의해 흡수되고 처리될 수 있다. 숙주 세포에 의해 처리되지 않거나 처리될 수 없는 폴레이트 및 특히 폴레이트의 유도체는 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위해 작용하는 선택 압력에 기여하지 않고, 따라서 폴레이트의 제한 농도에 기여하지 않는다. 그러나, 각각의 폴레이트, 예컨대 예를 들어 항폴레이트제가 존재할 수 있고, 훨씬 더 바람직하게는 예를 들어 추가의 선택가능 마커로서 DHFR과의 조합 선택이 본원에서 설명되는 바와 같이 수행될 경우 존재한다. 선택 배양 배지에 제한 농도로 존재하는 폴레이트는 예를 들어 산화된 폴레이트 또는 환원된 폴레이트 또는 그의 유도체일 수 있다. 산화된 폴레이트, 예컨대 엽산, 및 환원된 폴레이트로 알려진 엽산의 환원된 유도체 또는 테트라히드로 폴레이트 (THF)는 포유동물 세포에서 퓨린, 티미딜레이트 및 특정 아미노산의 생합성을 위한 필수적인 보조인자 및/또는 보조효소인 B9 비타민의 군이다. 환원된 폴레이트의 예는 5-메틸-테트라히드로엽산, 5-포르밀-테트라히드로엽산, 10-포르밀-테트라히드로엽산 및 5,10-메틸렌-테트라히드로엽산을 포함한다. 일반적으로, 폴레이트는 성장 및 증식을 유지하기 위해 숙주 세포 내로 흡수되어 처리될 수 있는 한 유용하다. 바람직하게는, 선택 배양 배지에 제한 농도로 포함되는 폴레이트는 엽산이다. 제한 농도의 폴레이트를 제공하기 위한 적절한 농도 범위는 아래에서 설명된다.
선택 동안, 본 개시내용에 따른 발현 벡터(들)을 성공적으로 포함하는 숙주 세포는 형질감염된 숙주 세포의 집단으로부터 풀로서 농축될 수 있다. 이어서, 예를 들어, 상기 풀은 관심 있는 폴리펩티드를 발현하고 예를 들어 양호한 특정 발현 속도, 성장 특징 및/또는 안정성 특성을 갖는 포함된 숙주 세포를 확인하기 위해 분석될 수 있다. 또한, 개별적인 숙주 세포는 형질감염되고 선택된 숙주 세포의 집단으로부터 단일 클론으로서 단리될 수 있다 (예를 들어 클론 선택 또는 FACS 선택에 의해). 선택 (예를 들어 FACS 분류 또는 제한 희석에 의한) 후에 얻은 생존하는 숙주 세포의 집단으로부터 성공적으로 형질감염된 단일 클론을 얻기 위한 선택 절차의 적절한 실시양태는 선행 기술에 잘 알려져 있고, 따라서 상세히 설명할 필요가 없다.
숙주 세포, 돌연변이된 선택가능 마커, 추가의 선택가능 마커 및 마커 조합물, 발현 벡터 및 벡터 조합물의 적절하고 바람직한 실시양태는 상기 상세하게 설명되었고, 상기 개시내용을 참고한다.
설명된 바와 같이, 본 개시내용에 따른 선택 방법은 세포 배양 배지 내의 폴레이트, 바람직하게는 엽산의 제한된 이용가능성을 기초로 한다. 이 시스템은 널리 적용가능하고, 특히 그의 세포 생존성이 폴레이트, 특히 엽산의 흡수에 의존하는 진핵 세포, 예컨대 특히 포유동물 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 포유동물 세포의 예는 상기 설명되었다. 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하는 것과 조합된 상기 폴레이트-기반 선택은 배양된 포유동물 세포에서 폴리펩티드의 가속되고 안정한 고수준의 과다발현을 위해 매우 적합한 우수한 전략이다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 돌연변이된 폴레이트 수용체가 선택가능 마커로서 사용되는 본 개시내용에 따른 방법은 고수준의 재조합 생성물, 예컨대 항체를 과다발현하는 숙주 세포, 특히 포유동물 숙주 세포의 가속된 선택, 스크리닝 및 확립을 허용한다. 그 결과는 야생형 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용할 때보다 개선된다.
본 개시내용에 따른 선택 시스템은 상기 설명된 바와 같이 형질감염 전에 내인성 폴레이트 수용체 유전자(들)의 게놈 결실 또는 약화를 필요로 하지 않고, 따라서 내인성 폴레이트 수용체 유전자 발현이 존재하더라도 임의의 수여체 세포에 적용될 수 있다. 이러한 핵심적인 이점은 선택가능 마커로서 돌연변이된 폴레이트 수용체의 형질감염 후에, 세포는 성장 배지로부터 폴레이트 (예를 들어 엽산)의 갑작스럽고 극심한 결핍에 노출될 수 있다는 사실을 기초로 한다. 여기서, 보다 낮은 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 사용할 때, 야생형 폴레이트 수용체를 사용하는 선택 시스템에 비해 훨씬 더 낮은 농도의 폴레이트가 선택 배양 배지에 사용될 수 있다. 유의한 양의 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 발현하는 형질감염체 세포만이 DNA 복제 및 세포 증식을 지속하기 위해 충분한 폴레이트를 숙주 세포 내로 수송할 수 있다. 이것은 심지어 선택 주기 동안 내인성 폴레이트 수용체 알파 유전자의 발현의 임의의 유의한 상승의 부재시에도 발생한다. 또한, 본 개시내용에 따른 선택 시스템은 분명히 내인성 RFC의 발현 증가를 비롯한 폴레이트 흡수의 대체 경로의 발현 증가를 통한 선택 압력의 완화에 의해 선택 엄격도의 상실로 인한 문제가 발생하지 않는다. 이러한 중요한 이점은 폴레이트 수용체 알파가 엽산에 대한 현저한 친화도 (Kd=0.1 nM)를 갖는 반면, RFC는 엽산에 대해 극히 불량한 친화도 (Km=0.2-0.4 mM)를 보인다는 사실에 의한 것이다.
본 개시내용의 엄격한 스크리닝/선택 절차로서 얻은 세포는 본래의 세포 집단의 비-선택된 세포로부터 단리 및 농축될 수 있다. 이들은 개별 세포 또는 세포 풀로서 단리하고, 배양할 수 있다. 얻어진 숙주 세포는 또한 임의로 추가의 정성적 또는 정량적 분석을 위해 하나 이상의 추가 라운드의 선택에 사용될 수 있거나, 또는 예를 들어 단백질 생산을 위한 클론 세포주의 개발에서 사용될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 상기 설명된 바와 같이 선택된 생산 숙주 세포의 농축된 집단은 관심 있는 폴리펩티드를 양호한 수율로 생산하기 위한 집단으로서 직접 사용된다.
바람직하게는, 관심 있는 폴리펩티드를 안정적으로 발현하고 따라서 분비하는 숙주 세포가 선택된다. 안정한 형질감염/발현의 이점은 상기 상세하게 설명되었다. 본 발명자들은 상기 개시내용을 참고한다. 바람직하게는, 클론 세포주는 관심있는 단백질을 목적하는 고수율로 발현하는 선택된 숙주 세포로부터 확립된다.
적어도 하나의 선택 단계 b)에서 사용되는 선택 배양 배지는 하나 이상의 종류의 폴레이트를 포함할 수 있다. 선택 배양 배지에 제한 농도로 포함되는 폴레이트는 생존을 허용하고, 바람직하게는 세포 성장 및 증식을 지속하도록 허용하기 위해 형질감염된 숙주 세포에 의해 흡수되고 처리될 수 있다. 단계 b)에서 사용되는 선택 배양 배지는 하나 이상의 다음 특징을 가질 수 있다:
(a) 배지는 제한 농도의 폴레이트를 포함하고, 상기 폴레이트는 바람직하게는 약 2000 nM 이하, 약 1750 nM 이하, 약 1500 nM 이하, 약 1000 nM 이하, 약 500 nM 이하, 약 350 nM 이하, 약 300 nM 이하, 약 250 nM 이하, 약 150 nM 이하, 약 100 nM 이하, 약 75 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 35 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 25 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 15 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하 및 약 2.5 nM 이하로부터 선택된 농도의 엽산임; 및/또는
(b) 배지는 약 2000 nM 이하, 약 1750 nM 이하, 약 1500 nM 이하, 약 1000 nM 이하, 약 500 nM 이하, 약 100 nM 이하, 약 75 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 35 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 25 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 15 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하 및 약 2.5 nM 이하로부터 선택된 농도의 엽산을 포함함.
선택 배양 배지 내의 폴레이트 및 특히 엽산의 바람직한 농도는 다음으로부터 선택될 수 있다:
(a) 약 2000 nM - 0.1 nM;
(b) 약 1750 nM - 0.1 nM;
(c) 약 1500 nM - 0.1 nM;
(d) 약 1250 nM - 0.1 nM;
(e) 약 1000 nM- 0.1 nM;
(f) 약 750 nM - 0.1 nM;
(g) 약 500 nM - 0.1 nM;
(h) 약 250 nM - 0.1 nM; 바람직하게는 약 250 nM - 1 nM 또는 약 250 nM - 2.5 nM;
(i) 약 150 nM - 0.1 nM; 바람직하게는 약 150 nM - 1 nM 또는 약 150 nM - 2.5 nM;
(j) 약 100 nM - 0.5 nM; 바람직하게는 약 100 nM - 1 nM 또는 약 100 nM - 2.5 nM;
(k) 약 75 nM - 0.5 nM, 바람직하게는 약 75 nM - 1 nM 또는 약 75 nM - 2.5 nM;
(l) 약 50 nM - 1 nM; 바람직하게는 약 50 nM - 2.5 nM 또는 약 50 nM - 5 nM;
(m) 약 35 nM - 0.5 nM; 및
(n) 약 25 nM - 1 nM 또는 약 25 nM - 2.5 nM, 약 20 nM - 3 nM, 약 15 nM - 4 nM 또는 10 nM -5 nM.
한 실시양태에 따르면, 엽산은 제한 농도의 폴레이트에 기여하는, 선택 배양 배지에 포함되는 유일한 폴레이트이다.
상기 설명된 농도 및 농도 범위는 상업적인 생산 세포주에 바람직한 표현형인, 현탁 세포, 예컨대 CHO 세포의 신속한 성장에 특히 적합하다. 선택 배양 배지에 포함되는 폴레이트는 바람직하게는 엽산이다. 그러나, 상이한 세포주는 상이한 엽산 소비 특성을 가질 수 있다. 그러나, 적절한 농도는 통상의 기술자에 의해 실험을 통해 쉽게 결정될 수 있다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하면 선택 배양 배지 내의 보다 낮은 폴레이트 농도를 사용할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 형질감염 및/또는 선택 단계 b) 전에 폴레이트 비함유 배양 배지 내에서 또는 제한 농도의 폴레이트를 포함하는 배양 배지 내에서 전배양된다. 이에 의해, 세포는 그의 내부 폴레이트 비축분 (reservoir)을 사용하도록 강제된다. 폴레이트의 적절한 제한 농도는 상기 설명되었다. 바람직하게는, 숙주 세포를 전배양하기 위한 상기 배양 배지는 폴레이트, 특히 엽산을 100 nM 이하, 75 nM 이하, 50 nM 이하, 바람직하게는 25 nM 이하, 보다 바람직하게는 15 nM 이하, 가장 바람직하게는 10 nM 이하의 농도로 포함하거나 또는 심지어 폴레이트가 존재하지 않을 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 세포 은행 (bank), 예를 들어 마스터 (master) 세포 은행 또는 제조용 세포 은행은 제한 농도의 폴레이트, 예를 들어 엽산에서 전배양된 상기 숙주 세포로부터 생성된다. 이것은 형질감염 및 세포주 생성을 위한 제조 시간이 보다 단축된다는 이점을 갖는다.
바람직한 실시양태에 따르면, 본 개시내용에 따른 선택가능 마커로서 사용되는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 상기 설명된 바와 같은 추가의 선택가능 마커와 조합하여 사용된다. 상기 논의된 바와 같이, 상기 추가의 선택가능 마커는 바람직하게는 폴레이트 대사에 관여하고, 바람직하게는 DHFR이다. 세포가 추가의 선택가능 마커로 추가로 형질감염되는 한 실시양태에 따르면, 단계 b)에서 사용되는 선택 배양 배지는 상기 추가의 선택가능 마커에 대한 적어도 하나의 적절한 억제제를 포함한다. 선택 배양 배지 내의 상기 억제제의 사용된 농도 (또한 점진적으로 증가될 수 있음)는 선택 조건의 엄격도에 기여한다. 또한, 선택 압력을 유지하기 위해, 배양 배지는 추가의 선택가능 마커의 활성을 우회하도록 허용하는 충분한 양의 대사산물을 포함하지 않아야 한다. 예를 들어, DHFR이 폴레이트 대사에 관여하는 추가의 선택가능 마커로서 사용될 경우, 선택 배양 배지는 관련 뉴클레오티드를 포함하지 않는 것이 유리하다. 일반적으로, 선정된 선택 전략을 방해하는 대사산물 또는 다른 첨가제는 선택 배지에서 제어되고, 예를 들어 방지될 것이다.
돌연변이된 폴레이트 수용체 (제한 농도의 폴레이트)에 대한 및 추가의 선택가능 마커 (예를 들어, DHFR이 선택가능 마커로서 사용되는 경우에 DHFR 억제제)에 대한 선택 조건은 적절한 선택 배양 배지를 사용함으로써 단계 b)에서 동시에 적용될 수 있다. 이것은 선택 압력을 증가시키고, 보다 효율적인 선택 절차를 허용하여 관심 있는 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 적절한 세포주를 얻기 위한 시간을 감소시킬 수 있다. 선택가능 마커 조합인 돌연변이된 폴레이트 수용체/DHFR에 대해, 제한 농도의 폴레이트 (적절한 농도 및 폴레이트의 예는 상기 설명됨)를 포함하고 DHFR의 억제제, 예컨대 항폴레이트제를 추가로 포함하는 선택 배양 배지가 바람직하게는 단계 b)에서 사용된다. DHFR의 억제제는 특히 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)의 활성을 억제하는 화합물을 나타낸다. 각각의 억제제는 예를 들어 DHFR에 대한 결합을 위해 DHFR 기질과 경쟁할 수 있다. 적절한 DHFR 억제제는 예를 들어 항폴레이트제, 예컨대 메토트렉세이트 (MTX)이다. 추가의 예는 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트 (뉴트렉신), 트리메토프림, 피리메타민 및 페메트렉세드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 단계 b)에서 사용되는 선택 배양 배지는 추가로 적어도 하나의 DHFR 억제제, 예컨대 바람직하게는 항폴레이트제, 예컨대 MTX를 포함한다.
따라서, 한 실시양태에 따르면, 단계 a)에서 제공되는 숙주 세포는 DHFR인 선택가능 마커를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 단계 b)에서, 항폴레이트제를 1500 nM 이하, 1250 nM 이하, 1000 nM 이하, 750 nM 이하, 500 nM 이하, 250 nM 이하, 200 nM 이하, 150 nM 이하, 125 nM 이하, 100 nM 이하 또는 75 nM 이하의 농도로 포함하는 선택 배양 배지가 사용된다. 한 실시양태에 따르면, 선택 배양 배지는 MTX를 항폴레이트제로서 포함한다. 바람직하게는, 선택 배양 배지는 MTX를 약 350 nM 이하, 200 nM 이하, 바람직하게는 약 150 nM 이하, 125 nM 이하, 100 nM 이하, 75 nM 이하 또는 50 nM 이하의 농도로 포함한다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 매우 낮은 MTX 농도가 본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있는 것이 특히 유리하다. 항폴레이트제, 특히 MTX의 바람직한 농도는 다음으로부터 선택될 수 있다:
(a) 약 500 nM - 1 nM;
(b) 약 350 nM - 2.5 nM;
(c) 약 200 nM - 5 nM;
(d) 약 150 nM - 7.5 nM;
(e) 약 100 nM - 10 nM; 및
(f) 약 75 nM - 10 nM.
상기 설명된 폴레이트 및 항폴레이트제에 대한 바람직한 농도 및 농도 범위는 서로 조합될 수 있다. 한 실시양태에서, 약 0.1 nM - 100 nM, 바람직하게는 1 nM - 75 nM, 보다 바람직한 5 nM - 50 nM의 폴레이트 농도는 선택 배양 배지 내의 2.5 nM - 150 nM, 바람직하게는 5 nM 내지 125 nM, 보다 바람직한 7.5 nM 내지 100 nM, 보다 바람직하게는 10 nM 내지 50 nM의 항폴레이트제 농도와 조합되어 사용된다. 설명된 바와 같이, 바람직하게는 엽산은 폴레이트로서, MTX는 항폴레이트제로서 사용된다.
또한, 사용된 폴레이트 및 항폴레이트제 농도가 서로 영향을 미칠 수 있음도 밝혀졌다. 따라서, 폴레이트 및 항폴레이트제의 절대 농도 이외에, 비율이 또한 적절한 선택 조건을 제공하기 위한 인자일 수 있다. 항폴레이트제 (바람직하게는 MTX)의 농도는 폴레이트 (바람직하게는 엽산) 농도의 약 20배까지일 수 있다. 항폴레이트제 (바람직하게는 MTX) 농도는 폴레이트 (바람직하게는 엽산) 농도의 약 10배일 수 있다. 바람직하게는, 선택 배양 배지는 폴레이트 및 항폴레이트제를 1:10 내지 10:1의 농도비, 바람직하게는 1:5 내지 5:1의 농도비로 포함한다. 약 등몰 농도의 폴레이트 및 항폴레이트제가 사용될 경우 매우 양호한 결과가 얻어진다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 이들 비는 선택가능 마커의 목적하는 조합이 사용될 경우 고생산 숙주 세포를 얻기 위한 매우 적절한 선택 배양 조건을 제공한다.
돌연변이된 폴레이트 수용체가 선택을 위해 폴레이트 대사에 관여하는 선택가능 마커, 바람직하게는 DHFR과 조합하여 사용되는 본 개시내용에 따른 상기 실시양태는 선택에서 생존한 세포 집단의 생산성이 현저하게 증가된다는 이점을 갖는다. 특히, 평균 생산성은 상기 원리가 본 개시내용에 따라 돌연변이된 폴레이트 수용체와 함께 사용될 경우 실시예에서 제시되는 바와 같이 현저하게 증가한다. 실시예는 선택 방법 후에 얻은 숙주 세포가 관심 있는 폴리펩티드를 특정한 고수율로 생산함을 보여주었다. 따라서, 보다 적은 스크리닝 노력으로 고 생산자 클론을 발견할 가능성이 커진다. 따라서, 본 개시내용에 따른 선택 시스템은 선행 기술에서 사용되는 선택 시스템보다 우수하다.
또한, 선택 단계 b)를 적어도 2회 수행하고, 여기서 각각의 선택 단계 b) 사이에 형질감염된 세포가 비제한 또는 적어도 보다 약한 제한 농도의 폴레이트를 포함하고 바람직하게는 DHFR 억제제를 미함유하는, 따라서 예를 들어 항폴레이트제를 미함유하는 배양 배지에서 배양되면, 생산 속도가 추가로 증가될 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 각각의 선택 단계 b) 사이에, 세포를 비-선택 조건 하에 배양하는 것이 바람직하다. 세포가 선택 단계 또는 선택 주기 사이에서 회복하도록 허용하면서 시행되는 각각의 반복된 선택은 관심있는 단백질을 특정 고수율로 발현하는 숙주 세포를 제공하고, 또한, 고 생산자의 수가 유의하게 증가하는 것으로 밝혀졌다.
상기 설명된 바와 같이, 돌연변이된 폴레이트 수용체 및 폴레이트 대사에 관여하는 선택가능 마커에 추가로, 하나 이상의 추가의 선택가능 마커를 또한 사용할 수 있다. 상기 추가의 선택가능 마커에 대한 선택 조건은 단계 b)에서 돌연변이된 폴레이트 수용체 및 임의로 폴레이트 대사에 관여하는 선택가능 마커에 대한 선택 조건을 적용하기 전에 (예를 들어 단계 a)와 b) 사이에 수행한 예비-선택 단계에서) 또는 이와 동시에 적용될 수 있다. 예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (neo)가 추가의 선택가능 마커로서 사용되는 경우, 세포는 본 개시내용에 따른 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물을 포함하는 세포를 예비선택하기 위해, 예를 들어 G418을 함유하는 배지에서 먼저 성장될 수 있다. 고 발현 세포는 이어서 DHFR 기반 선택과 조합한 유리한 실시양태에 따라, 돌연변이된 폴레이트 수용체 기반 선택을 사용하여 상기 예비선택된 세포 집단으로부터 선택된다.
또한, 상기 설명된 바와 같이, 본 개시내용에 따른 선택 방법은 선행 기술에 알려져 있는 유동 세포 분석 기반 선택 방법과 조합될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 유동 세포 분석을 수반하는 선택 단계는 본 개시내용의 방법에 따라 숙주 세포가 선택된 후에, 따라서 단계 c) 후에 수행한다. 이것은 관심 있는 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 생존 집단으로부터 숙주 세포를 선택하기 위해서 수행될 수 있다. 상기 방법은 수동 클로닝 단계 (예를 들어 제한된 희석)를 구식으로 만든다. 이를 위해, 바람직하게는 적어도 일부의 관심 있는 폴리펩티드는 숙주 세포의 세포 표면 상에 제시되는 막 고정된 융합 폴리펩티드로서 발현된다. 제시된 융합 폴리펩티드의 양을 기초로 하여, 유동 세포 분석, 바람직하게는 FACS를 사용하여 관심 있는 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 숙주 세포를 선택할 수 있다. 각각의 선택을 허용하는 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 적절한 발현 카세트는 상기 설명되었다. 각각의 개시내용을 참고한다. 선택을 위해, 숙주 세포는 적어도 일부의 관심 있는 폴리펩티드가 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되도록 관심 있는 폴리펩티드의 발현을 허용하기 위해 배양되고, 상기 융합 폴리펩티드는 상기 숙주 세포의 표면 상에 제시되고, 적어도 하나의 숙주 세포가 세포 표면 상에 제시된 융합 폴리펩티드의 양을 기초로 하여 선택된다. 여기서, 융합 단백질의 세포외 부분에 결합할 수 있는 표지된 검출 화합물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 형광 표지된 검출 화합물이 사용될 수 있다. 별법으로, 융합 단백질은 세포를 표시하여 그의 특징을 기초로 한 직접 선택을 허용하는 리포터, 예컨대 GFP를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 리포터는 막횡단 앵커의 하류에 위치하고, 따라서 세포 내에 위치한다. 상기 논의된 바와 같이, 숙주 세포는 유동 세포 분석, 특히 FACS를 사용하여 발현 수율을 기초로 하여 선택될 수 있다.
관심 있는 폴리펩티드의 생산 방법
제5 측면에 따르면, 본 개시내용에 따른 숙주 세포 및/또는 본 개시내용에 따라 선택된 숙주 세포를 관심 있는 폴리펩티드의 발현 및 분비를 허용하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 관심 있는 재조합 폴리펩티드의 생산 공정을 제공한다. 관심 있는 폴리펩티드를 생산하기 위해 본 개시내용에 따른 숙주 세포를 사용하는 것은 관심 있는 폴리펩티드를 고수율로 생산할 수 있다는 이점을 갖는다. 이것은 특히 발현을 위한 적절한 숙주 세포의 선택을 위해 본 개시내용에 따른 선택 방법을 수행할 때 그러하다. 따라서, 본 개시내용은 관심 있는 폴리펩티드를 생산하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 적절한 숙주 세포는 상기 설명되었고; 본 발명자들은 상기 개시내용을 참고한다.
폴리펩티드는 배양 배지 내로 분비되고, 이로부터 얻을 수 있다. 상기 목적을 위해, 적절한 분비 리더 펩티드가 관심 있는 폴리펩티드에 제공된다. 그 예는 상기 설명되었다. 이에 의해, 재조합 폴리펩티드는 생산되고, 효율적으로 고수율로 얻고/단리될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 상기 숙주 세포는 무혈청 조건 하에 배양된다.
관심 있는 폴리펩티드의 생산 방법은 적어도 하나의 다음 단계를 포함할 수 있다:
- 관심 있는 폴리펩티드를 상기 세포 배양 배지로부터 단리하는 단계; 및/또는
- 단리된 관심 있는 폴리펩티드를 처리하는 단계.
개시내용에 따라 생산된 관심 있는 폴리펩티드는 또한 관심 있는 폴리펩티드를 목적하는 품질로 생산하기 위해 추가의 처리 단계, 예를 들어 정제 및/또는 변형 단계에 적용될 수 있다. 예를 들어, 생성물은 원심분리, 여과, 한외여과, 추출 또는 침전을 포함하고 이로 제한되지 않는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다. 정제는 크로마토그래피 (예를 들어 이온 교환, 친화도, 소수성, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), 및 크기 배제), 전기영동 절차 (예를 들어, 정제용 등전 포커싱 (preparative isoelectric focusing), 용해도 차 (예를 들어 황산암모늄 침전) 또는 추출을 포함하고 이로 제한되지 않는 관련 기술 분야에 알려진 다양한 절차에 의해 수행할 수 있다. 단리된 관심 있는 폴리펩티드는 제약 조성물로서 제제화될 수 있다.
관심 있는 폴리펩티드의 예는 제1 측면과 관련하여 상기 설명되었고, 각각의 개시내용을 참고한다. 포유동물 세포는 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대응하는, 각각 동일한 내인성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 포유동물 세포는 관심 있는 폴리펩티드에 대응하는 내인성 유전자를 포함하지 않는다. 또한, 상기에서 및 청구범위에서 규정되는 본 개시내용에 따른 방법에 의해 얻은 폴리펩티드가 제공된다. 상기 폴리펩티드는 특히 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편일 수 있다.
용도
본 개시내용의 제6 측면은 선택가능 마커로서,
a) 다음 서열을 갖거나 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체
Figure pct00015
(여기서, Xaa는 알라닌이 아니고, 돌연변이된 폴레이트 수용체의 폴레이트 결합 친화도는 Xaa가 알라닌인 대응하는 야생형 폴레이트 수용체 (서열 1)에 비해 감소됨), 또는
b) 서열 9에 제시된 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체 (여기서, Xaa는 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체에서 알라닌이 아니고, 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체의 폴레이트 결합 친화도는 Xaa가 알라닌인 환원된 야생형 폴레이트 수용체 알파 서열 (서열 1 참조)에 비해 감소됨)
를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 상기 선택가능 마커는 그의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는, 성공적으로 형질감염된 숙주 세포, 예컨대 특히 포유동물 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 이것은 관심 있는 재조합 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 숙주 세포를 확인하기 위한 선택 마커로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체는 발현 벡터에 포함된다. 각각 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하는 것에 대한 상세한 내용, 조합 및 이점 및 적절한 발현 벡터는 상기 설명되었고, 상기 개시내용을 참고한다. 본 개시내용의 방법에서 사용하는 것이 특히 바람직하다. 상기 설명된 바와 같이, Xaa는 바람직하게는 류신, 글라이신, 발린, 이소류신, 히스티딘 및 아스파르트산으로부터 선택된 아미노산이다. 가장 바람직하게는, Xaa는 류신이다. 바람직하게는, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 GPI 고정된다. 한 실시양태에 따르면, 상기 선택가능 마커는 추가의 선택가능 마커로서의 DHFR과 조합하여 사용된다. 상기 실시양태 및 적절한 선택 조건의 상세한 내용은 상기 설명되었고, 상기 개시내용을 참고한다.
본 개시내용의 제7 측면은 선택가능 마커로서,
a) 다음 서열을 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체
Figure pct00016
또는
Figure pct00017
(여기서, Xaa는 류신임), 또는
b) 서열 9 또는 서열 13에 제시된 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체 (여기서, Xaa는 b)에 따른 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체에서 류신임)
를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 상기 선택가능 마커는 그의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 세포, 예컨대 특히 포유동물 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 이것은 관심 있는 재조합 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 숙주 세포를 확인하기 위한 선택 마커로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 선택가능 마커로서 사용되는 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체는 발현 벡터에 포함된다. 각각 돌연변이된 폴레이트 수용체 (A49L 돌연변이체)를 선택가능 마커로서 사용하는 것 및 적절하고 바람직한 발현 벡터에 대한 상세한 내용, 조합 및 이점은 상기 설명되었고, 또한 실시예에서 설명된다. 각각의 개시내용을 참고한다. 본 개시내용의 방법에서 사용하는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 GPI 고정된다. 한 실시양태에 따르면, 상기 선택가능 마커는 추가의 선택가능 마커로서의 DHFR과 조합하여 사용된다. 상기 실시양태 및 적절한 선택 조건의 상세한 내용은 상기 설명되었고, 상기 개시내용을 참고한다. 상기 제7 측면의 바람직한 실시양태는 다시 아래에서 설명된다.
제7 측면의 한 실시양태에 따르면, 다음을 포함하는 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물이 사용된다:
a) 선택가능 마커로서 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
b) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드,
여기서,
i) 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체는 다음 서열을 포함하거나,
Figure pct00018
또는
Figure pct00019
(여기서, Xaa는 류신임), 또는
ii) 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체는 서열 9 또는 서열 13에 제시된 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 Xaa는 ii)에 따른 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체에서 류신이다.
바람직하게는, 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 별개의 발현 카세트에 포함된다. 발현 카세트 및 발현 벡터의 적절하고 바람직한 실시양태의 상세한 내용은 상기 설명되었고, 상기 개시내용을 참고한다. 바람직하게는, 관심 있는 폴리펩티드는 분비된 폴리펩티드이다. 상세한 내용은 제1 측면과 관련하여 상기 설명되었다. 한 실시양태에 따르면, 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물은 폴레이트 대사에 관여하는 선택가능 마커, 바람직하게는 디히드로폴레이트 환원효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 적절하고 바람직한 실시양태는 상기 설명되었고, 상기 개시내용을 참고한다. 바람직하게는 DHFR인 상기 선택가능 마커는 바람직하게는 별개의 발현 카세트에 포함된다.
상기 측면의 한 실시양태에 따르면, 다음을 포함하는, 그의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 숙주 세포가 또한 제공되고, 관심 있는 폴리펩티드는 상기 숙주 세포로부터 분비된다:
a) 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드, 및
b) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 도입된 폴리뉴클레오티드,
여기서,
i) 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체는 다음 서열을 포함하거나,
Figure pct00020
또는
Figure pct00021
(여기서, Xaa는 류신임), 또는
ii) 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체는 서열 9 또는 서열 13에 제시된 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 Xaa는 ii)에 따른 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체에서 류신이다.
바람직하게는, 상기 숙주 세포는 상기 설명된 바와 같은 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물을 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 설치류 세포, 보다 바람직하게는 CHO 세포이다. 한 실시양태에 따르면, 포유동물 숙주 세포는 내인성 폴레이트 수용체를 발현한다. 한 실시양태에 따르면, 포유동물 숙주 세포는 폴레이트 대사에 관여하는 선택가능 마커, 바람직하게는 디히드로폴레이트 환원효소를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 적절하고 바람직한 실시양태 및 각각의 숙주 세포를 생산하기 위한 방법은 상기 상세하게 설명되었다. 각각의 개시내용을 참고한다.
상기 측면의 한 실시양태에 따르면,
a) aa) 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드 및
bb) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 도입된 폴리뉴클레오티드
를 포함하는, 그의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 다수의 숙주 세포를 제공하고;
b) 상기 다수의 숙주 세포를 폴레이트를 제한 농도로 포함하는 선택 배양 배지 내에서 배양하고;
c) 관심 있는 폴리펩티드를 발현하는 적어도 하나의 숙주 세포를 얻는 것
을 포함하는, 관심 있는 재조합 폴리펩티드를 요구되는 수율로 발현할 수 있는 적어도 하나의 숙주 세포를 선택하는 방법이 또한 제공되고,
여기서
i) 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체는 다음 서열을 포함하거나,
Figure pct00022
또는
Figure pct00023
(여기서, Xaa는 류신임), 또는
ii) 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체는 서열 9 또는 서열 13에 제시된 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 Xaa는 ii)에 따른 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체에서 류신이다.
단계 b)에서 사용되는 선택 배양 배지는 제한 농도의 폴레이트를 포함하고, 상기 폴레이트는 바람직하게는 약 2000 nM 이하, 약 1750 nM 이하, 약 1500 nM 이하, 약 1000 nM 이하, 약 500 nM 이하, 약 350 nM 이하, 약 300 nM 이하, 약 250 nM 이하, 약 150 nM 이하, 약 100 nM 이하, 약 75 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 35 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 25 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 15 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 7.5 이하, 약 5 nM 이하 및 약 2.5 nM 이하로부터 선택되는 농도의 엽산이다. 바람직하게는, 엽산이 폴레이트로서 사용된다. 숙주 세포는 바람직하게는 포유동물 세포이다. 한 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 디히드로폴레이트 환원효소인 선택가능 마커를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 상기 실시양태에서, 단계 b)에서 사용된 선택 배양 배지는 한 실시양태에 따르면 1500 nM 이하, 1000 nM 이하, 750 nM 이하, 500 nM 이하, 200 nM 이하, 150 nM 이하, 125 nM 이하, 100 nM 이하, 75 nM 이하, 50 nM 이하, 25 nM 이하, 20 nM 이하, 15 nM 이하, 12 mM 이하 및 10 nM 이하로부터 선택된 농도의 항폴레이트제를 추가로 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 단계 c) 후에, 세포는 비-제한 농도의 폴레이트를 포함하는 배양 배지 내에서 배양한 후, 다시 단계 b)에 따라 배양하고, 단계 c)에 따라 얻는다. 바람직하고 적절한 선택 배양 배지의 추가의 상세한 내용 및 선택 방법의 실시양태는 제4 측면과 관련하여 상기 설명되었고, 각각의 개시내용을 참고한다.
상기 측면의 추가의 실시양태에 따르면,
a) 상기 측면의 선행 문단에서 설명된 숙주 세포 및/또는 상기 측면의 선행 문단에서 설명된 방법에 따라 선택된 숙주 세포를 관심 있는 폴리펩티드의 발현 및 분비를 허용하는 조건 하에 배양하고;
b) 관심 있는 폴리펩티드를 세포 배양 배지로부터 단리하고;
c) 임의로 단리된 관심 있는 폴리펩티드를 처리하는 것
을 포함하는, 관심 있는 폴리펩티드를 생산하는 방법이 또한 제공된다.
각각의 생산 방법, 및 관심 있는 폴리펩티드의 적절하고 바람직한 실시양태에 대한 상세한 내용도 상기 설명되었고, 상기 개시내용을 참고한다. 바람직하게는, 관심 있는 폴리펩티드는 치료 활성 폴리펩티드, 예컨대 항체이다.
본 발명은 본원에 개시된 예시적인 방법 및 물질에 의해 제한되지 않는다. 본원에서 설명되는 수치 범위는 그 범위를 규정하는 수치를 포함한다. 본원에서 제시되는 제목은 그 전체로서 명세서에 참고로 이해될 수 있는 본 발명의 다양한 측면 또는 실시양태를 제한하지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 특정 요소를 포함하는 것으로서 본원에서 설명되는 대상은 각각의 요소로 이루어진 대상을 나타낸다. 특히, 특정 서열을 포함하는 것으로서 본원에서 설명되는 폴리뉴클레오티드는 또한 각각의 서열로 이루어질 수 있다. 본원에서 설명되는 바람직한 실시양태를 선택하고 조합하는 것이 바람직하고, 바람직한 실시양태의 각각의 조합에 의해 생성되는 특정 대상도 본 개시내용에 속한다.
다음 실시예는 임의의 방식으로 그 범위를 제한하지 않으면서 본 개시내용을 예시하는 역할을 한다. 특히, 실시예는 본 개시내용의 바람직한 실시양태에 관한 것이다.
실시예
후속 실험에서, 다음 벡터를 사용하였다:
참조 벡터 "V-DHFRref"는 다음 주요 발현 카세트를 포함하였다: 선택 마커로서 DHFR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트; 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트; 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트, 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트. 모든 발현 카세트는 동일한 방향으로 배향되었다. 전체 항체는 상기 참조 벡터로부터 발현된다. 적절한 벡터 디자인은 WO 2009/080720에 또한 설명되어 있다.
선택 마커로서 폴레이트 수용체를 포함하는 벡터는 선택가능 마커로서 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대하여 선택가능 마커로서 DHFR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 교환함으로써, 참조 벡터에 기초하여 설계되었다. 그 외에는, 발현 카세트는 동일하게 유지되었다. 벡터 "V-wtFR알파"는 선택 마커로서 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파를 포함하였다. 벡터 "V-mutFR알파"는 A49L 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 인간 폴레이트 수용체 알파를 포함하였다.
실시예 1: 단일 형질감염
단일 형질감염을 위해, 야생형 인간 엽산 수용체 알파 (벡터: V-wtFR알파) 또는 돌연변이체 인간 폴레이트 수용체 알파 (벡터: V-mutFR알파)를 선택 마커로서 CHO 세포 내로 도입하였다. 본 실험은 폴레이트 수용체 선택 시스템의 기능을 분석하기 위한 목적을 수행하였고, 상기 시스템은 DHFR/MTX-시스템과는 반대로, 세포 성장의 독성 억제에 기반하는 것이 아니라, 배양 배지 내에 엽산 결핍으로 인한 성장 억제에 기반한다. 엽산은 비타민 B9의 산화된 형태이다. 엽산은 그의 환원된 형태, 즉, 테트라히드로폴레이트 (THF)에서 생물학적 활성이다. 엽산은 효소 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)에 의해 NADPH-의존 반응으로 디히드로폴레이트 (DHF)를 통해 세포 내에서 그의 생물학적 활성 형태인 테트라히드로폴레이트 (THF)로 환원된다. 엽산의 흡수는 세포 성장 및 세포 증식을 지속하기 위해 포유동물 세포에 필수적이다.
형질감염된 벡터를 게놈 내로 통합하고, 야생형 폴레이트 수용체 알파 (V-wtFR알파) 또는 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파 (V-mutFR알파)를 높은 효율로 발현하는 세포만이 배양 배지 내에 제한 농도의 폴레이트에 기초한 선택 조건에서 생존할 수 있다. 심지어 배양 배지가 제한 농도의 엽산을 포함하더라도, 이들 세포는 세포 성장에서 증식을 지속하기 위해 배양 배지로부터 충분한 양의 엽산을 세포 내로 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 관심있는 단백질 (본 실험에서 항체의 중쇄 및 경쇄)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 때문에, 폴레이트 수용체 기반 선택 기술을 이용하여 안정한 고생산의 생산 세포주를 선택할 수 있다.
세포의 성장에 대한 엽산 농도의 영향을 결정하기 위해, 상이한 선택 배양 배지를 시험하였다. 표준 배양 배지는 11.7 μM 엽산을 포함한다 (완전 배지). 배양 배지 내에 ≤50 nM 엽산을 사용할 때 가장 엄격한 선택 조건이 달성되었음이 밝혀졌다. 또한, 상이한 엽산 농도를 사용할 때 성장 속도의 차이가 관찰되었다. 배양 배지 내에 엽산이 보다 적으면, 세포의 성장이 더 느렸다.
먼저, CHO 세포의 내부 엽산 비축분을 감소시키고, 표준 배양 배지 (완전 배지)로부터의 엽산의 선택 배지 내로 동시-전달을 방지하였다. 따라서, 형질감염에 앞서, 제한 엽산 농도를 이용한 선택을 위해 의도된 세포를 PBS로 3회 세척하고, 엽산 비함유 배지 내에 접종하였다. 참조 대조군 (벡터 V-DHFRref)을 완전 배지 내에서 동일한 세포 밀도로 계대배양하였다. 형질감염에 앞서 세포의 성장을 분석하였고, 완전 배지 (5x106 LZ/ml) 내에서 성장시킨 배양액이 선택 배지 (2.5x106 LZ/ml) 내에서 성장시킨 배양액보다 약 2배 더 우수하게 성장하였음이 밝혀졌다.
벡터를 뉴클레오펙션을 이용하여 세포 내로 형질감염시켰다. 5x106개의 생활 세포 (LZ/ml)를 3 ㎍ 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 벡터 V-wtFR알파, V-mutFR알파 및 음성 대조군 (V-DHFRref를 포함하고 DNA 미함유)을 포함하는 CHO 세포를 선택 배지 내로 옮기고; 참조 형질감염체를 완전 배지 내로 옮겼다. 수행된 단일 형질감염을 표 1에 요약한다. 선택은 형질감염의 48시간 후에 시작하여, 세포가 뉴클레오펙션으로부터 회복하고 도입된 발현 벡터의 발현을 시작하도록 하였다. 시험할 선택 마커를 포함하는 세포를 제한된 농도의 엽산에 노출시켰다. 평행으로, 선택 마커 DHFR (V-DHFRref)를 상이한 MTX 포함 배양 배지 및 상이한 엽산 (FA) 함유 선택 배지에 노출시켰다. 추가의 DNA가 없는 배양액은 음성 대조군으로서 역할을 하였다.
Figure pct00024
형질감염 효율은 GFP 제어를 통해 48h 후에 결정하였다. 후속 표 2는 엽산 기반 선택의 제12일에 달성된 생활 세포 밀도에 관한 개요를 제공한다.
Figure pct00025
표 2는 대조군 (V-DHFRref; DNA 미함유), V-wtFR알파 및 V-mutFR알파로 형질감염시키고 상이한 엽산 농도를 이용하여 선택된 세포 풀의 세포 밀도 [LZ/mL]를 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, 선택 배지 내의 엽산 농도가 감소할 때 성장이 감소한다. 선택 마커로서 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파로 형질감염된 세포 풀은 제한 농도의 엽산을 포함하는 선택 배지 내에서, 다른 풀에서 관찰되는 세포 성장보다 대략 2배 높거나 훨씬 더 높은 세포 성장을 보여준다. 제12일에, 야생형 폴레이트 수용체 알파로 형질감염된 세포는 성장 이점을 보이지 않았다. 이들은 V-DHFRref를 포함하는 집단 또는 음성 대조군과 대략 동일하게 잘 성장하였다. 그러나, 야생형 폴레이트 수용체 알파에서 성장 이점은 대략 제16일 내지 제20일에 시작하여 보다 후기 단계 - 사용된 엽산 농도에 따라 -에서 보인다. 따라서, 두 종류의 폴레이트 수용체 (야생형 및 돌연변이체)는 배양 배지 내에서 제한 농도의 엽산에 기반하여 세포를 선택하기 위해 적절하다. 그러나, 본원에 교시된 선택가능 마커로서 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파의 사용은, 성공적으로 형질감염된 세포의 성장 이점이 야생형 폴레이트 수용체 알파를 사용할 때 보다 더 초기에 보이기 때문에 더 유익하다. 또한, 돌연변이된 폴레이트 수용체는 보다 낮은 엽산 농도, 예컨대 15 nM 및 심지어 5 nM에서의 선택을 허용하였다. 따라서, 선택 마커로서 본원에 따른 돌연변이된 폴레이트 수용체를 사용할 때 보다 엄격한 선택 조건을 사용할 수 있다.
선택의 제12일에 세포 풀의 생존성을 분석할 때, 35 - 50 nM의 엽산 농도에서 관찰된 생존성은 대략 동일하였다 (세포 풀의 생존성 > 90%). 높은 생존성 때문에, 상기 일에 집단을 계대배양하는 것이 가능하였다. 그러나, 보다 낮은 엽산 농도에서, 생존성은 감소하였다. 최저 엽산 선택 배지 내에서, V-mutFR알파 형질감염된 집단이 76%의 비교적 높은 생존성을 보였다.
또한, 선택에 필요한 시간을 분석하였다. 선택을 위해 필요한 전체 시간은 새로운 선택 마커를 확립할 때 중요하다. CHO 세포를 배양할 때, 단일 선택 단계 DHFR-MTX-선택은 사용된 선택 조건에 따라 15 내지 16일 이내에 완료될 수 있다. 그러나, 다단계 유전자 증폭은 대체로 유의하게 더 오래 소요된다. 상기 기간 동안, 세포는 선택 압력 때문에 유도되는 위기 (crisis)로부터 회복할 것이다. 표 3은 선택에서 다음 계대배양까지 일수, 즉, 세포가 90%를 초과하는 생존성을 달성하여 세포가 항체 역가 스크리닝을 위해 사용될 수 있기 위해 필요한 시간 기간을 보여준다.
Figure pct00026
표 3은 선택에서 다음 계대배양까지의 일수, 즉, 세포가 선택 위기를 극복하고 90% 초과의 생존성을 달성하기 위해 필요한 시간틀을 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, 시작에서, 모든 세포 풀은 50, 45 또는 35 nM 엽산을 포함하는 선택 배지 내에서 배양할 때 회복하였다. 그러나, 보다 낮은 엽산 농도는 세포 상에 보다 큰 선택 압력을 가하여, V-mutFR알파의 사용만이 우수한 회복, 및 따라서 이들 매우 엄격한 조건 하에 16일 후에 생존성을 허용하였다. 여기서, V-mutRF알파로 형질감염된 집단은 단지 5 nM 내지 25 nM 엽산을 포함하는 선택 배지 내에서 회복하고 90% 초과의 생존성을 보여주었다. V-wtFR알파로 형질감염된 세포는 보다 많은 시간을 필요로 하고 매우 낮은 엽산 농도에서 회복하지 못하였다.
실시예 2: 항체 생산성의 결정
형질감염의 성공 및 관심있는 유전자 (여기서, 참조 항체)의 발현에 기반한 선택을 분석하기 위해, 실시예 1에 따라 얻어진, 즉, 선택된 세포를 선택 후에 세포의 생산성을 결정하기 위해 13일 동안 진탕 플라스크 내에서 배치 (batch) 배양액으로서 배양하였다. 세포는 90% 초과의 생존성을 가졌다. 제13일에, 배양 상청액 내의 항체 농도를 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 이용하여 결정하였다 [mg/L]. 결과를 표 4에 제시한다.
Figure pct00027
도입된 발현 벡터로부터 발현된 항체를 모든 세포 집단에서 관찰할 수 있었다. DNA로 형질감염되지 않은 풀에서 또한 소량의 항체가 결정되었으므로, 9 mg/l을 초과한 값만을 유의한 것으로 결정하였다. 125 nM MTX (표준 DHFR/MTX 선택 시스템) 내의 참조 집단은 28 mg/l을 생산하였다. V-wtFR알파로 형질감염된 4가지 세포 집단의 결과는 보다 높은 엽산 농도에서 배경 범위에 있었다. 그러나, 배양 배지 내의 엽산 농도를 15 nM 엽산으로 낮추면, 항체 발현이 125 nM MTX에서 참조 대조군 V-DHFRref (28 mg/l)와 대략 동일하게 높았다 (24 mg/l). 이것은 야생형 폴레이트 수용체가 선택 마커로서 역할을 할 수 있고, 심지어 선택을 위해 독성제를 사용하지 않더라도 확립된 DHFR/MTX 시스템에 대등한 효율을 달성한다는 선행 발견을 입증한다. V-mutFR알파로 형질감염된 세포 풀은 항체 역가의 선형 증가를 보여주었고, 이것은 배양 배지 내의 엽산 농도에 의존성이었다. 배양 배지 내의 엽산의 농도가 낮을수록, 생성되는 항체 발현 속도가 더 높았다. 따라서, 본 개시내용에 따른 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택 마커로서 사용하는 것은 선택 마커로서 야생형 폴레이트 수용체를 사용하는 것에 비해 잇점을 갖는다.
통합된 도입유전자의 수가 발현 속도에 대해 중요한 영향을 가지므로, 가장 중요한 요소, 즉, 발현된 항체의 경쇄 및 중쇄 (LC, HC)의 카피수 및 폴레이트 수용체 (돌연변이된 또는 야생형)의 카피수를 세포 풀의 게놈 DNA에 기초한 정량적 PCR을 이용하여 결정하였다.
측정된 항체 역가와 관련하여, 카피수는 간접적으로, 게놈 내로의 통합 위치가 강한 발현 또는 약한 발현에 대해 책임이 있는지에 대한 의문에 통찰력을 제공할 수 있다. 본원에서 수행한 정량적 PCR 분석은 도입유전자 카피수의 평균 값을 제공하고, 이것은 단일 세포 클론이 아니라, 선택에서 생존한 상이한 세포의 집단을 분석했기 때문이다.
Figure pct00028
표 5는 선택 후에 V-wtFR알파 및 V-mutFR알파 형질감염체의 정량적 PCR 분석의 결과를 보여준다. 대조군 풀로부터, 최고 선택 엄격도에서 생존한 풀을 분석하였다 (V-DHFRref: 125 nM MTX, 35 nM 엽산, DNA 미함유: 25 nM 엽산). 또한, 선택 압력 없이 배양된 비형질감염된 CHO 세포를 음성 대조군으로서 분석하였다. 표 5는 경쇄 및 중쇄에 대한 카피수, 및 선택 마커로서 사용된 폴레이트 수용체에 대한 카피수를 보여준다. 이 값은 CHO 세포의 이론적 게놈 크기를 나타낸다. 표 5는 비형질감염된 CHO 세포에서, 예상된 바와 같이, 항체 서열이 결정될 수 없음을 보여준다. 또한, 내인성 야생형 엽산 수용체 알파 카피만이 결정되었다. 125 nM MTX를 사용하여 선택된 참조 대조군 V-DHFRref는 항체 도입유전자의 평균 2배 통합을 보여준다. 35 nM 엽산을 사용하여 선택된 집단 V-DHFRref를 볼 때, 항체의 경쇄 및 중쇄의 훨씬 더 많은 통합을 볼 수 있다. 5.5 카피의 중쇄 및 6.8 카피의 경쇄가 검출되었다. FR 알파 유전자의 카피수는 모 CHO 세포와 대등하고, 내인성 대립유전자에 기인한다.
V-wtFR알파로 형질감염된 풀은 V-DHFRref를 갖는 대조군에 비해 단지 수 카피의 HC 및 LC만을 보여주었다. 농도-의존 차이는 관찰되지 않았다. 폴레이트 수용체 카피의 수는 50 nM로부터 35 nM 엽산까지 2.8 카피로 증가하지만, 이어서 25 nM에서 감소하였다. 또한, 15 nM 엽산을 사용하여 선택된 풀은 평균 2.6 카피의 항체 사슬을 포함하였다. 이와 반대로, V-mutFR알파로 형질감염된 세포 풀은 항체 사슬의 유전자 카피의 거의 선형 증가를 보여주었고, 이것은 선택 배지 내의 엽산의 감소와 평행이었다. 따라서, 선택 배지 내의 엽산의 농도가 낮을수록, 선택된 세포에서 보다 많은 카피수의 LC 및 HC 유전자가 검출되었다. 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파 유전자의 카피수는 대등한 경향을 보여주었다. 5 nM 엽산을 사용하여 선택된 풀은 125 nM MTX를 사용하여 선택된 참조 대조군 V-DHFRref보다 약 3배 더 많은 카피의 항체가 통합되었다.
실시예 3: 단일 세포 클로닝
관심있는 유전자를 고수율로 안정적으로 생산하는 세포주를 개발하기 위해, 실시예 1에 따른 선택에서 생존한 상이한 생산 세포의 얻어진 집단으로부터, 높은 항체 발현 속도 및 우수한 세포 성장을 모두 보이는 최상의 세포 클론을 선택하는 것이 필요하다. 상기 목적을 위해, 단일 세포로부터 제한 희석에 의해 세포주를 생산하였다. 제한 희석에 의해 실시예 1에 따른 선택에서 생존한 세포의 폴리클로날 집합체로부터 시작하여 모노클로날 세포 집단을 얻을 수 있다. 이것은 모 (폴리클로날) 세포 배양액의 일련의 증가하는 희석비를 설정함으로써 달성하였다. 모 세포의 현탁액을 제조한다. 이어서, 출발 집단 내의 세포수에 따라 적절한 희석액을 제조한다. 최종 희석액을 생산한 후, 단일 세포를 세포 배양 플레이트의 웰에 넣고, 그로부터 클론을 제조한다. 모노클로날 세포의 집단을 확립하면 장기간에 걸쳐 안정한 항체 발현을 보장한다. 선택된 세포 집단 V-wtFR알파 (15 nM 엽산), V-mutFR알파 (5 nM 엽산), V-DHFRref (125 nM MTX) 및 V-DHFRref (250 nM MTX - 상이한 형질감염으로부터)를 각각 클로닝하였다. 클로닝은 완전 배지 내에서, 및 또한 선택을 위해 앞서 사용한 것에 대응하는 선택 배지 내에서 수행하였다. 따라서, 후자의 경우에, 단일 세포 클로닝 동안 선택 압력이 유지되었다. 성공적인 성장 후에, 클론을 70% 이상의 전면생장률에서 24 웰 플레이트 내로 옮기고, 배치 배양액 (지속시간 10일) 내에서 그들의 항체 생산에 대해 시험하였다. 배치 배양 동안, 다시 완전 배지 (선택 압력 없음) 또는 선택 배지 (유지된 선택 압력)를 사용하였다. 클론을 최고부터 최저 발현 수준까지 정렬시켰다 (배지-의존성). 결과를 도 1 내지 4에 제시한다.
완전 배지 (선택 후에 선택 압력을 유지하지 않음) 및 선택 배지 (선택 압력은 선택 후에 유지되었다) 내에서 달성된 클로닝 결과를 제시한다. 여기서, 수동 클로닝 절차의 대표적인 전개가 보여진다. 1-5의 고생산 세포 클론이 발견되었고, 그 후, 곡선은 저-발현 또는 심지어 비-발현 세포 클론으로 급속하게 하강한다. 추가로, 저생산 세포 클론 내에서, 광범위한 세포 생산성이 관찰되었지만, 대다수는 9 mg/l의 역치 미만이었다.
완전 배지 및 선택 배지 내에서 V-DHFRref로 형질감염된 세포의 클로닝 (125 nM MTX를 사용하여 선택된)은 6 x 96-웰 플레이트로부터 86개의 클론 (완전 배지에서 53개, 선택 배지에서 33개)을 생성하였다. 최고 생산 클론을 선택 배지 내에서 배양하였고, 24-웰 내에서 배치 28.4 mg/l을 생산하였다. 250 ml 진탕 플라스크 (총 50 ml) 내에서, 원래의 폴리클로날 풀은 또한 28 mg/l의 역가를 달성하였다. 완전 배지 및 선택 배지 내에서 V-DHFRref로 형질감염된 세포의 클로닝 (250 nM MTX를 사용하여 선택된)은 76개의 클론 (완전 배지에서 41개 및 선택 배지에서 35개)의 단리를 허용하였다. 3개의 최상의 클론은 완전 배지 내에서 배양된 세포로부터 단리되었고, 달리 선택 배지 내에서 성장시킨 세포는 완전 배지 내의 클론과 같이 보다 높은 전체 생산성을 보여주었다. 출발 폴리클로날 풀은 27 mg/l의 역가를 가졌고, 최고 생산 세포 클론은 24 웰 내에서 42 mg/l을 달성하였다. 두 참조 대조군은 모두 선택 동안 사용된 최고 MTX 농도가 반드시 최고 역가를 생성하지는 않음을 보여준다. 최상의 클론을 단리할 수 있기 위해, 다수의 세포 클론을 분석하는 것이 필요하다.
선택가능 마커로서 야생형 폴레이트 수용체 알파를 포함하는 벡터 V-wtFR알파로 형질감염된 세포 (15 nM 엽산을 사용하여 선택된)를 또한 완전 배지 (선택 후에 선택 압력을 유지하지 않음) 내에서 또는 선택 배지 (그에 의해 클로닝 동안 선택 압력을 유지하는) 내에서 클로닝하였다. 2개의 최고 생산 클론이 선택 배지 내에서 단리되었다. 최상의 클론은 24 웰 형식에서 53 mg/l을 달성하였다. 단지 7개의 클론이 상기 선택 배지 내에서 생존한 것은 놀라웠다. 완전 배지 내에서 49개의 클론이 생존하였다. 원래의 풀은 250 ml 진탕 플라스크 내에서 약 24 mg/l의 항체 농도를 가졌다.
선택가능 마커로서 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파를 포함하는 벡터 V-mutFR알파로 형질감염된 세포 (5 nM 엽산을 사용하여 선택된)를 또한 완전 배지 (선택 후에 선택 압력을 유지하지 않음) 내에서 또는 선택 배지 (그에 의해 클로닝 동안 선택 후에 선택 압력을 유지하는) 내에서 클로닝하였다. 2개의 최상의 클론이 완전 배지로부터 및 선택 배지로부터 단리되었다. 최고 생산 클론은 상청액 내에 42 mg/l의 역가를 가졌다. 함께 살펴보면, 100개의 클론이 24-웰 플레이트 내로 옮겨질 수 있었다 (완전 배지 내에 52개 및 선택 배지 내에 48개). 여기서, 선택 배지 및 완전 배지 내에서 유사한 결과가 달성되었다. 표 6은 최상의 생산 클론의 생산 속도를 요약한다.
Figure pct00029
표 6은 2개의 선택가능 마커, 즉 야생형 폴레이트 수용체 알파 (V-wtFR알파) 및 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파 (V-mutFR알파)를 사용한 선택이, 수행된 클로닝 실험에서 얻은 세포 클론에게 단일 세포 클로닝 후에 참조 선택가능 마커 DHFR과 적어도 동등하게 양호한 결과를 제시하였음을 보여준다. 추가의 실험 (아래 참조)은 또한 본 개시내용에 따른 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용할 때 보다 높은 전체 생산 속도를 얻을 수 있음을 보여준다.
실시예 4: 동시-형질감염 실험
선택 배지 내의 엽산 결핍 및 MTX 첨가 형태의 이중-선택 압력의 선택 엄격도 및 효율을 분석하기 위해, 세포를 V-DHFRref 및 V-mutFR알파로 동시-형질감염시켰다. 모든 형질감염된 벡터는 관심있는 단백질과 동일한 항체 유전자를 포함하였다. 2개의 별개의 발현 벡터를 동시-형질감염시켰고, 여기서 각각의 벡터는 항체의 경쇄 및 중쇄를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하였다. 형질감염 전에, 완전 배지로부터의 엽산 잔류물을 감소시키기 위해 CHO 세포 (DHFR 참조 대조군을 위해 사용된 세포 제외)를 PBS로 3회 세척하고, 형질감염을 위해 선택 배지로 계대배양하였다. 참조 대조군 V-DHFRref의 형질감염을 위해 사용된 CHO 세포의 계대배양은 완전 배지 내에서 수행하였다.
벡터를 뉴클레오펙션을 사용하여 세포 내로 형질감염시켰다. 단일 벡터 형질감염과 달리, 동시-형질감염을 위해 2배의 양의 세포 (1x107 LZ/ml) 및 2배의 양의 DNA (벡터 3 ㎍당)를 사용하여 형질감염시켰다. 그러나, 세포당 기준으로, 형질감염된 DNA의 양은 동일하였다. V-DHFRref/V-mutFR알파 및 대조군으로 형질감염된 CHO 세포를 선택 배지 내로 옮기고; 참조 형질감염체를 완전 배지 내로 옮겼다. 선택은 형질감염 48시간 후에 시작하였다. 시험 설정당 3개의 형질감염물을 48h 후에 합하고, 원심분리하고, 9 ml 선택 배지 또는 완전 배지에 재현탁하고, 3개의 선택 배지에 3개 1조로 분배하였다. 동시-형질감염된 세포 풀 및 대조군의 3개의 배치를 선택을 위해 3가지 상이한 농도의 엽산/MTX에 노출시켰다. 그와 평행으로, 참조 대조군은 G418/MTX 선택을 사용하여 벡터 V-DHFRref로 수행하였다. 여기서, 세포는 엽산을 풍부하게 포함하는 완전 배지에서 배양하였다. 선택 주기를 시작하기 위해, 선택제를 이어서 첨가하여 선택 압력을 유도하였다. 음성 대조군으로서, DNA를 첨가하지 않은 형질감염을 수행하였다. 수행된 형질감염 및 사용된 배양 배지를 후속 표 7에 요약한다.
Figure pct00030
선택이 완료된 후에, 통합된 항체 유전자의 발현 속도를 결정하기 위해 선택된 세포로부터 배치 배양액을 제조하였다. 배치 배양 동안, 세포 집단을 완전 배지 내에서 배양하였다. 모든 세포 집단에서, 배치 배양의 13일 후에 항체 발현을 결정하기 위해 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 이용하여 동시-형질감염 및 참조 형질감염에 대해 항체 농도를 결정하였다. 결과를 표 8에 제시하고, 여기서 배치 배양액은 선택 배지 내의 그들의 기원에 따라 명명하였고, 즉, 수행된 선택을 따라 명명하였다 (50/50, 50/100, 12.5/50 [nM FA/nM MTX] 또는 V-DHFRref-G418-MTX - 삼중으로 수행함). 생존하지 않은 세포 풀을 제시하지 않는다. 다시, 사용된 측정 방법 때문에, 9 mg/l을 초과하는 값을 유의한 것으로 간주하였다.
Figure pct00031
표 8에서 볼 수 있는 바와 같이, DHFR 참조 방법의 풀은 3회의 선택 단계 (0.8 mg/ml G418 - 500 nM MTX - 1 μM MTX) 후에 58 mg/l까지의 항체 역가를 생산하였다. V-mutFR알파/V-DHFRref를 이용하는 동시-형질감염으로부터, 완전 배지 내에서 선택 후에 세포가 옮겨질 때 거의 모든 세포 풀이 생존하였다. 50/50 선택 배지로부터 기원하는 V-mutFR알파/V-DHFRref 풀은 25 mg/l까지 생산하였고, 풀 - 50/100 및 12.5/50 집단은 36 mg/l까지의 역가를 생산하였다.
3회의 연속 선택 주기를 DHFR 참조 방법에서 사용하였고, 이것은 G418 선택 이후 2회의 MTX 선택 주기 (500 nM 및 1 μM MTX)가 이어졌기 때문이다. 따라서, 세포 배양 배지 내에서 제한 농도의 엽산 및 MTX를 사용하여 2회의 선택 주기를 수행할 때 발현 속도가 증가될 수 있는지 추가로 시험하였다. 따라서, 제한 농도의 엽산 및 MTX (사용된 농도에 대해서는 상기 참조)를 사용하는 제1 선택 주기를 수행한 후에, 세포를 완전 배지 내로 옮겨 회복을 허용하였다. 그 후, 세포를 제2 선택 주기에서 동일한 선택 배지에, 및 따라서 동일한 선택 압력에 다시 노출시켰다. 결과를 표 9에 제시한다.
Figure pct00032
표 9는 V-mutFR알파/V-DHFRref로 형질감염된 세포가 35-38일 후에 선택 압력에 다시 노출될 때, 세포가 21로부터 670 mg/l로 매우 높은 유의한 생산 증가를 나타냄을 보여준다. 이것은 항체 역가의 30배 증가이다. 또한, 50/50 선택 배지 내의 다른 집단은 반복된 선택 압력 하에서 완전 배지 내에서 배양된 배양액보다 20배 더 많이 생산하였다. 또한, 얻어진 결과는 3개의 선택 주기를 수행한 DHFR 참조 방법 사용시보다 유의하게 더 양호하였다 (표 8 참조). 따라서, 2개의 선택 주기를 비-선택 배지에서의 중간 배양 단계와 함께 제한 농도의 폴레이트 및 항폴레이트제를 포함하는 선택 배지를 사용하여 수행하는 상기 선택 원리는 현저하게 높은 발현 역가를 생성하였다.
실시예 5: 단일 세포 클로닝
안정한 벡터 발현을 갖는 세포주를 생성하기 위해, 실시예 4에 따라 얻어진 세포 집단을 선택이 완료된 후에 클로닝하였다. 선택 후에, 폴리클로날 형질감염 풀 50/50을 6x96-웰 플레이트 내에 완전 배지 (이에 의해, 클로닝 동안 선택 압력을 유지하지 않는다) 및 선택 배지 (이에 의해, 클로닝 동안 선택 압력을 유지한다) 내의 제한 희석을 이용하여 클로닝하였다. 클론의 성공적인 성장 후에, 클론을 70% 초과의 전면생장률로 24-웰 플레이트에 옮기고, 10일의 배치 배양 후에 그의 항체 생산성에 대해 시험하였다. V-mutFR알파/V-DHFRref 동시-형질감염되고 분비된 집단의 클로닝시에 달성된 결과를 도 5에 제시한다. 도 5에 제시된 바와 같이, 완전 배지 및 선택 배지 내의 V-mutFR알파/V-DHFRref 세포의 클로닝에 의해 6x96-웰 플레이트로부터 65개의 클론 (55개: 완전 배지, 10개: 50 nM FA/50 nM MTX를 포함하는 선택 배지)을 얻었다. 클론을 최고부터 최저 발현 수준까지 정렬하였다 (배지-의존성). 최고 생산 클론을 완전 배지 내의 클로닝으로부터 단리하고, 24-웰 배치에서 450 mg/l를 생산하였다. 250 ml 진탕 플라스크 (총 50 ml) 내에서, 원래의 풀은 670 mg/l의 역가를 달성하였다.
참조물로서, 선행 G418-MTX 선택 후에 DHFR 벡터 V-DHFRref의 제한 희석 클로닝을 수행하였다. 각각의 결과를 선행 실험으로부터 얻고, 유사한 조건 하에 수행하였다. 클로닝을 선택 배지 내에서 수행하고, 이에 의해 클로닝 동안 선택 압력을 유지하였다. 그 결과를 표 10에 제시한다.
Figure pct00033
여기서, 점진적인 G-418 500 nM MTX 1 μM-MTX 선택을 수행하였다. 표 10은 선택 배지 내의 집단의 종점 희석 (1 μM MTX)의 결과를 보여준다. 클론을 최고부터 최저 발현 수준까지 정렬하였다. 상기 참조물의 최고 생산 클론은 20-웰 배치에서 51 mg/l를 달성하였다. 큰 범위의 세포 생산성이 달성되었지만, 이들은 대부분 9 mg/l의 역치 미만이었다.
도 5 및 표 10에 제시된 결과는 V-mutFR알파/V-DHFRref의 동시-형질감염이 유의하게 더 높은 생산성을 제시하고, 또한, 단리된 고생산 세포 클론의 수가 유의하게 증가하였음을 보여준다. 선택된 폴리클로날 집단으로부터 단리된 50% 초과의 클론은 300 mg/l보다 높은 역가를 달성하였다. 최고 선택 엄격도 하의 동시-형질감염은 V-mutFR알파, V-DHFRref (상이한 선택 방법) 및 V-mutFR알파/V-DHFRref의 최고 생산 세포 클론 내에서 항체 농도의 9배 증가를 달성하였다. 결과를 표 11에 제시한다.
Figure pct00034
표 11은 클로닝 후에 수행된 선택의 최고 생산자의 항체 농도 (mAb [mg/L])를 보여준다. 알 수 있는 바와 같이, V-mutFR알파/V-DHFRref의 동시-형질감염 및 제한된 농도의 엽산을 포함하고 항폴레이트제를 추가로 포함하는 선택 배지 내에서의 선택은 최상의 결과를 제시하였다.
상기 결과는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택가능 마커로서 사용하는 것을 기초로 한 선택이, 제한된 양의 폴레이트, 여기서 엽산을 포함하는 선택 배지를 사용할 때 성공적으로 형질감염된 세포의 생존을 가능하게 함을 보여준다. 선택 마커로서 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파를 사용하는 선택은 선택 마커로서 야생형 폴레이트 수용체 알파를 사용할 때보다 더 신속하였다. 야생형 폴레이트 수용체 알파는 엽산에 고 친화도로 결합하기 때문에 (KD = 0.1 nM), 선택 압력은 또한 DNA 없이 형질감염된 세포가 생존할 수 있는 허용되는 엽산 역치 농도 미만에서 높다. 이것은 또한 결정된 항체 농도에 반영된다. 돌연변이된 폴레이트 수용체로 형질감염된 세포는 모든 시험된 선택 배지에서 생존할 수 있었다. 또한, 비교적 균일한 성장이 관찰되었다. 3개의 최고 농축된 배양 배지 내에서, 세포는 12일 후에 계대배양될 수 있고; 최저 엽산 농도를 갖는 3개의 배지에서 회복은 제16일에 달성되었다. 이들 경우에, 세포에 대한 선택 압력은 야생형 폴레이트 수용체에 비해 추가로 증가되었다. 돌연변이된 폴레이트 수용체의 과다발현은 관심있는 단백질의 발현과 연관성이 있기 때문에, 결정된 항체 역가는 선택 배지 내의 엽산 농도와 반비례한다.
실시예 6: dhfr , 야생형 FoIR 및 FoIR A49L을 선택가능 마커로서 갖는 벡터의 형질감염
상기 실시예에서, 상이한 선택 조건을 시험하고, 비교하였다. CHO 세포를 벡터 V-DHFRref, V-wtFR알파 및 V-mutFR알파 (A49L 돌연변이체)로 형질감염시켰다. 선택 배지 내의 제한 농도의 엽산을 사용하여 본원에서 엽산 결핍으로도 언급되는 숙주 세포에 대한 선택 압력을 생성하였다.
세포 배양, 형질감염 및 스크리닝은 화학적으로 규정된 배양 배지에서 CHO 세포를 성장시키는 현탁액을 사용하여 진탕 플라스크 내에서 수행하였다. 세포를 전기천공 (뉴클레오펙션)에 의해 형질감염시켰다. 엽산 결핍 기반 선택을 위해, 세포를 형질감염 3일 전에 엽산 비함유 배지에 계대배양하고, 내부 엽산 비축분을 감소시키기 위해 엽산 비함유 배지에서 형질감염시켰다. 세포 생존성에 따라, 선택은 선택 배지를 세포에 첨가함으로써 형질감염 24-48 h 후에 시작하였다.
V-wtFR알파 및 V-mutFR알파 형질감염된 세포를 6개의 상이한 엽산 농도 (11700, 150, 50, 5, 0.5 및 0 nM)를 사용하여 선택한 반면, V-DHFRref 형질감염된 세포의 경우 6개의 상이한 MTX 농도를 참조물 (2000, 1000, 500, 250, 125 및 0 nM)로서 시험하였다.
세포가 선택 후에 80% 초과의 생존성으로 회복한 후, 생존 세포 집단의 생산성을 분석하였다. 선택된 세포 집단의 생산성은 11.7 μM 엽산을 함유하는 완전 배지에서 과성장된 진탕 플라스크 배치 배양을 통한 선택 후에 분석하였다. 배치 배양액을 50 ml 작업 부피로 진탕 플라스크 (125)에 파종 (seeding)하고, 150 rpm 및 10% CO2에서 진탕기 캐비넷 (비가습)에서 배양하였다. 세포의 생존성은 검정을 시작할 때 >90%이어야 하였다. 파종 세포 밀도는 2x105 c/ml이었다. 역가 결정은 제13일에 발생하였다. 세포 배양 상청액 내의 항체 역가를 배양 개시 13일 후에 단백질-A HPLC에 의해 결정하였다.
상기 실험의 결과를 다음에 설명한다. 제한 엽산 농도 하에 두 폴레이트 수용체 변이체의 선택 엄격도를 평가하기 위해, 11700 nM (참조 배지, 완전 배지) 내지 0 nM의 다양한 엽산 농도를 항체 과다발현 세포를 선택하기 위해 시험하였다. 이와 평행으로, 성능을 비교하기 위해 참조 DHFR 벡터를 사용하여 상이한 MTX 농도를 시험하였다. 모든 형질감염된 세포 집단은 회복될 수 있었다. 0 nM 엽산에서 세포는 전배양 배지로부터 넘겨진 미량의 엽산을 함유한 것으로 추정되었다. 이들 잔여량의 엽산은 세포의 하위 부분의 생존을 촉진하기에 분명히 충분하였다. 그러나, 엽산 함유 배지의 후속 공급이 이들 집단을 회복시키기 위해 필요하였다. 생산성은 상기 설명된 바와 같이 평가하였다. 표 12는 생산성 결과를 요약한 것이다.
Figure pct00035
표 12는 진탕 플라스크 배치 배양액에서 분석한 상이한 엽산 또는 MTX 농도에서 선택된 형질감염된 세포에 대한 결과를 보여준다. 배양 제13일에, 배양 배지의 샘플을 채취하고, 단백질-A HPLC에 의해 항체 함량에 대해 분석하였다. 모든 세포 집단은 항체를 생산하는 것으로 밝혀졌다. V-wtFR알파 사용시에, 최대 생산성은 5 nM 엽산에서 선택할 때 달성되었다. 상기 엽산 농도는 상기 실험에서 관찰된 농도보다 더 낮고, 이것은 아마도 일부 엽산이 상기 실시예에서의 초기 배양 배지로부터 넘겨졌다는 사실에 의한 것으로 보인다. 이것은 또한 0 nM 엽산에서 달성된 회복 및 생산 속도를 설명할 것이다. 추가의 엽산 감소는 야생형 폴레이트 수용체를 사용할 때 보다 높은 생산성을 유도하지 않았다. 이와 대조적으로, V-mutFR알파 사용시에, 보다 높은 생산성은 선택 동안 최저 엽산 농도에서 달성된다. 돌연변이체를 사용하여 달성된 생산성은 야생형 폴레이트 수용체를 사용하여 달성된 생산성보다 유의하게 더 높고, 또한 DHFR/MTX 사용시만큼 유의하게 더 높다.
또한, 선택 동안 세포의 회복을 분석할 때, V-mutFR알파로 형질감염된 세포가 매우 낮은 엽산 농도, 특히 < 25 nM 하에서 유의하게 더 빨리 회복됨이 밝혀졌다. 따라서, 상기 설명된 보다 빠른 회복 속도는 또한 상기 실험에서 확인되었다.
상기 설명된 실시예 1 내지 6은 돌연변이된 폴레이트 수용체가 선택을 위해 사용되는 본 개시내용을 사용하여 달성되는 이점을 보여준다. 예를 들어, 상기 설명된 실시예에서 참조 집단 (DHFR) 항체 분비는 28 mg/l로 결정되었고, V-wtFR알파 형질감염된 세포의 최고 생존 선택 엄격도에서 24 mg/l가 얻어졌고, V-mutFR알파 형질감염된 세포에서 26.6 mg/l가 얻어졌다. 따라서, 각각의 실험에서 결정된 생산 속도는 유사한 범위에 해당하고, 이것은 야생형 폴레이트 수용체 알파 및 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파가 선택가능 마커로서 "표준 시험법 (gold standard)"으로 여겨질 수 있는 확립된 DHFR/MTX 선택 시스템과 대등한 결과를 달성함을 보여준다. 또한, 선택에 필요한 기간을 비교할 때, 유의하게 더 빠른 선택은 본 개시내용에 의해 제공되는 돌연변이된 폴레이트 수용체 기반 선택 시스템을 사용하여 수행할 수 있음이 관찰되었다. 심지어 동일한 농도에서 V-mutFR알파 형질감염된 세포 (16일)보다 더 긴 회복 기간을 필요로 한, 15 nM 엽산 및 25 nM 엽산에서 V-wtFR알파 벡터로 형질감염된 세포는 참조 대조군 (DHFR)에 비해 여전히 위기 상황의 시점인 20일에서 분명한 이점을 보였다. 따라서, 본 개시내용에 따른 폴레이트 수용체 돌연변이체를 사용하면, DHFR/MTX 시스템에 비해 세포주 개발시에 선택기 동안 시간을 줄일 수 있고, 또한 야생형 기반 선택 시스템보다 더 빠른 선택이 가능하다. 이 결과는 또한 세포가 보다 넓은 엽산 농도 범위에서 생존하고 특히 보다 낮은 엽산 농도에서 생존할 수 있어 보다 엄격한 선택 조건을 허용하기 때문에, 돌연변이된 폴레이트 수용체의 사용은 시험된 선택 배지에서 야생형 폴레이트 수용체를 사용하는 것에 비해 이점을 세포에 제공함을 나타낸다. 또한, 선택 위기는 야생형 폴레이트 수용체로 형질감염된 세포의 경우보다 돌연변이된 폴레이트 수용체 사용시에 유의하게 더 일찍 회복된다. 이 결과는 본원에서 설명되는 돌연변이된 폴레이트 수용체의 사용이 중요한 이점을 갖는다는 것을 보여준다.
추가로, 선택가능 마커로서 폴레이트 수용체 및 DHFR에 대한 이중 선택을 폴레이트를 제한 농도로 포함하고 항폴레이트제를 추가로 포함하는 선택 배지를 사용하여 수행한 실험도 돌연변이된 폴레이트 수용체에 대한 분명한 이점을 보여주었다. 폴레이트 수용체의 돌연변이는 상기 이중 선택 압력 하의 세포 성장에 대한 긍정적인 효과를 분명하게 갖는다. 이론에 매이지 않지만, 항-폴레이트, 예컨대 MTX에 대한 친화도는 돌연변이체에서 감소되고, 따라서 보다 적은 MTX가 세포 내에 포함될 수 있다. 또한, 제1 선택 라운드 후에 세포를 회복시키기 위해, 2개의 선택 주기 사이에 세포를 선택하고 완전 배지 내로 옮기는 것을 반복하는 것이 유리함이 밝혀졌다. 세포를 선택 배지 내로 옮긴 후에, 그의 게놈 내로 두 벡터를 통합하고 따라서 이중 선택 압력에서 생존할 수 있는 세포를 농축할 수 있었다. 생산성은 완전 배지에 비해 20 내지 30배까지 증가된 것으로 밝혀졌다. 이것은 유의하게 유리하다. 표준 G418/MTX 다-단계 선택 후에 참조 대조군에 비해, 여전히 6 내지 13배의 생산성 증가가 관찰되었다. 따라서, 돌연변이된 폴레이트 수용체가 DHFR과 조합하여 사용되는 본 개시내용에 따른 선택 시스템은 선행 기술의 선택 시스템에 비해 분명한 이점을 갖는다. 또한, 상기 이중 선택 전략을 사용하면, 300 mg/l 초과의 역가를 갖는 50% 초과의 고생산 클론을 선발할 수 있다. 따라서, 초고생산 클론에 대한 검색은 덜 복잡하였고, 이것은 산업적 단백질 생산을 위한 기존의 스크리닝 기술에 비추어 유의한 개선이다.
본 개시내용에 따라 선택 마커로서 사용되는 돌연변이된 폴레이트 수용체는 형질감염된 집단이 참조 선택 시스템보다 더 빨리 성장 위기에서 생존하기 때문에 매우 유리하다. 또한, 돌연변이체 폴레이트 수용체로 형질감염된 세포 집단은 상이한 선택 배지에서 선택 후에 엽산 농도에 반비례하는 수용체 및 항체 발현을 보였다. 상기 상관관계는 게놈 DNA (카피수) 및 RNA 수준에 대한 분자 생물학적 분석을 사용하여 제시될 수 있다. 또한, 본원에서 설명되는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 사용하는 것은 DHFR/MTX를 사용한 동시-선택을 추구할 때 매우 유리한 것으로 밝혀졌다. 사용된 대조군 (FRwt, FRmut 및 DHFR의 단일 형질감염)은 엽산 결핍 및 MTX의 엄격한 조합의 치사 효과에서 생존할 수 없었다. 상기 선택 시스템의 높은 엄격도는 그럼에도 불구하고, 몇몇의 동시-형질감염된 집단이 선택되는 효과를 가졌다. 그러나, 엽산을 중간 단계로서 첨가하고 제2 선택 라운드를 수행함으로써, FRmut/DHFR을 사용한 이중 선택 원리를 사용할 때 동시-형질감염 원리를 사용하여 매우 양호한 결과가 얻어졌다. 상기 방법은 최상의 생산 (최고) 클론에 대한 보다 빠르고 덜 복잡한 스크리닝을 허용함이 밝혀졌다. 최고 생산 세포 집단 (50 ml 배양 부피에서 670 mg/l)의 단일 세포 클로닝은 300 mg/l 초과를 생산한 고생산 세포 클론의 약 50% 회복을 유도하였다. 단일 형질감염 및 참조 형질감염에 비해, 동시-형질감염된 집단의 클로닝은 240 mg/l의 평균 생산성을 달성하였고, 이것은 생산성이 40배 증가한 것이다. 최상 생산 세포 클론은 24-웰 배치에서 450 mg/l를 달성하였다. 이들 결과는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 선택 마커로서 사용하는 것을 기초로 하는 본 개시내용이 기존의 선택 시스템에 대해 유의하게 기여함을 확인해준다.
실시예 7: 2개의 선택가능 마커를 포함하는 발현 벡터의 형질감염
상기 실시예에서, 돌연변이된 인간 폴레이트 수용체 알파 (A49L 돌연변이체 - mutFR알파, 상기 참조)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트, 및 DHFR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터 (V-mutFR알파/DHFRref)로 CHO 세포를 형질감염 (뉴클레오펙션)시켰다. 따라서, 선택가능 마커 mutFR알파 및 DHFR 둘 모두가 동일한 발현 벡터에 존재하였다. 또한, 발현 벡터는 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트, 및 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하였다. 상기 실험에서, 선행 실시예와 상이한 항체가 발현되었다. 50 nM 엽산 (FA) 및 상이한 농도의 MTX를 사용하는 5개의 상이한 선택 조건을 시험하였다. 선택 배지를 하기 표 13에 요약한다. 선택 후에, 선택된 세포 풀을 완전 배지에 옮기고, 진탕 플라스크 배치 배양액 내에서 성장시켰다. 배양 제13일에, 배양 배지의 샘플을 채취하고, 단백질-A HPLC에 의해 항체 함량에 대해 분석하였다. 결과를 또한 표 13에 제시한다.
Figure pct00036
알 수 있는 바와 같이, 5 nM만큼 이미 낮은 MTX 농도는 돌연변이된 폴레이트 수용체 및 DHFR을 선택가능 마커로서 포함하는 발현 벡터 V-mutFR알파/DHFRref를 사용할 때 유의한 선택 이점을 제공하였다. 이것은 또한 다른 실시예에서 제시된, 선택을 위해 DHFR과 조합하여 돌연변이된 폴레이트 수용체를 사용할 때의 이점을 확인해준다. 항체 생산성은 유의하게 증가하고, 또한 보다 낮은 농도의 MTX가 선택 동안 사용될 수 있고, 이것은 MTX가 독성제임을 고려할 때 유의한 이점이다.
실시예 8: 모 CHO 세포의 단순화된 전처리를 사용한 형질감염
절차에서 세포 원심분리/세척 단계를 회피할 수 있는지 시험하기 위해, 제한 농도의 50 nM 엽산을 함유하는 배양 배지를 사용한 배양액에, 완전 배지 또는 50 nM 엽산 함유 배지에 동결보존된 세포로부터 모 CHO 세포를 채취하였다. 상기 배지에서 수 회의 계대배양 후에, 세포를 뉴클레오펙션 방법 및 모노클로날 항체를 코딩하는 발현 벡터 V-mutFR알파/DHFRref를 사용하여 형질감염시켰다. 상기 형질감염 및 후속 배양은 50 nM 엽산을 함유하는 동일한 배지를 사용하여 수행하였다. 이어서, 형질감염 48h 후에, 10 nM MTX를 배양액에 첨가함으로써 선택 압력을 증가시켰다. 선택으로부터 회복된 배양액의 생산성은 완전 배지를 사용한 진탕 플라스크 배치 배양액에서 평가하였다. 그 결과를 표 14에 제시한다. 표 14에 제시된 바와 같이, 형질감염 및 선택 절차에 대한 상기 단순화된 프로토콜은 선행 실시예의 절차 (예를 들어 표 13)와 대등한 생산성을 제시한다.
Figure pct00037
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> Novel selection vectors and methods of selecting eukaryotic host cells <130> PAT055303-WO-PCT <150> US 61/860,439 <151> 2013-07-31 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys 1 5 10 15 His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys 20 25 30 Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu 35 40 45 Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys 50 55 60 Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys 65 70 75 80 Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp 85 90 95 Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu 100 105 110 Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys 115 120 125 Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys 130 135 140 Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro 145 150 155 160 Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn 165 170 175 Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala 180 185 190 Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala 195 200 205 <210> 2 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala Ala Trp Pro Phe Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu Ser 20 25 <210> 3 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val 1 5 10 15 Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu 20 25 30 Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly 35 40 45 Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala 50 55 60 Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr 65 70 75 80 Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys 85 90 95 Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn 100 105 110 Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg 115 120 125 Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu 130 135 140 Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp 145 150 155 160 Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln 165 170 175 Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile 180 185 190 Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg 195 200 205 Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu 210 215 220 Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala 225 230 235 240 Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu 245 250 255 Ser <210> 4 <211> 203 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met Asp Ala Lys His His 1 5 10 15 Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Asp Gln Cys Ser Pro 20 25 30 Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr Ser Gln Glu Leu His 35 40 45 Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp Asp His Cys Gly Lys 50 55 60 Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr 65 70 75 80 Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asn Gln Thr 85 90 95 Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys 100 105 110 Gln Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His Thr Cys Lys Ser Asn 115 120 125 Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val Asn Lys Cys Pro Ala 130 135 140 Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Pro Thr Pro Ala Ala 145 150 155 160 Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser 165 170 175 Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Ser Ala Gln Gly 180 185 190 Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala 195 200 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Ala Met His Val Asn Ala Gly Glu Met Leu His Gly Thr Gly Gly 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Gln Leu Trp Leu Leu Gly 20 25 30 <210> 6 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Val Trp Lys Trp Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Val Cys Val Ala 1 5 10 15 Thr Met Cys Ser Ala Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met 20 25 30 Asp Ala Lys His His Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His 35 40 45 Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr 50 55 60 Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp 65 70 75 80 Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln 85 90 95 Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln 100 105 110 Gln Val Asn Gln Thr Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp Val Pro Leu 115 120 125 Cys Lys Glu Asp Cys Gln Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His 130 135 140 Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val 145 150 155 160 Asn Lys Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe 165 170 175 Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys 180 185 190 Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe 195 200 205 Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala 210 215 220 Ala Ala Met His Val Asn Ala Gly Glu Met Leu His Gly Thr Gly Gly 225 230 235 240 Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Gln Leu Trp Leu Leu Gly 245 250 255 <210> 7 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Pro Arg Ser Ala Arg Ala Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met 1 5 10 15 Asn Ala Lys His His Lys Thr Gln Pro Ser Pro Glu Asp Glu Leu Tyr 20 25 30 Gly Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr 35 40 45 Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp 50 55 60 Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Thr Cys Lys Arg His Phe Ile Gln 65 70 75 80 Asp Ser Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Arg 85 90 95 Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asn Val Pro Leu 100 105 110 Cys Lys Glu Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr 115 120 125 Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Ile 130 135 140 Asn Glu Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Ser Thr Phe Glu Ser Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Phe Lys 165 170 175 Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe 180 185 190 Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Lys Phe Tyr Ala 195 200 205 Ala Ala Met Asn Ala Gly Ala Pro Ser Arg Gly Ile Ile Asp Ser 210 215 220 <210> 8 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Asp Met Ala Trp Gln Met Met Gln Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val 1 5 10 15 Thr Ala Ala Gly Ser Ala Gln Pro Arg Ser Ala Arg Ala Arg Thr Asp 20 25 30 Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Thr Gln Pro Ser 35 40 45 Pro Glu Asp Glu Leu Tyr Gly Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala 50 55 60 Cys Cys Thr Ala Ser Thr Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg 65 70 75 80 Leu Tyr Asn Phe Asn Trp Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Thr Cys 85 90 95 Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Ser Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn 100 105 110 Leu Gly Pro Trp Ile Arg Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg 115 120 125 Ile Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu 130 135 140 Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp 145 150 155 160 Asn Trp Thr Ser Gly Ile Asn Glu Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Ser 165 170 175 Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu 180 185 190 Trp Ser His Ser Phe Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg 195 200 205 Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu 210 215 220 Val Ala Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Met Asn Ala Gly Ala Pro Ser Arg 225 230 235 240 Gly Ile Ile Asp Ser 245 <210> 9 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mature mutated folate receptor <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is any amino acid except Ala <400> 9 Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys 1 5 10 15 His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys 20 25 30 Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu 35 40 45 Xaa His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys 50 55 60 Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys 65 70 75 80 Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp 85 90 95 Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu 100 105 110 Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys 115 120 125 Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys 130 135 140 Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro 145 150 155 160 Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn 165 170 175 Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala 180 185 190 Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala 195 200 205 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val 1 5 10 15 Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg 20 25 <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Val Trp Lys Trp Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Val Cys Val Ala 1 5 10 15 Thr Met Cys Ser Ala 20 <210> 12 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Asp Met Ala Trp Gln Met Met Gln Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val 1 5 10 15 Thr Ala Ala Gly Ser Ala 20 <210> 13 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated folate receptor <400> 13 Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys 1 5 10 15 His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys 20 25 30 Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu 35 40 45 Leu His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys 50 55 60 Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys 65 70 75 80 Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp 85 90 95 Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu 100 105 110 Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys 115 120 125 Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys 130 135 140 Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro 145 150 155 160 Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn 165 170 175 Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala 180 185 190 Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met 195 200 205 Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala 210 215 220 Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu Ser 225 230

Claims (35)

  1. a) 선택가능 마커로서 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    b) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드
    를 포함하고, 숙주 세포 내로 도입될 때, 관심 있는 폴리펩티드가 상기 숙주 세포로부터 분비되는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  2. 제1항에 있어서, 코딩되는 돌연변이된 폴레이트 수용체가 야생형 폴레이트 수용체에 비해 폴레이트 결합 친화도를 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 폴레이트 결합 포켓 내에 포함하는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 코딩되는 돌연변이된 폴레이트 수용체가 폴레이트 결합 친화도를 감소시키는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩되는 돌연변이된 폴레이트 수용체가 돌연변이된 폴레이트 수용체 알파인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  5. 제4항에 있어서, 코딩되는 돌연변이된 폴레이트 수용체가 성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파의 아미노산 서열 (서열 1)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 돌연변이된 폴레이트 수용체의 아미노산 서열은 성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파 (서열 1)에 비해 폴레이트 결합 친화도를 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 돌연변이된 폴레이트 수용체가 성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 서열의 위치 49, 104 및 166으로부터 선택된 아미노산 위치에 구조적으로 또는 아미노산 서열 상동성에 의해 대응하는 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 폴레이트 수용체가 성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파 서열 (서열 1)의 아미노산 49에 구조적으로 또는 아미노산 서열 상동성에 의해 대응하는 아미노산 위치에 치환을 포함하는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 특히 제6항 또는 제7항에 있어서, 돌연변이된 폴레이트 수용체가 야생형 폴레이트 수용체에 비해 5-메틸테트라히드로폴레이트의 6S 부분입체 이성질체에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 특히 제6항 또는 제7항에 있어서, 돌연변이된 폴레이트 수용체가 야생형 폴레이트 수용체에 비해 엽산에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩되는 돌연변이된 폴레이트 수용체가 성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파 서열 (서열 1)의 아미노산 49에 구조적으로 또는 아미노산 서열 상동성에 의해 대응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하고, 야생형 서열에 존재하는 알라닌이 류신, 글라이신, 발린, 이소류신, 히스티딘 및 아스파르트산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환되는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  11. 제10항에 있어서, 위치 49에서 야생형 서열에 존재하는 알라닌이 류신에 의해 치환되는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩되는 성숙 돌연변이된 폴레이트 수용체가 인간 폴레이트 수용체 알파의 성숙 야생형 서열 (서열 1)에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 성숙 돌연변이된 폴레이트 수용체의 아미노산 서열이 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파에 비해 성숙 돌연변이된 폴레이트 수용체의 폴레이트 결합 친화도를 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩되는 돌연변이된 폴레이트 수용체가,
    a) 성숙 돌연변이된 폴레이트 수용체는 서열
    Figure pct00038

    을 포함하고, 여기서, Xaa는 알라닌이 아니고, 바람직하게는 류신, 글라이신, 발린, 이소류신, 히스티딘 및 아스파르트산으로부터 선택되는 아미노산이고, 보다 바람직하게는 Xaa는 류신이거나; 또는
    b) 성숙 돌연변이된 폴레이트 수용체는 서열 9에 제시된 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, Xaa는 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체에서 알라닌이 아니고, 바람직하게는 Xaa는 류신, 글라이신, 발린, 이소류신, 히스티딘 및 아스파르트산으로부터 선택되는 아미노산이고, 보다 바람직하게는 Xaa는 류신이고, 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체의 폴레이트 결합 친화도는 Xaa가 알라닌인 성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파 서열 (서열 1 참조)에 비해 감소됨
    을 특징으로 하는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩되는 돌연변이된 폴레이트 수용체가,
    a) 돌연변이된 폴레이트 수용체는 서열
    Figure pct00039

    을 포함하고, 여기서, Xaa는 류신이거나; 또는
    b) 돌연변이된 폴레이트 수용체는 서열 13에 제시된 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, Xaa는 류신이고, 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체의 5-메틸테트라히드로폴레이트의 6S 부분입체 이성질체에 대한 결합 친화도는 Xaa가 알라닌인 성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파 서열 (서열 1 참조)에 비해 감소됨
    을 특징으로 하는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 폴레이트 대사에 관여하는 선택가능 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  16. 제15항에 있어서, 선택가능 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 디히드로폴레이트 환원효소를 코딩하는 것인 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파 서열 (서열 1)의 아미노산 49에 구조적으로 또는 아미노산 서열 상동성에 의해 대응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하고 상기 위치에서 야생형 서열에 존재하는 알라닌이 류신에 의해 치환된 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트;
    b) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트; 및
    c) 선택가능 마커로서 디히드로폴레이트 환원효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트
    를 포함하는 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물.
  18. a) 선택가능 마커로서 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드 및
    b) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 도입된 폴리뉴클레오티드
    를 포함하고, 상기 관심 있는 폴리펩티드가 숙주 세포로부터 분비되는 것인, 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 숙주 세포.
  19. 제18항에 있어서, 돌연변이된 폴레이트 수용체가 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 규정된 하나 이상의 특징을 갖는 것인 숙주 세포.
  20. 제19항에 있어서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 규정된 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물을 포함하는 숙주 세포.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가
    a) 숙주 세포는 포유동물 세포임;
    b) 숙주 세포는 설치류 세포임;
    c) 숙주 세포는 CHO 세포임;
    d) 숙주 세포는 내인성 폴레이트 수용체를 발현함;
    e) 숙주 세포는 폴레이트 대사에 관여하는 선택가능 마커, 바람직하게는 디히드로폴레이트 환원효소를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함함; 및/또는
    f) 도입된 폴리뉴클레오티드는 게놈 내로 안정적으로 통합됨
    중 하나 이상의 특징을 갖는 것인 숙주 세포.
  22. 숙주 세포의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 숙주 세포 내로
    a) 선택가능 마커로서 야생형 폴레이트 수용체에 비해 감소된 폴레이트 결합 친화도를 갖는 돌연변이된 폴레이트 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및
    b) 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드
    를 도입하는 것을 포함하고, 상기 관심 있는 폴리펩티드는 상기 숙주 세포로부터 분비되는 것인, 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 생산 방법.
  23. 제22항에 있어서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물이 숙주 세포 내로 도입되는 것인 방법.
  24. a) 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 다수의 숙주 세포를 제공하고;
    b) 상기 다수의 숙주 세포를 제한된 농도의 폴레이트를 포함하는 선택 배양 배지에서 배양하고;
    c) 관심 있는 폴리펩티드를 발현하는 적어도 하나의 숙주 세포를 얻는 것
    을 포함하는, 관심 있는 폴리펩티드를 요구되는 수율로 발현할 수 있는 적어도 하나의 숙주 세포를 선택하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 단계 b)에서 사용되는 선택 배양 배지가 제한 농도의 폴레이트를 포함하고, 상기 폴레이트가 바람직하게는 약 2000 nM 이하, 약 1750 nM 이하, 약 1500 nM 이하, 약 1250 nM 이하, 약 1000 nM 이하, 약 750 nM 이하, 약 500 nM 이하, 약 350 nM 이하, 약 300 nM 이하, 약 250 nM 이하, 약 150 nM 이하, 약 100 nM 이하, 약 75 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 35 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 25 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 15 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 7.5 이하, 약 5 nM 이하 및 약 2.5 nM 이하로부터 선택된 농도의 엽산인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 숙주 세포가 디히드로폴레이트 환원효소인 선택가능 마커를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 단계 b)에서 사용되는 선택 배양 배지가 1500 nM 이하, 1250 nM 이하, 1000 nM 이하, 750 nM 이하, 500 nM 이하, 200 nM 이하, 150 nM 이하, 125 nM 이하, 100 nM 이하, 75 nM 이하, 50 nM 이하, 25 nM 이하, 20 nM 이하, 15 nM 이하 및 10 nM 이하로부터 선택된 농도의 항폴레이트제를 포함하는 것인 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 단계 b) 및 c)를 포함하는 하나 이상의 선택 주기를 수행함;
    ii) 단계 c) 후에, 세포를 비-제한 농도의 폴레이트를 포함하는 배양 배지 내에서 배양한 후, 다시 단계 b)에 따라 배양하고, 단계 c)에 따라 얻음;
    iii) 하나 이상의 추가의 선택 단계를 단계 b) 및/또는 c) 수행 전 및/또는 후에 수행하고, 상기 하나 이상의 추가의 선택 단계는 유동 세포 분석 기반 선택 및 숙주 세포 내로 도입된 하나 이상의 추가의 선택가능 마커에 대한 선택으로부터 선택됨;
    iv) 숙주 세포는 안정적으로 형질감염됨; 및/또는
    v) 선택된 숙주 세포는 이뮤노글로불린 분자를 재조합 방식으로 발현하고 분비함
    중 하나 이상의 특징을 갖는 것인 방법.
  28. a) 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 및/또는 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따라 선택된 숙주 세포를 관심 있는 폴리펩티드의 발현 및 분비를 허용하는 조건 하에 배양하고;
    b) 관심 있는 폴리펩티드를 세포 배양 배지로부터 단리하고;
    c) 임의로 단리된 관심 있는 폴리펩티드를 처리하는 것
    을 포함하는, 관심 있는 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  29. 세포의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 세포를 선택하기 위한 선택가능 마커로서의,
    a) 다음 서열을 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체
    Figure pct00040

    (여기서, Xaa는 알라닌이 아니고, 돌연변이된 폴레이트 수용체의 폴레이트 결합 친화도는 Xaa가 알라닌인 대응하는 야생형 폴레이트 수용체 (서열 1)에 비해 감소됨), 또는
    b) 서열 9에 제시된 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체 (여기서, Xaa는 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체에서 알라닌이 아니고, 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체의 폴레이트 결합 친화도는 Xaa가 알라닌인 성숙 야생형 인간 폴레이트 수용체 알파 서열 (서열 1 참조)에 비해 감소됨)
    를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도.
  30. 제29항에 있어서, Xaa가 류신, 글라이신, 발린, 이소류신, 히스티딘 및 아스파르트산으로부터 선택되는 아미노산이고, 바람직하게는 Xaa가 류신인 용도.
  31. 세포의 생존성이 폴레이트 흡수에 의존하는 세포를 선택하기 위한 선택가능 마커로서의,
    a) 다음 서열을 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체
    Figure pct00041

    (여기서, Xaa는 류신임), 또는
    b) 서열 9에 제시된 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 폴레이트 수용체 (여기서, Xaa는 b)에 따른 상기 돌연변이된 폴레이트 수용체에서 류신임)
    를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 폴레이트 수용체가 제8항, 제9항 또는 제14항에서 규정된 특징을 갖는 것인 용도.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 돌연변이된 폴레이트 수용체가 GPI 고정된 것인 용도.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 폴레이트 수용체가 선택가능 마커로서 디히드로폴레이트 환원효소와 조합되어 선택가능 마커로서 사용되는 것인 용도.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법에서의 용도.
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