KR20160099675A - 신규한 진핵 세포 및 관심 생성물의 재조합 발현 방법 - Google Patents

신규한 진핵 세포 및 관심 생성물의 재조합 발현 방법 Download PDF

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Abstract

본원은 관심 생성물의 재조합 생산을 위해 적합한 신규한 진핵 세포에 관한 것이고, 여기서 숙주 세포의 게놈은, 단백질 FAM60A의 효과가 예를 들어 유전자 FAM60A의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 상기 세포 내에서 손상되어 안정성 특징을 개선하도록 변경된다. 또한, 본 개시내용은 상기 숙주 세포가 재조합 생산 기술에 사용되는 관련 기술을 제공한다.

Description

신규한 진핵 세포 및 관심 생성물의 재조합 발현 방법{NOVEL EUKARYOTIC CELLS AND METHODS FOR RECOMBINANTLY EXPRESSING A PRODUCT OF INTEREST}
본 개시내용은 재조합 발현 기술의 분야에 관한 것이다. 본원은 특히 안정성이 증가된 관심 생성물을 발현할 수 있는 변경된 진핵 세포 및 재조합 발현 방법에서의 그의 용도를 제공한다. 또한, 진핵 세포의 발현 프로파일을 기초로 하여 안정성이 개선된 재조합 생성물을 발현하는 진핵 세포를 선택 과정의 초기에 확인할 수 있도록 허용하는 도구가 제공된다. 진핵 세포는 바람직하게는 포유동물 세포이다.
생물의약품이 현대 의학에 점점 더 중요해지고 있기 때문에, 생물의약품 시장은 빠른 속도로 계속 성장하고 있다. 현재, 증가하는 수의 생물의약품이 진핵 세포, 예컨대 특히 포유동물 세포에서 생산된다. 따라서, 진핵 세포에서 생물의약품의 성공적인 고수율 생산이 매우 중요하다. 관심 재조합 치료 단백질을 생산하는 세포주를 생산하는 시간은 임의의 생물의약품을 병원에 공급하는데 필요한 시간의 필수적인 부분이다. 추가로, 또한 생물의약품 및 다른 재조합 제품의 생산 비용을 고려할 때, 높은 수준으로, 또한 특히 안정적으로 발현하는 재조합 진핵 세포주, 특히 포유동물 세포주를 갖는 것이 중요하다.
특히 산업적 규모의 생물의약품 생산 효율을 위해, 단기간 내에 우수한 안정성 및 성장 특징을 갖는 고생산 클론의 확인을 목적으로 하는 클론 선택 공정에 큰 노력을 기울이고 있다. 그러나, 고발현 클론이 스크리닝 과정에서 확인된 경우에도, 이들 초기 고발현 클론은 종종 그의 유리한 발현 특징을 상실하고, 발현 수율이 시간이 경과함에 따라 감소한다. 장기간의 계대배양 동안 세포 클론에서 상기 재조합 단백질 발현의 점진적인 상실은 많은 세포주, 예컨대 CHO 세포주에서 발생하는 공통적인 문제이고, 불안정성으로서 언급된다. 상기 불안정성은 재조합 방식으로 생산되는 폴리펩티드의 산업 생산 공정에 심각한 영향을 준다. 생산 불안정성의 원인은 숙주 세포의 유전적 불안정성 및 트랜스진 (transgene) 서열의 후생학적 침묵화 (epigenetic silencing)에 의한 재조합 유전자 카피의 상실에 관련된다고 생각된다. 또한, 불안정성 비율은 개별 연구기획 (project), 즉, 발현되는 관심 개별 생성물에 따라 상이할 수 있음이 밝혀졌다. 25% 내지 거의 90%까지의 불안정성 비율이 진핵 세포주에서 관찰되었다. 따라서, 성공적 발현 세포 집단 내에서 및 심지어 초기에 우수한 수율로 관심 단백질을 발현하는 세포 클론 중에서, 장기 배양 동안 고생산 안정성을 또한 갖고 따라서 재조합 단백질 발현의 점진적인 상실 경향을 보이지 않는 세포, 세포 클론을 각각 확인하기 위해 주의하여야 한다. 상기 클론은 또한 "안정한" 클론을 언급된다. 장기 배양 기간 동안, 안정한 클론은 8-12주, 예를 들어 10주의 기간 내에 그의 초기 생산성의 30% 초과, 바람직하게는 25%를 초과하여 생산성을 상실하지는 않아야 한다. 생산성은 특정 배양 시점에서 부피당 발현된 단백질의 양 (예를 들어 g/L)인 부피 생산성으로서, 각각 1일당 세포당 발현된 단백질의 특이적인 양 (예를 들어 pg/세포/일)인 세포 특이적 생산성으로서 규정된다. 불안정성을 보이기 쉽고 따라서 장기 배양 동안 역가를 상실할 세포 클론이 후속 대규모 생산을 위해 선택되는 것을 방지하기 위해, 대체로 광범한 안정성 분석을 수주 내지 수개월까지 수행하여 그 기간 동안 불안정해지는 세포 클론을 제거하고 안정한 클론을 확인한다. 따라서, 대규모로 생산되는 치료 단백질 및 다른 재조합 폴리펩티드의 생산을 위한 재조합 세포 클론의 생성은 대규모 생산을 위해 필요한 발현 안정성을 보이는 세포 클론을 확인하기 위해 시간이 소요되는 안정성 연구에 의한 개별 클론의 과도한 스크리닝을 대체로 포함한다. 불안정한 클론을 제거하고 안정한 클론을 확인하기 위한 상기 스크리닝은 생물공학적 생산 공정의 개발을 장기화한다. 사용되는 선택 조건 하에서 고발현 세포의 생존에 유리한 고엄격성 선택 시스템을 사용하는 경우에도, 생존 집단 내에서 고발현율과 우수한 성장 및 안정성 특징을 함께 갖는 적합한 생산 클론의 발견은 어렵다.
진핵 세포, 예컨대 특히 포유동물 세포에서 관심 생성물의 재조합 생산을 개선하는 것이 본 발명의 목적이다. 특히, 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의한 안정한 형질감염시에 개선된 안정성 특징을 갖는 관심 생성물을 발현하는 신규한 진핵 세포주를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 특히, 장기 배양 동안 유의한 생산성 상실 위험이 감소된 재조합 진핵 세포를 제공하는 것이 목적이다. 추가로, 안정적으로 형질감염된 진핵 세포, 특히 포유동물 세포를 사용하여 관심 생성물을 재조합 방식으로 생산하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이 목적이다. 또한, 발달 과정의 초기 단계에서 안정한 세포 클론과 불안정한 세포 클론의 식별을 허용하는 분석 도구를 제공하는 것이 목적이다.
발명의 개요
본원은 특히 예를 들어 FAM60A 유전자의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 진핵 세포 내에서 단백질 FAM60A의 효과를 손상시키기 위한 진핵 세포의 게놈의 변경이 상기 세포에서 관심 재조합 생성물의 발현 안정성을 유의하게 증가시킨다는 예기치 않은 발견을 기초로 한다. FAM60A 유전자를 사용하여, 재조합체 발현의 안정성에 영향을 미치는 핵심 유전자를 확인하였다. 세포에서 FAM60A 효과의 손상은 발현 안정성 증가에 의해 관심 생성물의 재조합 생산을 유의하게 개선하는 것을 허용한다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 숙주 세포로서 본원에서 설명되는 신규한 진핵 세포를 사용할 때, 유의하게 개선된 안정성 특징을 보이는 재조합 세포 클론을 선택 후에 얻는다. 장기 배양 동안 발현 안정성의 현저한 상실은 각각의 숙주 세포에서 보다 드물고, 또한 발생한 경우에도, 게놈이 세포 내의 단백질 FAM60A의 효과를 손상하도록 변경되지 않은 세포에 비해 생산성의 보다 적은 극적인 감소를 야기한다. 안정한 클론의 풍부도는 안정한 형질감염시에 증가한다. 따라서, 불안정성이 아니거나 불안정성 경향이 보다 작은 숙주 세포를 확인하기 위한 안정성 분석은 단축되거나 심지어 생략할 수 있다. 이것은 장기간에 걸쳐 우수한 수율로 관심 재조합 생성물을 안정적으로 발현하는 세포 클론을 얻기 위해 필요한 시간을 단축하고 따라서 대규모 생산에 적합하기 때문에 중요한 이점이다. 따라서, 본 발명은 스크리닝 노력을 유의하게 감소시키고, 선행 기술에 중요하게 기여한다.
제1 측면에 따르면, 본 개시내용은 단백질 FAM60A의 효과가 진핵 세포 내에서 손상되도록 진핵 세포의 게놈이 변경되고 상기 세포가 그의 게놈 내에 통합된 관심 생성물을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 단리된 진핵 세포를 제공한다. 단백질 FAM60A의 효과는 예를 들어 내인성 유전자 FAM60A의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해, 예를 들어 유전자 침묵화, 유전자 결실 또는 비-기능성 단백질 또는 기능이 보다 작은 단백질이 발현되도록 하는 유전자의 돌연변이에 의해 상기 세포 내에서 손상될 수 있다. 다른 선택 사항이 또한 본원에서 설명된다.
제2 측면에 따르면,
(a) 숙주 세포로서 제1 측면에 따른 진핵 세포를 제공하고;
(b) 관심 생성물을 발현하는 하나 이상의 숙주 세포를 선택하는 것
을 포함하는, 관심 생성물을 재조합 발현하는 숙주 세포의 선택 방법이 제공된다.
제3 측면에 따르면, 관심 생성물의 재조합 발현을 위한 숙주 세포로서 제1 측면에 따른 진핵 세포를 사용하는 것을 포함하는, 관심 생성물을 재조합 방식으로 생산하는 방법이 제공된다. 관심 생성물은 제1 측면에 따른 진핵 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 상기 논의된 바와 같이, 그의 유리한 발현 안정성 특징 때문에, 이들 신규한 진핵 세포는 관심 생성물의 재조합 생산을 위한 숙주 세포로서 특히 적합하다.
제4 측면에 따르면, 진핵 세포의 게놈을 변경함으로써 상기 세포 내의 단백질 FAM60A의 효과를 손상시키고, 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터를 상기 세포 내로 안정적으로 형질감염시키는 것을 포함하는, 관심 생성물의 재조합 생산에 적합한 진핵 세포의 생산 방법이 제공된다. FAM60A의 효과는 예를 들어 상기 세포 내의 유전자 FAM60A의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 손상될 수 있다.
제5 측면에 따르면, 단백질 FAM60A의 효과가 진핵 세포 내에서 손상되는지 직접 또는 간접적으로 분석하는 것을 포함하는, 관심 재조합 생성물을 안정적으로 발현하기 위한 숙주 세포로서의 그의 적합성에 대해 진핵 세포를 분석하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 예를 들어 단백질 FAM60A의 효과가 세포 내에서 손상된 진핵 세포가 얻어졌는지 확인하기 위해 제4 측면에 따른 방법과 조합하여 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 방법은 관심 생성물을 발현하는 안정한 세포 클론과 불안정한 세포 클론을 선택 과정의 초기에 식별하기 위한 분석 도구로서 사용될 수 있다.
제6 측면에 따르면, 본 개시내용은 단백질 FAM60A의 효과가 진핵 세포에서 손상되도록 게놈이 변경된, 관심 생성물을 재조합 방식으로 발현하기 위한 단리된 진핵 세포의 용도에 관한 것이다.
본원의 다른 목적, 특징, 이점 및 측면은 다음 설명 및 첨부되는 청구의 범위로부터 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 그러나, 다음 설명, 첨부되는 청구의 범위 및 구체적인 예는 본원의 바람직한 실시양태를 나타내면서, 단지 예시의 목적으로 제시됨을 이해하여야 한다. 본 발명의 취지 및 범위 내의 다양한 변화 및 변형은 하기 설명을 통해 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
도 1은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포의 염색체 8의 텔로머 영역 및 상기 텔로머 영역에 위치한 유전자의 개요에 대한 모식도를 제공한다. 도면에 도시된 게놈 영역은 염색체 8 상의 합해진 스캐폴드 수 (merged scaffolds number) 6 및 25의 결과이다. CHO 세포의 염색체 8 상의 유전자 및 추정 유전자에 대한 개요는 브링크롤프 (Brinkrolf) 등의 어셈블리 (assembly) (문헌 [Brinkrolf et al. (Nature Biotechnology Volume 31, 694-695 (2013)]; 상기 문헌에서 설명되는 유전자 은행: APMK00000000, 버전 APMK01000000 참조)와 연관된 유전자 은행 주석 파일 (주석 file)을 사용하여 볼 수 있다. 또한, 베이징 게노믹스 인스티튜트 (Beijing Genomics Institute)도 상기 영역의 주석을 제시하였다 (Xu et al., Nature Biotechnology, Volume 29, number 8, 735-741 (2011); 유전자 은행: AFTD00000000, 버전 AFTD01000000 참조). 도 1에 *로 표시된 주석은 유전자 은행 파일 AFTD01000000의 것이다.
마우스의 염색체 6의 텔로머 영역에 대한 대응하는 개요는 예를 들어 Ensemble 데이타베이스에서 볼 수 있다. 마우스의 염색체 6은 차이니즈 햄스터의 염색체 8에 대응하는 구조를 갖는다. Ensemble 데이타베이스의 아래 링크는 FAM60A 유전자를 함유하는 마우스의 염색체 6의 텔로머 영역을 보여준다:
http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Location/View?db=core;g=ENSMUSG00000039985; r=6:148921035-148946467
하기 표 1은 도 1에 제시된 유전자 및 코딩되는 생성물의 약어 및 대체 명칭 (별칭)에 대한 개요를 제공하고, 실현가능한 경우 마우스 및 차이니즈 햄스터에서 대응하는 주석 (문헌 [Brinkrolf et al., 2013] 및/또는 [Xu et al., 2011]에 따른)을 나타낸다. 표 1은 또한 예를 들어 상이한 종에서 사용되는 대체 명칭을 제시한다. 본 개시내용이 구체적인 단백질 또는 유전자 명칭을 언급하는 경우, 이것은 또한 예를 들어 상이한 종에서 대응하는 유전자 또는 단백질의 특징을 나타내기 위해 사용되는 상기 단백질 또는 유전자의 임의의 대체 명칭을 나타내고 포함한다. 특히, 동일한 기능을 갖는 상동체 및 오르톨로그 (ortholog)도 포함된다.
<표 1>
차이니즈 햄스터의 염색체 8 또는 마우스의 염색체 6에 위치하는 유전자에 의해 코딩되는 생성물의 약어 및 대체 명칭 (별칭).
Figure pct00001

Figure pct00002

Figure pct00003

도 2는 CHO 세포주 내의 염색체 8의 텔로머 영역에 위치하는 유전자, 즉 TMTC1 (1), RPS4Y2 (2), IPO8 (3), CAPRIN2 (4), FAM60A (5), Dennd5b (6), METTL20 (7), AMN1 (8), C12orf35 (9), Bicd1 (10)의 상대적인 발현 수준을 보여준다.
도 3은 관심 생성물로서 항체를 코딩하는 발현 벡터에 의한 안정한 형질감염 후에 3개의 상이한 세포 클론 (CHO 야생형 및 상기 야생형으로부터 유래한 2개의 FAM60A 낙아웃 (knock-out) 클론 s16 및 s23)을 사용하여 7/8주 동안 수행한 안정성 시험 결과를 보여준다. (1)은 모 야생형 세포 (CHO-K1로부터 유래된)를 사용하여 얻은 안정성 결과를 보여주고; (2)는 FAM60A 낙아웃 클론 s16을 사용하여 얻은 안정성 결과를 보여주고; (3)은 FAM60A 낙아웃 클론 s23을 사용하여 얻은 안정성 결과를 보여준다. 알 수 있는 바와 같이, 발현 안정성은 FAM60A 낙아웃 세포로부터 유래된 세포 클론에서 유의하게 증가하였다 ((2) 및 (3) 참조). 안정한 클론의 수는 재조합 발현을 위해 FAM60A 낙아웃 세포를 사용할 때 유의하게 증가하였다. 따라서, 여기서 유전자 낙아웃에 의한 숙주 세포 내의 FAM60A의 효과의 손상은 발현 안정성을 유의하게 개선하였다.
도 4A 내지 L은 siRNA를 사용하여 차이니즈 햄스터 (CHO) 세포의 염색체 8의 텔로머 영역에 위치하는 상이한 표적 유전자의 발현 감소 후에 얻어진 FACS 프로파일을 보여준다. 발현 벡터로 안정적으로 형질감염되고 코딩되는 항체를 관심 생성물로서 발현한 세포는 재조합 발현된 항체의 양을 검출하기 위해 형광 염색하였다. FACS 프로파일에서 강도가 높을수록, 보다 많은 항체가 염색된 세포로부터 발현된다. FACS 프로파일에 제시된 좌측 피크는 비교 목적으로 포함된 모 세포주 (형질감염되지 않아서 항체를 발현하지 않는)에 대응한다. 2개의 다른 곡선은 발현 벡터로 안정적으로 형질감염되고 항체를 재조합 방식으로 발현한 세포 클론에 대해 얻은 결과를 나타낸다. 상기 세포 클론은 siRNA 음성 대조군 (어두운 곡선; 임의의 유전자의 발현에 대한 효과 없음) 또는 표적 유전자의 발현을 감소시키는 siRNA (밝은 회색 곡선)로 형질감염되었다. 표적 유전자의 침묵화가 항체의 재조합 발현에 대한 효과를 갖지 않으면, siRNA 대조군 및 표적 siRNA에 대한 형광 곡선은 중복되고 동일하게 유지된다. 표적 유전자의 침묵화가 재조합 방식으로 발현된 항체의 발현 비율을 증가시키면, 상응하는 FACS 프로파일의 강도는 증가하고, 우측으로 이동한다. A: 유전자 Mettl20_1, 125 pmol, 24.9%; B: 유전자 C12orf35_1, 125 pmol, 30.6%; C: 유전자 C12orf35_2, 150 pmol, 31.7%; D: 유전자 Caprin2_6, 100 pmol, 53.3%; E: FAM60A_3, 150 pmol, 48%; F: Ipo8_1, 125 pmol, 20.3%; G: Ipo8_2, 150 pmol, 57.5%; H: Ipo8_3, 150 pmol, 21.5%; I: Dennd5b_2, 100 pmol, 36.9%; J: Amn1_4, 125 pmol, 30.8%; K: TMTC1_1, 150 pmol, 60.6%; L:TMTC1_2, 150 pmol, 53.4% (비율 값은 참조 siRNA 대 Ctrl siRNA 사이의 표적 유전자의 mRNA 발현에 대응한다). 도 4B 및 C는 유전자 C12orf35의 하향조절이 재조합 항체의 발현을 유의하게 증가시키고 따라서 FACS 프로파일의 우측으로의 분명한 이동에 의해 표시되는 바와 같이 보다 높은 생산성을 유도함을 보여준다 (화살표로 표시된 우측의 밝은 회색 곡선 참조). 따라서, 한 실시양태에 따르면, 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과은 수율을 개선하기 위해 숙주 세포 내에서 추가로 손상된다.
도 5 및 6은 각각의 경우에 RNAi에 의해 CHO 세포 내의 유전자 C12orf35의 발현을 감소시킨 후 상이한 클론 및 풀 (pool)에서 2개의 상이한 관심 모델 폴리펩티드 (항체 1 및 2)의 항체 경쇄 및 중쇄의 mRNA 발현 수준을 보여준다. 항체 사슬의 mRNA 수준은 유전자 C12orf35의 발현이 유전자 침묵화에 의해 감소되면 상향조절된다. 따라서, C12orf35 발현의 감소는 놀랍게도 HC 및 LC의 보다 높은 mRNA 수준을 유도한다.
도 7은 siRNA를 사용한 유전자 C12orf35의 침묵화시에, 유의하게 보다 높은 세포 특이적 발현 역가가 얻어짐 (배양 제3, 4, 5 및 6일로부터 계산됨)을 보여준다.
도 8은 염색체 8 (q 아암 (arm)) 상의 유전자 FAM60A 및 유전자 C12orf35를 포함하는 텔로머 영역이 결실된 (C8DEL) CHO 세포주로부터 유래된 46개의 최고 생산 클론 (흑색)이 IPO8 양성으로 시험된 모 세포주로부터 얻은 45개의 최고 생산 클론 (회색)에 비해 더 높은 역가를 갖는다는 것을 보여준다.
도 9는 엽산염(folate) 수용체/DHFR 시스템을 사용한 선택 후에 안정적으로 형질감염된 C8DEL 세포 풀의 FACS 프로파일을 보여준다. MTX의 농도는 A로부터 E로 증가하였다 (A: MTX 미함유; B: 1 nM MTX; C: 5 nM MTX; D: 10 nM MTX; E: 50 nM MTX). 재조합 항체 발현은 형광을 기초로 하여 검출되었다. 50 nM MTX에서, 우세한 고 생산 세포는 FACS 분석에 의해 입증되는 바와 같이 얻은 풀에 포함되었다. 얻은 풀 프로파일은 세포 클론의 프로파일과 현저하게 유사하였다. 이것은 본원에서 설명된 기술이 재조합 숙주 세포의 발현 특징에 대해 달성하는 현저한 개선을 지지한다.
발명의 상세한 설명
본 개시내용은 특히 단백질 FAM60A의 효과가 예를 들어 상기 세포 내의 내인성 FAM60A 유전자의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해, 예를 들어 상기 유전자를 결실시킴으로써 또는 코딩 서열 내로 돌연변이를 도입함으로써 손상된 진핵 세포가, 안정한 형질감염시에 유의하게 개선된 안정성 특징과 함께 관심 재조합 생성물을 발현할 수 있다는 놀라운 발견을 기초로 한다. 포유동물 세포에 대한 예에 의해 제시되는 바와 같이, 각각 변경된 세포는 놀랍게도 장기 배양 기간 동안 매우 안정한 발현 특징을 보이고, 이에 의해 안정한 클론의 확인을 위한 시간이 소요되는 안정성 분석은 단축되거나 심지어 생략할 수 있다. 성공적으로 형질감염된 숙주 세포의 집단에서, 장기 배양 기간 동안 그의 유리한 발현 특징을 상실한 숙주 세포의 수는 각각 변경된 진핵 세포를 사용할 때 유의하게 감소된다. 따라서, 그의 유리한 안정성 특징 때문에, 상기 변경된 진핵 세포는 재조합 생산 기술을 위한 숙주 세포로서 특히 적합하고, 관심 생성물의 재조합 생산을 위해 사용될 수 있다. 상기 유전자 FAM60A가 진핵 숙주 세포 내의 재조합 발현 안정성에 대한 강력한 영향을 갖는다 놀라운 발견을 기초로 하여, 본 개시내용은 또한 관심 생성물의 재조합 생산의 개선을 허용하는 신규한 선택 및 생산 방법 및 관련 기술을 제공한다. 따라서, 본 개시내용은 선행 기술에 중요하게 기여한다.
개별적인 측면 및 그의 적합하고 바람직한 실시양태를 이제 상세하게 설명한다.
A. 변형된 진핵 세포
제1 측면에 따르면, 본 개시내용은 단백질 FAM60A의 효과가 진핵 세포 내에서 손상되도록 진핵 세포의 게놈이 변경되고 상기 세포가 그의 게놈 내에 통합된 관심 생성물을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 단리된 진핵 세포를 제공한다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 상기 변경된 세포는 FAM60A의 효과가 손상되지 않은 비변형된 세포에 비해 관심 생성물의 유의한 보다 높은 생산 안정성을 보인다. 안정한 발현 특징을 보이는 세포의 풍부도는 포유동물 세포가 진핵 세포로서 사용되는 바람직한 실시양태에 대해 제시된 바와 같이 형질감염된 세포의 집단에서 증가된다. 상기 개선된 발현 안정성 때문에, 고발현 세포 클론의 시간이 소요되는 장기간 안정성 연구를 단축하거나 심지어 생략할 수 있다. 추가의 이점은 또한 아래에서 설명되고, 실시예로부터 또한 분명해진다. 따라서, 관심 생성물의 재조합 생산을 위해 상기 유리한 신규한 진핵 세포주를 사용하면, 안정한 발현 특징을 갖는 고발현 세포 또는 세포 클론을 확인하기 위한 스크리닝 노력이 감소되고, 특히 관심 생성물을 대규모로 생산하기 위해 적합한 안정한 세포 클론을 얻기 위해 필요한 시간이 감소될 수 있다. 따라서, 상기 변경된 진핵 세포주는 재조합 생산 기술을 위한 숙주 세포로서 사용될 때 중요한 이점을 갖는다.
FAM60A는 전사 억제에서 기능하는 SIN3-히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 복합체 (SIN3/HDAC 복합체)의 하위단위이다 ([Munoz et al., 2012, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 287, NO. 39, pp. 32346-32353]; [Smith et al., 2012, Mol Cell Proteomics 11(12): 1815-1828]). 히스톤 데아세틸라제 (HDAC)는 히스톤으로부터 아세틸기의 제거를 촉매한다. 라이신 상의 히스톤의 아세틸화는 염색질 입체형태의 조정을 위한 주요 메카니즘이다. 히스톤 아세틸화는 이완된 (relaxed) 전사 활성 염색질 상태를 촉진하고, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC)에 의해 촉매된 탈아세틸화는 침묵 불활성 상태에 유리하다. 데이타베이스 분석은 대부분의 후생동물에 적어도 하나의 FAM60A 오르톨로그가 존재하지만, 선충에는 존재하지 않음을 보여준다. FAM60A 유전자는 후생동물에서 보존되고, 완전히 서열이 결정된 모든 척추동물 및 대부분의 무척추동물 게놈에서 발견될 수 있다. 예를 들어 FAM60A 단백질의 100% 서열 동일성이 인간, 래트, 마우스 및 소 사이에서 발견될 수 있다. FAM60A 상동체의 서열 유사성 연구는 대부분, 게놈 내에 상기 패밀리의 하나의 대표적인 구성원만이 존재함을 나타낸다. 단지 몇몇의 예외만이 존재한다. 문헌 [Smith et al., 2012]에 따르면, FAM60A 단백질은 임의의 알려진 단백질 도메인에 결여된 특유한 서열을 갖는다. 또한, 문헌 [Smith et al. 2012]에 이 단백질은 인간 프로테옴 (proteome) 내의 다른 알려진 단백질에 대한 임의의 서열 상동성을 보이지 않는다고 기재되어 있다. 상이한 종으로부터의 FAM60A 단백질 사이의 서열 비교는 FAM60A 단백질이 일반적으로 다음 3개의 영역을 포함함을 보여주었다: (1) 모든 후생동물에서 고도로 보존된 절편을 포함하는 N-말단, (2) 척추동물에 걸쳐 고도로 보존되지만 무척추동물에서는 가변 길이의 비-보존된 스페이서로 이루어진 중앙 영역, (3) 모든 후생동물에서 고도로 보존된 절편을 포함하는 C-말단. 따라서, 최고의 보존은 FAM60A N- 및 C-말단 영역 내에서 관찰되었다.
상기 논의된 바와 같이, 연구는 FAM60A가 다양한 진핵 세포 종류, 예컨대 특히 포유동물 세포에서 SIN3/HDAC 복합체와 연관됨을 나타낸다. 그러나, 현재까지 FAM60A에 대한 기능성 정보는 매우 제한된다. 최근의 기능성 연구 ([Smith et al., 2012] 참조)는 FAM60A가 유전자 발현을 억제하고 특정 유전자 하위세트를 조절함을 나타낸다. 문헌 [Smith et al. 2012]은 암 진행, 전이, 세포 이동 및 면역 감시와 같은 과정에서 중추적인 역할을 수행하는 TGF-베타 신호전달 경로의 조절에서 FAM60A의 역할을 보고한 바 있다. FAM60A는 TGF-베타 신호전달 경로의 전사 리프레서이고, 상기 FAM60A 기능은 SIN3-HDAC 복합체에서의 그의 역할을 통해 허용되는 것으로 보인다는 발견이 존재한다. FAM60A에 대한 siRNA를 사용한 상이한 암 세포주에서 FAM60A의 고갈은 정상적인 암세포 형태의 변화를 야기하였다. 또한, FAM60A 단백질 수준은 U2OS 세포의 세포 주기 과정 내에서 주기적으로 변하는 것으로 밝혀졌다 (Munoz et al., 2012). U2OS 인간 골육종 세포에서 FAM60A siRNA를 사용한 FAM60A 낙다운 (knock-down) 실험은 FAM60A가 사이클린 D1 유전자 발현을 억제함을 보여주었다. 상기 과학적 배경과 반대로, 진핵 세포, 예컨대 바람직하게는 포유동물 세포에서 단백질 FAM60A의 효과의 손상이, 재조합 발현에 중요한 세포의 다른 특징에 부정적인 영향을 주지 않으면서 상기 세포 내의 이종성 유전자 발현의 안정성을 유의하게 증가시킨다는 것은 매우 놀라운 발견이었다. 단백질 FAM60A와 세포의 장기 배양 동안 발현 안정성 사이의 상기 상관성은 예기치 않은 것이었다.
설명된 바와 같이, FAM60A 유전자는 후생동물에서 및 포유동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트 및 햄스터에서 내인성으로 발현되고, FAM60A의 아미노산 서열은 포유동물 종 및 척추동물에서 고도로 보존된다. 제1 측면에 따라 변경된 진핵 세포는 FAM60A를 내인성으로 발현하는 진핵 세포로부터 유래된다. 쉽게 단순화하기 위해, 단백질 FAM60A 및 단백질 FAM60A를 코딩하는 FAM60A 유전자는 본원에서 대문자로 표시되지만, 일부의 종에서는 유전자 및/또는 단백질에 대해 상이한 철자가 사용된다. 서열 목록은 상이한 척추동물 종, 즉 호모 사피엔스(Homo sapiens) (서열(SEQ ID NO) 1), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) (서열 2), 무스 무스쿨루스(Mus musculus) (서열 3), 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus) (서열 4), 갈루스 갈루스(Gallus gallus) (서열 5), 판 트로글로디테스(Pan troglodytes) (서열 6), 퐁고 아벨리이(Pongo abelii) (서열 7) 및 보스 타우루스(Bos taurus) (서열 8)의 알려진 및/또는 예측된 FAM60A 단백질의 예시적인 아미노산 서열을 보여준다. 크리세툴루스 그리세우스의 예측된 FAM60A cDNA는 서열 9 (14-679의 코딩 서열; 또한 NCBI 참조 서열: XM_003505482.1 참조)에 제시된다. 상이한 명칭이 상이한 종의 단백질 FAM60A 또는 FAM60A 유전자에 대해 지정될 수 있고, 비-제한적인 대체 명칭 (별칭)이 또한 상기 표 1에 제시된다. 용어 "FAM60A"는 본원에서 사용되는 바와 같이, FAM60A와 동일한 기능을 갖는 FAM60A의 임의의 상동체 및 오르톨로그를 또한 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 용어 "FAM60A"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 특히 서열 1 내지 8에 제시된 하나 이상의 아미노산 서열에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성을 공유하는 단백질을 의미한다. 한 실시양태에 따르면, 상기 비율 값은 상동성 대신에 폴리펩티드 동일성을 의미한다. 상동성, 또는 동일성은 참조 단백질의 전체 길이에 걸쳐 계산될 수 있다. 각각의 단백질은 바람직하게는 서열 1 또는 서열 2 내지 8 중의 하나 이상, 바람직하게는 서열 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 동일한 기능을 갖는다. FAM60A 단백질은 문헌에 상세하게 기재되어 있지 않다. 따라서, 예를 들어 숙주 세포 내의 FAM60A 유전자의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 달성될 수 있는 바와 같이, 내인성 단백질 FAM60A의 효과가 세포 내에서 손상되도록 숙주 세포의 게놈이 변경되면, 재조합 숙주 세포의 발현 안정성이 개선될 수 있다는 것은 매우 놀라운 것이었다. FAM60A가 관심 재조합 생성물의 발현 안정성에 영향을 미친다는 사실은 예기치 않은 것이었다.
FAM60A 단백질을 코딩하는 FAM60A 유전자는 세포 내의 FAM60A의 효과를 손상시키기 위해 본원에서 설명되는 바와 같이 변형될 수 있다. 이것은 예를 들어 유전공학 기술, 예컨대 유전자 낙아웃 기술에 의해 달성될 수 있다. 상이한 포유동물 종의 게놈 유전자 서열은 알려져 있고, 예를 들어 호모 사피엔스 (NCBI 유전자-ID: 58516); 라투스 노르베기쿠스 (NCBI 유전자-ID: 686611); 무스 무스쿨루스 (NCBI 유전자-ID: 56306); 보스 타우루스 (NCBI 유전자-ID: 538649) 등이 기재되어 있다. 전사체 변이체는 종-의존적 방식으로 및 상이한 수로 존재할 수 있다. 예를 들어 인간 FAM60A 유전자는 UTR에서 상이하지만 동일한 단백질을 코딩하는 3개의 추정 전사체 이소형을 발현한다.
본 개시내용은 특히 대응하는 비변형된 진핵 세포에 의해 내인성으로 발현된 단백질 FAM60A의 효과가 손상되도록 진핵 세포의 게놈이 변경된 변형된 진핵 세포, 예컨대 바람직하게는 포유동물 세포에 관한 것이다. 상기 변형은 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 안정적으로 형질감염된 세포 집단 내의 안정적으로 발현하는 세포의 수를 증가시킬 수 있다.
상기 세포에서 단백질 FAM60A의 효과를 손상시키기 위해 세포의 게놈을 변형할 몇몇의 가능성이 존재한다. FAM60A의 효과는 예를 들어 유전자 수준 또는 단백질 수준에서 손상될 수 있다. FAM60A의 효과는 예를 들어 구조/서열, 전사, 번역 및/또는 SIN3/HDAC 복합체를 형성하는 다른 성분과의 상호작용의 변형에 의해 손상될 수 있다. 비-제한적인 방식을 아래에서 설명한다.
한 실시양태에 따르면, 단백질 FAM60A의 효과는 상기 세포 내의 유전자 FAM60A의 기능적 발현이 감소 또는 제거되기 때문에 손상된다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 예를 들어 유전자 낙아웃 또는 발현 수준의 감소에 의해 유전자 FAM60A의 발현을 변경하는 것은 개선된 안정성 특징을 갖는 관심 재조합 생성물을 발현하는 변경된 세포를 제공하기 위해 매우 효율적인 수단이다.
유전자 FAM60A의 기능적 발현의 감소 또는 제거는 다양한 수단에 의해 달성할 수 있다. 기능적 발현은 예를 들어 FAM60A의 발현 수준을 감소시킴으로써 또는 FAM60A의 기능을 파괴함으로써 또는 상기 방법의 조합에 의해 감소될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 세포는 유전자 낙아웃, 유전자 돌연변이, 유전자 결실, 유전자 침묵화 또는 이들의 임의의 조합에 의해 FAM60A 유전자의 기능적 발현이 제거 또는 감소되도록 변경된다. 한 실시양태에 따르면, 유전자 FAM60A의 기능적 발현은 유전자 낙아웃에 의해 세포 내에서 감소 또는 제거된다. 유전자 낙아웃은 그의 기능을 파괴함으로써 유전자가 작동하지 않도록 만드는 유전자 기술이다. 예를 들어 핵산은 코딩 서열 내로 삽입되어 유전자 기능을 파괴할 수 있다. 또한, 완전 FAM60A 유전자 또는 그의 일부가 결실되어, 기능성 단백질이 각각 변경된 세포에 의해 발현되지 않을 수 있다. 또 다른 방식은 하나 이상의 낙아웃 돌연변이를 코딩 서열 내로 도입하여, 비-기능적 발현 생성물 또는 기능이 보다 낮은 발현 생성물을 생성하는 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 프레임쉬프트 (frameshift) 돌연변이가 코딩 서열 내로 도입되어, 비-기능적 발현 생성물 또는 기능이 보다 낮은 발현 생성물을 유도할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 하나 이상의 정지 코돈이 코딩 서열 내로 도입되어, 말단절단된 (truncated), 비-기능적 또는 기능이 보다 낮은 단백질을 얻을 수 있다. 또한, 스플라이싱 (splicing) 부위가 변경될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, FAM60A 유전자는 비-기능적 발현 생성물 또는 기능이 보다 낮은 발현 생성물을 제공하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 하나 이상의 돌연변이가 FAM60A 유전자의 엑손 1 내로 도입된다. 한 실시양태에 따르면, 도입된 하나 이상의 돌연변이에 의해, FAM60A의 모든 또는 일부의 N-말단 또는 C-말단 영역이 발현 생성물에 존재하지 않는다. 다른 방식은 프로모터, 5'- 및/또는 3' UTR 또는 다른 조절 요소 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에 따르면, FAM60A 유전자의 프로모터 기능은 예를 들어 프로모터 결실을 도입함으로써 또는 프로모터와 전사 출발 부위 사이에 구축물을 도입함으로써 파괴된다. 표적 유전자의 발현을 억제 또는 제거하기 위해 유전자 낙아웃을 달성하기 위한 방법은 또한 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 따라서 본원에서 상세히 설명할 필요가 없다. 그럼에도 불구하고, 일부의 비-제한적인 예를 아래에서 설명한다.
한 실시양태에 따르면, FAM60A 유전자는 유전공학에 의해 기능적으로 낙아웃된다. 그 예는 게놈 편집 (editing), 예컨대 조작된 뉴클레아제 (GEEN)를 사용한 게놈 편집을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 이것은 DNA가 인공적으로 조작된 뉴클레아제, 또는 "분자 가위 (molecular scissors)"를 사용하여 게놈에 삽입 또는 교체되거나 게놈으로부터 제거되는 유전공학의 한 종류이다. 뉴클레아제는 게놈 내의 목적하는 위치에 특이적 이중 가닥 파손 (break) (DSB)을 생성하고, 상동성 재조합 (HR) 및 비상동성 말단-연결 (NHEJ)의 천연 과정에 의해 유도된 파손을 복구하기 위해 세포의 내인성 메카니즘을 이용한다. 다음과 같이 사용될 수 있는 조작된 뉴클레아제의 적어도 4개의 패밀리가 존재한다: 아연 핑거 뉴클레아제 (Zinc finger nuclease: ZFN), 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (Transcription Activator-Like Effector Nuclease: TALEN), CRISPR, 및 조작된 메가뉴클레아제 재-조작된 호밍 (homing) 엔도뉴클레아제. FAM60A 유전자가 낙아웃되어 상기 세포 내의 단백질 FAM60A의 효과를 손상시킨 변경된 포유동물 세포를 제공하기 위해 TALEN 기술을 또한 실시예에서 사용하였다.
한 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 카피, 및 임의로 보다 많은 카피의 유전자 FAM60A가 진핵 세포의 게놈 내에 존재할 경우 모든 카피는 진핵 세포 내의 단백질 FAM60A의 효과를 감소 또는 제거하여 손상시키기 위해 변경, 예를 들어 낙아웃, 결실 또는 다른 방식으로 작동되지 않도록 처리된다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 카피의 유전자 FAM60A가 진핵 세포의 게놈 내에서 결실 또는 기능적으로 불활성화된다. 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이는 비-기능적 발현 생성물 또는 기능이 보다 낮은 발현 생성물을 제공하기 위해 또는 진핵 세포 내의 FAM60A의 발현을 완전히 제거하거나 감소시켜 그 효과를 손상시키기 위해 하나 이상의 카피의 FAM60A 유전자 내에 삽입될 수 있다. 이에 의해, FAM60A 유전자는 게놈 내에서 기본적으로 불활성화된다. 한 실시양태에 따르면, 모든 카피의 유전자 FAM60A는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 내에서 각각 변경된다.
한 실시양태에 따르면, 진핵 세포는 후생동물 세포, 척추동물 세포 또는 바람직하게는 포유동물 세포이다. 한 실시양태에 따르면, 염색체의 일부는 상기 세포에서 결실되고, 결실된 부분은 유전자 FAM60A를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 유전자 FAM60A를 포함하는 염색체 부분은 1개 초과의 카피가 존재하면 한 카피의 유전자 FAM60A를 포함하는 모든 염색체에서 결실된다. 이에 의해, 모든 카피의 유전자 FAM60A는 게놈으로부터 결실된다.
한 실시양태에 따르면, 염색체의 텔로머 영역의 일부가 결실되고, 결실된 부분은 유전자 FAM60A를 포함한다. 바람직한 실시양태에 따르면, 변경된 세포는 설치류 세포이다. 한 실시양태에 따르면, 세포는 햄스터 세포, 예를 들어 CHO 세포이고, 염색체 8의 텔로머 영역의 적어도 일부가 게놈에서 결실되고, 상기 결실된 부분은 유전자 FAM60A를 포함한다. 용어 "FAM60A"의 의미는 상기 설명되어 있고, 상기 용어의 범위에 또한 포함되는 상동체 및 오르톨로그의 비-제한적인 대체 명칭이 또한 표 1에 표시된다. 한 실시양태에 따르면, 상기 결실은 FAM60A 유전자를 포함하는 햄스터 세포, 특히 차이니즈 햄스터 세포의 염색체 8의 q 아암에서 발생한다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 염색체 8의 텔로머 영역에 각각의 결실을 포함하는 CHO 세포가 재조합 발현을 위한 숙주 세포로서 특히 적합하다. 발현 벡터를 사용한 안정한 형질감염 후에, 상기 세포는 염색체 8의 텔로머 영역의 상기 부분이 상실되지 않은 세포에 비해 유의하게 더 높은 발현 안정성 및 생산성을 보인다. 또한, 형질감염된 세포 집단 내의 풍부도 및 따라서 안정적으로 발현하는 세포의 비율은 유의하게 증가한다. 장기 배양 동안 역가의 유의한 상실은 거의 관찰되지 않는다. 따라서, 재조합 발현의 안정성은 염색체 8 내의 텔로머 영역의 상기 부분을 상실한 상기 햄스터 세포에서 유의하게 개선된다. 추가의 중요한 이점은 염색체 8의 텔로머 영역의 각각의 일부가 염색체 파손 때문에 결실된 CHO 세포의 특성이 추가로 결정되는 실시예에서 상세하게 설명된다. 유리한 특성 때문에, 이들 햄스터 세포는 산업적 생산 세포주로서 특히 적합하게 된다. 별법으로, 변경된 설치류 세포는 염색체 6의 텔로머 영역의 적어도 일부가 게놈에서 결실된 마우스 세포일 수 있고, 상기 결실된 부분은 유전자 FAM60A를 포함한다. 마우스의 염색체 6의 텔로머 영역은 햄스터의 염색체 8의 텔로머 영역과 크게 유사하다.
한 실시양태에 따르면, 텔로머 영역의 적어도 일부는 햄스터의 염색체 쌍 8 (또는 마우스 세포의 경우 염색체 쌍 6)의 두 염색체에서 결실되거나 존재하지 않고, 결실된 부분은 FAM60A 유전자를 포함한다.
한 실시양태에 따르면, 텔로머 영역의 적어도 일부는 햄스터의 염색체 쌍 8 (또는 마우스 세포의 경우 염색체 쌍 6)의 하나의 염색체에서 결실되고, 상기 결실된 부분은 FAM60A 유전자를 포함하고, 추가의 카피가 존재할 경우 다른 염색체 내의 유전자 FAM60A의 발현은 감소 또는 제거된다. 유전자 발현을 감소시키거나 제거하기 적합한 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있고, 비-제한적인 예가 또한 본원에서 설명된다. 한 실시양태에 따르면, 상기 결실은 햄스터, 특히 차이니즈 햄스터의 염색체 8의 q 아암에서 발생한다.
한 실시양태에 따르면, 결실된 염색체 영역은 FAM60A 유전자를 포함하고, Bicd1, C12orf35, Amn1, 메틸트랜스퍼라제-유사 단백질 20, Dennd5b, Caprin2 및 Ipo8로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 또는 모든 유전자를 추가로 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 상기 언급된 모든 유전자가 결실된다. 한 실시양태에 따르면, 결실된 염색체 영역은 유전자 Tmtc1의 적어도 일부 또는 전부를 추가로 포함한다. 햄스터 세포, 예컨대 CHO 세포에서, 이들 유전자는 염색체 8의 텔로머 영역 내에 위치할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 결실된 염색체 영역은 존재하는 경우에 유전자 RPS4Y2를 추가로 포함한다. 상기 언급된 유전자의 위치가 제시된 차이니즈 햄스터 게놈의 염색체 8의 텔로머 영역에 대한 개요는 도 1에 제시된다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 염색체 8의 텔로머 영역 (q 아암)에 각각의 결실을 포함하는 CHO 세포는 발현 수율 및 발현 안정성에 관하여 특정한 유리한 특성을 갖는다. 마우스 세포에서, 상기 언급된 유전자는 염색체 6의 텔로머 영역 내에 위치한다. 오르톨로그 및 상동체를 비롯하여 상기 언급된 개별 유전자 및/또는 코딩되는 단백질의 비-제한적인 대체 명칭은 또한 상기 표 1에 표시되고, 각각의 유전자는 개별 유전자에 대해 상기 사용된 용어의 범위에 포함된다.
한 실시양태에 따르면, FAM60A 유전자의 결실은 염색체 파손 때문이다. 염색체 파손은 포유동물 세포를 염색체 파손을 촉진하는 독성제, 예컨대 MTX, 아피디콜린 또는 히그로마이신으로 처리함으로써 유도될 수 있다. 염색체 파손을 유도하기 위한 다른 방식은 방사선, 방사선 조사, 돌연변이원, 발암 물질 및 블레오마이신을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 염색체 파손은 또한 형질감염, 예를 들어 전기천공 동안 자연적으로 발생할 수 있다. 염색체 파손을 유도하는 방법은 또한 통상의 기술자에게 알려져 있고, 따라서 본원에서 상세히 설명할 필요가 없다. 염색체 파손을 유도한 후, 목적하는 파손점 (breakpoint) (유전자 FAM60A의 결실을 일으키는)을 갖는 세포는 예를 들어 DNA를 분석함으로써 또는 본 개시내용의 제5 측면에 따른 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 처리된 세포의 발현 프로파일은 유전자 FAM60A, 또는 유전자 FAM60A의 동원체에 위치하는 유전자가 발현되는지, 발현이 감소되는지 또는 유전자가 발현되지 않는지 분석될 수 있다. 예를 들어, 마우스 또는 햄스터 세포의 경우, 유전자 FAM60A가 발현되는지 분석될 수 있고, 별법으로 또는 추가로, Bicd1, C12orf35, 메틸트랜스퍼라제-유사 단백질 20, Dennd5b, Caprin2, Ipo8, Tmtc1 또는 상기 언급된 유전자의 텔로머에 위치하는 유전자 (이와 관련하여 텔로머는 텔로머 단부의 방향을 의미함)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 세포에 의해 발현되는지 및/또는 발현이 감소 또는 제거되는지 분석될 수 있다. 유도된 파손점이 각각의 유전자(들)의 동원체에 위치하면 (여기서, 이와 관련하여 동원체는 추가로 염색체 내, 따라서 텔로머 말단으로부터 멀리 위치함을 의미함), 상기 유전자를 포함하는 텔로머 말단은 결실되어, (다른 카피의 유전자가 다른 부위에 존재하여 발현되면) 그의 발현을 감소시키거나 제거한다. 도 1에서 분명히 알 수 있는 바와 같이, 유전자 FAM60A는 상기 언급된 유전자 Caprin2, Ipo8 및 Tmtc1의 텔로머에 위치하고, 즉, 보다 텔로머 단부의 방향으로 위치한다. 따라서, 상기 언급된 유전자가 염색체 파손에 의해 결실되면, 결실된 영역은 또한 유전자 FAM60A를 포함한다. 따라서, 상기 유전자는 유도된 염색체 파손이 유전자 FAM60A를 포함하는 염색체 부분의 결실을 유도하였는지 기본적으로 간접적으로 결정하기 위한 마커로서 유효하게 사용될 수 있다. 또한, 유전자 FAM60A의 텔로머에 위치하는 경우에도, 또한 다른 유전자, 예컨대 Bicd1 또는 C12orf35가, 유전자 FAM60A의 결실을 야기한 염색체 파손이 유도되었는지 결정하기 위한 마커로서 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 예를 들어 유전자 Bicd1 또는 유전자 C12orf35가 염색체 파손 때문에 결실되면, 결실은 대체로 유전자 FAM60A를 또한 포함함이 CHO 세포에서 밝혀졌다. 상기 언급된 유전자는 높고 안정한 발현 특징을 갖는 세포 클론을 낮고 불안정한 발현 특징을 갖는 세포 클론으로부터 식별하기 위한 마커로서 유효하게 사용될 수 있음이 수백 개의 클론의 발현 특징을 분석함으로써 확인되었다. CHO 세포 내의 상기 언급된 유전자의 상대적인 발현을 도 2에 제시한다. 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 유전자 Ipo8 (3), FAM60A (5) 및 C12orf35 (9)는 염색체 8의 텔로머 영역 내에 결실을 포함하지 않는 정상 CHO-K1 세포 내의 염색체 8의 텔로머 영역 내에 위치하는 다른 유전자에 비해 상대적으로 높은 수준으로 발현된다. 따라서, 그의 발현의 제거 또는 감소의 검출을 단순화하기 때문에 하나 이상의 상기 언급된 유전자를 분석에 포함하는 것이 유리하다. 상동체 및 오르톨로그를 비롯하여 상기 언급된 개개의 유전자 및 코딩되는 단백질의 비-제한적인 대체 명칭이 또한 상기 표 1에 표시되고, 각각의 유전자는 개개의 유전자에 대해 상기 사용된 용어의 범위에 포함된다.
한 실시양태에 따르면, 염색체 8 상의 파손점은 FAM60A 유전자의 동원체, Caprin2 유전자의 동원체, Ipo8 유전자의 동원체 또는 유전자 RPS4Y2의 동원체에 위치한다. 햄스터 게놈의 염색체 8 상의 파손점은 종종 Ipo8 유전자의 동원체에 위치하는 것으로 밝혀졌다. 한 실시양태에 따르면, 염색체 8 상의 파손점은 Tmtc1 유전자 내에 위치하고, 상기 유전자는 발현되지 않거나 발현이 낮다. 한 실시양태에 따르면, Ergic2 유전자 (Tmtc1 유전자의 동원체에 위치하는)는 염색체 8 상에서 결실되지 않는다. 따라서, 상기 실시양태에 따르면, 파손점은 Ergic2 유전자의 텔로머에 위치하고 (이와 관련하여 텔로머는 텔로머 단부의 방향으로의 하류를 의미함), Ergic2 유전자는 존재한다.
한 실시양태에 따르면, 세포의 게놈은 유전자 FAM60A의 기능적 발현이 감소 또는 제거되도록 변경된다. FAM60A의 기능적 발현은 다양한 수단에 의해, 예를 들어 전사체가 보다 적게 생산되거나 생산되지 않도록 FAM60A 유전자의 프로모터 및/또는 인핸서를 변경함으로써, 또는 유전자 침묵화 기술, 예컨대 전사 또는 전사후 유전자 침묵화에 의해 영향받을 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 단리된 진핵 세포는 FAM60A 유전자의 프로모터 영역 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 프로모터 영역은 기능성이 보다 작은 프로모터 또는 비-기능성 프로모터를 제공하도록 변경될 수 있고, 프로모터는 완전히 제거될 수도 있다. 별법으로 또는 추가로, FAM60A 유전자의 프로모터와 출발 코돈 사이에 정지 코돈을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 부가하여 FAM60A 대신에 다른 폴리펩티드의 발현을 유도하는 것이 가능하다. 각각의 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 따라서 본원에서 상세히 설명할 필요가 없다.
기능성 유전자 발현의 감소는 발현이 심지어 제거되는 수준을 달성할 수 있다. 전사후 유전자 침묵화는 예를 들어 안티센스 분자 또는 RNA 간섭을 매개하는 분자에 의해 달성될 수 있다. 비-제한적인 예를 다음에 간단히 설명한다.
안티센스 폴리뉴클레오티드는 RNA에 특이적으로 결합하여, 역전사 또는 메신저 RNA 번역의 중지와 함께 RNA-DNA 또는 RNA-RNA 혼성체의 형성을 유발하도록 설계될 수 있다. 많은 형태의 안티센스가 개발되었고, 효소-의존적 안티센스 또는 입체 차단 안티센스로 넓게 분류될 수 있다. 효소-의존적 안티센스는 단일 가닥 DNA, RNA, 및 포스포로티오에이트 안티센스를 비롯하여 표적 mRNA를 분해하기 위해 RNase H 활성에 의존하는 형태를 포함한다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 전사된 가닥으로서 안티센스 가닥을 함유하는 안티센스 구축물로부터의 발현에 의해 세포 내에 생성된다. 트랜스-절단 (trans-cleaving) 촉매 RNA (리보자임)는 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 RNA 분자이다. 리보자임은 특정 표적에 대해 특이적으로 설계될 수 있고, 세포 RNA의 배경에서 임의의 RNA 종을 부위-특이적으로 절단하도록 조작될 수 있다. 절단 사건은 mRNA를 불안정하게 만들고, 단백질 발현을 억제한다. 진핵 세포의 게놈은 각각의 안티센스 분자가 예를 들어 영구적으로 발현되도록 변경될 수 있다.
전사후 수준에 대해 유전자 FAM60A의 기능적 발현을 감소시키기 위한 또 다른 적합한 방식은 RNA 간섭 (RNAi)을 기초로 한다. RNAi에 의한 유전자의 침묵화 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 따라서 본원에서 상세히 설명할 필요가 없다. siRNA 화합물의 몇몇 실시양태 및 변형은 관련 기술 분야에 알려져 있고, 유전자 FAM60A의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. RNA 수준에서 표적 유전자의 선택/확인된 표적 서열을 표적화하는 적합한 siRNA는 특정 설계-알고리즘을 적용한 적절한 컴퓨터를 사용한 방법에 의해 확인될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, RNAi 유도 화합물은 진핵 세포 내로 안정적으로 형질감염되고 따라서 진핵 세포의 게놈 내로 통합된 벡터에 의해 발현된다. siRNA에 대해, 이것은 예를 들어 2개의 가닥 사이에 루프를 도입하고, 진핵 세포에서 기능성 siRNA로 처리될 수 있는 단일 전사체를 생산함으로써 수행될 수 있다. 상기 전사 카세트는 일반적으로 대체로 작은 핵 RNA (shRNA)의 전사를 유도하는 RNA 폴리머라제 III 프로모터 (예를 들어 U6 또는 H1)를 이용한다. 이어서, 벡터로부터 생성되는 shRNA 전사체는 다이서 (dicer)에 의해 처리되어, 바람직하게는 특유한 3' 오버행 (overhang)을 갖는 이중 가닥 siRNA 분자를 생산하는 것으로 가정된다. 한 실시양태에 따르면, 상기 shRNA 제공 벡터는 진핵 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 상기 실시양태는, 유전자 FAM60A의 하향조절이 일시적인 것이 아니라 안정적으로 끊임없이 생산된 siRNA에 의한 것이고, 따라서 개선된 발현 안정성을 갖는 포유동물 숙주 세포를 제공하는 것은 실행가능하기 때문에 유리하다. 이어서, 각각의 shRNA 제공 벡터를 포함하는 세포는 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염될 수 있다. 별법으로, 동시-형질감염 전략이 사용될 수 있고, 여기서 shRNA 생성 벡터는 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 함께 동시-형질감염된다.
전사 유전자 침묵화는 예를 들어 후생학적 변형을 포함할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 유전자 FAM60A의 기능적 발현은 후생학적 침묵화에 의해 감소된다. 또한, 유전자 FAM60A의 서열은 FAM60A mRNA의 반감기를 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 이에 의해, 보다 적은 FAM60A 단백질이 얻어지고, 이것은 또한 세포 내의 FAM60A 단백질의 효과 감소를 달성한다.
한 실시양태에 따르면, 유전자 FAM60A의 기능적 발현은 FAM60A 유전자의 발현 조절에 관여하는 조절 요소를 표적화함으로써 감소 또는 제거된다. 예를 들어 전사 인자, 프로모터 (또한 상기 참조), 인핸서, UTR, 또는 다른 조절 요소는 예를 들어 상기 조절 요소를 불활성화하거나 그 활성을 감소시켜 유전자 FAM60A의 기능적 발현을 방지 또는 감소시키고 그에 의해 상기 세포에서 내인성 FAM60A의 효과를 손상시키는 낙아웃, 결실, 하향조절 또는 임의의 다른 변경에 의해 표적화될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 진핵 세포의 게놈은 비-기능성이거나 또는 내인성으로 발현된 FAM60A 단백질보다 기능이 더 낮은 돌연변이체 FAM60A의 이종성 발현에 의해 FAM60A의 효과를 손상시키기 위해 변경된다. 상기 실시양태에서, 단리된 진핵 세포는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드에 추가로 돌연변이체 FAM60A를 코딩하는 추가의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 각각의 비-기능성 또는 기능이 보다 낮은 돌연변이체 FAM60A를 과다발현함으로써, 우성 음성 표현형이 생성될 수 있다. 세포 내의 FAM60A를 손상시켜 그 효과를 감소시키기 위한 추가의 방식은 단백질, 예컨대 세포 내의 FAM60A를 중화하여 FAM60A의 효과를 손상시키는 항체의 이종성 발현이다. 한 실시양태에 따르면, FAM60A의 효과는 FAM60A와 기능적으로 상호작용하는 분자의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해, 예를 들어 SIN3/HDAC 복합체의 하나 이상의 구성원의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 세포 내에서 손상된다. 상기 실시양태는 또한 FAM60A의 효과를 손상시키는데, 이것은 그의 기능적 발현이 감소 또는 제거되기 때문에 FAM60A가 그의 생물학적 효과를 발휘할 수 있기 위해 필요한 FAM60A의 하나 이상의 상호작용 파트너가 기능성 형태로 존재하지 않기 때문이다.
한 실시양태에 따르면, 유전자 FAM60A의 발현은 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 75배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배 또는 적어도 125배, 적어도 250배, 적어도 500배, 적어도 750배, 적어도 1000배, 적어도 1250배, 적어도 1500배, 적어도 1750배, 적어도 2000배, 적어도 2500배, 적어도 3000배 또는 적어도 3500배 감소한다. 발현은 예를 들어 실시간 RT-PCR 또는 다른 민감한 RNA 검출 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 상기 감소는 예를 들어 내인성 유전자 FAM60A의 발현이 감소되지 않은 비변형된 참조 세포와 비교할 때 달성될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 유전자 FAM60A의 발현은 동일한 세포 내의 18S RNA의 발현 (100%로서 설정함)에 비해 0.05% 이하, 0.04% 이하, 0.03% 이하, 0.02% 이하, 0.01% 이하, 0.005% 이하 또는 0.0025% 이하이다. 한 실시양태에 따르면, 유전자 FAM60A의 발현은 동일한 세포 내의 18S RNA의 발현 (100%로서 설정함)에 비해 훨씬 더 낮고, 예컨대 0.001% 이하, 0.0005% 이하 또는 심지어 0.0002% 이하이다.
한 실시양태에 따르면, 바람직하게는 포유동물 세포인 단리된 진핵 세포는 단백질 FAM60A의 효과가 상기 세포 내에서 손상되도록 변경된 진핵 세포의 집단으로부터 유래하고, 상기 세포는 그의 게놈 내로 안정적으로 통합된 관심 생성물을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 평균적으로 상기 집단으로부터 유래하는 세포의 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85% 또는 적어도 90%의 세포는 적어도 8주, 바람직하게는 10주, 보다 바람직하게는 12주의 기간에 걸쳐 30% 초과, 바람직하게는 25%를 초과하는 그의 관심 생성물 발현 역가를 상실하지 않는다. 실시예에 제시되는 바와 같이, 형질감염 및 안정적으로 형질감염된 세포의 확인 후에, 장기 배양 동안 점진적인 생산성 상실을 보이지 않는 세포의 양은 본원에서 설명되는 변경된 세포를 사용할 때 증가하고, 즉, 보다 안정한 세포 클론이 선택된 세포 집단으로부터 얻어진다. 안정성 특성은 상기 집단으로부터 개별 세포를 세포 클론으로서 배양하고, 지시된 기간에 걸쳐 역가를 결정함으로써 시험할 수 있다. 안정성은 예를 들어, 실시예에 설명된 검정을 이용하여 시험할 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 안정성 비율은 발현된 단백질, 및 예를 들어 코돈-최적화 여부에 따라 연구기획마다 다를 수 있다. 그러나, 본 개시내용에 따라 변경된 진핵 세포를 사용하면, 분석된 모든 연구기획에서, 비변형된 야생형 세포에 비해 안정적으로 발현하는 클론의 유의한 증가가 관찰되었다. 관심 생성물을 안정적으로 발현하는 세포 클론의 비율은 특정 연구기획에서 8 내지 12주의 기간의 장기 배양 동안 분석된 클론에서 80% 또는 이보다 훨씬 더 높았다. 따라서, 안정한 발현 특징을 갖는 세포의 풍부도는 성공적으로 형질감염된 숙주 세포의 집단에서 유의하게 증가하였다. 따라서, 장기 배양 동안 생산성을 점진적으로 상실하는 불안정한 클론이 대규모 생산을 위해 선택될 위험은 본 개시내용에 따르면 유의하게 감소한다. 이러한 중요한 이점 때문에, 불안정한 클론을 제거하기 위해 장기 안정성 분석을 유의하게 감소시키거나 심지어 완전히 생략할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 추가로, Bicd1, C12orf35, Amn1, 메틸트랜스퍼라제-유사 단백질 20, Dennd5b, Fam60a, Caprin2, Ipo8, RPS4Y2 및 Tmtc1로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 언급된 유전자의 텔로머에 위치하는 하나 이상의 유전자의 발현 생성물의 효과가 손상된다. 상동체 및 오르톨로그를 비롯하여 상기 언급된 개개의 유전자 및 코딩되는 단백질의 비-제한적인 대체 명칭이 또한 상기 표 1에 표시되고, 각각의 단백질을 코딩하는 각각의 유전자는 개별 유전자 또는 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질에 대해 상기 사용된 용어의 범위에 포함된다. 효과의 손상은 유사하게 예를 들어 각각의 유전자의 기능적 발현을 감소시키거나 제거함으로써 달성될 수 있다. 적합한 기술 및 실시양태는 FAM60A 유전자와 관련하여 상기 설명되어 있고, 임의의 다른 표적 유전자에도 마찬가지로 적용된다. 상기 논의된 바와 같이, 상기 유전자는 차이니즈 햄스터의 염색체 8 및 마우스의 염색체 6의 텔로머 영역에 위치한다. 예를 들어 상기 논의된 바와 같이 염색체 파손에 의해 상기 텔로머 영역의 일부가 결실되면, 결실된 영역은 대체로 하나 이상의 상기 언급된 유전자를 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 단백질 FAM60A의 효과가 손상된 상기 세포에서, 추가로, 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과는 바람직하게는 유전자 C12orf35의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 상기 세포 내에서 손상된다. 추가의 예기치 않은 발견은 예를 들어 상기 내인성 유전자의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 진핵 세포 내의 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과를 손상시키면 관심 재조합 생성물의 발현이 유의하게 증가한다는 것이었다. 따라서, 재조합체 발현에 영향을 미치는 추가의 핵심 유전자가 확인되었다. 진핵 세포 내의 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과 손상은 실시예에서 입증되는 바와 같이 발현 수율을 유의하게 증가시킨다. 따라서, FAM60A 및 C12orf35의 효과 손상은 특히 유리하고, 이것은 발현 안정성 및 수율에 관하여 개선된 특징을 보이고 따라서 관심 재조합 생성물의 생성에 특히 유리한 특성을 보이는 숙주 세포가 제공되기 때문이다. 설명한 바와 같이, 숙주 세포는 바람직하게는 포유동물 세포이다.
C12orf35 유전자는 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 종, 예컨대 인간, 마우스 및 햄스터에서 내인성으로 발현된다. C12orf35 유전자의 발현 생성물은 다소 큰 단백질이다. 서열 목록은 상이한 포유동물 종, 예컨대 햄스터 (서열 10 및 11), 인간 (서열 12 및 13), 마우스 (서열 14), 소 (서열 15) 및 멧돼지 (서열 16)의 내인성 C12orf35 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 예시적인 아미노산 서열 또는 추정 아미노산 서열을 보여준다. 차이니즈 햄스터로부터의 C12orf35의 CDS (코딩 DNA 서열)는 서열 17로서 제시한다. 또한, 차이니즈 햄스터로부터의 C12orf35 mRNA의 5'UTR (서열 18 참조) 및 3'UTR (서열 19 참조)의 절편을 서열결정하였다. 유전자 C12orf35는 또한 햄스터에서 C12orf35like 또는 C12orf35 상동체 또는 마우스에서 2810474O19Rik로서 칭한다. 유전자, 코딩 서열 및 예측된 C12orf35 단백질에 대한 정보는 또한 크리세툴루스 그리세우스에 대해 NCBI에 XM_003512865로 개시되어 있고, 본원에 참고로 포함된다. 인간에서, 이것은 KIAA1551로도 언급된다. 상이한 명칭을 단백질 또는 유전자에 대해 상이한 종에서 지정할 수 있고, 비-제한적인 대체 명칭 (별칭)이 또한 상기 표 1에 제시되어 있다. 따라서, 용어 "C12orf35 유전자"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 특히 서열 10 내지 16에 제시된 하나 이상의 아미노산 서열 또는 서열 17에 의해 코딩되는 단백질에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 공유하는 단백질을 코딩하는 임의의 내인성 유전자를 포함한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 바람직하게는 서열 10 또는 하나 이상의 서열 11 내지 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 서열 17에 의해 코딩되는 단백질과 동일한 기능을 갖는다. 상기 유전자는 비변형된 세포에 의해 발현된 발현 생성물의 기능을 손상시키기 위해 본원에서 설명된 바와 같이 변형될 수 있다. 유전자 C12orf35에 의해 발현된 단백질은 문헌에서 상세하게 설명된 바 없다. 본원에서 사용되는 용어 "C12orf35 단백질" 또는 "내인성 C12orf35 유전자의 발현 생성물" 및 유사한 표현은 특히 서열 10 내지 16에 제시된 하나 이상의 아미노산 서열 또는 서열 17에 의해 코딩되는 단백질에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 공유하는 임의의 단백질을 포함한다. 상동성, 또는 동일성은 참조 단백질의 전체 길이에 걸쳐 계산될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 유전자 C12orf35의 발현은 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 75배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배 또는 적어도 125배, 적어도 250배, 적어도 500배, 적어도 750배, 적어도 1000배, 적어도 1250배, 적어도 1500배, 적어도 1750배 또는 적어도 2000배 감소한다. 이것은 예를 들어 실시간 RT-PCR 또는 다른 민감한 RNA 검출 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 상기 감소는 예를 들어 내인성 유전자 C12orf35의 발현이 감소되지 않은 비변형된 참조 세포와 비교할 때 달성될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 유전자 C12orf35의 발현은 동일한 세포 내의 18S RNA의 발현 (100%로서 설정함)에 비해 0.05% 이하, 0.0475% 이하, 0.045% 이하, 0.0425% 이하, 0.04% 이하, 0.0375% 이하, 0.035% 이하, 0.0325% 이하, 0.03% 이하, 0.0275% 이하, 0.025% 이하, 0.0225% 이하, 0.02% 이하, 0.0175% 이하, 0.015% 이하이다. 한 실시양태에 따르면, 유전자 C12orf35의 발현은 동일한 세포 내의 18S RNA의 발현 (100%로서 설정함)에 비해 훨씬 더 낮고, 예컨대 0.001% 이하, 0.0001% 이하 또는 심지어 0.00001% 이하이다. 상기 변형된 진핵 세포가 관심 생성물을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염되면, 유전자 C12orf35의 기능적 발현이 감소 또는 제거되지 않은 대응하는 세포에 비해 관심 재조합 생성물의 발현을 증가시키도록 유전자 C12orf35의 기능적 발현이 감소된다. 한 실시양태에 따르면, 관심 재조합 생성물의 발현은 유전자 C12orf35의 기능적 발현이 감소 또는 제거되지 않은 대응하는 세포의 발현보다 적어도 1.5배, 적어도 1.75배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 4배 또는 적어도 5배 더 높다. 실시양태에 따르면, 유전자 C12orf35의 발현이 감소 또는 제거되지 않은 대응하는 세포의 발현보다 적어도 8배, 적어도 10배 또는 적어도 15배 더 높은 발현 비율이 얻어진다. 재조합 생성물의 발현 비율은 예를 들어, 실시예에 설명된 검정을 이용하여 시험할 수 있다.
진핵 세포는 정상적으로 FAM60A를 내인성으로 발현하는 세포 종류로부터 유래된다. 그 예를 아래에 설명한다. 상기 설명된 바와 같이 (또한 문헌 [Smith et al., 2012] 참조), FAM60A는 진핵 세포, 예컨대 모든 후생동물, 특히 척추동물에서 내인성으로 발현되지만, 무척추동물 및 모든 포유동물 세포에서도 내인성으로 발현된다. 용어 "단리된"은 진핵 세포가 살아있는 유기체, 예컨대 동물 또는 인간에 함유되지 않음을 분명하게 만들기 위해 사용된다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 세포는 세포 배양액, 세포주, 세포 클론 등으로서 제공될 수 있다. 그 예를 또한 아래에서 설명한다. 상기 설명된 바와 같이, 진핵 세포는 FAM60A를 내인성으로 발현하는 대응하는 비변형 진핵 세포에 비해, 예를 들어 FAM60A의 효과를 감소시키거나 제거함으로써 상기 세포에서 FAM60A의 효과를 손상시키기 위해 변경된다. 손상은 바람직하게는 세포 내의 유전자 FAM60A의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 달성된다. 비-제한적인 실시양태가 상기 설명되어 있다. 일정한, 따라서 예측가능한 안정성 특징을 갖는 생산 세포주를 제공하기 위해, 진핵 세포의 게놈은 상기 결과를 달성하도록 변경된다. 적합한 실시양태가 상기 설명되어 있다. 각각 변경된 진핵 세포는 이어서 게놈 내로 통합된 관심 생성물을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 측면에 따른 진핵 세포를 제공하기 위해 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 안정적으로 형질감염될 수 있다. 진핵 세포는 바람직하게는 척추동물 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포이다. 따라서, 진핵 세포에 대해 본원에서 설명되는 모든 실시양태는 일반적으로 포유동물 세포가 사용되는 바람직한 실시양태에 적용된다. 진핵 세포는 예를 들어 설치류 세포, 인간 세포 및 원숭이 세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 포유동물 세포는 설치류 세포, 예를 들어 햄스터 또는 마우스로부터 유래된 세포이다. 이들은 차이니즈 햄스터 세포, 예컨대 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, C127 세포, 마우스 3T3 섬유모세포 세포, 및 SP2/0 세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 세포는 CHO 세포, 예를 들어 CHO 세포, 예컨대 CHO-K1, CHO-S, CHO-K1SV, CHO-SSF3, CHO-DG44, CHO-DUXB11, 또는 이로부터 유래된 세포주이다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, CHO 세포에서 유전자 FAM60A의 낙아웃은 장기 안정성 특징을 갖는 안정적으로 형질감염된 세포의 풍부도가 증가한 CHO 세포의 집단을 제공한다. FAM60A 유전자는 또한 인간 세포에서 발현된다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 포유동물 세포는 예를 들어 HEK293 세포, MCF-7 세포, PerC6 세포, CAP 세포, 조혈 세포 및 HeLa 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 인간 세포로부터 유래된다. 또 다른 대안은 예를 들어 COS 세포, COS-1, COS-7 세포 및 Vero 세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있는 원숭이 세포이다. 한 실시양태에 따르면, 바람직하게는 포유동물 세포인 진핵 세포는 세포 클론 또는 세포주로서 제공된다.
FAM60A의 효과가 진핵 세포 내에서 손상되도록 게놈이 변경되고 상기 세포로부터 발현된, 특히 분비된 관심 생성물을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드, 선택가능 마커를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드 및/또는 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 진핵 세포는 본 개시내용에 따른 진핵 세포를 제조하기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 각각의 "빈 (empty)" 변경된 진핵 세포는 예를 들어 재조합 생산 기술을 위한 클로닝 세포주로서 사용될 수 있다. 각각의 세포는 예를 들어 적절한 발현 벡터를 사용하여 관심 생성물을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드로 안정적으로 형질감염될 수 있다. FAM60A의 효과가 손상되고 재조합 생성물을 아직 발현하지 않고 특히 재조합 생성물을 분비하지 않는 상기 "빈" 진핵 세포는 따라서 재조합 방식으로 생산될 목적하는 관심 생성물에 따라 상이한 발현 벡터로 형질감염될 수 있다. 따라서, 상기 진핵 세포주는 상이한 연구기획을 위해, 즉, 상이한 관심 생성물, 특히 상이한 분비된 관심 폴리펩티드의 생산을 위해 사용될 수 있다.
제1 측면에 따른 진핵 세포는 그의 게놈 내로 안정적으로 통합된 관심 생성물을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 관심 생성물은 진핵 세포에 의해 다량 발현될 재조합 생성물이다. 바람직하게는, 관심 생성물은 폴리펩티드이다. 바람직한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드는 세포에 의해 분비된다. 진핵 세포는 선택가능 마커를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드 및/또는 리포터를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 성공적으로 형질감염되고 따라서 관심 생성물을 발현하는 숙주 세포의 선택을 단순화한다. 또한, 진핵 세포는 상이한 선택가능 마커 및/또는 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 몇몇의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
"이종성 폴리뉴클레오티드" 또는 "이종성 핵산" 및 본원에서 사용되는 유사한 표현은 특히 예를 들어 재조합 기술, 예컨대 형질감염을 사용하여 진핵 세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. "폴리뉴클레오티드"는 특히 대체로 하나의 데옥시리보스 또는 리보스로부터 또 다른 데옥시리보스 또는 리보스에 연결된 뉴클레오티드의 중합체를 의미하고, 문맥에 따라 DNA 및 RNA를 나타낸다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 크기 제한을 포함하지 않는다.
발현 벡터가 이종성 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트 내에 포함될 수 있다. 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들) 및 선택가능 마커 또는 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)은 동일한 또는 상이한 발현 벡터에 위치할 수 있다. 진핵 세포 내로의 도입은 예를 들어 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적합한 발현 벡터를 숙주 세포 내로 형질감염시킴으로써 달성될 수 있다. 발현 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다 (안정한 형질감염). 실시예에 제시되는 바와 같이, 본원에 설명된 신규한 진핵 세포는 장기간 안정성을 갖는 클론의 수가 증가하기 때문에 안정한 형질감염을 위해 유리하다. 안정한 형질감염은 또한 관심 생성물, 예컨대 관심 폴리펩티드를 산업 규모로 생산하기 위한 고발현 세포 클론의 생성을 위한 표준이다. 이것은 치료적 또는 진단적 관심 폴리펩티드에 특히 중요하다. 이종성 핵산, 예컨대 발현 벡터를 진핵, 예컨대 포유동물 숙주 세포 내로 도입하기 위한 몇몇의 적절한 방법이 관련 기술 분야에 알려져 있고, 따라서 본원에서 상세히 설명할 필요가 없다. 각각의 방법은 인산칼슘 형질감염, 전기천공, 리포펙션 (lipofection), 비올리스틱 (biolistic)- 및 중합체-매개 유전자 전달 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 전통적인 무작위 통합 기반 방법 이외에, 재조합 매개 방법이 또한 이종성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 게놈 내로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 각각의 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있기 때문에, 본원에서 상세히 설명할 필요가 없다. 적합한 벡터 설계의 비-제한적인 실시양태를 또한 후속적으로 설명하고, 각각의 개시내용을 참고한다.
재조합 생성물의 발현을 달성하기 위해 사용되는 발현 벡터는 대체로 전사 유도에 적합한 전사 제어 요소, 예를 들어 대체로 발현 카세트의 요소로서 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 중지 또는 종결 신호를 포함한다. 목적하는 생성물이 폴리펩티드이면, 적합한 번역 제어 요소, 예를 들어 리보솜 동원에 적합한 5' 캡 (cap) 구조를 유도하는 5' 비번역 영역 및 번역 과정을 종결시키는 정지 코돈이 바람직하게는 벡터 내에 포함된다. 생성되는 전사체는 단백질 발현 (즉, 번역) 및 적절한 번역 종결을 용이하게 하는 기능성 번역 요소를 보유한다. 통합된 폴리뉴클레오티드의 발현을 적절하게 유도하는 기능적 발현 단위는 또한 "발현 카세트"로서 칭한다. 진핵 세포, 예컨대 바람직하게는 포유동물 세포에서 발현을 허용하기 위해 발현 카세트를 설계하는 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
본원에 설명된 바와 같이 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들) 및 선택가능 마커(들) 및/또는 리포터 폴리펩티드(들)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 발현 카세트 내에 포함된다. 몇몇의 실시양태가 적합하다. 예를 들어, 각각의 상기 폴리뉴클레오티드(들)은 별개의 발현 카세트 내에 포함될 수 있다. 이것은 또한 단일 시스트론 (monocistronic) 설정으로 언급된다. 또한, 적어도 2개의 각각의 폴리뉴클레오티드가 하나의 발현 카세트 내에 포함되는 것도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 한 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 내부 리보솜 도입 부위 (IRES) 요소는 동일한 발현 카세트로부터 발현되는 폴리뉴클레오티드들 사이에 기능적으로 위치한다. 이에 의해, 별개의 번역 생성물이 상기 전사체로부터 얻어지는 것이 보장된다. 각각의 IRES 기반 발현 기술 및 다른 이중- 및 다중 시스트론 시스템은 잘 알려져 있고, 따라서 본원에서 상세히 설명할 필요가 없다.
설명된 바와 같이, 발현 벡터는 발현 카세트의 요소로서 적어도 하나의 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서 요소를 포함할 수 있다. 프로모터는 2개의 클래스, 즉 구성적으로 기능하는 것 및 유도 또는 탈억제에 의해 조절되는 것으로 나눌 수 있다. 둘 모두 적합하다. 많은 세포 종류에서 발현을 유도하는 강력한 구성적 프로모터는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 최조기 (immediate early) 프로모터, SV40 및 라우스 육종 (Rous Sarcoma) 바이러스 프로모터, 및 뮤린 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터, EF1a를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 프로모터 및/또는 인핸서는 CMV 및/또는 SV40로부터 얻는다. 전사 프로모터는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, EF1알파 프로모터, RSV 프로모터, BROAD3 프로모터, 뮤린 로사 26 프로모터, pCEFL 프로모터 및 β-액틴 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 바람직하게는 포유동물 세포인 진핵 세포에서 관심 생성물의 발현을 유도할 경우 다른 프로모터도 사용될 수 있다.
또한, 발현 카세트는 적어도 하나의 인트론을 포함할 수 있다. 대체로, 인트론은 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)의 5' 말단에 위치하지만, 3' 말단에도 위치할 수 있다. 상기 인트론은 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서 요소(들)와 발현되는 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임의 5' 말단 사이에 위치할 수 있다. 본 개시내용과 관련하여 사용될 수 있는 몇몇의 적합한 인트론은 관련 기술 분야에 알려져 있다.
관심 생성물은 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 유전적 정보의 전사, 번역 또는 임의의 다른 발현 사건에 의해 생산될 수 있는 임의의 생물학적 생성물일 수 있다. 관심 생성물은 폴리펩티드 및 핵산, 특히 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 생성물은 제약 또는 치료 활성 화합물, 또는 검정에 이용되는 연구 도구 등일 수 있다. 바람직하게는, 관심 생성물은 폴리펩티드이다. 임의의 관심 폴리펩티드는 본 발명의 방법을 사용하여 발현될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 의미한다. 폴리펩티드는 단백질 (예를 들어, 50개 초과의 아미노산을 갖는) 및 펩티드 (예를 들어 2 - 49개 아미노산)를 비롯하여 임의의 길이의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 임의의 활성, 기능 또는 크기의 단백질 및/또는 펩티드를 포함하고, 예를 들어 효소 (예를 들어 프로테아제, 키나제, 포스파타제), 수용체, 수송체, 살균 및/또는 엔도독소-결합 단백질, 구조 폴리펩티드, 막-결합된 폴리펩티드, 당단백질, 구형 단백질, 면역 폴리펩티드, 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 혈액 인자, 백신 등을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 펩티드 호르몬, 인터류킨, 조직 플라스미노겐 활성화인자, 시토카인, 이뮤노글로불린, 특히 항체 또는 그의 기능성 항체 단편 또는 변이체 및 Fc-융합 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 본원에서 설명된 개시내용에 따라 발현되는 관심 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드의 하위단위 또는 도메인, 예를 들어 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체일 수 있다. 용어 "관심 생성물" 또는 "관심 폴리펩티드"는 문맥에 따라 상기 개개의 하위단위 또는 도메인 또는 각각의 하위단위 또는 도메인으로 이루어진 최종 단백질을 나타낼 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 분자, 보다 바람직하게는 항체, 또는 그의 하위단위 또는 도메인, 예를 들어 항체의 중쇄 또는 경쇄이다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 특히 디술피드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 단백질을 나타낸다. 용어 "항체"는 천연적으로 생성되는 항체 및 모든 재조합 형태의 항체, 예를 들어, 인간화 항체, 완전 인간 항체 및 키메라 (chimeric) 항체를 포함한다. 각각의 중쇄는 대체로 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역 (CH)으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 대체로 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 이루어진다. 그러나, 용어 "항체"는 또한 다른 종류의 항체, 예컨대 단일 도메인 항체, 중쇄 항체, 즉 하나 이상, 특히 2개의 중쇄만으로 이루어진 항체, 및 나노바디 (nanobody), 즉, 단일 단량체 가변 도메인만으로 이루어진 항체를 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 관심 폴리펩티드로서 항체의 하나 이상의 하위단위 또는 도메인, 예를 들어 중쇄 또는 경쇄 또는 그의 기능적 단편 또는 그의 유도체를 코딩할 수 있다. 상기 하위단위 또는 도메인은 동일한 또는 상이한 발현 카세트로부터 발현될 수 있다. 항체의 "기능적 단편 또는 유도체"는 특히 항체로부터 유래되고 항체와 동일한 항원, 특히 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 나타낸다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편 또는 그의 유도체에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 단편 또는 유도체의 예는 다음을 포함한다: (i) 각각의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 제1 불변 도메인으로 이루어지는 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; (iii) 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 도메인 CH1로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 Fv 단편; (v) 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어지는 Fv 단편인 scFv 단편; (vi) 함께 공유 연결된 2개의 Fv 단편으로 이루어지는 (Fv)2 단편; (vii) 중쇄 가변 도메인; 및 (viii) 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 회합이 분자 내가 아니라 분자 사이에서만 발생할 수 있도록 하는 방식으로 함께 공유 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 멀티바디 (multibody). 한 실시양태에 따르면, 진핵 세포는 관심 폴리펩티드를 세포 배양 배지 내로 분비한다. 한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드는 SIN3A가 아니거나 이를 포함하지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드는 FAM60A가 아니거나 이를 포함하지 않는다.
진핵 세포는 각각 동일한 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대응하는 내인성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 진핵 세포는 관심 생성물에 대응하는 내인성 유전자를 포함하지 않는다.
실시양태에서 설명되는 바와 같이, 진핵 세포는 관심 생성물을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드 이외에 선택가능 마커를 코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드 및/또는 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"선택가능 마커"는 적절한 선택 배양 조건 하에 상기 선택가능 마커를 발현하는 숙주 세포의 선택을 허용한다. 선택가능 마커는 선택 조건 하에서 상기 마커의 운반체에게 생존 및/또는 성장 이점을 제공한다. 이에 의해, 발현 벡터로 성공적으로 형질감염된 숙주 세포는 적절한 선택 조건 하에서 선택될 수 있다. 일반적으로, 선택가능 마커 유전자는 선택제, 예컨대 약물, 예를 들어 항생제 또는 다른 독성제에 대한 내성을 부여하거나, 또는 숙주 세포에서 대사 또는 이화 결함을 보충할 것이다. 이것은 양성 또는 음성 선택 마커일 수 있다. 성공적으로 형질감염된 숙주 세포를 선택하기 위해, 배양 배지는 사용되는 선택가능 마커의 선택을 허용하는 선택제를 포함하는 숙주 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 선택 마커는 숙주 세포가 선택 마커가 결여된 숙주 세포의 생존 및/또는 증식에 필수적인 화합물의 부재 또는 감소 하에서 생존 및 증식할 수 있도록 만든다. 필수적인 화합물을 숙주 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 충분히 높은 농도로 포함하지 않거나 또는 감소된 양의 상기 필수적인 화합물을 포함하는 배지에서 숙주 세포를 배양함으로써, 선택 마커를 발현하는 숙주 세포만 생존 및/또는 증식할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 선택가능 마커는 해당 약물을 수반하는 선택 조건에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 약물 내성 마커이다. 다양한 선택가능 마커 유전자가 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, WO 92/08796, WO 94/28143, WO2004/081167, WO2009/080759, WO2010/097240 참조). 예를 들어, 하나 이상의 항생제에 대한 내성을 부여하는 적어도 하나의 선택가능 마커가 사용될 수 있다. 선택가능 마커는 한 실시양태에 따르면 증폭가능한 선택가능 마커일 수 있다. 증폭가능한 선택가능 마커는 벡터 함유 숙주 세포의 선택을 허용하고, 숙주 세포에서 상기 벡터의 유전자 증폭을 촉진할 수 있다. 진핵 세포, 예컨대 특히 포유동물 세포에 통상 사용되는 선택가능 마커 유전자는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 (APH), 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hyg), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 티미딘 키나제 (tk), 글루타민 합성효소, 아스파라긴 합성효소에 대한 유전자, 및 네오마이신 (G418), 푸로마이신, 히그로마이신, 제오신, 와바인 (ouabain), 블라스티시딘, 히스티디놀 D, 블레오마이신, 플레오마이신 및 미코페놀산에 대한 내성을 코딩하는 유전자를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 엽산염 수용체는 본원에 설명된 신규한, 바람직하게는 포유동물 세포인 진핵 세포와 함께 선택가능 마커로서 사용된다 (예를 들어 WO2009/080759 참조). 한 실시양태에 따르면, 엽산염 흡수에 의존적인 진핵 세포는 선택가능 마커로서 엽산염 수용체를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하고/하거나 선택가능 마커로서 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 실시양태를 또한 제2 측면에 따른 선택 방법과 관련하여 아래에서 상세히 설명할 것이다. 진핵 세포는 내인성으로 DHFR 및 엽산염 수용체를 발현할 수 있다.
"리포터 폴리펩티드"는 보고 특징 (예를 들어 형광)을 기초로 하여 상기 리포터 폴리펩티드를 발현하는 세포의 확인을 허용한다. 리포터 유전자는 대체로 숙주 세포에게 생존 이점을 제공하지 않는다. 그러나, 리포터 폴리펩티드의 발현은 리포터 폴리펩티드를 발현하는 세포와 발현하지 않는 세포를 구별하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 리포터 유전자는 또한 성공적으로 형질감염된 숙주 세포를 선택할 수 있게 한다. 적합한 리포터 폴리펩티드는 예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP), YFP, CFP 및 루시페라제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 리포터 폴리펩티드는 유동 세포 측정에 의한 선택을 가능하게 하는 특징을 갖는다.
설명된 바와 같이, 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 또한 1개 초과의 선택가능 마커 및/또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 선택가능 마커(들)을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 리포터 폴리펩티드(들)을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가, 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 함께 동시-형질감염되는 하나 이상의 상이한 발현 벡터에 또한 제공될 수 있다. 유사하게 상기 동시-형질감염 전략을 통해 관련 기술 분야에 잘 알려진 선택을 실시할 수 있다.
진핵 세포 내에 포함된 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합은 추가의 벡터 요소를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 관심 생성물을 코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 상기 설명된 바와 같이 및 본 개시내용에 따라 발현될 수 있는 폴리펩티드의 상기 설명된 예로부터 분명해지는 바와 같이, 숙주 세포에 의해 생산되고 바람직하게는 분비되는 최종 폴리펩티드는 또한 몇몇의 개개의 하위단위 또는 도메인으로 이루어진 단백질일 수 있다. 각각의 단백질의 바람직한 예는 이뮤노글로불린 분자, 특히 예를 들어 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체이다. 상이한 개별적인 하위단위 또는 도메인으로 이루어진 각각의 단백질을 생산하기 위한 여러 방법이 존재하고, 적절한 벡터 설계가 관련 기술 분야에 알려져 있다. 한 실시양태에 따르면, 상기 단백질의 2개 이상의 하위단위 또는 도메인은 한 발현 카세트로부터 발현된다. 상기 실시양태에서, 하나의 긴 전사체는 단백질의 개별적인 하위단위 또는 도메인의 코딩 영역을 포함하는 각각의 발현 카세트로부터 얻는다. 한 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 IRES 요소 (내부 리보솜 도입 부위)는 개별적인 하위단위 또는 도메인의 코딩 영역들 사이에 기능적으로 위치하고, 각각의 코딩 영역 앞에 분비 리더 서열이 존재한다. 이에 의해, 별개의 번역 생성물이 상기 전사체로부터 얻어지고 최종 단백질이 제대로 조립되고 분비될 수 있도록 보장된다. 각각의 기술은 선행 기술에 알려져 있고, 따라서 본원에서 상세한 설명을 할 필요가 없다.
일부의 실시양태, 예컨대 항체의 발현에서, 상이한 발현 카세트로부터 개별적인 하위단위 또는 도메인을 발현시키는 것이 훨씬 바람직하다. 한 실시양태에 따르면, 관심 생성물의 발현을 위해 사용되는 발현 카세트는 단일 시스트론 발현 카세트이다. 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합물에 포함되는 모든 발현 카세트는 단일 시스트론일 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 따라서, 관심 생성물의 발현을 위해 설계된 각각의 발현 카세트는 관심 폴리펩티드로서 발현되는 단백질의 하나의 하위단위 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 항체의 경우에, 하나의 발현 카세트는 항체의 경쇄를 코딩하고, 또 다른 발현 카세트는 항체의 중쇄를 코딩할 수 있다. 개별적인 발현 카세트로부터 개별적인 하위단위/도메인의 발현 후에, 최종 단백질, 예컨대 항체는 상기 하위단위 또는 도메인으로부터 조립되고, 숙주 세포로부터 분비된다. 상기 실시양태는 이뮤노글로불린 분자, 예컨대 항체의 발현에 특히 적합하다. 이 경우에, 관심 생성물을 코딩하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하고, 관심 생성물을 코딩하는 제2 이종성 폴리뉴클레오티드는 이뮤노글로불린 분자의 다른 사슬을 코딩한다. 한 실시양태에 따르면, 포유동물 숙주 세포의 형질감염을 위해 사용되는 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물은 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트, 및 이뮤노글로불린 분자의 경쇄 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 동일한 발현 벡터에 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물이 사용되는 경우에 상이한 발현 벡터에 위치할 수 있다. 형질감염된 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현시에, 기능적 이뮤노글로불린 분자가 얻어지고, 바람직하게는 숙주 세포로부터 분비된다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 바람직하게는 FAM60A 유전자의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 FAM60A의 효과가 숙주 세포 내에서 손상되도록 숙주 세포의 게놈이 변경된 본원에서 설명되는 신규한 세포 및 세포주를 사용하는 것은 그의 개선된 안정성 특징 때문에 단백질을 발현하기 위해 특히 적합하다. 또한, 특히 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과가 추가로 손상된 실시양태에서, 발현 수율이 또한 유의하게 증가한다. 따라서, 본원에 설명된 신규한 진핵 세포주는 도메인의 몇몇의 하위단위로 이루어진 단백질, 예를 들어 항체를 포함하는 폴리펩티드의 재조합 발현을 위해 사용될 때 특정 이점을 갖는다. 추가의 이점이 또한 실시예와 관련하여 설명된다.
B. 선택 방법
제2 측면에 따르면,
(a) 숙주 세포로서 제1 측면에 따른 진핵 세포를 제공하고;
(b) 관심 생성물을 발현하는 하나 이상의 숙주 세포를 선택하는 것
을 포함하는, 관심 생성물을 재조합 방식으로 발현하는 숙주 세포의 선택 방법이 제공된다.
적합한 및 바람직한 실시양태를 비롯하여 제1 측면에 따른 진핵 숙주 세포, 및 그의 이점은 상기 상세히 설명되어 있고, 또한 여기에서 적용되는 각각의 개시내용을 참고한다. 설명된 바와 같이, 척추동물 세포, 특히 포유동물 세포가 숙주 세포로서 바람직하게 사용된다. 진핵 세포의 유리한 특성은 예를 들어 적합한 생산 클론의 선택 및 따라서 확인을 단순화한다. 또한, 형질감염된 세포 집단에서 유리한 안정성 특징을 갖는 세포의 비율은 본원에서 설명되는 진핵 세포를 사용할 때 유의하게 증가하기 때문에, 적합한 안정한 생산 클론을 확인하기 위해 그의 생산 특징에 대해 보다 적은 클론이 분석되고 스크리닝될 수 있다. 이것은 시간을 절약하고, 또한 보다 많은 연구기획을 동시에 수행할 수 있도록 한다. 또한, 실시예에서 입증되는 바와 같이, 실시양태에서, 유리한 특징을 갖는 고발현 세포의 수 또는 비율은 안정한 형질감염 및 선택 단계 후에 증가한다. 상기 발현 세포 (또한 세포 풀로 불림)는 유의한 양의 관심 생성물을 생산한다. 따라서, 고발현 세포를 포함하는 상기 세포 풀은 예를 들어 단기간 내에 관심 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 관심 생성물은 각각의 세포 내에서 신속하게 생산될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 제2 측면에 따른 선택 방법의 단계 (a)는 단백질 FAM60A의 효과가 진핵 세포 내에서 손상되도록 세포 내의 게놈이 변경된 진핵 세포를 관심 생성물을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드로 형질감염시켜, 게놈 내로 안정적으로 통합된 관심 생성물을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 각각의 진핵 세포를 제공하는 것을 포함한다. 설명된 바와 같이, 포유동물 세포가 진핵 숙주 세포로서 바람직하게는 사용된다. 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내에 포함될 수 있고, 이 벡터는 이어서 진핵 세포 내로 형질감염된다.
선택 단계 (b)는 관심 생성물을 고수율로 발현하는 숙주 세포를 선택하고 따라서 확인하기 위한 몇몇 선택 단계를 포함하는 다단계 선택 과정일 수 있다. 예를 들어, 단계 (b)는 성공적으로 형질감염된 세포를 확인하기 위한 하나 이상의 선택 단계 및 성공적으로 형질감염된 세포의 풀로부터 고발현 세포를 선택하기 위한 하나 이상의 후속적인 선택 단계를 포함할 수 있다. 적절한 선택 전략은 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위해 사용되는 발현 벡터의 설계에 의존하고, 특히 사용된 선택 마커(들) 및/또는 리포터(들)에 의존한다. 비-제한적인 실시양태를 다음에 설명할 것이다.
상기 논의된 바와 같이, 진핵 숙주 세포는 선택가능 마커를 코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 선택가능 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 또는 상이한 동시-형질감염된 발현 벡터를 사용하여 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 함께 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이어서, 단계 (b)는 예를 들어 적절한 선택 배지를 사용하여 성공적으로 형질감염된 숙주 세포를 확인하기 위해 숙주 세포에 선택 압력을 제공하는 조건 하에서 상기 다수의 숙주 세포를 배양하는 것으로 포함한다. 본원에서 사용되는, "선택 배지"는 특히 선택가능 마커를 발현하는 숙주 세포의 선택에 유용한 세포 배양 배지를 의미한다. 이것은 예를 들어 성공적으로 형질감염된 숙주 세포의 확인을 허용하는 선택제, 예컨대 독성 약물을 포함할 수 있다. 별법으로, 필수적인 화합물은 존재하지 않을 수 있거나 또는 그의 농도는 선택 배지에서 감소될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 성공적으로 형질감염되지 않고 따라서 선택 마커(들)을 발현하지 않거나 또는 발현이 낮은 숙주 세포는 선택 배양 조건 하에 증식할 수 없거나 죽는다. 이와 대조적으로, 발현 벡터(들)로 성공적으로 형질감염되고 선택 마커(들) (따라서 동시 도입된 관심 생성물)을 충분한 수율로 발현하는 숙주 세포는 선택 압력에 내성이거나 영향을 덜 받고, 따라서 증식할 수 있고, 이에 의해 성공적으로 형질감염되지 않거나 또는 세포의 게놈 내의 통합 부위가 유리하지 않은 숙주 세포보다 빨리 성장할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 선택가능 마커는 항생제 내성 마커, 약물 내성 마커 및 대사 마커로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 선택가능 마커의 적합한 예 및 선택 원리는 제1 측면과 관련하여 상기 설명되고, 개개의 선택가능 마커에 대한 적절한 선택 조건은 또한 통상의 기술자에게 알려져 있다. 비-제한적인, 그러나 유리한 실시양태를 후속적으로 간단하게 설명할 것이다.
실시예에서 제시되는 바와 같이, 본원에서 설명되는 신규한 진핵 세포, 예컨대 특히 유전자 FAM60A 및 따라서 또한 유전자 C12orf35를 포함하는 염색체 8의 텔로머 영역에서 결실을 포함하는 CHO 세포주의 한 이점은 이미 하나의 표준 선택 단계, 예를 들어 G418/neo 선택 후에, 안정한 특징을 갖는 고생산 세포의 비율이 유의하게 증가한다는 점이다. 예를 들어, 각각 변경되지 않은 정상 CHO 세포주를 형질감염시킬 때, 종종 G418/neo 선택에서 생존하는 60% 또는 심지어 80%까지의 세포는 비-생산자이다. 비-또는 저 생산자의 수는 본 개시내용에 따른 신규한 세포주를 사용할 때 유의하게 감소한다. 이것은 단지 하나의 선택가능 마커, 따라서 단지 하나의 선택 단계, 예를 들어 필요한 경우 G418/neo 선택을 사용함으로써 단계 (b)에서 선택을 효율적으로 수행할 수 있도록 허용한다. 이것은 선택의 속도를 증가시키고, 따라서, 관심 생성물을 발현하는 안정적으로 형질감염된 세포를 얻기 위해 필요한 시간을 단축한다. 또한, 높고 안정한 생산자의 수가 증가하기 때문에, 심지어 고 생산 세포에 대한 특이적 선택의 부재 하에서도, 클론 유사 성능을 갖는 세포 집단이 매우 짧은 시간 내에 생산될 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 관심 생성물은 상기 풀로부터도 제조될 수 있다. 따라서, 예를 들어 단지 일정량의 단백질이 급히 필요한 용도를 위해, 예를 들어 연구 또는 시험 목적을 위해, 우수한 생산 세포 또는 생산 세포 풀을 신속하게 제공하는 상기 신속한 선택 시스템은 매우 유리하다.
그러나, 생산성을 추가로 증가시키는 것이 요구될 경우, 단계 (b)의 다단계 선택이 바람직하다. 이것은 관심 생성물을 대규모, 특히 산업 규모로 생산하기 위해 클론 세포주를 확립하는 것이 의도될 때 특히 그러하다.
상기 논의된 바와 같이, 본원에서 설명되는 세포 내로 도입되는 발현 벡터 또는 발현 벡터들은 2 이상의 선택가능 마커 유전자를 포함할 수 있고, 상이한 선택가능 마커의 선택은 발현 벡터(들)로 성공적으로 형질감염되고 관심 생성물을 고수율로 발현하는 숙주 세포를 선택하기 위해 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 배양을 위해 사용되는 선택 배지는 사용되는 모든 선택가능 마커에 대한 선택제를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 배양은 사용되는 선택가능 마커 유전자의 하나 또는 하위세트의 선택제(들)만을 포함하는 선택 배지를 사용하여 먼저 수행한 후, 나머지 선택가능 마커 유전자에 대한 하나 이상의 선택제를 첨가하여 수행할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 벡터(들)의 선택가능 마커 유전자의 하나 또는 하위세트의 선택제(들)만을 포함하는 제1 선택 배지를 사용하여 숙주 세포를 배양한 후, 나머지 선택가능 마커 유전자에 대한 하나 이상의 선택제(들)을 포함하는 제2 선택 배지를 사용하여 배양한다. 한 실시양태에 따르면, 제2 선택 배지는 제1 선택 배지에 사용된 선택제(들)을 포함하지 않는다.
한 실시양태에 따르면, 단계 (a)에서 제공되는 진핵 세포는 선택가능 마커로서 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 단계 (b)는 DHFR에 대한 선택 단계를 수행하는 것을 포함한다. 각각의 선택 단계는 대체로 DHFR 억제제를 포함하는 선택 배지를 수반한다. 선택가능 마커로서 사용될 수 있는 몇몇의 적합한 DHFR 효소 및 따라서 DHFR 유전자는 관련 기술 분야에 알려져 있다. 용어 DHFR은 야생형 DHFR 및 상응하는 야생형 DHFR 효소의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 서열 교환 (예를 들어 결실, 치환 또는 부가)을 갖는 DHFR 효소, DHFR 효소를 포함하는 융합 단백질 및 추가의 구조 및/또는 기능을 제공하기 위해 변형된 DHFR 효소, 및 DHFR 효소의 적어도 하나의 기능을 계속 갖는 이들의 기능적 단편을 의미한다. 상기 실시양태는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있고, 따라서, 상세하게 설명할 필요가 없다. 예를 들어, DHFR 효소는 엽산염 길항제, 예컨대 MTX에 대해 야생형 DHFR 효소 및/또는 발현될 경우 숙주 세포에 의해 내인성으로 발현된 DHFR 효소보다 더 또는 덜 감수성인 선택가능 마커로서 사용될 수 있다. 각각의 DHFR 효소는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 EP 0 246 049 및 다른 문헌에 기재되어 있다. DHFR 효소는 본 발명에서 기능성이라면, 즉, 이용되는 포유동물 숙주 세포에 적합하다면 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, MTX에 대해 큰 내성을 갖는 돌연변이체 마우스 DHFR은 진핵 세포에서 우세한 선택가능 마커로서 광범하게 사용되고 있다. DHFR 효소는 DHFR+ (플러스) 숙주 세포 및 따라서 기능성 내인성 DHFR 유전자를 포함하는 숙주 세포에서 내인성으로 발현된 DHFR 효소보다 DHFR 억제제, 예컨대 MTX에 덜 감수성인 선택가능 마커로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 인트론 또는 그의 단편은 DHFR 유전자의 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에 위치한다. DHFR 발현 카세트에 사용되는 인트론은 DHFR 유전자의 더 작은 비-기능적 변이체를 유발한다 (Grillari et al., 2001, J. Biotechnol. 87, 59-65). 이에 의해, DHFR 유전자의 발현 수준은 저하되고, 이것은 선택 엄격도를 추가로 증가시킨다. DHFR 유전자의 발현 수준을 감소시키기 위해 인트론을 이용하는 다른 방법이 EPO 724 639에 기재되어 있고, 역시 이용될 수 있다.
"DHFR 억제제"는 특히 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)의 활성을 억제하는 화합물을 의미한다. 각각의 억제제는 예를 들어 DHFR에 결합하기 위해 DHFR 기질과 경쟁할 수 있다. 적합한 DHFR 억제제는 예를 들어 엽산염 길항제, 예컨대 메토트렉세이트 (MTX)이다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 단계 (b)는 적어도 하나의 DHFR 억제제, 예컨대 바람직하게는 엽산염 길항제를 포함하는 선택 배양 배지에서 상기 다수의 숙주 세포를 배양함으로써 DHFR에 대한 선택 단계를 수행하는 것을 포함한다. 각각의 선택 조건은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 한 실시양태에 따르면, 엽산염 길항제를 1500 nM 이하, 1250 nM 이하, 1000 nM 이하, 750 nM 이하, 500 nM 이하, 250 nM 이하, 200 nM 이하, 150 nM 이하, 125 nM 이하, 100 nM 이하 또는 75 nM 이하의 농도로 포함하는 선택 배양 배지가 단계 (b)에서 사용된다. 선택 배양 배지 내의 상기 억제제의 사용된 농도 (또한 점진적으로 증가될 수 있음)가 선택 조건의 엄격성을 결정한다. 엽산염 길항제의 바람직한 농도 범위는 500 nM - 0.1 nM, 350 nM - 1 nM, 200 nM - 2.5 nM, 150 nM - 5 nM, 100 nM - 7.5 nM 및 75 nM - 10 nM로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 선택 배양 배지는 MTX를 엽산염 길항제로서 포함한다. 낮은 MTX 농도는 특히 선택이 제한된 농도의 엽산염과 조합하여 수행될 경우, DHFR 선택을 수행하기 위해 본원에서 설명되는 신규한 진핵 세포와 함께 사용될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 단계 (a)에서 제공되는 본 개시내용에 따른 숙주 세포는 선택가능 마커로서 엽산염 수송체를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 엽산염 수송체 기반 선택 시스템은 엽산염 흡수에 의존하는 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포와 함께 사용될 때 몇몇 이점을 갖는다. 엽산염 수송체는 적어도 하나의 엽산염을 배양 배지로부터, 바람직하게는 포유동물 세포인 숙주 세포 내로 도입하는 것을 허용한다. 한 실시양태에 따르면, 엽산염 수송체는 환원된 엽산염 수송체 (RFC)이거나 이를 포함한다. RFC는 환원된 엽산염, 예컨대 5-메틸-THF 및 5-포르밀-THF를 세포 내로 흡수시키기 위한 주요 운반체로서 기능하는 도처에서 발현된 막 당단백질이다. 그러나, RFC는 산화된 엽산염인 엽산(folic acid)에 대한 매우 불량한 친화도를 보인다. 따라서, RFC의 발현이 결여되거나 게놈 RFC 유전자좌로부터 결실된 세포는 환원된 엽산염, 예컨대 5-포르밀-THF가 성장 배지로부터 점진적으로 고갈되는 조건 하에서 선택가능 마커 유전자 RFC의 형질감염을 위한 수용자로서 기능할 수 있고, 이에 의해 증가된 수준의 상기 엽산염 수송체 및 따라서 관심 생성물을 발현하는 세포를 확인할 수 있다. 선택가능 마커로서 RFC를 사용할 때 적합한 선택 조건은 통상의 기술자에게 알려져 있고, 예를 들어 WO2006/059323에 기재되어 있다.
또한 아래에서 및 실시예 섹션에서 상세히 설명하는 한 실시양태에 따르면, 선택가능 마커로서 사용된 엽산염 수송체는 엽산염 수용체이다. 엽산염 수용체 기반 선택 시스템은 몇몇 이점을 가진다. 예를 들어 선택을 위해, 어떠한 독성 물질도 필요로 하지 않고 (이들이 사용될 수 있는 경우에도), 또한, 숙주 세포의 내인성 엽산염 수용체는 낙아웃될 필요가 없다. 또한, 상기 발현 시스템은 바람직하게는 포유동물 세포인, 본원에서 설명되는 신규한 세포와 함께 특히 잘 작동한다.
본원에서 사용되는 "엽산염 수용체"는 기능성이고 따라서 엽산염 또는 그의 유도체를 진핵 세포 내로 도입 또는 흡수시킬 수 있는 수용체를 나타낸다. 바람직하게는, 수용체는 엽산염 또는 그의 유도체를 진핵 세포 내로 1방향성으로 도입 또는 흡수시킬 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 엽산염 수용체는 막-결합된다. 따라서, 본원에서 설명되는 엽산염 수용체는 기능적 막-결합된 엽산염 수용체이다. 막 고정 (anchorage)은 예를 들어 막횡단 (transmembrane) 앵커 또는 GPI 앵커에 의해 달성될 수 있다. GPI 앵커는 막-결합된 엽산염 수용체의 천연 설정에 대응하기 때문에 바람직하다. 엽산염 수용체 (FR)는 고-친화도 엽산염-결합 당단백질이다. 이들은 3개의 별개의 유전자 FR 알파, FR 베타 및 FR 감마에 의해 코딩된다. FR 알파 및 FR 베타는 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI)-고정된 세포 표면 당단백질인 반면, FR 감마에는 GPI 앵커가 존재하지 않고, 분비된 단백질이다. 그러나, 이것은 막횡단 도메인 또는 GPI 앵커를 포함하도록 유전적으로 변경될 수 있다. 막 앵커를 포함하는 FR 감마의 상기 변경된 형태는 엽산염 또는 그의 유도체를 진핵 세포 내로 도입 또는 흡수시킬 수 있다면, 이 역시 막-결합된 엽산염 수용체로 간주된다. 용어 "엽산염 수용체"는 또한 엽산염 흡수가 가능한 야생형 엽산염 수용체의 막-결합된 돌연변이체 및 각각의 엽산염 수용체를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
사용되는 엽산염 수용체는 본 발명 내에서 기능성이라면, 즉, 사용되는 숙주 세포에 적합하고 형질감염된 숙주 세포에서 발현될 때 엽산염, 특히 엽산을 배양 배지로부터 엽산염 흡수에 의존하는 숙주 세포 내로 도입한다면, 임의의 종의 엽산염 수용체로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 선택가능 마커로서 숙주 세포 내로 도입된 엽산염 수용체는 숙주 세포의 내인성 엽산염 수용체에 대해 동종성 또는 이종성일 수 있다 (내인성 엽산염 수용체가 존재하는 것이 바람직한 경우). 돌연변이된 엽산염 수용체가 동종성일 경우, 이것은 바람직하게는 포유동물 숙주 세포인 숙주 세포와 동일한 종으로부터 유래될 것이다. 이종성일 경우, 이 수용체는 숙주 세포와 상이한 종으로부터 유래될 것이다. 예를 들어, 인간 엽산염 수용체가 설치류 숙주 세포, 예를 들어 햄스터 세포, 예컨대 CHO 세포에 대한 선택가능 마커로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 포유동물 종으로부터 유래된, 예를 들어 설치류, 예컨대 마우스, 래트 또는 햄스터로부터, 또는 보다 바람직하게는 인간으로부터 유래된 엽산염 수용체가 사용된다. 선택가능 마커로서 사용된 막-결합된 엽산염 수용체는 엽산염 수용체 알파, 엽산염 수용체 베타 및 엽산염 수용체 감마로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 인간 엽산염 수용체 알파가 선택가능 마커로서 사용된다.
엽산염 수송체로서 막-결합된 엽산염 수용체의 사용은 그 자신의 엽산염 수용체를 내인성으로 발현하는 세포가 사용될 수 있고 엽산은 엽산염 수용체에 의해 처리될 수 있기 때문에 유리하다. 엽산염 흡수에 의존하는 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포에 대해 선택가능 마커로서 사용될 수 있는 적합한 막-결합된 엽산염 수용체 및 적합한 선택 조건은 또한 본원에 참고로 포함된 WO 2009/080759에 기재되어 있다. 한 실시양태에 따르면, 서열 20에 제시된 하기 아미노산 서열 (1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 제시됨)을 포함하는 성숙 야생형 인간 엽산염 수용체 알파가 사용된다.
엽산염 수용체 알파는 세포막에 GPI 앵커에 의해 천연적으로 고정된다. GPI 앵커에 대한 신호 서열은 서열 20에 제시되지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 서열 20으로부터 유래되거나 이를 포함하는 엽산염 수용체 알파는 C-말단에 GPI 앵커 신호를 포함한다. 임의의 적절한 GPI 앵커 신호가 사용될 수 있다. 인간 엽산염 수용체 알파의 천연 GPI 앵커 신호 서열은 서열 21에 제시된다 (1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 제시됨).
막 고정은 별법으로 막 앵커, 예를 들어 막횡단 앵커를 사용하여 달성될 수 있다. 이 실시양태에서, 엽산염 수용체는 그의 C-말단에 막 앵커를 포함한다. 적합한 앵커는 관련 기술 분야에 알려져 있다. 서열 20으로부터 유래되거나 이를 포함하는 엽산염 수용체 알파는 N-말단에서 리더 서열을 포함할 수 있다. 엽산염 수용체의 기능적 발현을 보장하는 임의의 적합한 리더 서열을 사용할 수 있다.
야생형 인간 엽산염 수용체 알파의 천연 리더 서열 (N-말단의) 및 천연 GPI 앵커 신호 서열 (C-말단의)을 포함하는 전체 아미노산 서열은 서열 22에 제시된다 (1-문자 코드, N-말단에서 C-말단 방향으로 제시됨).
한 실시양태에 따르면, 막-결합된 엽산염 수용체는 서열 20, 또는 22의 아미노산 서열을 갖거나 포함하거나 또는 서열 20 또는 22에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖고 막-결합되고 세포 내로 엽산을 흡수시킬 수 있는 기능적 변이체이다.
엽산염 수송체, 바람직하게는 엽산염 수용체를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 엽산염 흡수에 의존성인 진핵 세포, 예컨대 포유동물 숙주 세포를 사용할 때, 단계 (b)는 상기 다수의 숙주 세포가 엽산염을 제한 농도로 포함하는 선택 배양 배지에서 배양되는 선택 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 "엽산염의 제한 농도"는 특히 숙주 세포에 대한 선택 압력을 제공하는 선택 배양 배지 내의 엽산염(들)의 농도를 나타낸다. 상기 선택 조건 하에, 발현 벡터를 포함하고 따라서 선택가능 마커로서 엽산염 수송체를 발현하는 숙주 세포만이 성장하고 증식한다. 따라서, 엽산염은 선택 배양 배지에 풍부하게 포함되지 않고, 상기 배양 배지 내의 엽산염(들)의 제한은 숙주 세포에 대한 선택 압력을 제공한다. 제한 농도로 선택 배양 배지에 포함되는 엽산염은 숙주 세포, 특히 선택가능 마커로서 사용되는 엽산염 수송체를 포함하는 숙주 세포에 의해 흡수되고 처리될 수 있다. 숙주 세포에 의해 처리되지 않거나 처리될 수 없는 엽산염 및 특히 엽산염의 유도체는 엽산염 수송체를 선택가능 마커로서 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위해 작용하는 선택 압력에 기여하지 않고, 따라서 엽산염의 제한 농도에 기여하지 않는다. 그러나, 각각의 엽산염, 예를 들어 엽산염 길항제가 존재할 수 있고, 훨씬 더 바람직하게는 DHFR과의 조합 선택이 추후 설명되는 바와 같이 수행될 경우 존재한다. 선택 배양 배지에 제한 농도로 존재하는 엽산염은 예를 들어 산화된 엽산염 또는 환원된 엽산염 또는 그의 유도체일 수 있다. 산화된 엽산염, 예컨대 엽산, 및 환원된 엽산염으로 알려진 엽산의 환원된 유도체 또는 테트라히드로폴레이트 (THF)는 엽산염 흡수에 의존성인 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포에서 퓨린, 티미딜레이트 및 특정 아미노산의 생합성을 위한 필수적인 보조인자 및/또는 보조효소인 B-9 비타민의 군이다. THF 보조인자는 DNA 복제 및 따라서 세포 증식에 특히 중요하다. 바람직하게는, 선택 배양 배지에 제한 농도로 포함되는 엽산염은 엽산이다. 제한 농도의 엽산염을 제공하기 위한 적절한 농도 범위는 아래에서 설명된다.
엽산염 수송체 기반 선택 시스템은 세포 배양 배지 내의 엽산염, 바람직하게는 엽산의 제한된 이용가능성을 기초로 한다. 발현 벡터(들)을 성공적으로 포함하지 않고, 바람직하게는 엽산염 수용체인 충분한 양의 엽산염 수송체를 발현하지 않는 숙주 세포는 발현 벡터(들)을 성공적으로 포함한 숙주 세포에 비해 선택 배양 조건 하에 죽거나 성장이 손상된다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 본원에서 설명되는 신규한 세포와 조합하여 엽산염 수용체 기반 선택을 사용하는 것은 고수준의 관심 재조합 생성물, 예컨대 폴리펩티드를 안정적으로 과다발현하는 세포 클론의 가속된 선택, 스크리닝 및 확립을 허용한다.
선택가능 마커로서 엽산염 수용체에 대한 선택을 위해 단계 (b)에서 사용되는 또는 단계 (b)의 하위 단계에서 사용되는 선택 배양 배지는 엽산염, 특히 엽산을 다음으로부터 선택되는 농도로 포함할 수 있다:
(a) 약 5000 nM - 0.1 nM;
(b) 약 2500 nM - 0.1 nM;
(c) 약 1500 nM - 0.1 nM;
(d) 약 1000 nM - 0.1 nM;
(e) 약 750 nM - 0.1 nM;
(f) 약 500 nM - 0.1 nM;
(g) 약 250 nM - 0.2 nM; 바람직하게는 약 250 nM - 1 nM 또는 약 250 nM - 2.5 nM;
(h) 약 150 nM - 0.3 nM; 바람직하게는 약 150 nM - 1 nM 또는 약 150 nM - 2.5 nM;
(i) 약 100 nM - 0.5 nM; 바람직하게는 약 100 nM - 1 nM 또는 약 100 nM - 2.5 nM;
(j) 약 75 nM - 0.6 nM, 바람직하게는 약 75 nM - 1 nM 또는 약 75 nM - 2.5 nM;
(k) 약 50 nM - 1 nM; 바람직하게는 약 50 nM - 2.5 nM 또는 약 50 nM - 5 nM;
(l) 약 35 nM - 0.75 nM; 및
(m) 약 25 nM - 1 nM 또는 약 25 nM - 2.5 nM, 약 20 nM - 3 nM ,약 15 nM - 4 nM 또는 10 nM - 5 nM.
상기 설명된 농도 및 농도 범위는 상업적인 생산 세포주에 바람직한 실시양태인, 현탁 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포의 신속한 성장에 특히 적합하다. 그러나, 상이한 세포주는 상이한 엽산 소비 특성을 가질 수 있다. 그러나, 적절한 농도는 통상의 기술자에 의해 실험을 통해 쉽게 결정될 수 있다. 선택 배양 배지 내에 포함된 엽산염은 바람직하게는 엽산이고, 한 실시양태에 따르면, 엽산은 제한 농도의 엽산염에 기여하는 선택 배양 배지 내에 포함된 유일한 엽산염이다.
한 실시양태에 따르면, 단계 (a)에서 제공되는 숙주 세포는 제1 선택가능 마커로서 엽산염 수송체를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드, 및 엽산염, 엽산염의 유도체 및/또는 엽산염의 처리에 의해 얻을 수 있는 생성물인 기질을 처리하는 제2 선택가능 마커를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 제2 선택가능 마커는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 또는 DHFR의 하류에서 또는 DHFR과 함께 작용하는 효소, 예컨대 티미딜레이트 합성효소 (TS) 및 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (SHMT)이다. 바람직하게는, 막-결합된 엽산염 수용체는 제1 선택가능 마커로서 사용되고, 제2 선택가능 마커는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)이다. 상기 실시양태에 따르면, 단계 (b)는 엽산염, 바람직하게는 엽산을 제한 농도로 포함하고 적어도 하나의 DHFR 억제제, 예를 들어 MTX를 포함하는 선택 배양 배지에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 본원에서 설명되는 신규한 세포주를 사용할 때, 풀 내의 안정한 고 발현 세포의 수는 유의하게 증가하고, 상기 세포 풀로부터 대규모 생산을 위한 적합한 세포 클론을 얻는 것이 단순해진다. 보다 적은 세포 클론이 필요하여 스크리닝 노력을 감소시킬 수 있다. 엽산염 수용체 및 DHFR의 적합한 실시양태 및 적합한 선택 조건 및 농도는 상기 설명되었고, 여기서도 적용되는 상기 개시내용을 참고한다. 상기 설명된 엽산염 및 엽산염 길항제에 대해 설명된 농도 및 농도 범위는 서로 조합될 수 있다. 한 실시양태에서, 약 0.1 nM - 150 nM, 1 nM - 125 M, 5 nM - 100 nM 또는 7.5 nM 내지 75 nM의 엽산염 농도는 선택 배양 배지 내에서 0.1 nM - 150 nM, 1 nM 내지 125 nM, 2.5 nM 내지 100 nM, 5 nM 내지 75 nM 또는 7.5 nM 내지 50 nM의 엽산염 길항제 농도와 조합하여 사용된다. 설명된 바와 같이, 엽산이 엽산염으로서, MTX가 엽산염 길항제로서 바람직하게 사용된다.
선택가능 마커로서 엽산염 수용체 및 DHFR의 각각의 조합물을 사용하고 단계 (b)에서 적절한 선택 배양 배지를 사용하여 동시에 두 마커에 대해 선택 조건을 적용하는 것은 형질감염된 숙주 세포 집단으로부터 고 생산 세포의 효율적인 농축을 허용하는 매우 엄격한 선택 시스템을 제공한다. 숙주 세포의 생존성은 두 선택가능 마커가 강력하게 발현되면 선택 조건 하에서 상당히 증가한다. 이에 의해, 관심 생성물의 증가된 발현 비율을 보이는, 엽산염 흡수에 의존성인 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포가 선택될 수 있다. 엽산염 수용체를 선택가능 마커로서 엽산염 대사에 관여하는 추가의 선택가능 마커, 예컨대 바람직하게는 DHFR과 조합하여 사용하는 상기 개념은 본원에 참고로 포함된 WO 2010/097240에 개시되어 있다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 상기 실시양태에 따른 선택 시스템의 높은 엄격도는 특히 포유동물 세포가 사용될 때 본원에서 설명되는 신규한 세포와 유리하게 조합될 수 있다. 이러한 조합은 저 생산자의 수를 추가로 감소시키고, 고 생산 세포의 보다 균일한 집단이 선택 후에 얻어질 수 있다. 이것은 특히 안정한 생산 세포의 단일 세포 클로닝을 단순화한다. 또한, 상기 조합은 DHFR 선택을 위해 필요한 MTX 농도를 유의하게 저하시킬 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 단계 (b)에서 2 이상의 선택 단계를 수행하고, 여기서 2 이상의 선택 단계는 동일한 또는 상이한 선택 원리를 기초로 한다. 예를 들어, 추가의 선택가능 마커가 엽산염 수용체 및/또는 DHFR에 추가로 사용되면, 상기 추가의 선택가능 마커에 대한 선택 조건은 엽산염 수용체 및/또는 DHFR에 대한 선택 조건을 적용하기 전에 (예를 들어 예비-선택 단계에서) 또는 이와 동시에 적용될 수 있다. 예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (neo)가 추가의 선택가능 마커로서 사용되는 경우, 단계 (b)는 발현 벡터 또는 적어도 2개의 발현 벡터의 조합물을 포함하는 세포를 선택하기 위해, 예를 들어 G418을 함유하는 배지에서 세포를 먼저 성장시킨 후, 제한 농도의 엽산염 및 제2 선택가능 마커의 억제제, 예를 들어 DHFR을 제2 선택가능 마커로서 사용할 때 MTX를 포함하는 선택 배양 배지를 사용하여 선택 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 유동 세포 측정 기반 선택은 단계 (b)에서 수행한다. 유동 세포 측정, 특히 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용하는 선택 단계는 목적하는 특징적인 발현 수율을 위해 매우 많은 세포가 신속하게 스크리닝될 수 있는 이점을 갖는다.
한 실시양태에 따르면, 상기 유동 세포 측정 기반 선택은 하나 이상의 선택가능 마커 유전자(들)에 대한 하나 이상의 선택 단계에 추가로, 바람직하게는 이 단계가 수행된 후 수행된다. 이에 의해, 고발현 세포 클론은 성공적으로 형질감염된 세포의 집단에서 확인되고 분리될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 고발현 세포는 동시-발현된 리포터 폴리펩티드, 예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP), CFP, YFP, 루시페라제 또는 유동 세포 측정에 의해 검출될 수 있는 다른 통상적인 리포터 폴리펩티드의 발현을 검출함으로써 확인된다. 상기 실시양태에 따르면, 단계 (a)는 리포터를 코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 다수의 숙주 세포를 제공하는 것을 포함하고, 단계 (b)는 유동 세포 측정을 사용하여 상기 리포터 폴리펩티드의 적어도 하나의 특징을 기초로 하여 리포터를 발현하는 숙주 세포를 확인하는 것을 포함한다. 상기 리포터 기반 선택에서, 리포터 유전자의 발현은 관심 생성물의 발현과 상호관련된다. 리포터 폴리펩티드는 세포 내에 위치하여, 발현 세포를 표시할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 리포터 폴리펩티드의 발현은 폴리펩티드인 관심 생성물의 발현과 긴밀하게 연관된다. 예를 들어, 리포터 폴리펩티드 및 관심 폴리펩티드는 별개의 폴리펩티드로서 발현될 수 있지만, 동일한 발현 카세트로부터 발현될 수 있고, 이 경우 이들은 IRES 요소 (내부 리보솜 도입 부위)에 의해 분리된다. 또한, 리포터 폴리펩티드 및 관심 폴리펩티드는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트에서, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 리포터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 적어도 하나의 정지 코돈에 의해 분리된다. 리포터 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질은 단지 번역이 정지 코돈을 넘어 해독하는 경우에만 발현된다. 정지 코돈 번역 초과 (readthrough)는 특정 정도로만 발생하고 정지 코돈의 수 및 디자인 및 배양 조건에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 특정 비율의 관심 폴리펩티드는 유동 세포 측정에 의해 검출될 수 있는 리포터 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로서 생산된다. 각각의 전략은 리포터 폴리펩티드의 발현을 관심 폴리펩티드의 발현과 긴밀하게 연관시키는 것을 허용한다. 정지 코돈 번역 초과에 의해 융합 단백질을 얻는 원리는 또한 융합 단백질 (반드시 리포터를 포함하는 것은 아님)이 세포 표면 상에 제시되고, 예를 들어 검출 화합물을 사용함으로써 염색되는 것인 실시양태와 함께 후속적으로 설명될 것이다. 분비된 관심 폴리펩티드를 발현하기 위해, 정지 코돈과 리포터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 또는 리포터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류에 막 앵커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 막 앵커는 리포터 폴리펩티드가 발현 세포와 결합된 상태로 유지되는 것을 보장한다. 이에 의해, 융합 단백질 내에 포함된 리포터 폴리펩티드는 발현 세포에게 유동 세포 측정에 의해 선택가능한 특질을 제공한다. 관심 폴리펩티드는 배양 배지 내로 발현된다. 예를 들어 리포터 폴리펩티드의 형광이 높을수록, 보다 많은 융합 단백질이 생산되고, 따라서 관심 폴리펩티드의 발현 비율이 더 높다. 각각의 방법은 예를 들어 참고로 포함되는 WO 03/014361에 개시되어 있다.
한 실시양태에 따르면, 단계 (b)는
(i) 형질감염된 숙주 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 선택가능 마커에 대해 선택적인 조건 하에서 적어도 하나의 선택을 수행하고;
(ii) 유동 세포 측정 기반 선택을 수행하는 것
을 포함한다.
임의로, 하나 이상의 추가의 선택 단계를 단계 (i) 및/또는 단계 (ii) 전에 또는 그 후에 수행할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 유동 세포 측정 기반 선택은 관심 폴리펩티드의 존재 또는 양을 기초로 하여 요구되는 수율로 관심 폴리펩티드를 발현하는 다수의 숙주 세포를 선택하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 관심 폴리펩티드는 분비된 폴리펩티드이다. 한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드는 관심 폴리펩티드에 결합하는 검출 화합물을 사용하여 세포 표면에서 검출된다. 한 실시양태에 따르면, 분비된 관심 폴리펩티드는 세포막을 통과하면서 검출되고, 따라서 폴리펩티드 분비 동안 원형질막과 일시적으로 회합한다. 각각의 유동 세포 측정 기반 선택 시스템은 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 WO03/099996에 개시되어 있다.
한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드의 일부는 막 앵커에 융합되어 발현되고, 따라서 막-결합된 융합 폴리펩티드로서 발현된다. 이에 의해, 폴리펩티드의 일부는 세포 표면 상에 융합 폴리펩티드로서 제시되고, 검출 화합물을 사용하여 염색될 수 있다. 리포터 폴리펩티드는 상기 종류의 선택을 위해 필요하지 않지만, 추가로 사용될 수도 있다. 막 앵커의 존재 때문에, 관심 폴리펩티드는 발현 세포에 단단히 고정된다. 생산된 융합 폴리펩티드의 양은 발현 세포의 전체 발현 비율과 상호관련되므로, 숙주 세포는 세포 표면 상의 막 앵커를 통해 제시되는 융합 폴리펩티드의 양을 기초로 하여 유동 세포 측정을 통해 선택될 수 있다. 이것은 고 생산 숙주 세포의 신속한 선택을 허용한다. 유동 세포 측정을 사용하여, 바람직하게는 FACS를 사용하여 효율적인 선택을 허용하기 위해, 관심 폴리펩티드를 발현하기 위한 특수한 발현 카세트 설계를 사용하는 것이 유리하다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현된 관심 폴리펩티드의 일부가 막 앵커를 포함하도록 설계된 발현 카세트 내에 포함된다. 막 앵커에 융합된 관심 폴리펩티드는 또한 융합 폴리펩티드 또는 융합 단백질로도 언급된다. 상기 결과를 달성하기 위한 몇몇의 방식이 존재한다.
한 실시양태에 따르면, 단계 (a)에서 제공되는 숙주 세포는
(i) aa) 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
bb) 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 하류의 적어도 하나의 정지 코돈, 및
cc) 막 앵커를 코딩하는 정지 코돈 하류의 추가의 폴리뉴클레오티드 및/또는 막 앵커에 대한 신호
를 포함하는 이종성 발현 카세트; 및
(ii) 선택가능 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 이종성 발현 카세트
를 포함하고;
단계 (b)의 선택은
(i) 적어도 하나의 선택가능 마커에 대해 선택적인 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 관심 폴리펩티드의 발현을 허용하고, 여기서 관심 폴리펩티드의 적어도 일부는 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되고, 상기 융합 폴리펩티드는 상기 숙주 세포의 표면 상에 제시되고;
(ii) 유동 세포 측정을 사용하여 세포 표면 상에 제시된 융합 폴리펩티드의 존재 또는 양을 기초로 하여 관심 폴리펩티드를 요구되는 수율로 발현하는 다수의 숙주 세포를 선택하는 것을 포함하는, 유동 세포 측정 기반 선택을 수행하는 것
을 포함한다.
상기 설명된 발현 카세트 내에 포함된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사는 적어도
aa) 그 번역이 관심 폴리펩티드를 생성하는 폴리뉴클레오티드;
bb) 상기 폴리뉴클레오티드 하류의 적어도 하나의 정지 코돈;
cc) 막 앵커 및/또는 막 앵커에 대한 신호를 코딩하는, 상기 정지 코돈 하류의 폴리뉴클레오티드
를 순차적으로 포함하는 전사체를 생성한다.
전사체의 적어도 일부는 적어도 하나의 정지 코돈의 번역 초과에 의해 관심 폴리펩티드 및 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드로 번역된다. 본 실시양태에서 사용되는 발현 카세트의 상기 설계는 번역 초과 과정 (정지 코돈이 "균열됨 (leaky)")을 통해 한정된 일부의 관심 폴리펩티드가 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 생산되는 효과를 갖는다. 따라서, 전사체의 적어도 일부는 적어도 하나의 정지 코돈의 번역 초과에 의해 관심 폴리펩티드 및 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드로 번역된다. 번역 초과는 정지 코돈의 선택/번역 종결 신호의 설계에 의해 천연적으로 발생할 수 있거나 또는 배양 조건을 조정함으로써, 예를 들어 종결 억제제를 사용함으로써 유도될 수 있다. 상기 번역 초과 수준은 특정 비율의 융합 폴리펩티드를 생성한다. 상기 융합 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 세포 표면에 단단히 고정시키는 막 앵커를 포함한다. 그 결과, 융합 폴리펩티드는 세포 표면 상에 제시되고, 높은 수준의 막-고정된 융합 폴리펩티드를 제시하는 세포는 유동 세포 측정, 바람직하게는 FACS에 의해 선택될 수 있다. 이에 의해, 관심 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 숙주 세포가 선택된다. 상기 정지 코돈 번역 초과 기반 기술에 대한 상세한 내용 및 바람직한 실시양태는 WO2005/073375 및 WO2010/022961에 설명되어 있고, 상세한 내용에 대해서는 그 개시내용을 참고한다.
한 실시양태에 따르면, 발현 카세트는 iv) 리포터 폴리펩티드, 예를 들어 GFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 정지 코돈의 하류에 위치한다. 정지 코돈 번역 초과시에, 리포터 폴리펩티드의 특징, 예를 들어 그의 형광을 기초로 하여 유동 세포 측정에 의한 선택을 허용하는 융합 폴리펩티드가 얻어진다. 상기 실시양태의 상세한 내용은 이미 상기 설명되어 있고, 상기 개시내용을 참고한다. 바람직하게는, 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 막 앵커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치한다.
다른 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드의 일부는 WO2007/131774에 설명된 기술을 사용하여 세포 표면에 제시된 융합 폴리펩티드로서 발현된다. 여기서, 전사 및 전사체 처리를 통해 적어도 2개의 상이한 성숙 mRNA (mRNA-관심 폴리펩티드) 및 (mRNA-관심 폴리펩티드-앵커)가 관심 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트로부터 얻어진다. mRNA-관심 폴리펩티드의 번역은 관심 폴리펩티드를 생성한다. mRNA-관심 폴리펩티드-앵커의 번역은 관심 폴리펩티드 및 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드를 생성한다. 그 결과, 상기 융합 폴리펩티드는 다시 세포 표면 상에 제시되고, 높은 수준의 막-고정된 융합 폴리펩티드를 제시하는 세포는 유동 세포 측정, 바람직하게는 FACS에 의해 선택될 수 있다. 이에 의해, 다시 높은 발현 비율을 갖는 숙주 세포가 선택될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 발현 카세트는 리포터 폴리펩티드, 예를 들어 GFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 인트론의 하류에 위치한다. 이에 의해, 리포터 폴리펩티드를 포함하고 따라서 리포터의 특징, 예를 들어 그의 형광을 기초로 하여 유동 세포 측정에 의한 선택을 허용하는 융합 폴리펩티드가 얻어진다. 바람직하게는, 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 막 앵커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치한다. 이에 의해, 리포터는 숙주 세포 내부에 위치한다.
상기 설명된 두 예시적인 실시양태에 따르면, 관심 폴리펩티드의 일부는 숙주 세포의 표면에서 제시되는 융합 폴리펩티드로서 발현되고, 높은 수준의 막-고정된 융합 폴리펩티드 (높은 수준의 분비된 폴리펩티드를 나타냄)를 제시하는 세포는 예를 들어 유동 세포 측정에 의해, 특히 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 선택될 수 있다. 여기서, 상이한 실시양태가 이용가능하다. 예를 들어, 리포터 폴리펩티드가 융합 폴리펩티드 내에 포함되면, 고발현 숙주 세포는 리포터 폴리펩티드의 특징, 예를 들어 그의 형광을 기초로 하여 선택될 수 있다. 또한, 적절하게 표지된 검출 화합물은 다음에 간단하게 설명되는 바와 같이 사용될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 단계 b)는 숙주 세포를 세포 표면 상에 제시된 융합 폴리펩티드에 결합하는 검출 화합물과 접촉시키고, 유동 세포 측정을 사용하여 세포 표면 상에 제시된 융합 폴리펩티드의 존재 또는 양을 기초로 하여 요구되는 수율로 관심 폴리펩티드를 발현하는 다수의 진핵 숙주 세포를 선택함으로써, 유동 세포 측정을 사용하여 세포 표면 상에 제시된 융합 폴리펩티드의 존재 또는 양을 기초로 하여 요구되는 수율로 관심 폴리펩티드를 발현하는 다수의 진핵 숙주 세포를 선택하는 것을 포함한다. 따라서, 세포는 융합 단백질, 예를 들어 관심 폴리펩티드에 대응하는 부분에 결합하는 적절하게 표지된 검출 화합물과 접촉될 수 있다. 융합 폴리펩티드에 결합하기 위해 사용되는 검출 화합물은 적어도 하나의 다음 특징을 가질 수 있다: 상기 화합물은 표지, 특히 형광 표지될 수 있거나, 항원일 수 있거나, 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 결합 단편일 수 있거나 또는 단백질-A, -G, 또는 -L일 수 있다. 세포 표면에서 융합 폴리펩티드에 결합하기 위해 사용되는 검출 화합물은 예를 들어 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 단편, 예컨대 융합 폴리펩티드를 인식하는 항체 또는 항체 단편일반적으로. 기본적으로, 융합 폴리펩티드의 모든 접근가능한 부분, 및 또한 가용성 형태로 융합 폴리펩티드와 동시에 분비되는 관심 폴리펩티드에 대응하는 부분이 검출될 수 있다. 검출 및 선택을 허용하기 위해, 융합 폴리펩티드에 결합하기 위해 사용되는 상기 검출 화합물은 표지될 수 있다. 세포 표면 상에 제시된 융합 폴리펩티드에 결합하는 표지된 검출 화합물은 세포 표면을 표지하거나 염색한다. 숙주 세포에 의해 발현되는 융합 폴리펩티드의 양이 많을수록, 보다 많은 표지된 검출 화합물이 결합되고, 염색이 보다 더 강하게 된다. 이것은 결합된 검출 화합물의 존재뿐만 아니라 양도 결정될 수 있기 때문에 숙주 세포의 유동 세포 측정 기반 선택을 쉽게 수행할 수 있다는 이점을 갖는다. 고 생산 숙주 세포를 선택하기 위해, 숙주 세포는 검출 화합물에 의해 가장 효과적으로, 또는 강하게 표지된 숙주 세포의 집단으로부터 선택될 수 있다. 표지는 유동 세포 측정 기반 선택, 특히 FACS 선택에 적합하다. 유동 세포 측정에 의한 용이한 검출을 허용하기 때문에 형광 표지가 바람직하다.
한 실시양태에 따르면, 발현 카세트는 약 ≤ 50%, ≤ 25%, ≤ 15%, ≤ 10%, ≤ 5%, ≤ 2.5%, ≤ 1.5%, ≤ 1% 또는 ≤ 0.5%의 융합 폴리펩티드가 얻어지도록 구축된다. 나머지 부분은 막 앵커를 포함하지 않는 선택된 폴리펩티드 형태로서 생산된다.
막 앵커는 관심 폴리펩티드의 세포막에 대한 고정을 가능하게 하고 따라서 융합 폴리펩티드가 세포 표면 상에 제시되도록 허용하는 임의의 종류의 것일 수 있다. 적절한 실시양태는 GPI 앵커 또는 막횡단 앵커를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 막횡단 앵커는 융합 폴리펩티드의 세포 표면에 대한 긴밀한 결합을 보장하고 융합 폴리펩티드의 이탈 (shedding)을 방지하는 것이 바람직하다. 특히 항체를 관심 폴리펩티드로서 발현할 때, 이뮤노글로불린 막횡단 앵커의 사용이 특히 바람직하다. 다른 막 앵커 및 이뮤노글로불린 막횡단 앵커의 바람직한 실시양태는 WO2007/131774, WO2005/073375 및 WO 2010/022961에 설명되어 있다.
한 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 관심 폴리펩티드로서 이뮤노글로불린 분자, 예컨대 항체를 발현한다. 이뮤노글로불린 분자의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이뮤노글로불린 분자의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 발현 카세트에 포함될 수 있거나 또는 바람직하게는 제1 측면과 관련하여 상기 설명된 바와 같이 별개의 발현 카세트에 포함될 수 있다. 관심 폴리펩티드의 일부가 번역 초과 또는 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)에 의해 막-고정된 융합 폴리펩티드로서 생산되는 상기 설명된 바와 같은 발현 카세트 설계를 사용할 때, 상기 설계는 항체 중쇄의 발현을 위해 사용된다.
한 실시양태에 따르면, 고발현 숙주 세포를 선택하고 풍부하게 하기 위해 2 이상의 유동 세포 측정 기반 선택 사이클이 단계 (b)에서 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 다량의 관심 폴리펩티드를 발현하고 따라서 높은 신호를 나타내는 숙주 세포는 형광-활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 분류된다. FACS 분류는 관심 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 세포를 확인하고 풍부화하기 위한 다량의 숙주 세포의 신속한 스크리닝을 허용하기 때문에 유리하다. 이 실시양태는 세포가 상기 설명된 바와 같이 융합 단백질의 발현을 기초로 하여 선택될 경우 특히 적합하다. 최고 형광 비율을 보이는 세포는 FACS에 의해 확인되고 단리될 수 있다. FACS에 의해 결정된 형광과 생산된 폴리펩티드의 양 사이의 양성의 통계상 유의한 상관성이 제시된다. 따라서, FACS 분류는 일반적으로 관심 폴리펩티드를 발현하는 세포를 확인하기 위한 정성 분석을 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 실제로는 높은 수준의 관심 폴리펩티드를 발현하는숙주 세포를 확인하기 위해 정량적으로 사용될 수 있다. 이에 의해, 최고의 생산 세포가 단계 (b)에서 선택/풍부화될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 목적하는 수율로, 예를 들어 특정 역치를 초과하여 관심 폴리펩티드를 발현하는 세포 및/또는 상위 15%, 상위 10%, 상위 5% 또는 상위 2%의 숙주 세포가 풀로서 선택된다. 예를 들어, 몇몇의 고발현 세포, 예를 들어 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 500, 적어도 1000 또는 적어도 5000개의 고발현 세포가 단계 (b)에서 선택되고, 세포 풀로 분류될 수 있다. 다수의 상이한 고발현 세포를 포함하는 상기 세포 풀은 또한 고발현 세포 풀로서 칭한다. 상이한 개별 고발현 세포를 포함하는 상기 세포 풀은 이어서 관심 폴리펩티드의 대규모 생산을 위한 개별 세포 클론을 얻기 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 단계 (a)에서 제공되는 진핵 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 설치류 세포, 보다 바람직하게는 햄스터 세포, 예컨대 CHO 세포이다. 적합한 및 바람직한 실시양태는 제1 측면과 관련하여 상기 설명되어 있고, 상기 개시내용을 참고한다. 상기한 바와 같이, 한 실시양태에 따르면, 상기 CHO 세포는 염색체 8의 텔로머 영역의 일부를 상실하였고, 여기서 상기 상실된 부분은 유전자 FAM60A를 포함한다. 대체 실시양태가 또한 상기 설명된다. 이들 세포는 수율 및 안정성에 관하여 특히 유리한 특징을 갖는다. 한 실시양태에 따르면, 제2 측면에 따른 방법은 유전자 FAM60A의 발현의 감소 또는 제거 여부를 분석하는 단계를 포함한다. 상기 분석은 선택, 특히 DHFR 선택 후에 수행될 수 있다. 상기 분석 방법의 상세한 내용은 제1 측면과 관련하여 이미 상기 설명되어 있고, 또한 제5 측면에 따른 방법과 관련하여 아래에 설명하고, 각각의 개시내용을 참고한다.
특히 바람직하게는 포유동물 세포인 제1 측면에 따른 진핵 세포, 발현 벡터, 또는 발현 벡터의 조합물에 대한 추가의 바람직한 실시양태는 상기 상세하게 설명되어 있다. 상기 개시내용을 참고한다.
제2 측면에 따른 선택 방법의 결과로서 얻은 세포는 단리되어 개별 세포로서 배양될 수 있다. 그러나, 상이한 숙주 세포의 농축 집단, 즉, 세포 풀을 하류 공정에 사용하는 것도 가능하다. 또한, 얻은 숙주 세포는 추가의 정성 또는 정량적 분석에 적용될 수 있거나, 또는 예를 들어 단백질 생산을 위한 클론 세포주의 개발에 사용될 수 있다. 클론 세포주는 관심 생성물을 고수율로 안정적으로 발현하는 선택된 숙주 세포로부터 확립될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에 따르면, 선택된 세포는 크론 세포 배양액의 형태로 세포 클론을 제공하기 위해 배양된다. 클론 세포 배양액은 하나의 단일 조상 세포로부터 유래된 세포 배양액이다. 클론 세포 배양액에서, 모든 세포는 서로에 대한 클론이다. 바람직하게는, 세포 배양액 내의 모든 세포는 동일한 또는 실질적으로 동일한 유전적 정보를 함유한다. 특정 실시양태에서, 생산성을 결정하기 위해 세포 배양액 내의 관심 폴리펩티드의 양 또는 농도가 결정된다. 예를 들어, 역가는 배양 상청액을 분석함으로써 측정될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 각각의 개별 클론의 생산성 성능을 결정한 후, 최고 생산 클론을 생산 클론으로서 선택하기 위해 역가의 순위를 매긴다. 또한, 안정성 연구는 얻어진 세포 클론을 사용하여 수행할 수 있다. 그러나, 실시예에서 제시되는 바와 같이, 숙주 세포로서 본원에서 설명되는 신규한 세포를 사용하면, 선택 후에 유의하게 개선된 안정성을 보이는 재조합 세포 클론을 제공할 수 있다. 따라서, 발현 안정성의 상실은 각각의 숙주 세포에서 보다 드물고, 또한 발생한 경우에도, 유전자 FAM60A의 기능적 발현이 감소 또는 제거되지 않은 세포를 사용할 때에 비해 종종 생산성의 보다 적은 극적인 감소만을 야기한다. 따라서, 안정성 분석은 단축되거나 심지어 생략할 수 있고, 이것은 관심 생성물의 대규모 생산을 위해 사용될 수 있는 안정적으로 발현하는 세포 클론을 얻기 위해 필요한 시간을 단축하기 때문에 중요한 이점이다.
C. 관심 생성물의 생산 방법
제3 측면에 따르면, 관심 생성물의 재조합 발현을 위한 숙주 세포로서 제1 측면에 따른 진핵 세포를 사용하는 것을 포함하는, 재조합 관심 생성물의 생산 방법이 제공된다.
상기 논의된 바와 같이, 본원에서 제공되는 신규한 진핵 세포는 관심 생성물, 예컨대 관심 폴리펩티드를 재조합 방식으로 생산하기 위한 생산 숙주 세포로서 특히 적합하다. 세포 내의 단백질 FAM60A의 효과가 바람직하게는 유전자 FAM60A의 기능적 발현을 감소시키거나 제거함으로써 손상된 상기 진핵 세포의 적합한 및 바람직한 예, 및 관심 생성물의 적합한 및 바람직한 예는 상기 상세하게 설명되어 있고, 여기서도 적용되는 상기 개시내용을 참고한다. 상기 논의된 바와 같이, 진핵 세포는 바람직하게는 척추동물 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포이다. FAM60A 이외에, 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과가 예를 들어 유전자 C12orf35의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 손상된 실시양태가 특히 유리하고, 이것은 이에 의해 생산 수율이 유의하게 개선될 수 있기 때문이다. 단백질 FAM60A 및 단백질 C12orf35의 효과를 손상시킴으로써, 장기간 안정성 및 생산 수율 둘 모두에 대해 개선된 특징, 및 따라서 관심 생성물, 특히 관심 폴리펩티드의 대규모 생산을 위해 중요한 특징을 보이는 포유동물 숙주 세포가 제공될 수 있다.
바람직하게는 포유동물 세포인 진핵 숙주 세포는 게놈 내로 안정적으로 통합된 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드의 도입은 상기 설명된 바와 같이 안정한 형질감염에 의해 달성할 수 있다. 성공적으로 형질감염된 세포의 선택은 제2 측면에 따른 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 방법은
(a) 관심 생성물의 발현을 허용하는 조건 하에 제1 측면에 따른 숙주 세포를 배양하고;
(b) 상기 세포 배양 배지로부터 및/또는 상기 숙주 세포로부터 관심 생성물을 단리하고;
(c) 임의로, 단리된 관심 생성물을 처리하는 것
을 포함한다.
한 실시양태에 따르면, 상기 숙주 세포는 무혈청 조건 하에서 배양된다. 발현된 관심 생성물은 숙주 세포를 파괴함으로써 얻을 수 있다. 바람직하게는, 관심 생성물은 폴리펩티드이다. 폴리펩티드는 바람직하게는 배양 배지 내로 발현, 예를 들어 분비되고, 그로부터 얻을 수 있다. 상기 목적을 위해, 적절한 리더 펩티드가 관심 폴리펩티드에 제공된다. 분비를 달성하기 위한 리더 서열 및 발현 카세트 설계는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 또한, 각각의 방법의 조합도 가능하다. 이에 의해, 폴리펩티드, 예컨대 단백질이 생산되고, 고수율로 효율적으로 얻은/단리될 수 있다.
바람직하게는 폴리펩티드인 생산된 관심 생성물은 관련 기술분야에 알려진 방법에 의해 회수, 추가로 정제, 단리, 처리 및/또는 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 원심분리, 여과, 한외여과, 추출 또는 침전을 포함하고 이로 제한되지 않는 통상의 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다. 추가의 처리 단계, 예컨대 정제 단계는 크로마토그래피 (예를 들어 이온 교환, 친화도, 소수성, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), 및 크기 배제), 전기영동 절차 (예를 들어, 예비 등전 포커싱 (preparative isoelectric focusing)), 차등 용해 (differential solubility) (예를 들어 황산암모늄 침전) 또는 추출을 포함하고 이로 제한되지 않는, 관련 기술 분야에 알려진 다양한 절차에 의해 수행될 수 있다. 또한, 단리되고 정제된 관심 생성물은 추가로 조성물, 예를 들어 제약 조성물로 처리, 예를 들어 제제화될 수 있다.
D. 진핵 세포의 생산 방법
제4 측면에 따르면, 진핵 세포의 게놈을 변경함으로써 상기 세포 내의 단백질 FAM60A의 효과를 손상시키고, 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터를 상기 세포 내로 안정적으로 형질감염시키는 것을 포함하는, 관심 생성물의 재조합 생산에 적합한 진핵 세포의 생산 방법이 제공된다. 상기 결과를 달성하기 위해 적합한 및 바람직한 실시양태는 제1 측면에 따른 진핵 세포와 관련하여 상기 설명되어 있고, 여기서도 적용되는 상기 개시내용을 참고한다. 비-제한적인 실시양태를 다시 다음에 간단히 설명한다.
한 실시양태에 따르면, 방법은 진핵 세포에서 유전자 FAM60A의 기능적 발현을 감소시키거나 제거하도록 진핵 세포의 게놈을 변경하여 상기 세포 내의 단백질 FAM60A의 효과를 손상시키는 것을 포함한다. 적합한 방식이 본 개시내용의 제1 측면에 따른 진핵 세포와 관련하여 상기 설명되어 있고, 본원에서 참고된다.
예를 들어, 유전자 낙아웃이 FAM60A 유전자 내에 도입될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 상기 유전자 낙아웃은 1개 초과의 카피가 존재하면 FAM60A 유전자의 모든 카피에 도입된다. 한 실시양태에 따르면, FAM60A 유전자는 결실된다. FAM60A 유전자의 모든 카피는 1개 초과의 카피가 존재하면 게놈에서 결실될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 방법은 염색체의 일부를 결실하는 것을 포함하고, 여기서 결실된 부분은 유전자 FAM60A를 포함한다. 결실된 부분은 텔로머 영역에 대응할 수 있다. 그러나, 유전자 재배열 때문에, 상기 영역은 또한 염색체의 상이한 영역 내에 위치할 수 있다. 상기 결실은 예를 들어 염색체 파손을 유도하는 작용제를 사용함으로써 유도될 수 있다. 여기서, 세포는 예를 들어 상기 유전자의 모든 카피가 유도된 염색체 파손 때문에 결실되기 때문에 유전자 FAM60A의 기능적 발현이 감소 또는 제거된 세포를 얻기 위해 상기 작용제로 반복적으로 처리할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 진핵 세포는 후생동물 세포, 바람직하게는 척추동물 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포이다. 한 실시양태에 따르면, 포유동물 세포는 설치류 세포이다. 바람직하게는, 설치류 세포는 차이니즈 햄스터 세포, 예컨대 CHO 세포, 예를 들어 CHO-K1로부터 유래된 CHO 세포이다. 한 실시양태에 따르면, 방법은 햄스터 세포에서 염색체 8의 텔로머 영역의 적어도 일부를 결실시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 결실된 부분은 FAM60A 유전자를 포함한다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 염색체 8의 텔로머 영역, 여기서 q 아암에 각각의 결실을 포함하는 CHO 세포는 특히 유리한 발현 특징을 갖고, 따라서 재조합 생산을 숙주 세포로서 특히 적합하다. 한 실시양태에 따르면, 결실된 텔로머 영역은 FAM60A 유전자 및 Caprin2, Ipo8 및 RPS4Y2로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 또는 모든 유전자를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 결실된 영역은 추가로 적어도 일부의 또는 모든 Tmtc1 유전자를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 방법은 염색체 쌍 8의 두 염색체 모두 내의 텔로머 영역의 적어도 각각의 일부를 결실시키는 것을 포함한다. 상기 언급된 개별 유전자 및/또는 코딩되는 단백질의 비-제한적인 대체 명칭은 또한 상기 표 1에 표시되고, 오르톨로그 및 상동체를 비롯하여 각각의 유전자는 개별 유전자에 대해 상기 사용된 용어의 범위에 포함된다.
상기 논의된 바와 같이, 마우스에서 염색체 6의 텔로머 영역은 차이니즈 햄스터의 염색체 8의 텔로머 영역에 대응한다. 따라서, 햄스터의 염색체 8의 텔로머 영역에 대한 상기 개시내용은 마우스의 염색체 6의 텔로머 영역에 대응하여 적용된다.
한 실시양태에 따르면, 방법은 햄스터 게놈의 염색체 8 (또는 마우스 게놈의 염색체 6)의 텔로머 영역에 염색체 파손을 유발하는 것을 포함하고, 여기서 염색체 8 (또는 마우스 게놈의 염색체 6) 상의 파손점은 Fam60a 유전자의 동원체, Caprin2 유전자의 동원체, Ipo8 유전자의 동원체 또는 RPS4Y2 유전자의 동원체에 위치한다. 이에 의해, 그의 텔로머에 존재하는, 즉, 텔로머 단부의 방향으로 더 멀리 위치하는 모든 유전자가 결실된다. 상기 언급된 개별 유전자 및 상동체 및 오르톨로그의 비-제한적인 대체 명칭은 또한 상기 표 1에 표시되고, 각각의 유전자 및 코딩되는 단백질은 개별 유전자 및/또는 단백질에 대해 상기 사용된 용어의 범위에 포함된다. 한 실시양태에 따르면, 텔로머 영역에 염색체 파손을 포함하는 얻어진 세포는 하나 이상의 다음 특징을 갖는다:
a) 파손점이 Ipo8 유전자의 동원체에 위치하고;
b) 파손점이 Tmtc1 유전자 내에 위치한다.
상기 논의한 바와 같이, 파손점의 텔로머에, 즉, 텔로머 단부의 방향으로 더 멀리 위치하는 모든 유전자는 결실된 영역에 포함된다. 이것은 유전자 FAM60A를 포함한다. 상기 파손점을 갖는 각각의 포유동물 세포를 확인하는 방법은 상기 설명되어 있고, 또한 본 개시내용의 제5 측면과 관련하여 다음에 설명한다. 한 실시양태에 따르면, Ergic2 유전자는 결실되지 않는다.
한 실시양태에 따르면, 바람직하게는 세포주 K1로부터 유래된 CHO 세포는 단백질 FAM60A의 효과가 바람직하게는 유전자 FAM60A의 기능적 발현을 감소시키거나 제거함으로써 손상된 변경된 포유동물 세포주를 생산하기 위해 사용된다. 한 실시양태에 따르면, 유전자 FAM60A를 포함하는 염색체 8의 q 아암 상의 텔로머 영역이 결실된다. 이 결과를 달성하는 방법에 대한 상세한 내용은 통상의 기술자에게 알려져 있고, 적합한 실시양태가 또한 본원에서 설명되어 있고, 상기 개시내용을 참고한다. 추가로, 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과가 예를 들어 유전자 C12orf35의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 상기 세포에서 손상된 실시양태가 특히 유리하고, 이것은 이에 의해 생산 수율이 유의하게 개선될 수 있다고 밝혀졌기 때문이다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 제4 측면에 따른 방법은 상기 세포에서 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과를 손상시키는 것을 추가로 포함한다. 바람직하게는 유전자 C12orf35의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 상기 결과를 달성하는 방법은 상기 설명되어 있고, 각각의 개시내용을 참고한다. FAM60A 및 C12orf35의 효과 둘 모두가 상기 세포 내에서 손상되도록 변경된 포유동물 숙주 세포는 특히 유리한 발현 특징을 갖는다. 이에 의해, 장기간 안정성 및 생산 수율 둘 모두에 대해 개선된 특징, 및 따라서 관심 생성물, 특히 관심 폴리펩티드의 대규모 생산을 위해 중요한 특징을 보이는 포유동물 숙주 세포가 제공된다.
한 실시양태에 따르면, 제4 측면에 따른 방법은 유전자 FAM60A의 기능적 발현이 감소 또는 제거된 진핵 세포 내로 관심 생성물을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 바람직하게는 선택가능 마커를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 선택가능 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 또는 별개의 발현 벡터에 위치한다. 적합한 및 바람직한 실시양태가 상기 설명되어 있고, 여기서도 적용되는 각각의 개시내용을 참고한다. 발현 벡터(들)은 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어, 안정적으로 형질감염된 세포를 제공한다. 성공적으로 형질감염되고 관심 생성물을 발현하는 숙주 세포는 제2 측면에 따른 방법을 사용하여 선택될 수 있다. 상기 개시내용을 참고한다.
E. 진핵 세포의 분석 방법
제5 측면에 따르면, 유전자 FAM60A의 발현 생성물의 기능이 진핵 세포 내에서 손상되는지 직접 또는 간접적으로 분석하는 것을 포함하는, 관심 생성물의 재조합 발현을 위한 숙주 세포로서의 적합성에 대해 진핵 세포를 분석하는 방법이 제공된다. 상기 논의된 바와 같이, 진핵 세포는 바람직하게는 포유동물 세포이다.
상기 분석 방법은 예를 들어 단백질 FAM60A의 효과가 손상된 진핵 세포가 얻어졌는지 확인하기 위해 본 개시내용의 제4 측면에 따른 방법과 조합하여 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 방법은 선택/스크리닝 과정 동안 안정한 클론과 불안정한 클론을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 실시양태에서, 상기 방법은 추가로 고생산 클론과 저생산 클론을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 상기 분석 방법을 이용함으로써, 유리한 발현 특징을 갖는 클론은 선택 과정에서 초기에 확인될 수 있다. 이것은 보다 높은 비율의 안정한 고생산 클론을 생성하는 안정한 고생산 클론의 선택 가능성을 증가시킨다. 따라서, 상기 분석 방법은 중요한 용도를 갖고, 적합한 생산 클론의 확인에 필요한 시간을 단축하기 때문에 재조합 발현 기술에 대한 추가의 개선을 제공한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 방법은 유전자 FAM60A의 기능적 발현이 상기 세포 내에서 감소 또는 제거되는지 여부를 분석하는 것을 포함한다. 유전자 FAM60A의 기능적 발현의 감소 또는 제거 여부의 분석은 직접 또는 간접적으로 수행할 수 있다. 비-제한적인 실시양태를 다음에 설명한다. 어떤 분석 방법이 적합한지는 또한 세포가 내인성 유전자 FAM60A의 기능적 발현의 감소 또는 제거를 달성하도록 변경되는 방법에 따라 결정된다.
예를 들어, 유전자 FAM60A의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 낙아웃을 FAM60A 유전자 내에 도입할 때, 대응하는 DNA 절편을 증폭하고, 유전자 낙아웃이 유전자 FAM60A에 도입되었는지 확인하기 위해 증폭된 DNA의 서열을 결정할 수 있다. 상기 유전자를 완전히 또는 부분적으로 결실시킴으로써 유전자 FAM60A의 기능적 발현이 감소 또는 제거되면, 예를 들어 결실을 검출하기 위해 적합한 증폭 기반 검출 방법 (상기 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있다)을 사용하여 DNA 수준에서 결실을 검출할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 진핵 세포의 발현 프로파일은 유전자 FAM60A의 기능적 발현이 감소 또는 제거되는지 여부를 결정하기 위해 분석된다. 예를 들어, 분석은 FAM60A mRNA의 존재, 부재, 양 또는 길이를 검출하기 위해 정성 또는 정량적 RT (역전사) PCR을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 이것은 분석이 유전자 FAM60A의 전사체를 직접 수반하기 때문에 직접 분석의 예일 것이다. 유전자 FAM60A의 발현 상태가 유전자 FAM60A와 상이한 유전자의 발현 프로파일을 분석함으로써 간접적으로 결정되고, 따라서 분석이 유전자 FAM60A 또는 그의 전사체의 분석을 직접 수반하지 않는 간접 분석이 또한 적합하고, 따라서 용어 "유전자 FAM60A의 기능적 발현이 감소 또는 제거되는지 여부를 분석하는"에 포함된다. 상기 간접 분석은 예를 들어 유전자 FAM60A (및 다른 유전자)를 포함하는 염색체 부분이 염색체 파손에 의해 결실될 경우 적합하고, 후속적으로 설명될 것이다. 정량적 분석을 위해, 참조군 (예를 들어 비변경된 대응하는 세포)과의 비교를 수행할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 추가로 내인성 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과가 상기 세포에서 손상되는지 직접 또는 간접적으로 분석된다. 이것은 상기 세포에서 유전자 C12orf35의 기능적 발현이 상기 세포에서 감소 또는 제거되는지 여부를 결정함으로써 분석될 수 있다. 상기 분석은 유전자 FAM60A에 대해 설명된 바와 같이, 필요한 변경을 가하여 수행할 수 있다. 상기 논의를 참고한다.
한 실시양태에 따르면, 분석 전에, 세포는 FAM60A 유전자를 포함하는 염색체의 일부를 결실시키기 위해 염색체 파손을 유도하는 작용제로 처리된다. 상기 논의된 바와 같이, 이에 의해 유전자 FAM60A의 모든 카피가 결실될 수 있다. 이어서, 분석은 상기 작용제 처리가 유전자 FAM60A를 포함하는 염색체의 일부의 결실을 유발하였는지 분석하는 것을 포함할 수 있다. 세포는 염색체 파손이 일어나도록 하기에 적절한 농도의 염색체 파손을 유도하는 작용제로 처리된다. 여기서, 또한 수회의 처리 라운드를 수행할 수 있다. 염색체 파손은 선택이 염색체 파손을 유도하는 작용제를 충분히 고농도로 사용하는 것을 수반할 경우 선택 과정 동안 유도될 수 있다. 적합한 작용제의 비-제한적인 예는 예를 들어 MTX이다. 상기 경우에, 세포는 MTX 처리시에 생존할 수 있도록 선택가능 마커로서 DHFR을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그러나, 상기 논의한 바와 같이 또한 다른 작용제, 예를 들어 히그로마이신이 사용될 수 있고, 이것은 실시예에서 확인되었다.
염색체 파손을 유도하기 위해 세포를 처리한 후, 얻어진 세포는 상기 작용제를 사용한 처리가 유전자 FAM60A를 포함하는 염색체의 일부의 결실을 유발하였는지 결정하기 위해 제5 측면에 따른 방법을 사용하여 분석할 수 있다. 상이한 실시양태가 상기 목적에 적합하다. 한 실시양태에 따르면, 처리된 세포의 발현 프로파일이 분석된다. 예를 들어, 유전자 FAM60A 또는 유전자 FAM60A의 동원체에 위치하는 하나 이상의 유전자 (즉, 텔로머 말단으로부터 염색체 내로 멀리 존재하는)가 발현되는지 분석될 수 있다. 예를 들어, 마우스 또는 차이니즈 햄스터 세포의 경우에, 유전자 FAM60A가 발현되는지 분석될 수 있고, 따라서, 그의 mRNA가 검출될 수 있다면 (직접 분석의 예), 별법으로 또는 그에 대해 추가로, Caprin2, Ipo8 및 Tmtc1 또는 상기 언급된 유전자의 텔로머에 위치하는 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 세포에 의해 발현되는지 분석될 수 있다 (간접 분석의 예). 상기 언급된 개별 유전자의 비-제한적인 대체 명칭은 또한 상기 표 1에 표시되고, 각각의 유전자는 개별 유전자 및 코딩되는 생성물에 대해 상기 사용된 용어의 범위에 포함된다. 유도된 파손점이 각각의 유전자(들)의 동원체에 위치하면, 상기 유전자는 결실되어 그의 발현이 제거 또는 감소된다 (다른 부위에 존재하는 유전자의 다른 카피가 발현될 경우). 도 1로부터 분명히 알 수 있는 바와 같이, 유전자 FAM60A는 상기 언급된 유전자의 텔로머에 위치한다. 따라서, 상기 언급된 유전자가 결실되면, 결실된 영역은 또한 유전자 FAM60A를 포함한다. 따라서, 상기 유전자는 유도된 염색체 파손이 유전자 FAM60A의 결실을 유도하고 따라서 유전자 FAM60A의 발현의 감소 또는 제거를 유도하였는지 기본적으로 간접적으로 결정하기 위한 마커로서 유효하게 사용될 수 있다. 따라서, 유전자 FAM60A의 발현이 감소 또는 제거되었는지에 대한 분석은 반드시 예를 들어 FAM60A mRNA의 직접 분석을 기초로 할 필요는 없고, 상기 간접 방법은 또한 제5 측면의 방법에 포함된다. 또한, 유전자 FAM60A의 텔로머에 위치하는 경우에도 (즉, 텔로머 단부의 방향으로 보다 아래로), 유전자, 예컨대 C12orf35 및 Bicd1이 또한 염색체 파손이 유전자 FAM60A의 결실을 유도하는 염색체 파손이 유도되었는지 결정하기 위한 마커로서 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 유전자 Bicd1 또는 C12orf35가 염색체 파손 때문에 결실되면, 결실된 텔로머 영역은 대체로 또한 FAM60A를 포함함이 차이니즈 햄스터 세포, 예컨대 CHO 세포의 분석과 관련하여 밝혀졌다. 상기 언급된 유전자는 안정한 고발현 특징을 갖는 세포 클론을 불안정한 저발현 특징을 갖는 세포 클론과 식별하기 위한 마커로서 유효하게 사용될 수 있음이 수백 개의 클론의 발현 특징을 분석함으로써 확인되었다. CHO 세포 내의 상기 언급된 유전자의 상대적인 발현은 도 2에 제시한다.
한 실시양태에 따르면, 제5 측면에 따른 방법은 햄스터 세포, 바람직하게는 CHO 세포를 분석하기 위한 것이고, 방법은 염색체 8의 텔로머 영역 내에 위치하고 Tmtc1 유전자 및 Tmtc1 유전자의 텔로머에 위치하는 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현이 상기 세포에서 감소 또는 제거되는지 분석함으로써 유전자 FAM60A의 발현이 상기 세포 내에서 감소되는지 분석하는 것을 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 염색체 파손을 도입하는 작용제로 처리한 후 Tmtc1 유전자 및/또는 Tmtc1 유전자의 텔로머에 위치하는 유전자를 더 이상 발현하지 않는 각각의 세포는 대체로 상기 유전자를 포함하는, 특히 FAM60A 유전자를 포함하는 염색체 8의 텔로머 영역 내의 결실을 포함한다. 파손점의 텔로머에 위치하는 유전 물질은 상실된다.
한 실시양태에 따르면, 상기 설명된 특징을 갖는 선택된 숙주 세포는 관심 생성물을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하고 바람직하게는 적어도 하나의 선택가능 마커를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된다. 적합한 실시양태는 다른 측면과 관련하여 상기 설명되어 있고, 상기 개시내용을 참고한다.
한 실시양태에 따르면, 제5 측면에 따른 방법을 사용하여 분석을 수행하기 전에, 진핵 세포는 관심 생성물을 코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드 및 선택가능 마커를 코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드로 형질감염되고, 성공적으로 형질감염된 숙주 세포를 확인하기 위해 분석 전에 적어도 하나의 선택 단계를 수행한다. 적합한 실시양태는 상기에서 상세하게 설명되어 있다. 한 실시양태에 따르면, 선택은 염색체 파손을 유도하는 선택제의 사용을 수반한다. 본 실시양태에서, 선택가능 마커는 DHFR일 수 있고, 선택제는 MTX일 수 있다. 별법으로, 선택제는 히그로마이신일 수 있고, 선택가능 마커는 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자, 예를 들어 hph 유전자일 수 있다. 상기 용도에서, 방법이 선택 과정 동안 또는 선택 과정 후에 수행되는 경우에, 제5 측면에 따른 방법은 선택된 세포 집단 내에서 유전자 FAM60A의 기능적 발현이 감소 또는 제거된 상기 세포를 확인하기 위한 분석 도구로서 사용될 수 있다. 설명된 바와 같이, 상기 감소 또는 제거는 예를 들어 염색체 파손이 유도되어 유전자 FAM60A의 결실을 유발할 경우 선택 조건에 의해 유발되거나 지지될 수 있고, 제5 측면에 따른 방법은 예를 들어 그의 발현 프로파일을 기초로 하여 상기 세포의 확인을 허용한다. 이것은 그의 발현 프로파일 때문에, 특히 유전자 FAM60A의 기능적 발현의 감소 또는 제거 때문에, 관심 생성물의 높은 발현이 안정한 상태로 유지되는 것이 예상될 수 있는 재조합 생산 세포주의 확립에 특히 적합한 상기 세포 또는 세포 클론의 확인을 허용한다. 이것은 특히, 유전자 FAM60A가 상실되면, 유전자 C12orf35가 마찬가지로 상실되고, 본원에 설명된 바와 같이 상기 발현 수율을 유의하게 증가시키기 때문이다. 설명된 바와 같이, 유전자 FAM60A가 염색체 8의 텔로머 영역 내에 위치하는 햄스터 세포, 예컨대 CHO 세포의 경우에, 세포가 염색체 8의 텔로머 영역, 바람직하게는 q 아암을 상실하여 유전자 FAM60A의 발현을 감소 또는 제거하는 것이 바람직하다. 분석 방법은 고발현 세포의 집단 내에 포함된 세포로부터 세포 클론을 생성한 후에 수행할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 다수의 세포 클론은 안정한 세포 클론과 불안정한 세포 클론을 및/또는 고생산 클론과 저생산 세포 클론을 식별하기 위해 분석된다.
한 실시양태에 따르면, 제5 측면에 따른 방법은 관심 생성물, 바람직하게는 관심 폴리펩티드의 재조합 발현을 위해, 유전자 FAM60A의 발현 생성물의 기능이 바람직하게는 유전자 FAM60A의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 손상된 적어도 하나의 세포를 선택하는 것을 포함한다. 각각의 특징을 갖는 세포는 실시예에서 제시되는 바와 같이 재조합 발현에 특히 적합하다. 각각의 세포의 추가의 실시양태 는 또한 상기에서 상세하게 설명되어 있다. 설명된 바와 같이, 바람직하게는 척추동물 세포, 예컨대 가장 바람직하게는 포유동물 세포가 진핵 숙주 세포로서 사용된다.
F. 관심 생성물의 재조합 생산을 위한 변경된 진핵 세포의 사용
제6 측면에 따르면, 본 개시내용은 단백질 FAM60A의 효과가 진핵 세포에서 손상되도록 게놈이 변경된, 관심 생성물을 재조합 방식으로 발현하기 위한 단리된 진핵 세포의 용도에 관한 것이다. 각각 변경된 진핵 숙주 세포에 대한 상세한 내용 및 바람직하게는 유전자 FAM60A의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 상기 세포에서 단백질 FAM60A의 효과의 손상을 달성하기 위해 적합한 실시양태는 상기에서 상세히 설명되었고, 또한 여기에서도 적용되는 상기 개시내용을 참고한다. 비-제한적인 실시양태를 아래에서 간단하게 설명한다.
진핵 세포는 후생동물, 척추동물 또는 포유동물 세포로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 진핵 세포는 포유동물 세포, 예컨대 설치류 세포이다. CHO 세포가 바람직하다. 진핵 세포의 게놈은 상기 상세히 설명된 바와 같이 변경될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 추가로 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과는 바람직하게는 내인성 유전자 C12orf35의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 상기 세포에서 손상된다. 상기 실시양태에 관한 상세한 내용 및 관련 이점은 상기에서 상세히 설명되었고, 상기 개시내용을 참고한다.
한 실시양태에 따르면, 관심 생성물은 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 관심 폴리펩티드는 진핵 세포에서 발현될 때 세포 배양 배지 내로 분비된다. 관심 폴리펩티드에 관한 상세한 내용은 상기 설명되어 있고, 각각의 개시내용을 참고한다. 관심 생성물의 발현을 허용하기 위해, 진핵 숙주 세포는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 안정적으로 형질감염될 수 있다. 상세한 내용은 상기 설명되어 있고, 상기 개시내용을 참고한다. 바람직하게는, 제1 측면에 따른 진핵 숙주 세포가 진핵 숙주 세포로서 사용된다. 상기 세포는 상기에서 상세히 설명되어 있고, 상기 개시내용을 참고한다.
본원에서 설명되는 수치 범위는 그 범위를 규정하는 수치를 포함한다. 본원에서 제시되는 제목은 그 전체로서 명세서에서 참고로 이해될 수 있는 본 개시내용의 다양한 측면 또는 실시양태를 제한하지 않는다. 한 실시양태에 따르면, 특정 요소를 포함하는 것으로서 본원에서 설명되는 대상은 각각의 요소로 이루어진 대상을 나타낸다. 특히, 특정 서열을 포함하는 것으로서 본원에서 설명되는 폴리뉴클레오티드는 또한 각각의 서열로 이루어질 수 있다. 본원에서 설명되는 바람직한 실시양태를 선택하고 조합하는 것이 바람직하고, 바람직한 실시양태의 각각의 조합에 의해 생성되는 특정 대상도 본 개시내용에 속한다.
본원은 그 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된, 2013년 12월 20일 출원된 US 특허 가출원 US 61/919340을 기초로 한 우선권을 주장한다.
실시예
다음 실시예는 임의의 방식으로 그 범위를 제한하지 않으면서 본 발명을 예시하는 역할을 한다. 특히, 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 것이다.
실시예 1: TALEN 기술을 사용하는 CHO 세포 내에서 FAM60A의 낙아웃
FAM60A 유전자 내에 낙아웃 돌연변이를 포함하는, 세포주 CHO-K1로부터 유래된 CHO 세포에 기반한 2개의 세포 클론을 제조하였다. FAM60A 돌연변이체 세포를 생성하기 위해, TALEN (전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제) 기술을 사용하였다. FAM60A의 낙아웃을 위해, 유전자 FAM60A의 코딩 영역 (추정 엑손 1)이 표적화되었다. 모 세포로서 사용된 CHO-K1 세포는 단지 하나의 카피의 FAM60A를 함유한다. 따라서, 세포당 단일 낙아웃이 상기 세포에서 FAM60A의 효과를 손상시키기에 충분하다.
1. FAM60A에 특이적인 TALEN의 설계/생산 및 사용
CHO 모 세포주의 유전자 FAM60A의 다음 게놈 DNA 엑손 서열이 표적화되었다:
Figure pct00004
TALEN 결합 부위의 뉴클레오티드를 굵게 표지한다. 상기 제시된 FAM60 (서열 23)의 코딩 서열을 표적화하는 2개의 TAL Fok I을 설계하였다. TALEN TAL-L은 상기 서열 23에 제시된 바와 같은 유전자 FAM60A의 5' (정방향) DNA 가닥 상의 표지된 25개의 뉴클레오티드를 표적으로 하고 그에 결합하고, TALEN TAL-R은 3' (역방향) DNA 가닥 상의 표지된 25개의 뉴클레오티드를 표적으로 하고 그에 결합한다 (낙아웃을 확인하기 위한 후속적으로 사용된 프라이머 서열을 추가로 보여주는 표 2를 또한 참조). 2개의 결합 부위는 절단 부위의 16개의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 2개의 TALENS TAL-L 및 TAL-R을 코딩하는 플라스미드를 수득하였다.
<표 2>
FAM60A 유전자 낙아웃을 위한 TALEN 표적 서열 및 프라이머 서열
Figure pct00005
서열 23에 제시된 표적화된 코딩 서열을 포함하고 또한 인트론 섹션 내에 위치하는 프라이머 1, 2 및 4에 대한 프라이머 결합 부위 위로 연장하는, 유전자 FAM60A의 게놈 DNA 서열의 일부를 서열 30으로서 제시한다.
2. TALEN 플라스미드의 형질감염
생존성이 95%를 초과하는 지수 성장기의 모 CHO 세포 및 5 ㎍의 각각의 TALEN 플라스미드를 사용한 전기천공을 수반하는 표준 형질감염 프로토콜을 이용하여 형질감염을 수행하였다.
3. Cel -I-검정 및 세포 분류
SAFC 바이오사이언시즈 (SAFC Biosciences)의 매뉴얼에 따라 Cel-I-검정을 수행하였다. Cel-I-검정은 절단 효율을 결정하기 위한 표준 검정이다. 간단히 설명하면 수일의 배양 후에, 게놈 DNA를 세포로부터 단리하고, 프라이머 1 및 2를 사용하여 PCR을 수행하였다 (표 2 참조). 증폭 생성물을 변성시키고 재생시켰다. 이어서, 뉴클레아제 S 및 뉴클레아제 S 인핸서를 첨가하고 인큐베이팅하였다. 소화된 생성물을 분석하였다. TALEN 활성이 발생하면, 게놈의 상기 영역 내에서 TALEN 활성을 지시하는 2개의 보다 작은 밴드가 존재하고, 따라서, 이것은 FAM60A 유전자가 낙아웃된 세포가 분석된 세포 풀 내에 존재함을 지지한다. 양성 세포 풀로부터, 단일 세포를 제한 희석에 의해 96 웰 플레이트 내에서 분류하였다.
4. 스크리닝 전략
게놈 DNA (gDNA)를 96 웰 플레이트 내에서 각각의 클론으로부터 추출하였다. PCR 분석에 의해 낙아웃 클론을 확인하기 위해 gDNA를 표준 절차에 의해 분석하였다. 상기 목적을 위해, 프라이머 3 및 4 (표 2 참조)를 사용하였다. 절단 영역 내의 돌연변이의 경우에, 프라이머 3은 결합하지 않을 것이고, 따라서 PCR 생성물은 생성되지 않는다. 도입된 돌연변이를 분석하기 위해, 양성 클론의 gDNA의 프라이머 1 및 2 (상기 참조)를 사용한 PCR로부터 생성하는 PCR 생성물을 서열결정하였다.
낙아웃 돌연변이를 갖는 2개의 세포 클론을 얻었다: 14개 뉴클레오티드의 결실을 갖는 FAM60A_ko_s16 (s16), 및 5개 뉴클레오티드의 결실을 갖는 FAM60A-ko_s23 (s23). 세포 클론의 돌연변이된 서열을 표 3에 제시한다. 각각의 결실은 프레임-쉬프트를 일으킨다. FAM60A의 표적화된 서열 내에서 프레임-쉬프트 때문에, 해독 프레임 내에 정지 코돈이 제공된다 (이탤릭체의 밑줄그은 뉴클레오티드에 의해 표 3에서 강조됨). 따라서, 얻어진 FAM60A 낙아웃 클론에 의해, 비정상적으로 짧고 저- 또는 비-기능성의 FAM60A 발현 생성물이 발현되는 것으로 예상된다.
<표 3>
CHO 야생형 (WT - CHO-K1으로부터 유래된) 및 상기 WT로부터 유래된 2개의 낙아웃 세포 클론 (s16 및 s23) 내에서 FAM60A의 추정 엑손 1의 DNA 서열. TALEN 결합 부위의 뉴클레오티드를 굵게 표시하여 강조하고, 미성숙 정지 코돈의 뉴클레오티드를 이탤릭체로 밑줄긋는다.
Figure pct00006
5. 안정성 분석
FAM60A 낙아웃 클론이 얻어지는 모 WT 세포주, 및 얻어진 FAM60A 낙아웃 세포를, 관심 폴리펩티드로서 항체를 코딩하는 발현 벡터로 안정적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 발현 벡터는 상기 발현 벡터로부터 완전 항체가 발현되도록, 선택가능 마커로서 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트, 선택가능 마커로서 DHFR을 코딩하는 발현 카세트, 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트, 및 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하였다. 발현 벡터 내의 모든 발현 카세트는 동일한 방향으로 배향되었다. 중쇄에 대해 사용된 발현 카세트는 중쇄의 일부가 정지 코돈 번역 초과 때문에 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되도록 설계되었다. 융합 단백질은 세포 표면 상에 제시되어, FACS 분석을 단순화시킨다 (설명 참조). 형질감염된 세포는 G418 및 MTX (1 μΜ) 선택을 이용하여 재조합 발현을 위해 선택되었다. 각각의 안정적으로 형질감염된 세포주 (CHO WT, s16 및 s23)의 선택된 풀로부터, 우수한 수율로 관심 생성물을 발현한 세포 클론을 얻고, 장기 배양 동안 그의 발현 안정성을 분석하기 위해 수주 (WT CHO 모 세포주 (45개 클론)에 대해 7주 및 FAM60A 낙아웃 세포 (s16에 대해 13개 클론 및 s23에 대해 18개 클론)에 대해 8주) 동안 배양하였다. 생산 세포주가 고용적 생물반응기에 규모상향될 수 있도록 보장하기 위해, 12주의 안정성 연구, 특히, 12주 배양 동안 발현 안정성의 추가의 분석을 또한 수행하였다. 클론은 이들이 분석된 안정성 기간에 걸쳐 25% 초과의 그들의 초기 부피 발현 역가를 상실하면 불안정한 것으로서 분류하였다. 통상의 변동 수준 내에서, 일부 클론은 25%의 경계선 바로 위 또는 아래에 있다. 모 세포주에 대해 제12주에 비해 제7/8주에 보다 높은 비율의 불안정한 클론은 25% 역치에 가까운 클론에 대한 생산성 검정의 변동으로 설명될 수 있다.
표 4에서는 세포주들을 사용하여 얻어진 안정성 결과를 비교한다. 알 수 있는 바와 같이, 안정한 부피 역가를 갖는 클론의 비율은 야생형 세포주로부터 유래된 클론에 비해 FAM60A 낙아웃 세포주로부터 유래된 클론에서 상당히 더 높다. 이것은 여기서 유전자 낙아웃을 도입함으로써 세포 내에서 내인성 FAM60A의 효과를 손상시키면 장기 배양 동안 안정성 결과를 유의하게 개선시킴을 입증한다. 본 발명의 세포를 사용할 때 안정한 대 불안정한 클론의 비가 유의하게 증가하여, 장기 배양 동안 그의 유리한 높은 발현 특징을 유지하는 보다 안정한 클론이 얻어진다. 본 실시예에서 재조합 발현된 항체는 코돈-최적화되지 않았고, 모 세포주 내에서 매우 높은 정도의 불안정성을 보였다. 상기 유의한 불안정성 때문에, 상기 연구기획이, 불안정성 비율이 야생형 비변형된 세포주를 사용할 때 높은 어려운 연구기획에 비교할 때조차 본 발명을 이용하여 달성되는 유의한 이익을 입증하기 때문에 비교를 위한 예로서 선택되었다. 그러나, 상기 논의한 바와 같이, 다른 연구기획에서, 불안정성 비율은 모 CHO 야생형 세포주를 사용할 때 덜 높다. 그러나, 분석된 모든 경우에, FAM60A의 효과가 상기 세포 내에서 손상된 본 개시내용에 따른 숙주 세포는 비변형된 야생형에 비교하여, 안정한 세포의 양의 유의한 증가를 달성한다. 안정성 비율은 연구기획에 따라 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 또는 심지어 90% 이상까지 이를 수 있다. 예를 들어, FAM60A 유전자에서 유전자 낙아웃을 포함하는 또는 염색체 파손 때문에 유전자 FAM60A를 포함하는 텔로머 영역의 일부가 상실된 본 개시내용에 따른 세포를 사용할 때, 불안정한 클론은 분석된 연구기획과 무관하게 유의하게 덜 빈번하게 나타났고, 심지어 나타나더라도 부피 생산성의 상실이 FAM60A의 효과가 세포 내에서 손상되지 않은 대응하는 세포에 비해 덜 현저하였다. 따라서, 형질감염 및 선택 후에 얻어지는 안정한 클론의 증가된 비율 때문에, 본 개시내용에 따른 세포를 사용하면 장기간 안정성 연구를 유의하게 단축하거나 심지어 생략할 수 있다. FAM60A 낙아웃 클론의 안정성 연구는 본 개시내용의 기술을 이용하여 달성되는 유익한 결과를 확인한다.
<표 4>
안정성 연구의 결과
Figure pct00007
결과를 또한 도 3에 제시하고, 여기서 유전자 낙아웃에 의해 세포 내에서 FAM60A의 효과를 손상시킬 때 달성되는 중요한 이점을 입증한다.
실시예 2: RNA 간섭 ( RNAi )에 의해 C12orf35 유전자 발현을 감소시키면 발현 수율을 증가시킨다
상기 논의된 바와 같이, FAM60A 단백질의 효과가 손상된 진핵 세포 내에서 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과를 추가로 손상시키는 것이 특히 바람직하다. 손상을 달성하기 위한 적합한 방법은 상기 설명되고, 내인성 C12orf35 유전자의 기능적 발현의 감소 또는 제거를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 진핵 세포에서, 예컨대 바람직하게는 포유동물 세포에서 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과를 손상시키면 놀랍게도 각각의 세포로부터 발현된 재조합 관심 폴리펩티드의 발현 수율을 유의하게 증가시키는 것이 밝혀졌다. 유전자 C12orf35의 기능적 발현을 감소시킬 때 얻어지는 발현 수율에 관하여 상기 유익한 효과는 본 실시예 2에서 입증된다.
유전자 C12orf35의 발현을 감소시키면 부피 및 비 생산성 (specific productivity)의 증가를 일으키는지 입증하기 위해, 분석된 차이니즈 햄스터 게놈 (CHO-K1)의 염색체 8의 텔로머 영역 내에 위치하는 상이한 표적 유전자에 대하여 siRNA를 설계하였다. 표 5에 열거된 다음 표적 유전자에 대하여 siRNA를 설계하였다:
<표 5>
상이한 표적 유전자에 대한 siRNA
Figure pct00008
사용된 siRNA는 이들이 유전자 침묵화에 의해 표적 유전자의 발현을 감소시키는 것을 확인하기 위해 실시간 RT-PCR을 이용하여 검증하였다. 유전자 발현을 18S RNA에 대해 표준화하였다. siRNA 음성 대조군을 형질감염시킬 때 관찰된 유전자 발현을 100%로서 설정하였다. 표적 유전자의 발현의 상대적인 감소를 표적 유전자 C12orf35에 대한 2가지 상이한 siRNA에 대해 후속 표 6에 제시한다:
< 표 6>
Figure pct00009
또한, 본 실험에서 사용된 표적 siRNA는 형질감염된 세포의 성장을 억제하지 않은 것으로 확인되었다. 추가로, 이용가능한 차이니즈 햄스터 게놈 데이타에 기반한 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 분석은 임의의 표적-비특이 (off-target) 효과를 나타내지 않는다.
다음 세포주를 형질감염시켰다: CHO-K1으로부터 유래된 CHO 세포주를 모 세포주로서 사용하였다. 상기 세포주는 도 2에 제시된 바와 같이 상기 유전자를 발현한다. 상기 모 세포주는 발현 벡터로 형질감염되지 않고 대조군으로 역할을 한다. 게놈 내로 안정적으로 통합된 관심 단백질로서 항체를 코딩하는 발현 벡터를 포함한, 상기 모 세포주로부터 유래된 CHO 세포 (클론 및 풀)를 siRNA의 효과를 결정하기 위해 사용하였다. 상기 세포 클론 내에 포함된 발현 벡터는 선택가능 마커 유전자를 포함하고, 항체 중쇄 및 항체 경쇄는 상이한 발현 카세트로부터 발현되었다. 중쇄에 대해 사용된 발현 카세트는 중쇄의 일부가 정지 코돈 번역 초과 때문에 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되도록 설계되었다. 융합 단백질은 세포 표면 상에 제시되어, FACS 분석을 단순화시킨다 (설명 참조). 상기 CHO 세포는 상기 언급된 siRNA 표적 유전자를, 수백개의 클론 및 풀에 대해 마이크로어레이 (microarray)에 의해 결정된 모 세포주와 유사하게 발현하였다. 하나 이상의 상기 표적 유전자의 하향조절이 관심 폴리펩티드의 발현의 증가를 일으키는지 여부를 결정하기 위해, 항체를 재조합 발현하는 CHO 클론을 사용하였다. 그러한 경우라면, FACS 분석을 이용하여 검출가능한 상기 세포 클론의 부피 항체 생산성의 증가가 보일 것이다.
게놈 내로 안정적으로 통합된 발현 벡터를 포함하는 CHO 클론을 siRNA 대조군 (유전자 발현에 대한 효과를 갖지 않음) 또는 표적 유전자에 대한 상기 언급된 siRNA 중 하나로 형질감염시켰다. siRNA의 형질감염 후에, 표적 유전자의 발현의 감소가 항체의 발현 증가를 일으키는지 여부를 분석하였다. 특히, 형질감염된 세포를 형광 검출 화합물을 사용하여 염색하고, 항체의 발현 비율을 결정하기 위해 FACS에 의해 분석하였다. 보다 많은 항체가 생산되면, 보다 많은 제시된 융합 단백질이 표지된 화합물을 사용하여 염색될 수 있고, 따라서, FACS에 의해 검출된 형광 신호가 보다 높다. 따라서, FACS 프로파일에서 강도가 보다 높을수록, 보다 많은 항체가 발현된다.
결과를 시험된 상이한 siRNA에 대해 도 4A 내지 4L에 제시한다. 프로파일 내의 좌측 피크는 항체를 발현하지 않는 모 세포주에 대해 얻어진 신호에 대응한다. 2개의 다른 곡선은 siRNA-음성 대조군 (발현에 대한 효과 없음), 또는 그의 표적 유전자의 발현을 감소시키는 시험된 siRNA로 형질감염된 항체 발현 세포 클론을 사용하여 얻어진 결과를 나타낸다. 시험된 siRNA, 및 따라서 표적 유전자의 하향조절이 항체의 발현에 대해 효과가 없으면 (즉, 부피 생산성의 상향조절 없음), siRNA-음성 대조군에 대해 얻어진 형광 곡선 및 표적 siRNA에 대해 얻어진 형광 곡선은 겹치고, 따라서 기본적으로 동일하다. 이것은 본질적으로 클론 수준 상의 모든 시험된 표적 유전자에 대해 그러한 경우였지만, 단, 유전자 C12orf35는 예외였다. 그러나, FAM60A에 대해, 풀 수준에서 약간의 이동이 보였고, 이것은 증가된 발현 안정성에 기인하는 것으로 가정된다 (데이타를 제시하지 않음).
C12orf35에 대한 siRNA를 사용하여 얻어진 결과로부터 볼 수 있는 바와 같이 (도 4B 및 4C 참조), siRNA-음성 대조군 및 유전자 C12orf35에 대한 siRNA에 대해 얻어진 형광 피크는 RNAi를 사용하여 유전자 C12orf35를 침묵화시킬 때 명백하게 분리한다. 유전자 C12orf35에 대한 siRNA로 형질감염된 세포 클론에 대해 얻어진 형광 피크는 명백하게 우측으로 이동하고 (화살표로 표지함), 이것은 형광이 유의하게 증가함을 의미한다. 상기 관찰된 형광 증가는, 보다 많은 융합 단백질이 존재하고 따라서 세포 표면 상에서 염색되므로 항체의 보다 높은 발현에 기인한다. 따라서, 상기 실험은 유전자 C12orf35의 기능적 발현의 하향조절이 직접적으로 항체의 재조합 발현 (항체의 수율)의 유의한 상향조절을 일으킴을 명백하게 보여준다. 3가지 모든 농도에서 C12orf35에 대한 상기 siRNA를 사용할 때, FACS 프로파일의 동일한 현저한 이동이 관찰되었다. 예를 들어, 상세한 설명에 설명된 바와 같이, RNA 간섭에 의한 유전자 C12orf35의 발현의 장기간 감소는 예를 들어, RNAi 유도 전사체를 발현하는 발현 벡터 내에 안정적으로 통합되면 달성할 수 있다. 또한, 유전자 C12orf35의 발현의 감소 또는 제거는 한 실시양태에 따라 상세한 설명에 설명된 바와 같이 햄스터 세포, 예컨대 CHO 세포의 경우에 염색체 8의 텔로머 영역의 일부를 결실시킴으로써, 유전자 낙아웃 또는 유전자 결실/돌연변이에 의해 달성할 수 있다. 추가로, 여기에 설명된 바와 같이, 예를 들어, 비-기능성 또는 기능성이 보다 작은 단백질을 생성시키는 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써 발현 생성물의 효과를 감소 또는 제거하는 것이 또한 실행가능하다.
재조합 관심 폴리펩티드의 발현의 달성된 증가는 또한 중쇄 및 경쇄 (별개의 발현 카세트로부터 발현된, 상기 참조)의 mRNA 발현 수준의 분석에 의해 확인하였다. 결과를 2개의 상이한 관심 폴리펩티드 (항체 1 및 2)에 대해 도 5 및 6에 제시한다. 제시된 데이타를 siRNA 음성 대조군 (125 pmol)에 표준화한다. 유전자 C12orf35의 발현 감소는 발현된 항체의 중쇄 및 경쇄의 유의하게 보다 높은 mRNA 수준을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 비교하면, 다른 시험된 표적 유전자의 발현 감소는 중쇄 및 경쇄의 mRNA 발현 수준에 대해 영향을 미치지 않았다. 따라서, 유전자 C12orf35의 발현 감소는 재조합 관심 폴리펩티드의 mRNA 수준의 유의한 증가를 일으켰다. 추가로, 유전자 C12orf35가 침묵화되면 또한 다른 도입된 유전자, 예컨대 선택 마커가 상향조절되는 것이 관찰되었다. 제3일에 출발하여 시간 경과에 따라 유전자 침묵화 효과를 측정한 실험은 siRNA1 (표 7에서 siRNA C12orf35_1 참조)이 siRNA2 (표 7에서 siRNA C12orf35_2 참조)에 비해 보다 긴 효과를 가짐을 보여주었다. 또한, 세포 수 및 역가를 시간 경로 실험 내내 결정하였고, C12orf35의 하향조절이 유의하게 보다 높은 비 생산성을 일으킴이 밝혀졌다 (도 7 참조).
또한, siRNA 1 및 2를 사용한 억제 시에 항체 발현 클론 내에서 18S RNA에 상대적인 C12orf35 유전자의 발현을 분석하고, 상이한 대조군에 비교하였다. 결과를 후속 표 7에 제시한다:
<표 7>
Figure pct00010
실시예 3: 유전자 FAM60A 및 유전자 C12orf35를 결실시키는, 염색체 8의 텔로 머 영역 내에 결실을 포함하는 CHO 세포주의 생성
염색체 8의 q 아암의 텔로머 영역 내에 결실을 포함하는 신규한 CHO 세포주 (C8DEL)를 생성하였다. 결실은 염색체 파손에 의해 유도되었다. 결실된 부분은 유전자 FAM60A뿐만 아니라, 특히 유전자 FAM60A로부터 텔로머에 위치하는 유전자 C12orf35를 포함하였다 (도 1 참조). 상기 신규한 세포주는 CHO-K1로부터 유래된 모 세포주로부터 얻었다. 염색체 8 내에 염색체 파손을 갖는 상기 세포주를 다음과 같이 제조하였다. 모 CHO 세포를 0.5 μΜ, 1 μΜ 또는 2 μΜ MTX를 포함하는 배양 배지 내에 2E5 세포/ml로 나누었다. 6일 후에, 세포 생존성은 약 30-40%이었다. 세포를 180xg에서 5 min 동안 원심분리하고, MTX가 없는 배양 배지 내에서 배양하여 세포를 생존성이 95% 초과일 때까지 (약 21일 후) 회복시켰다. 상기 절차를 2회 더 반복하였다. 단일 세포 클론은 세포 풀로부터 얻어졌다. 전체 561개 세포 클론이 성장되었고, "Extract-N-Amp Blood PCR 키트"를 사용하여 DNA를 단리하였다. 유전자 Ipo8을 검출하는 프라이머를 사용하는 PCR 스크리닝을 수행하였다. 561개 클론 중 3개가 Ipo8 유전자를 포함하는 염색체 8의 텔로머 영역의 상실을 지시하는 "IPO8 양성"이었다. Ipo8 유전자는 FAM60A 유전자의 동원체 내에 위치한다 (도 1 참조). 따라서, Ipo8 유전자가 염색체 파손 때문에 결실되면, Ipo8 유전자의 텔로머에 위치하는 모든 유전자 (및 따라서 또한 FAM60A 유전자 및 유전자 C12orf35)가 또한 결실된다. 이들 3가지 클론을 팽창시키고 추가로 평가하였다. 이들 클론 중 하나를 "C8DEL" 세포주로서 칭한다. PCR 기술을 사용하여, C8DEL 세포주로부터 염색체 8의 텔로머 영역의 파손점이 결정될 수 있다. 파손점은 PCR20 및 28로 불리는 2개의 PCR 사이에서 결정되었다:
Figure pct00011
파손점은 Tmtc1 유전자 내에 위치한다. 추가로, C8DEL 세포주의 확인된 파손점은 수주의 배양에 걸쳐 안정한 것으로 입증될 수 있다 (PCR을 통해 결정됨). 상기 신규한 세포주를 관심 생성물을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시키면 다음에 제시된 바와 같이 높은 발현 능력을 갖는 안정한 생산 클론을 선택하는 기회를 증가시킨다. C8DEL 세포주의 형질감염 및 MTX 처리는 형질감염된 클론의 분석에 기반하여 결정할 때, 명백하게 파손점에 대해 효과를 갖지 않는다 (추가의 유전적 물질이 상실되지 않는다).
실시예 4: 세포주 C8DEL의 특징의 분석
세포주 C8DEL을 관심 폴리펩티드를 재조합 발현할 때 그의 성능에 대해 분석하고, 그로부터 세포주 C8DEL이 유래되는 모 세포주에 비교하였다. 상기 논의된 바와 같이, 상기 모 세포주는 염색체 8의 텔로머 영역 내에 대응하는 결실을 포함하지 않는다.
4.1. 생산성의 분석
C8DEL의 부피 생산성을 그가 유래된 모 세포주에 비교하여 평가하였다. 안정한 및 일시적인 형질감염을 수행하였다.
안정한 형질감염
세포 배양, 형질감염 및 스크리닝을 화학적으로 규정된 배양 배지 내에서 현탁 성장하는 CHO 세포를 사용하여 진탕 플라스크 내에서 수행하였다. 세포를, 다양한 항체 및 치료 단백질을 코딩하는 상이한 발현 벡터를 사용하여 전기천공에 의해 형질감염시켰다. 사용된 발현 벡터는 발현 벡터로부터 완전 항체가 발현되도록 선택가능 마커로서 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트, 및 선택가능 마커로서 DHFR을 코딩하는 발현 카세트를 포함하였다. 항체를 발현하기 위해 사용된 발현 벡터는 상기 발현 벡터로부터 완전한 항체가 발현되도록 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트, 및 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 추가로 포함하였다. 항체가 아닌 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용된 발현 벡터는 선택 마커에 추가로 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하였다. 발현 벡터 내의 모든 발현 카세트는 동일한 방향으로 배향되었다. 벡터는 FACS 선택을 위해 적합하고, 상기 벡터의 상세한 내용은 상기 설명된다.
세포 생존성에 따라, 제1 선택 단계는 G418 선택 배지를 세포에 첨가함으로써 형질감염의 24-48 h 후에 시작하였다. 세포가 80% 초과의 생존성으로 회복하자마자, 세포를 500 nM MTX 또는 1 μΜ MTX에로 계대배양시킴으로써 제2 선택 단계를 적용하였다.
G418 또는 MTX를 함유한 배지 내에서 과성장 진탕 플라스크 배치 배양을 통한 G418 및 MTX 선택 단계 후에, 선택된 세포 집단의 부피 생산성을 분석하였다. G418 배치는 30 ml (125 ml 플라스크) 내에서, MTX 유가 배양 (fed-batch)은 100 ml (500 플라스크) 내에서 이루어졌다. G418 배치 배양액을 진탕 플라스크 내에서 1E5 vc/ml로 접종하고, 진탕기 캐비넷 (가습하지 않은) 내에서 150 rpm 및 10% CO2에서 배양하였다. 유가 배양액은 4E5 vc/ml로 접종하였다. 검정을 시작할 때 세포의 생존성은 >90%이어야 한다. 역가 결정은 제14일에 일어났다. 세포 배양 상청액 내의 항체 역가는 배양을 시작한 후 제14일에 단백질-A HPLC에 의해 결정하였다.
제1 선택 단계 (G418 선택) 후에, 안정적으로 형질감염된 모 풀에 비교하여 안정적으로 형질감염된 C8DEL 풀에 대해 대량 부피 역가 증가 (12-35배)가 검출될 수 있었다. 제2 선택 단계 (MTX 선택) 후에, 2개의 항체 (항체 1 및 항체 2)에 의해 예시되는 바와 같이 C8DEL 풀은 형질감염된 모 세포에 비교하여 4-7배 더 많은 관심 폴리펩티드를 발현하였다. 염색체 8의 텔로머 영역 내에 결실을 포함하지 않는 모 CHO 세포주에 비교하여 C8DEL의 부피 G418 및 MTX (유가 배양) 역가를 2개의 항체 연구기획에 대해 다음 표 8a 및 8b에 예시적으로 제시한다. 표 8a 및 8b는 모 풀에 비교하여 C8DEL에서 생성된 부피 G418 및 MTX 유가 배양 풀 역가 (항체)를 보여준다 (4 풀/조건의 평균을 보여준다).
<표 8a>
실시예 항체 1의 풀 역가
Figure pct00012
<표 8b>
실시예 항체 2의 풀 역가
Figure pct00013
결과는 FAM60A 유전자 및 C12orf35 유전자를 포함하는 염색체 8의 텔로머 영역 내의 결실이 보다 높은 부피 생산성과 상호관련된다는 결론을 지지한다. 이미 부피 풀 역가에 관하여, C8DEL 세포주는 염색체 8의 텔로머 영역 내의 각각의 결실을 포함하지 않는 모 세포주를 능가하고 있다. 실시예 2로부터 siRNA 결과를 고려하면, 부피 역가 증가는 상실된 텔로머 부분 상에 위치한 유전자 C12orf35의 상실 때문인 것으로 생각된다.
일시적인 형질감염
배양 배지 내에 성장시킨 C8DEL 세포 및 모 세포주 세포를 관심 모델 단백질로서 eGFP 또는 Fc 융합 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드로 3중으로 일시적 형질감염시켰다. 폴리에틸렌이민 (PEI)을 형질감염 시약으로서 사용하였다. 배지 상청액 내의 모델 단백질의 역가를 형질감염 후 제3일 및 제6일에 단백질 A HPLC에 의해 측정하였다. 모델 단백질의 발현은 C8DEL에서 약 3배 더 높았다. eGFP-발현 세포의 비율을 형질감염 48 h 후에 음성 대조군으로서 작용하는 비-형질감염된 세포를 사용하는 유동 세포 측정에 의해 측정하였다. 음성 대조군 세포의 99%를 초과하는 형광 수준을 보이는 세포가 "형질감염된" 것으로 간주되었다. 음성 대조군 세포의 강도의 1000배 초과의 형광 수준을 보이는 세포가 "고 형광"으로서 간주되었다. 고 형광 세포의 수는 그로부터 C8DEL이 유래되는 모 세포주에 비해 C8DEL 세포주를 사용할 때 2-3배 더 높았다.
본 실시예는 염색체 파손 때문에 염색체 8의 텔로머 영역의 일부가 상실된 C8DEL 세포주를 사용한 일시적 형질감염을 수행할 때 증가된 부피 생산성의 이점이 또한 달성되는 것을 보여준다.
4.2. 안정성 분석
46개의 C8DEL 유래 클론 및 모 세포주로부터 유래된 37개의 클론 (IPO8 양성인 것으로 시험되고 따라서 염색체 8의 텔로머 영역을 상실하지 않은)의 안정성 특징을 안정한 형질감염 후에 분석하였다. 모든 클론은 관심 생성물로서 동일한 항체를 재조합 방식으로 발현하였고, 이들이 12주 내에 25% 초과의 항체 역가 (부피)를 상실하지 않으면 안정한 것으로 분류되었다. 모 세포주로부터의 분석된 클론의 76%가 배양 12주 내에 25% 초과의 역가 (부피)를 상실하였다. 분석된 클론 중 단지 24%가 안정한 것으로서 분류되었다. 따라서, 불안정성 비율은 높았다. 비교하면, C8DEL 클론 중 67%는 안정한 것으로 분류되었고, 표 9에 제시된 바와 같이 단지 33%가 불안정하게 되었다:
<표 9>
안정성 연구의 결과
Figure pct00014
예이츠 수정 (Yates-correction)을 이용한 x2-시험을 사용하여, 0.0002의 p-값이 계산될 수 있었고, 이것은 C8DEL 유래 클론이 안정한 생산자일 경향이 유의하게 더 높음을 지지한다. 따라서, C8DEL 세포주에 대해 유의하게 더 많은 안정한 생산 클론이 발견되었다. 이것은 특히 실시예 1의 낙아웃 실험과 함께, 유전자 FAM60A를 포함하는 염색체 8의 텔로머 영역의 일부가 결실된 CHO 세포와 같은 햄스터 세포가 뛰어난 안정성 특징을 보인다는 것을 추가로 지지한다. 따라서, 재조합 발현을 위해 상기 세포주를 사용하면 안정한 고생산 재조합 세포가 확인되는 기회를 증가시킨다. 또한, 상기 클론의 부피 생산성을 분석하였다 (4.3. 참조).
4.3. C8DEL의 특징의 추가의 분석
염색체 8의 텔로머 영역 내에 결실을 포함하는 CHO 세포주 (여기서, 상기 결실은 유전자 FAM60A 및 유전자 C12orf35를 포함한다)의 특징을 추가의 실험에서 분석하였고, 이것은 상기 세포주의 추가의 이점을 입증한다.
고 생산자를 선택하기 위해 더 적은 단일 세포 클로닝이 요구됨
C8DEL 세포주의 유리한 특징은 단일 세포 클로닝 후에 고 생산 클론의 보다 큰 비율이다. C8DEL 풀은 CHO-K1로부터 유래된 모 세포주에 비해 확대된 비율의 고 생산 세포를 함유하는 (증가된 부피 풀 역가를 일으키는) 것으로 밝혀졌다. FACS 기술을 사용하는 C8DEL 풀의 단일 세포 클로닝 후에, 모 WT 세포주로부터 유래된 풀에 비해 유의하게 더 큰 비율의, 다량의 항체를 발현하는 클론이 선택되었다. 표 10은 모 세포주로부터 유래된 대부분의 클론이 0-20 mg/L의 "부피 96 웰 역가"를 가졌음을 보여준다. 이와 반대로, C8DEL 세포주로부터 유래된 대부분의 클론은 80-100 mg/L의 평균 부피 역가를 가졌고, 이것은 유의한 개선이다. C8DEL 풀을 사용하는 한 가지 이점은 대등한 수의 고 및 안정한 생산 클론을 얻기 위해 생성해야 할 클론의 수의 감소이다. 이것은 스크리닝 노력을 유의하게 감소시킨다.
<표 10>
Figure pct00015
생산 세포주로서 C8DEL 세포주를 사용하면 확대된 비율의 고 생산 클론을 생성할 뿐만 아니라 또한 개별 C8DEL 클론의 부피 역가가 보다 높다. 실시예 2의 결과를 고려하면, 상기 수율 증가는 유전자 C12orf35의 결실에 기인하는 것으로 생각된다. 도 8은 CHO-K1로부터 유래된 모 세포주로부터의 45개의 최고 생산 클론 (모두 Ipo8 양성) 및 항체 연구기획으로부터 C8DEL의 부피 역가를 보여준다 (상기 클론의 안정성 분석의 결과를 4.2에 제시한다). 알 수 있는 바와 같이, C8DEL로부터 유래된 클론에 대한 평균 부피 역가는 모 세포주에 비해 더 높고, 추가로 또한 최고 항체 생산자 클론이 C8DEL 세포주로부터 기원한다.
생물반응기 적합성
특히 규모확대 (upscaling)에 대한 그의 적합성을 결정하기 위해, CHO-K1로부터 유래된 모 세포주에 비교하여 C8DEL 세포주를 평가하기 위한 추가의 시험을 수행하였다. 생물반응기 실행은 C8DEL 세포주가 규모확대를 위해 적합함을 보여주었다. 생물반응기 내에서 배양된 C8DEL 세포주는 대규모 생산을 위해 적합한 생존 세포 밀도를 가졌다. 또한, 생존성은 모 세포주에 대한 것보다 더 우수한 것으로 밝혀졌다. 종합하면, C8DEL 세포주는 규모확대를 위해 적합하고, 생존성에 관하여 그가 유래하는 모 세포주를 능가한다. C8DEL 세포주의 생존성은 보다 높은 수준으로 더 오래 지속한다.
안정한 풀 생산을 위한 형질감염으로부터 개선된 세포주
C8DEL 세포주의 또 다른 이점은 MTX 선택으로부터 보다 빠른 회복이다. MTX 인큐베이션 후 풀의 회복은 유전자 FAM60A를 포함하는 염색체 8의 텔로머 영역의 일부가 결실되지 않은 모 세포주에 비해 더 빠른 7-8일에 달성되었다. 종합하면, 본 개시내용에 따른 세포를 사용할 때 세포 위기가 유의하게 더 낮은 것으로 밝혀졌다.
실시예 5: 선택가능 마커로서 엽산염 수용체를 사용한 선택
C8DEL 세포주를 선택가능 마커로서 엽산 수용체와 함께 상이한 상황에서 사용하였고, 상기 선택 시스템에서 특정 이점을 보인다. 특히, 선택가능 마커로서 엽산염 수용체 및 DHFR에 대한 조합 선택이 유익하다. 여기서, 형질감염된 세포는 선택가능 마커로서 인간 엽산염 수용체 알파 및 DHFR을 포함하고, 항체를 발현하였다. 매우 소량의 엽산 (50 nM 엽산 (FA)/50 nM MTX)을 사용하는 모 세포주의 선택은 선택 엄격도 때문에 어려움에 마주치는 반면 (세포가 항상 회복하는 것은 아니다), 선택가능 마커로서 엽산염 수용체 및 C8DEL의 조합은 상기 엄격한 조건 하에 매우 강력하고, 유의한 부피 역가 증가를 일으켰다. 표 11은 모 세포주 및 C8DEL 사이의 부피 역가 차이뿐만 아니라, 500 nM MTX 선택 단계 대신에 소량의 엽산과 함께 선택 마커로서 엽산염 수용체를 사용할 때 달성되는 추가의 부피 역가 증가를 강조한다. 따라서, 유전자 FAM60A 및 유전자 C12orf35의 발현이 감소 또는 제거된, 본원에서 설명되는 포유동물 세포를 사용하면 엽산염 수용체/DHFR 선택 시스템과 함께, 다량의 독성제의 사용을 요구하지 않는 매우 엄격한 선택 조건을 사용할 수 있다.
<표 11>
Figure pct00016
또한, 인간 엽산염 수용체 알파를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 및 DHFR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 사용하여 C8DEL 세포를 형질감염시켰다 (뉴클레오펙션 (nucleofection)). 따라서, 선택가능 마커 FR알파 및 DHFR이 모두 동일한 발현 벡터 상에 있었다. 추가로, 발현 벡터는 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트, 및 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하였다. 항체 중쇄에 대한 발현 카세트는 중쇄의 일부가 정지 코돈 번역 초과 때문에 막-고정된 융합체로서 생성되어, FACS 선택을 용이하게 하도록 (상기 참조) 설계되었다. 100 nM 엽산 (FA) 및 상이한 농도의 MTX를 사용하는 5가지 상이한 선택 조건을 시험하였다. 선택 배지를 후속 표 12에 요약한다. 선택 후에, 선택된 세포 풀을 완전 배지에 옮기고, 진탕 플라스크 배치 배양액으로 성장시켰다. 배양 제13일에, 배양 배지의 샘플을 취하고, 항체 함량에 대해 단백질-A HPLC에 의해 분석하였다. 결과를 또한 표 12에 제시한다.
<표 12>
Figure pct00017
알 수 있는 바와 같이, 이미 5 nM만큼 낮은 MTX 농도가 선택 이점을 제공하였다. 선택 엄격도를 증가시키면 또한 부피 풀 역가를 증가시킨다. 따라서, 부피 항체 생산성이 유의하게 증가된다. 또한, 표준 MTX 선택에 비해, 선택 동안 유의하게 더 낮은 농도의 MTX가 사용될 수 있다. 이것은 MTX가 독성제임을 고려하면 중요한 이점이다. 또한, 선택 엄격도가 부피 풀 역가 및 선택을 위한 시간에 영향을 미치는 방식을 분석하였다. MTX의 농도를 증가시킴으로써 선택 엄격도를 증가시키면 회복 시간을 연장시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상이한 적용의 필요에 따라 선택 엄격도를 조정할 수 있다 (시간 대 역가).
추가로, FACS에 의해 항체의 표면 발현에 대한 엽산/MTX 선택 후에 얻어진 풀을 분석하면, 상기 선택 시스템을 신규한 세포주와 함께 사용하면 도 9A 내지 E에 제시된 얻어진 형광 프로파일로부터 명백한 바와 같이 세포 풀 내에서 고 생산자의 풍부도를 유의하게 증가시킴을 보여준다. MTX의 농도를 A에서 E까지 증가시켰다 (A: MTX 미함유; B: 1 nM MTX; C: 5 nM MTX; D: 10 nM MTX; E: 50 nM MTX). MTX 농도를 증가시킬 때, 우측면 상의 피크 크기의 증가로부터 유래될 수 있는 바와 같이 세포 풀 내의 고발현 세포 클론의 수가 증가하였다 (보다 높은 형광은 보다 높은 항체 발현 비율과 상호관련된다). 50 nM 엽산을 10 nM MTX와 함께 사용하면 (도 9D 참조) 이미 우세하게 고 생산 세포 클론을 포함하는 (우측면 상의 하나의 우세한 피크) 세포 풀을 생성하였다. 또한, MTX 농도를 50 nM로 증가시킬 때 (도 9E 참조), 기본적으로 독점적으로 고생산 세포가 얻어진 풀 내에 포함되었다. C8DEL 세포주를 엽산염 수용체/DHFR 선택 시스템과 함께 사용할 때, 세포 풀 (유전적으로 상이한 세포들을 포함함)보다는 세포 클론 (유전적으로 동일한 세포를 포함함)을 보다 밀접하게 닮은 FACS 분석 후 풀 프로파일을 얻기 때문에, 이들 결과는 놀라운 것이다. 세포주 C8DEL의 상실된 텔로머 영역 내에 포함된 C12orf35 유전자의 결실은 부피 생산성의 유의한 증가를 일으켜, 기본적으로 적절한 조건 하에 엽산/MTX 선택 후에 얻어진 세포 풀 내의 대다수의 세포가 FACS 프로파일에 따라 고 생산자이도록 하는 것으로 보인다.
또한, C8DEL 세포주 (유전자 FAM60A가 상실됨, 상기 참조)로부터 얻어진 안정적으로 형질감염된 클론을 선택 배지 (50 nM 엽산, 10 nM MTX) 내에서 배양할 때, 80%까지 및 거의 100% 까지의 안정성 비율이 연구기획에서 얻어질 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 단지 제한 농도의 엽산 (50 nM)을 포함하지만 MTX를 미함유한 반-선택 배지 내에서 유의하게 높은 안정성 결과가 달성되었다. 여기서, 상기 세포주를 사용하여 87%까지의 안정성 비율이 달성되었다. 특정 연구기획에서, 거의 100%까지의 안정성 비율이 얻어졌다.
실시예 6: 발현 프로파일에 기반하여 안정한 고 생산자를 확인하기 위한 검증 도구
개발 파이프라인 (pipeline) 공정의 초기 단계에서 클론 생산성 및 안정성을 예측하기 위해, 실시간 RT-PCR 분석 도구를 개발하였다. 실시간 RT-PCR을 다음 4개의 유전자에 대해 실행하였다: C12orf35, Dennd5b, Fam60a 및 Ipo8 (모두 염색체 8의 q 아암 상의 텔로머 영역에 위치함). 선택 및 클론 생성 후에, 관심 폴리펩티드로서 항체를 안정적으로 발현하는 수백 개의 클론을 염색체 8의 텔로머 영역에서 이들 4개의 유전자의 존재 및 발현 수준 및 발현 수율에 관하여 분석하였다. 안정성, 부피 생산성 및 염색체 8의 텔로머 영역의 상실 사이에 명백한 상관성이 발견되었다. 안정성 및 염색체 8의 텔로머 영역의 존재 사이의 상관성이 존재하는지 결정하기 위해 연구를 수행하였다. 클론을 12주 내에 25% 초과의 역가 (부피)를 상실하지 않으면 안정한 것으로 분류하였다. 염색체 8의 텔로머 영역의 상실 및 클론 안정성 사이의 유의한 상관성이 존재한다 (p-값: x2-시험에 기반하여 4.67E-06). 따라서, 유전자 FAM60A를 포함하는 염색체 8 상의 텔로머 영역의 상실은 안정성에 대한 예측 도구로서 사용될 수 있다. 실시간 RT-PCR을 통해 염색체 8의 텔로머 영역의 존재 또는 부재를 분석하면 파이프라인 연구기획에서 보다 높은 비율의 안정한 클론을 선택할 가능성을 증가시킨다.
추가로, 염색체 8의 텔로머 영역의 일부를 상실한 수백 개의 클론을 분석함으로써, 염색체 8의 텔로머 영역 내의 몇몇 파손점이 유도될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 대부분의 분석된 사례에서, 파손점은 Ipo8 유전자의 동원체 내에 위치하였다. 파손점은 또한 FAM60A 및 Ipo8 사이에서 검출되었다. 결실된 영역은 모든 경우에 유전자 C12orf35 (메틸트랜스퍼라제-유사 단백질 20을 코딩하는 유전자의 텔로머에 위치하는)를 포함하였고, 이것은 부피 생산성의 증가와 연관된다.
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> Novel eukaryotic cells and methods for recombinantly expressing a product of interest <130> PAT056009-WO-PCT <150> US 61/919340 <151> 2013-12-20 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 221 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Phe Gly Phe His Lys Pro Lys Met Tyr Arg Ser Ile Glu Gly Cys 1 5 10 15 Cys Ile Cys Arg Ala Lys Ser Ser Ser Ser Arg Phe Thr Asp Ser Lys 20 25 30 Arg Tyr Glu Lys Asp Phe Gln Ser Cys Phe Gly Leu His Glu Thr Arg 35 40 45 Ser Gly Asp Ile Cys Asn Ala Cys Val Leu Leu Val Lys Arg Trp Lys 50 55 60 Lys Leu Pro Ala Gly Ser Lys Lys Asn Trp Asn His Val Val Asp Ala 65 70 75 80 Arg Ala Gly Pro Ser Leu Lys Thr Thr Leu Lys Pro Lys Lys Val Lys 85 90 95 Thr Leu Ser Gly Asn Arg Ile Lys Ser Asn Gln Ile Ser Lys Leu Gln 100 105 110 Lys Glu Phe Lys Arg His Asn Ser Asp Ala His Ser Thr Thr Ser Ser 115 120 125 Ala Ser Pro Ala Gln Ser Pro Cys Tyr Ser Asn Gln Ser Asp Asp Gly 130 135 140 Ser Asp Thr Glu Met Ala Ser Gly Ser Asn Arg Thr Pro Val Phe Ser 145 150 155 160 Phe Leu Asp Leu Thr Tyr Trp Lys Arg Gln Lys Ile Cys Cys Gly Ile 165 170 175 Ile Tyr Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Leu Ile Asp Thr His Leu Phe 180 185 190 Lys Pro Cys Cys Ser Asn Lys Lys Ala Ala Ala Glu Lys Pro Glu Glu 195 200 205 Gln Gly Pro Glu Pro Leu Pro Ile Ser Thr Gln Glu Trp 210 215 220 <210> 2 <211> 221 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Met Phe Gly Phe His Lys Pro Lys Met Tyr Arg Ser Ile Glu Gly Cys 1 5 10 15 Cys Ile Cys Arg Ala Lys Ser Ser Ser Ser Arg Phe Thr Asp Ser Lys 20 25 30 Arg Tyr Glu Lys Asp Phe Gln Ser Cys Phe Gly Leu His Glu Thr Arg 35 40 45 Ser Gly Asp Ile Cys Asn Ala Cys Val Leu Leu Val Lys Arg Trp Lys 50 55 60 Lys Leu Pro Ala Gly Ser Lys Lys Asn Trp Asn His Val Val Asp Ala 65 70 75 80 Arg Ala Gly Pro Ser Leu Lys Thr Thr Leu Lys Pro Lys Lys Val Lys 85 90 95 Thr Leu Ser Gly Asn Arg Met Lys Ser Ser Gln Ile Ser Lys Leu Gln 100 105 110 Lys Glu Phe Lys Arg His Asn Ser Asp Ala His Ser Thr Thr Ser Ser 115 120 125 Ala Ser Pro Ala Gln Ser Pro Cys Tyr Ser Asn Gln Ser Asp Glu Gly 130 135 140 Ser Asp Thr Glu Met Ala Ser Ser Ser Asn Arg Thr Pro Val Phe Ser 145 150 155 160 Phe Leu Asp Leu Thr Tyr Trp Lys Arg Gln Lys Ile Cys Cys Gly Ile 165 170 175 Ile Tyr Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Leu Ile Asp Thr His Leu Phe 180 185 190 Lys Pro Cys Cys Ser Ser Lys Lys Ala Ala Ala Glu Lys Pro Glu Glu 195 200 205 Gln Ala Pro Ala Pro Leu Pro Ile Ser Thr Gln Glu Trp 210 215 220 <210> 3 <211> 221 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Met Phe Gly Phe His Lys Pro Lys Met Tyr Arg Ser Ile Glu Gly Cys 1 5 10 15 Cys Ile Cys Arg Ala Lys Ser Ser Ser Ser Arg Phe Thr Asp Ser Lys 20 25 30 Arg Tyr Glu Lys Asp Phe Gln Ser Cys Phe Gly Leu His Glu Thr Arg 35 40 45 Ser Gly Asp Ile Cys Asn Ala Cys Val Leu Leu Val Lys Arg Trp Lys 50 55 60 Lys Leu Pro Ala Gly Ser Lys Lys Asn Trp Asn His Val Val Asp Ala 65 70 75 80 Arg Ala Gly Pro Ser Leu Lys Thr Thr Leu Lys Pro Lys Lys Val Lys 85 90 95 Thr Leu Ser Gly Asn Arg Met Lys Ser Asn Gln Ile Ser Lys Leu Gln 100 105 110 Lys Glu Phe Lys Arg His Asn Ser Asp Ala His Ser Thr Thr Ser Ser 115 120 125 Ala Ser Pro Ala Gln Ser Pro Cys Tyr Ser Asn Gln Ser Asp Glu Gly 130 135 140 Ser Asp Thr Glu Met Ala Ser Ser Ser Asn Arg Thr Pro Val Phe Ser 145 150 155 160 Phe Leu Asp Leu Thr Tyr Trp Lys Arg Gln Lys Ile Cys Cys Gly Ile 165 170 175 Ile Tyr Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Leu Ile Asp Thr His Leu Phe 180 185 190 Lys Pro Cys Cys Ser Ser Lys Lys Ala Ala Ala Glu Lys Pro Glu Glu 195 200 205 Gln Gly Pro Ala Pro Leu Pro Ile Ser Thr Gln Glu Trp 210 215 220 <210> 4 <211> 221 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 4 Met Phe Gly Phe His Lys Pro Lys Met Tyr Arg Ser Ile Glu Gly Cys 1 5 10 15 Cys Ile Cys Arg Ala Lys Ser Ser Ser Ser Arg Phe Thr Asp Ser Lys 20 25 30 Arg Tyr Glu Lys Asp Phe Gln Ser Cys Phe Gly Leu His Glu Thr Arg 35 40 45 Ser Gly Asp Ile Cys Asn Ala Cys Val Leu Leu Val Lys Arg Trp Lys 50 55 60 Lys Leu Pro Ala Gly Ser Lys Lys Asn Trp Asn His Val Ser His Ser 65 70 75 80 Arg Ala Gly Pro Ser Leu Lys Thr Thr Leu Lys Pro 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tttgtatttc ttgcagattt 60 gtgacattca aaaccacaga ctatgcaaca ctactactaa accaggtcaa at 112 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 19 cttcgggata gagtggtttt gcttttacca ccagga 36 <210> 20 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys 1 5 10 15 His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys 20 25 30 Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu 35 40 45 Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys 50 55 60 Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys 65 70 75 80 Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp 85 90 95 Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu 100 105 110 Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys 115 120 125 Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys 130 135 140 Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro 145 150 155 160 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agggttctgt ctcttgagta ttgtggtata gttagttcct atgttgtgtg 420 atataagaaa caaaggaggt agtggatgcc tcctagctcc aggtattttc gaatgttttg 480 tatactggcc ctatggagta gtagatctgg ggaattcttg tagtttgttt gacttggcta 540 taaaattgta tgtgctggag gtagggtgga acagagaaaa gtccttgcat cgtttcttgt 600 catttccctt aacaaagctg tgccaattcc tttgtcttta caggtattgc tcagaagaaa 660 agatgtttgg ttttcacaag ccaaagatgt accgaagtat agagggctgc tgtatctgca 720 gagccaagtc ctccagctct cggttcacgg acagtaaacg ttatgaaaag gacttccaga 780 gctgttttgg gtaagattag ttatggtccc tcccccaccc cattacccct cactctccac 840 cgaggcaggg tttctctgta gcttaagagc ttgtcctgga actggctctg tagaccaggt 900 tagcctcaaa ctcacagaga tcctcatgag tgctgggact aaaggcatgc accaccacca 960 tccacctgta ttccattctt agagggaaaa ataatcagga ttgtgtggaa atgtttccat 1020 gcaaagcaat gggaacaatg tgctaatatt taaaatcact agttttctat tatttgggtt 1080 <210> 31 <211> 114 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 31 atgtttggtt ttcacaagcc aaagatgtac cgaagtatag agggctgctg tatcctccag 60 ctctcggttc acggacagta aacgttatga aaaggacttc cagagctgtt ttgg 114 <210> 32 <211> 123 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 32 atgtttggtt ttcacaagcc aaagatgtac cgaagtatag agggctgctg tatctgccaa 60 gtcctccagc tctcggttca cggacagtaa acgttatgaa aaggacttcc agagctgttt 120 tgg 123 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA - METTL20_1 sense <400> 33 cccugauguu guuagaggat t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA - METTL20_1 antisense <400> 34 uccucuaaca acaucagggt t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA - C12orf35_1 sense <400> 35 cauccagaca aaucuuacat t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA - C12orf35_1 antisense <400> 36 uguaagauuu gucuggaugt g 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA - C12orf35_2 sense <400> 37 ccagaaagau aaaucuacat t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA - C12orf35_2 antisense <400> 38 uguagauuua ucuuucuggt a 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> 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Claims (35)

  1. 단백질 FAM60A의 효과가 세포 내에서 손상되도록 진핵 세포의 게놈이 변경되고 상기 세포가 그의 게놈 내에 통합된, 관심 생성물을 코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 단리된 진핵 세포.
  2. 제1항에 있어서, 단백질 FAM60A의 효과가, 유전자 FAM60A의 기능적 발현이 상기 세포 내에서 감소 또는 제거되기 때문에 손상되는 것인 단리된 진핵 세포.
  3. 제2항에 있어서, 진핵 세포가 유전자 낙아웃, 유전자 돌연변이, 유전자 결실, 유전자 침묵화 또는 이들의 임의의 조합에 의해 유전자 FAM60A의 기능적 발현을 감소시키거나 제거하도록 변경되는 것인 단리된 진핵 세포.
  4. 제3항에 있어서, FAM60A 유전자가 비-기능적 발현 생성물 또는 기능이 보다 낮은 발현 생성물을 제공하는 FAM60A 유전자 내의 하나 이상의 돌연변이를 유전자 돌연변이로서 포함하는 것인 단리된 진핵 세포.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 유전자 FAM60A의 적어도 하나의 카피가 진핵 세포의 게놈 내에서 결실되거나 기능적으로 불활성화되는 것인 단리된 진핵 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포가 후생동물 세포, 척추동물 세포 또는 포유동물 세포인 단리된 진핵 세포.
  7. 제6항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포인 단리된 진핵 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 염색체의 일부가 결실되고, 결실된 부분이 유전자 FAM60A를 포함하는 것인 단리된 진핵 세포.
  9. 제8항에 있어서, a) 진핵 세포가 햄스터 세포이고, 염색체 8의 텔로머 영역의 적어도 일부가 결실되고, 상기 결실된 부분은 유전자 FAM60A를 포함하거나; 또는
    b) 진핵 세포가 마우스 세포이고, 염색체 6의 텔로머 영역의 적어도 일부가 결실되고, 상기 결실된 부분은 유전자 FAM60A를 포함하는 것인 단리된 진핵 세포.
  10. 제9항에 있어서, 다음 특징 중 하나 또는 그 초과의 특징을 갖는 단리된 진핵 세포:
    a) 결실된 텔로머 영역은 유전자 FAM60A를 포함하고, Caprin2 및 Ipo8로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함함;
    b) 결실은 염색체 파손에 의해 유도되고, 파손점은 Ipo8 유전자의 동원체에 위치하고, 바람직하게는 Tmtc1 유전자 내에 위치함;
    c) 텔로머 영역의 적어도 일부가 각각의 염색체 쌍의 두 염색체 모두에서 결실되고, 결실된 부분은 유전자 FAM60A를 포함함.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 특징 중 하나 또는 그 초과의 특징을 갖는 단리된 진핵 세포:
    a) 진핵 세포는 설치류 세포임,
    b) 진핵 세포는 햄스터 세포, 바람직하게는 CHO 세포임,
    c) 진핵 세포는 DHFR 및 엽산염 수용체를 내인성으로 발현함, 및/또는
    d) 진핵 세포는 세포 클론 또는 세포주로서 제공됨.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 FAM60A 단백질이 서열 1 내지 8에 제시된 하나 또는 그 초과의 아미노산 서열에 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성을 공유하는 것인 단리된 진핵 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 내에서 추가로 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과가 바람직하게는 유전자 C12orf35의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 손상되는 것인 단리된 진핵 세포.
  14. 제13항에 있어서, C12orf35 유전자가 서열 10 내지 16에 제시된 하나 또는 그 초과의 아미노산 서열 또는 서열 17에 의해 코딩되는 단백질에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 공유하는 단백질을 코딩하는 유전자인 단리된 진핵 세포.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포가 그의 게놈 내로 안정적으로 통합된, 관심 생성물을 코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드 및 선택가능 마커 또는 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드가 동일한 또는 상이한 발현 벡터 상에 위치하는 것인 단리된 진핵 세포.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 특징 중 하나 또는 그 초과의 특징을 갖는 단리된 진핵 세포:
    a) 관심 생성물은 폴리펩티드임;
    b) 관심 생성물은 폴리펩티드이고, 진핵 세포는 상기 관심 폴리펩티드를 세포 배양 배지 내로 분비함; 및/또는
    c) 관심 생성물은 치료 폴리펩티드 및 진단 폴리펩티드로부터 선택된 폴리펩티드임.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 세포의 집단으로부터 기원하고, 평균적으로 상기 각각의 세포의 집단으로부터 기원하는 세포의 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%가 8주, 바람직하게는 10주, 보다 바람직하게는 12주의 기간에 걸쳐 그의 발현 역가 (부피)의 30% 초과, 바람직하게는 25% 초과의 역가를 상실하지 않는 것인 단리된 진핵 세포.
  18. (a) 숙주 세포로서 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 진핵 세포를 제공하고;
    (b) 관심 생성물을 발현하는 하나 이상의 숙주 세포를 선택하는 것
    을 포함하는, 관심 생성물을 재조합 방식으로 발현하는 숙주 세포의 선택 방법.
  19. 제18항에 있어서, 단계 (a)가, 게놈 내로 안정적으로 통합된, 관심 생성물을 코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 진핵 세포를 제공하기 위해, 단백질 FAM60A의 효과가 세포 내에서 손상되도록 게놈이 변경된 진핵 세포를 관심 생성물을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드로 안정적으로 형질감염시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 다음 특징 중 하나 또는 그 초과의 특징을 갖는 방법:
    a) 진핵 세포는 포유동물 세포임;
    b) 단계 (a)에서 제공되는 상기 숙주 세포는 선택가능 마커를 코딩하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 단계 (b)는 상기 다수의 숙주 세포를 선택가능 마커에 대해 선택적인 조건 하에 배양하는 것을 포함함;
    c) 이종성 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 벡터를 형질감염시킴으로써 진핵 세포 내로 도입됨;
    d) 관심 재조합 생성물은 폴리펩티드임;
    e) 단계 (b)가 다수의 선택 단계를 포함함;
    f) 단계 (b)가 유동 세포 측정 기반 선택을 수행하는 것을 포함함;
    g) 선택된 숙주 세포가 이뮤노글로불린 분자를 재조합 방식으로 발현함;
    h) 단계 (a)에서 제공되는 상기 숙주 세포는 각각 선택가능 마커를 코딩하는 적어도 2개의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제1 선택가능 마커는 엽산염 수용체이고, 제2 선택가능 마커는 DHFR이고, 단계 (b)는 상기 다수의 숙주 세포를 제한 농도의 엽산염 및 DHFR 억제제를 포함하는 선택 배양 배지에서 배양하는 것을 포함함.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 진핵 세포를 관심 생성물의 재조합 발현을 위한 숙주 세포로서 사용하는 것을 포함하는, 관심 생성물을 재조합 방식으로 생산하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    (a) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 관심 생성물의 발현을 허용하는 조건 하에 배양하고;
    (b) 관심 생성물을 세포 배양 배지로부터 및/또는 상기 숙주 세포로부터 단리하고;
    (c) 임의로, 단리된 관심 생성물을 처리하는 것
    을 포함하는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 생산을 위해, 추가로 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과가 바람직하게는 유전자 C12orf35의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 손상된 진핵 세포가 사용되는 것인 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 특징 중 하나 또는 그 초과의 특징을 갖는 방법:
    a) 진핵 세포는 후생동물 세포, 척추동물 세포 또는 포유동물 세포임;
    b) 진핵 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 설치류 세포임;
    c) 관심 생성물은 폴리펩티드임;
    d) 관심 생성물은 폴리펩티드이고, 숙주 세포는 관심 폴리펩티드를 세포 배양 배지 내로 분비함.
  25. 진핵 세포 내의 단백질 FAM60A의 효과를 손상시키기 위해 진핵 세포의 게놈을 변경하고, 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터를 상기 세포 내로 안정적으로 형질감염시키는 것을 포함하는, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 진핵 세포의 생산 방법.
  26. 제25항에 있어서, 유전자 FAM60A의 기능적 발현을 감소시키거나 제거하여 진핵 세포 내에서 단백질 FAM60A의 효과를 손상시키는 것을 포함하는 방법.
  27. 진핵 세포에서 FAM60A의 효과의 손상 여부를 직접 또는 간접적으로 분석하는 것을 포함하는, 진핵 세포를 관심 생성물의 재조합 발현을 위한 숙주 세포로서의 그의 적합성에 대해 분석하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 직접 분석이 유전자 FAM60A의 기능적 발현이 상기 세포 내에서 감소 또는 제거되는지 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 분석 전에, 진핵 세포를 염색체 파손을 유도하는 작용제로 처리하고, 분석이, 상기 작용제 처리가 유전자 FAM60A를 포함하는 염색체의 일부의 결실을 유발했는지 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 햄스터 세포이고, 방법이 염색체 8의 텔로머 영역 내에 위치하고 Tmtc1 유전자 및 Tmtc1 유전자의 텔로머에 위치하는 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 제거 또는 감소되는지 분석하여, 유전자 FAM60A의 기능적 발현이 상기 세포 내에서 감소 또는 제거되는지 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과가 상기 세포에서 손상되는지 직접 또는 간접적으로 분석하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 전에, 진핵 세포가 관심 생성물을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드 및 선택가능 마커를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드로 형질감염되고, 분석 전에 성공적으로 형질감염된 숙주 세포를 확인하기 위해 적어도 하나의 선택 단계가 수행되는 것인 방법.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 세포 클론이 안정한 세포 클론과 불안정한 세포 클론 및 임의로 고생산 클론과 저생산 클론을 식별하기 위해 분석되고, 유전자 FAM60A의 기능적 발현이 감소 또는 제거된 하나 이상의 세포 클론이 생산 클론으로서 선택되는 것인 방법.
  34. 단백질 FAM60A의 효과가 진핵 세포에서 손상되도록 게놈이 변경된, 관심 생성물을 재조합 방식으로 발현하기 위한 단리된 진핵 세포의 용도.
  35. 제34항에 있어서, 다음 특징 중 하나 또는 그 초과의 특징을 갖는 용도:
    a) 진핵 세포는 후생동물, 척추동물 또는 포유동물 세포임;
    b) 진핵 세포는 포유동물 세포임;
    c) 진핵 세포의 게놈이 제2항 내지 제5항 및 제8항 중 어느 한 항에서 규정된 바와 같이 변경됨;
    d) 상기 진핵 세포에서, 추가로 유전자 C12orf35의 발현 생성물의 효과가 바람직하게는 내인성 유전자 C12orf35의 기능적 발현의 감소 또는 제거에 의해 손상됨;
    e) 관심 생성물이 폴리펩티드임;
    f) 관심 생성물이, 진핵 세포에서 발현시에 세포 배양 배지 내로 분비되는 폴리펩티드임;
    g) 용도는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 진핵 세포를 안정적으로 형질감염시키는 것을 포함함, 및/또는
    h) 진핵 세포는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 규정된 세포임.
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