CN106029692A - 用于重组表达感兴趣产物的新型真核细胞和方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及适合重组生产感兴趣产物的新型真核细胞，其中内源基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果受损，从而在重组表达感兴趣多肽时增加其生产率。此外，本公开提供相关技术，其中这类宿主细胞被用于重组生产技术。

Description

用于重组表达感兴趣产物的新型真核细胞和方法

技术领域

本公开涉及重组表达技术领域。提供了能提高感兴趣产物生产的经改变真核细胞以及其在重组表达方法中的应用等。此外，提供能在选择过程早期基于真核细胞表达谱鉴定以提高的稳定性和高产率表达重组产物的真核细胞。所述真核细胞优选是哺乳动物细胞。

背景技术

随着生物制药对当今医学越来越重要，生物制药市场持续高速增长。目前，越来越多的生物药品在真核细胞如特定的哺乳动物细胞中生产。因此，在真核细胞中成功且高产率生产生物药品是关键的。产生这类生产感兴趣治疗蛋白的细胞系的时间是任何生物药品进入临床所需时间的重要部分。此外，也鉴于生物药品的生产成本，拥有高且稳定表达的重组真核细胞系很重要，特别是哺乳动物细胞系。

为了生物制药尤其是在工业规模上的生产效率，对克隆选择工艺付出巨大努力，目标是在短时间内鉴定有良好表达稳定性和生长特性的高产克隆。为生产治疗蛋白而产生重组细胞克隆通常包括重度筛选个体克隆以检测和分离高表达克隆。然而，即使在筛选过程中鉴定出高表达克隆，这些初始高表达克隆通常随着时间推移而失去其有利表达特性且表达产率减小。延长的继代培养期间细胞克隆中重组蛋白表达的逐步损失是许多细胞系如CHO细胞系的共同问题，称为不稳定性。此不稳定性严重影响重组生产多肽的工业生产过程。因此，必须审慎其事，才能从成功表达的细胞群体中，甚至从初时以良好产率表达感兴趣蛋白的细胞克隆中鉴定出如下细胞/个别细胞克隆：它们在长期培养中兼具高度生产稳定性，因而不易表现出重组蛋白表达逐渐损失。这些克隆也称为“稳定”克隆。在长时间培养期中，稳定克隆应在8-12周时间内损失不超过初始生产率的30％、优选不超过25％。生产率定义为容积生产率，其是在某一培养时间点每体积蛋白的表达量(如g/L)，个别地，作为细胞比生产率，是每天每细胞表达蛋白的具体量(如pg/细胞/天)。为防止有倾向于不稳定并因而在长时间培养中会损失效价的细胞克隆被选择用于后续大规模生产，通常在数周到多至数月中进行广泛的稳定性分析以去除在该时间段中变得不稳定的那些细胞克隆并鉴定稳定克隆。因此，大规模生产的治疗蛋白和其它重组多肽所用重组细胞克隆的产生通常包括过量且耗时地筛选个体克隆以鉴定也能显示大规模生产所需表达稳定性的高表达细胞克隆。此实践延长生物技术如生物药品生产过程的开发。甚至当使用在所用选择条件下有利于高表达细胞存活的高严谨选择系统时，仍难以在存活群体内发现结合高表达率与良好生长和稳定特性的合适生产克隆。

本发明的一个目的是提高感兴趣产物在真核细胞例如尤其是哺乳动物细胞中的重组生产。具体地，本发明的一个目的是提供新型真核细胞系，其在用编码感兴趣产物的多核苷酸转染后，以提高的产率表达感兴趣产物。此外，一个目的是提供能鉴定表达特性改善的成功转染细胞的选择方法。另外，一个目的是提供重组生产感兴趣产物的改良方法。此外，一个目的是提供能在开发过程早期区分高产与低产重组细胞克隆和/或稳定与不稳定细胞克隆的分析工具。

发明内容

本公开尤其基于以下意外发现：例如通过减少或消除基因C12orf35在所述细胞中的功能表达，削弱基因C12orf35表达产物在真核细胞中的效果，可使感兴趣的重组产物在所述细胞中的表达显著增加。因此，鉴定了影响重组表达稳定性的关键基因。如本文所述，削弱基因C12orf35表达产物在细胞中的效果能通过增加表达产率来显著提高感兴趣产物的重组生产。因此，本发明对现有技术作出重要贡献。

根据第一方面，本公开提供经分离真核细胞，其中基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果受损。削弱可例如通过减少或消除内源基因C12orf35在所述细胞中的功能表达来实现，例如通过基因沉默、基因缺失或通过突变基因，从而表达无功能蛋白或功能较少的蛋白。如实施例所示，瞬时或稳定转染后，各经改变真核细胞意外地能以更高产率生产感兴趣的重组产物。因此，这些真核细胞特别适合作为重组生产技术的宿主细胞并能用于重组生产感兴趣产物。

根据第二方面，提供选择重组表达感兴趣产物的宿主细胞的方法，包括

(a)提供第一方面所述真核细胞作为宿主细胞，其中所述宿主细胞包括至少一种编码感兴趣产物的外源多核苷酸；和

(b)选择一或多个表达感兴趣产物的宿主细胞。

根据第三方面，提供重组生产感兴趣产物的方法，包括使用第一方面所述真核细胞作为宿主细胞用于重组表达感兴趣产物。如上所述，由于其生产能力增加，这些新型真核细胞尤其适合作为宿主细胞用于重组生产。

根据第四方面，提供适合重组产生感兴趣产物的真核细胞的生产方法，包括削弱内源基因C12orf35表达产物在真核细胞中的效果。这能例如通过减少或消除基因C12orf35在所述细胞中的功能表达来实现。

根据第五方面，提供一种分析真核细胞作为宿主细胞重组表达感兴趣产物的适宜性的方法，所述方法包括直接或间接分析基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果是否受损。此方法可方便地使用，例如联合第四方面所述方法以鉴定例如是否获得真核细胞，其中基因C12orf35表达产物的效果受损。此外，该方法能用作分析工具以区分高表达与低表达克隆，且在多个实施方式中，区分表达感兴趣产物的稳定克隆与不稳定克隆。

根据第六方面，本公开涉及经分离真核细胞在重组表达感兴趣产物中的应用，其中基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果受损。

本申请的其它目的、特征、优点和方面通过以下说明书和所附权利要求对本领域技术人员来说是显而易见的。然而，应理解以下说明书、所附权利要求和特定实施例尽管指示本申请的优选实施方式，但仅作为例证给出。通过阅读以下内容，在所公开的发明精神和范围内的多种变化和修饰对本领域技术人员来说将是显而易见的。

附图说明

图1提供中国仓鼠卵巢(CHO)细胞染色体8端粒区和位于所述端粒区的基因的概述图。图中所示基因组区域是染色体8上合并拼接序列(scaffold)6和25号的结果。使用与Brinkrolf等(Nature Biotechnology卷31,694–695(2013)；参见基因库:APMK00000000,APMK01000000版，如所述出版物所述)的装配相关的基因库注释文件，可找到关于CHO细胞染色体8上基因和假定基因的概述。此外，北京华大基因公司还提供该区域的注释(Xu等,Nature Biotechnology,卷29,第8期,735-741(2011)；参见基因库:AFTD00000000,AFTD01000000版)。图1中用*标记的注释来自基因库文件AFTD01000000。

小鼠染色体6端粒区的对应概述可参见例如Ensembl数据库。小鼠染色体6具有对应于中国仓鼠染色体8的结构。Ensembl数据库的以下链接显示小鼠染色体6端粒区，其含有C12orf35基因(在此称为2810474O19Rik)。

http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Location/View？db＝core；g＝ENSMUSG00000032712；r＝6:149309414-149335658

下表1提供图1所示基因和编码产物的缩写和别称(别名)的概述，并且(可能的话)指示小鼠和中国仓鼠的相应注释(根据Brinkrolf等,2013和/或Xu等,2011)。表1还列出所采用的别名，例如在不同物种中所用。本公开提及特定的蛋白或基因名称时，还指代并涵盖所述蛋白或基因的任何别名，例如用于表征不同物种中的相应基因或蛋白。具体地，因而包括具有相同功能的同源物和直向同源物。

表1：位于中国仓鼠染色体8或小鼠染色体6的基因所编码产物的缩写和别称(别名)。

图2显示位于CHO细胞系染色体8端粒区的基因的相对表达水平，即TMTC1(1)、RPS4Y2(2)、IPO8(3)、CAPRIN2(4)、FAM60A(5)、Dennd5b(6)、METTL20(7)、AMN1(8)、C12orf35(9)和Bicd1(10)。

图3A-L显示用siRNA减少不同靶基因表达后获得的FACS分布，所述基因位于中国仓鼠(CHO)细胞的染色体8端粒区。用表达载体稳定转染并表达作为感兴趣产物的编码抗体的细胞进行荧光染色以检测重组表达的抗体量。FACS分布中的强度越高，染色细胞表达的抗体越多。FACS分布所示的左峰对应亲本细胞系(未转染并因此不表达抗体)，其被纳入以用于比较目的。2条其它曲线代表细胞克隆所得结果，所述克隆稳定转染有表达载体且重组表达抗体。此细胞克隆转染有siRNA阴性对照(深色曲线；对任何基因的表达无影响)或减少靶基因表达的siRNA(淡灰色曲线)。如果靶基因沉默不影响抗体重组表达，则siRNA对照和靶siRNA的荧光曲线重叠并保持相同。如果靶基因沉默增加重组表达抗体的表达率，则相应FACS分布的强度提高且右移。A:基因Mettl20_1,125pmol,24.9％；B:基因C12orf35_1,125pmol,30.6％；C:基因C12orf35_2,150pmol,31.7％；D:基因Caprin2_6,100pmol,53.3％；E:FAM60A_3,150pmol,48％；F:Ipo8_1,125pmol,20.3％；G:Ipo8_2,150pmol,57.5％；H:Ipo8_3,150pmol,21.5％；I:Dennd5b_2,100pmol,36.9％；J:Amn1_4,125pmol,30.8％；K:TMTC1_1,150pmol,60.6％；L:TMTC1_2,150pmol,53.4％(百分值对应于所提siRNA相比对照siRNA的靶基因mRNA表达)。图3B和C显示下调基因C12orf35可显著增加重组抗体表达并因而产生更高生产率，如FACS分布明显右移所示(参见右边的淡灰色曲线，也标有箭头)。

图4和5显示在通过RNAi使CHO细胞中的基因C12orf35表达减少后，不同克隆和库中的2种不同的感兴趣模式多肽(抗体1和2)的抗体轻链和重链的mRNA表达水平。如果基因C12orf35的表达通过基因沉默减少，则抗体链的mRNA水平上调。因此，C12orf35表达减少意外引起HC和LC的mRNA水平提高。

图6显示用siRNA使基因C12orf35沉默后，获得显著更高的体积效价。

图7还证明基因C12orf35沉默得到更高的比生产率(由培养的第3、4、5和6天计算)。siRNA-1的沉默作用比siRNA-2更显著并因而产生更高的表达率。

图8显示46个衍生自CHO细胞系(C8DEL)的最高产克隆(黑色)相比45个获自亲本细胞系的最高产克隆具有更高效价，C8DEL缺失染色体8(q臂)上含基因C12orf35的端粒区，而亲本细胞系测试为IPO8阳性(灰色)。

图9显示用叶酸受体/DHFR系统选择后，稳定转染的C8DEL细胞库的FACS分布。MTX浓度从A到E增加(A:无MTX；B:1nM MTX；C:5nM MTX；D:10nM MTX；E:50nM MTX)。重组抗体表达基于荧光检测。在50nM MTX时，如FACS分析所证实，所得库中主要包括高产细胞。所得库分布明显类似细胞克隆的分布。这支持本文所述的技术对表达产率有巨大影响。

图10显示3个不同细胞克隆(CHO野生型以及2个衍生自所述野生型的FAM60A敲除克隆s16和s23)用编码抗体作为感兴趣产物的表达载体稳定转染后，进行7/8周稳定性试验的结果。(1)显示用亲本野生型细胞(衍生自CHO-K1)所得的稳定性结果；(2)显示用FAM60A敲除克隆s16所得的稳定性结果；(3)显示用FAM60A敲除克隆s23所得的稳定性结果。可见，表达稳定性在衍生自FAM60A敲除细胞的细胞克隆中显著增加(见(2)和(3))。用FAM60A敲除细胞来重组表达时，稳定克隆的数目显著增加。因而，削弱FAM60A在宿主细胞中的效果(本文通过基因敲除实现)，可显著提高表达稳定性。因此，根据一个实施方式，额外削弱蛋白FAM60A在真核细胞中的效果，优选通过减少或消除功能表达，来提高稳定转染后的表达稳定性。

具体实施方式

本公开尤其基于以下意外发现：基因C12orf35表达产物的效果受损的真核细胞能以显著提高的产率表达感兴趣的重组产物，所述受损的成因例如：减少或消除内源基因C12orf35的功能表达、缺失所述基因或引入突变。根据基因C12orf35对感兴趣的重组产物表达具有强烈影响这一意外发现，本公开还提供能改善感兴趣产物重组生产的新颖选择和生产方法以及相关技术。因此，本公开对现有技术作出重要贡献。

现在详细描述各方面以及其合适和优选的实施方式。

A.经修饰真核细胞

根据第一方面，本公开提供经分离真核细胞，其中基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果受损。如哺乳动物细胞的实施例所示，各经修饰真核细胞在用表达载体稳定以及瞬时转染后显示明显更高的生产率，所述载体包括编码感兴趣产物的多核苷酸，如实施例所示。此外，用各经改变真核细胞时，转染细胞群中的高表达细胞丰度增加。在多种实施方式中，还发现克隆稳定性提高。提高的表达稳定性能缩短或甚至跳过耗时的高表达细胞克隆稳定性分析。其它优点也描述于下文并可由实施例显见。因此，使用这些具有优势的新型真核细胞系重组生产感兴趣产物，可减少鉴定高表达细胞或细胞克隆的筛选工作，特别能减少获得适合大规模生产感兴趣产物的高表达细胞克隆所需的时间。因此，这些真核细胞系被用作重组生产技术的宿主细胞时具有重要优势。

C12orf35基因在真核细胞例如哺乳动物如人、小鼠和仓鼠细胞中内源表达。C12orf35基因的表达产物是较大蛋白。序列表显示不同哺乳动物内源C12orf35基因所编码蛋白的示范性氨基酸序列或推定氨基酸序列，例如仓鼠(SEQ ID NO:1和2)、人(SEQ ID NO:3和4)、小鼠(SEQ ID NO:5)、牛(SEQ ID NO:6)和野猪(SEQ ID NO:7)。来自中国仓鼠C12orf35的CDS(编码DNA序列)如SEQ ID NO:8所示。此外，对来自中国仓鼠C12orf35mRNA的5’UTR(见SEQ ID NO:9)和3’UTR(见SEQ ID NO:10)的片段测序。基因C12orf35在仓鼠中也称为C12orf35样或C12orf35同源物，或在小鼠中称为2810474O19Rik。灰仓鼠(Cricetulusgriseus)的基因、编码序列和预测C12orf35蛋白信息公开于NCBI:XM_003512865，其通过引用纳入本文。其在人中也称为KIAA1551。所述蛋白或基因在不同物种可被赋予不同名称，非限制性别称(别名)也列于上表1。本文所用的术语“C12orf35”还包括具有与C12orf35相同功能的任意C12orf35同源物和直向同源物。因此，本文所用的术语“C12orf35基因”尤其涵盖任何内源基因，其编码的蛋白与一个或多个SEQ ID NO:1-7所示氨基酸序列或SEQ ID NO8编码蛋白共有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性。所述基因编码的蛋白优选具有与含SEQ ID NO:1所示或一个或多个SEQ ID NO:2-7所示的氨基酸序列的蛋白或SEQ ID NO:8编码蛋白相同的功能。所述基因能如本文所述修饰以削弱未修饰细胞表达的表达产物功能。基因C12orf35表达的蛋白在文献中未详细描述。本文所用的术语“C12orf35蛋白”或“内源C12orf35基因的表达产物”和类似表达涵盖C12orf35同源物和直向同源物，且尤其涵盖与一个或多个SEQ ID NO:1-7所示氨基酸序列或SEQ ID NO 8编码蛋白共有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性或同一性的任何蛋白。这种C12orf35蛋白优选具有与含SEQ ID NO:1所示或一个或多个SEQ ID NO:2-7所示的氨基酸序列的蛋白或SEQ ID NO:8编码蛋白相同的功能。可根据参考蛋白的全长计算同源性、各同一性。

本公开尤其涉及经修饰真核细胞，如优选哺乳动物细胞，其中C12orf35基因表达产物在所述细胞中的效果受损，所述C12orf35基因通常由对应的未修饰真核细胞内源表达。如实施例所示，细胞的这种修饰(可为瞬时的或永久)能增加感兴趣重组产物的表达。

有数种可选方法来修饰真核细胞以削弱基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果。例如可在基因水平或蛋白水平上削弱基因C12orf35表达产物的效果并由此削弱C12orf35蛋白的效果。可例如通过修饰C12orf35蛋白的结构/序列、转录和/或翻译，削弱C12orf35的效果。以下描述非限制性情况。

根据一个实施方式，基因C12orf35表达产物在真核细胞中的效果受损，因为基因C12orf35在所述细胞中的功能表达被减少或消除。如实施例所示，例如通过基因沉默或缺失所述基因改变基因C12orf35的表达，是提供能以高产率表达感兴趣重组产物的真核细胞的极有效措施。当基因C12orf35在真核细胞中的表达水平被减少或消除并因而在相应的经改变细胞中产生功能较少或无功能的C12orf35蛋白时，感兴趣重组产物的表达产率显著增加。功能性C12orf35表达与重组蛋白表达产率之间的这种相关性是一个意外发现。

减少或消除基因C12orf35的功能表达可通过多种方式实现。例如，功能表达能通过如下减少：降低基因C12orf35的表达水平或破坏C12orf35功能或通过此类方法的组合。根据一个实施方式，改变所述细胞，通过基因敲除、基因突变、基因缺失、基因沉默或前述方法的任意组合来减少或消除基因C12orf35的功能表达。根据一个实施方式，基因C12orf35的功能表达通过基因敲除在细胞中减少或消除。基因敲除是通过破坏基因功能而使其无效的基因技术。例如，核酸能插入编码序列内，从而破坏基因功能。此外，完整C12orf35基因或其部分可缺失，从而相应的经改变细胞没有蛋白表达或无功能蛋白表达。另一选择是将一种或多种敲除突变引入编码序列，产生无功能表达产物或较少功能的表达产物。例如，能引入一种或多种移码突变，其产生无功能表达产物或较少功能表达产物。替代或补充地，一个或多个终止密码子可被引入编码序列，从而获得截短、无功能或较少功能的蛋白。因此，根据一个实施方式，基因C12orf35包括提供无功能表达产物或较少功能表达产物的一种或多种突变。其它选择包括但不限于启动子、5’-和/或3’UTR或其它调控元件中的一种或多种突变。根据一个实施方式，基因C12orf35的启动子功能被破坏，例如通过引入启动子缺失或在启动子与转录起始之间引入构建体。技术人员也熟知实现基因敲除以抑制或消除靶基因表达的方法，因而不需要本文任何详述。然而，以下描述一些非限制性实施例。

根据一个实施方式，C12orf35基因通过遗传工程被功能性敲除。示例包括但不限于基因组编辑，如人工核酸酶介导的基因组编辑(GEEN)。这是一种遗传工程，其中使用人工核酸酶或“分子剪刀”插入、取代或从基因组中移除DNA。所述核酸酶在基因组所需位置产生特定双链断裂(DSB)，并利用细胞内源机制通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)的天然过程修复所诱发的断裂。有至少4个可使用的工程核酸酶家族：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR和人工大范围核酸酶再造型归巢核酸内切酶(engineered meganuclease re-engineered homing endonucleases)。

根据一个实施方式，真核细胞基因组中存在的基因C12orf35的一个或多个拷贝发生如敲除或缺失的改变，以减少或消除并因而削弱基因C12orf35表达产物在真核细胞中的效果。因此，根据一个实施方式，至少一个基因C12orf35拷贝在真核细胞基因组中缺失或功能失活。例如，可有一种或多种突变被插入基因C12orf35的一个或多个拷贝(如果存在超过一个拷贝)以提供无功能表达产物或较少功能表达产物或者完全去除或减少表达，并因而削弱C12orf35在哺乳动物细胞中的效果。由此，基因C12orf35在基因组中基本失活。根据一个实施方式，如果存在超过一个拷贝，所有基因C12orf35拷贝在真核细胞优选哺乳动物细胞中各自被改变。

根据一个实施方式，所述真核细胞是后生动物细胞、脊椎动物细胞或优选哺乳动物细胞。根据一个实施方式，所述细胞中染色体有部分缺失，其中缺失的部分包括基因C12orf35。根据一个实施方式，含基因C12orf35的染色体部分在所有含基因C12orf35拷贝的染色体中缺失。因此，所有基因C12orf35拷贝从基因组中缺失。

根据一个实施方式，部分染色体端粒区缺失，其中缺失的部分包括基因C12orf35。根据一个优选实施方式，经改变细胞是啮齿动物细胞。根据一个实施方式，所述细胞是仓鼠细胞例如CHO细胞，且在基因组中缺失染色体8端粒区的至少一部分，其中所述缺失部分包括基因C12orf35。术语“C12orf35”的含义如上所解释，由所述术语范围涵盖的同源物和直向同源物的非限制性别称也示于表1。根据一个实施方式，这类缺失发生在仓鼠细胞尤其是中国仓鼠细胞染色体8的q臂，其中包括FAM60A基因。如实施例所示，在染色体8端粒区中含相应缺失的CHO细胞特别适合作为重组表达的宿主细胞。用表达载体稳定或瞬时转染后，这些细胞显示的生产率显著高于所述染色体8端粒区部分未丧失的细胞。此外，经转染细胞群体中高表达型细胞的丰度被显著提高，因而其数量相应占比被显著提高。在稳定转染的情况中，重组表达的稳定性被显著提高，例如在失去所述染色体8端粒区部分的这类仓鼠细胞中。其它重要优点在实施例中有详述，这些实施例中进一步表征染色体8端粒区相应部分由于染色体断裂而缺失的CHO细胞。所述优良特性使得这些仓鼠细胞特别适合作为工业生产细胞系。或者，经改变啮齿动物细胞可以是小鼠细胞，其中在基因组中缺失染色体6端粒区部分的至少一部分，其中所述缺失部分包括基因C12orf35。小鼠染色体6端粒区与仓鼠染色体8端粒区高度类似。

根据一个实施方式，在仓鼠染色体对8(或在小鼠细胞情况中是染色体对6)的两条染色体中缺失或不存在至少一部分端粒区，其中所述缺失部分包括C12orf35基因。

根据一个实施方式，在仓鼠染色体对8(或在小鼠情况中是染色体对6)的1条染色体中缺失至少一部分端粒区，其中所述缺失部分包括C12orf35基因，且基因C12orf35在另一染色体中的表达减少或消除。减少或消除基因表达的合适方法为技术人员已知且本文也描述非限制性实施例。根据一个实施方式，这种缺失出现在仓鼠尤其是中国仓鼠的染色体8q臂中。

根据一个实施方式，缺失的染色体区包括C12orf35基因以及额外一个或多个选自下组的基因或全部：Bicd1、Amn1、甲基转移酶样蛋白20、Dennd5b、FAM60A、Caprin2和Ipo8。根据一个实施方式，所有上述基因缺失。根据一个实施方式，缺失的染色体区额外包括Tmtc1的至少一部分或全基因。在仓鼠细胞如CHO细胞中，这些基因也位于染色体8端粒区。根据一个实施方式，缺失的染色体区额外包括基因RPS4Y2(若存在)。图1提供中国仓鼠基因组染色体8端粒区的概述，其中显示了上述基因的位置。如实施例所示，在表达产率和表达稳定性方面，含染色体8端粒区(q臂)相应缺失的CHO细胞具有特别有利的性质。在小鼠细胞中，上述基因位于染色体6端粒区。上述含同源物和直向同源物的个体基因和/或编码蛋白的非限制性别称也示于上表1，上面用于个体基因的术语范围涵盖这些相应的基因。

根据一个实施方式，C12orf35基因缺失由染色体断裂引起。染色体断裂可被诱发，例如通过用促进染色体断裂的毒剂，如MTX、阿非迪霉素或潮霉素，来处理真核细胞。其它诱导染色体断裂的选择包括但不限于放射、照射、诱变剂、致癌物质和博来霉素。染色体断裂还可在转染如电穿孔期间自发发生。诱导染色体断裂的方法也为技术人员已知，因此不需要本文任何详述。诱导染色体断裂后，能鉴定出具有所需断点(导致基因C12orf35缺失)的真核细胞，例如通过分析DNA或使用本公开第五方面所述方法。例如，能分析经处理细胞的表达分布以测定基因C12orf35或位于基因C12orf35着丝粒的基因是否表达，表达是否减少或者基因是否未被表达。例如，在小鼠或仓鼠细胞的情况中，能分析基因C12orf35是否表达，替代或补充地，能分析一个或多个选自甲基转移酶样蛋白20、Dennd5b、FAM60A、Caprin2、Ipo8、Tmtc1的基因或位于上述基因端粒端的基因(其中这里的端粒端意味着进入端粒末端的方向)是否由细胞表达和/或表达是否减少或消除。如果诱导的断点位于相应基因的着丝粒端(其中这里的着丝粒端意味着进一步进入染色体并因此进一步远离端粒末端)，含所述基因的端粒末端缺失，消除或减少(如果存在别处的其它基因拷贝被表达)其表达。如图1所见，基因C12orf35位于上述基因的端粒端，即其位于进一步进入端粒末端方向。因此，如果上述基因通过染色体断裂而缺失，缺失区域还包括基因C12orf35。由此，上述基因能有效地被用作标记物来基本间接确定诱导的染色体断裂是否引起含基因C12orf35的染色体部分缺失。此外，发现即使位于基因C12orf35端粒端，其它基因如Bicd也能被用作标记物以确定是否诱导引起基因C12orf35缺失的染色体断裂。在CHO细胞中发现，如果基因Bicd1由于染色体断裂而缺失，所述缺失通常还包括基因C12orf35。通过分析数百个克隆的表达特征确认，上述基因能有效地被用作标记物以区分具有高且稳定表达特性的细胞克隆与具有低且不稳定表达特性的细胞克隆。图2显示上述基因在CHO细胞中的相对表达。如图2所示，相比位于染色体8端粒区的其它基因，在不包括染色体8端粒区缺失的正常CHO细胞如CHO-K1细胞中，基因Ipo8(3)、FAM60A(5)和C12orf35(9)表达相对较高。因此，分析中纳入一个或多个上述基因是有利的，因为这简化了其表达消除或减少的检测。含同源物和直向同源物的前述个体基因和编码蛋白的非限制性别称也示于上表1，且上面用于个体基因的术语范围涵盖相应基因。

根据一个实施方式，染色体8上的断点位于甲基转移酶样蛋白20基因着丝粒端、Dennd5b基因着丝粒端、FAM60A基因着丝粒端、Caprin2基因着丝粒端、Ipo8基因着丝粒端或基因RPS4Y2着丝粒端。发现仓鼠基因组染色体8上的断点通常位于Ipo8基因着丝粒端。根据一个实施方式，染色体8上的断点位于Tmtc1基因内，所述基因不表达或低表达。根据一个实施方式，位于Tmtc1基因着丝粒端的Ergic2基因在染色体8上不缺失。因此，根据一个实施方式，断点是Ergic2基因端粒端(其中这里的端粒端意味着向下进入端粒末端方向)且存在Ergic2基因。

根据一个实施方式，基因C12orf35在真核细胞优选哺乳动物细胞中的功能表达减少或消除。例如通过改变基因C12orf35的启动子和/或增强子以较少生产或不生产转录本，或通过基因沉默技术如转录或转录后基因沉默，基因C12orf35的功能表达可被多种方式影响。根据一个实施方式，经分离真核细胞包括基因C12orf35启动子区的一种或多种突变。例如，启动子区可改变成提供较少功能或无功能的启动子，启动子还可完全去除。替代或补充地，在基因C12orf35启动子与起始密码子之间能加入含终止密码子的编码多肽的多核苷酸序列，引起其它多肽而不是C12orf35的表达。各方法为技术人员熟知，因此不需要本文任何详述。

功能基因表达减少可达到甚至消除表达的水平。例如通过介导RNA干扰的反义分子或分子，能实现转录后基因沉默。非限制性示例简述于下。

反义多核苷酸可设计成特异性结合RNA，引起RNA-DNA或RNA-RNA杂交体形成，阻滞反转录或信使RNA翻译。开发了许多反义形式并能大致归类为酶依赖性反义或空间堆积反义。酶依赖性反义包括依赖RNase H活性以降解目标mRNA，包括单链DNA、RNA的形式，以及硫代磷酸反义。反义多核苷酸通常在细胞内通过表达包含反义链作为转录链的反义构建体来产生。反式切割催化RNA(核酶)是具有内切核糖核酸酶活性的RNA分子。核酶可特定设计用于具体目标，并可改造成能在细胞RNA背景下位点特异性切割任何RNA种类。切割事件使得mRNA不稳定并阻止蛋白表达。可改变真核细胞基因组以表达(例如永久地)相应的反义分子。

用于在转录后水平减少基因C12orf35功能表达的另一合适选择基于RNA干扰(RNAi)。如实施例所示，为增加宿主细胞的生产率，通过RNAi减少基因C12orf35表达是有效的。RNAi使基因C12orf35沉默后，生产明显更多的重组产物。此外，如实施例所证明，基因C12orf35沉默后，感兴趣产物的mRNA表达水平增加。通过RNAi使基因沉默的方法为技术人员熟知，因此不需要本文任何详述。能用于使基因C12orf35表达沉默的RNAi诱导化合物的示例包括但不限于小干扰核酸(siNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)以及其在细胞中加工成实际RNAi诱导化合物的前体。根据一个实施方式，siRNA用于沉默。siRNA可以为在各链有3’突出端的双链分子。还可使用钝端分子。所述siRNA可包括脱氧核糖核苷酸类以及核糖核苷酸类，此外可包括修饰核苷酸。siRNA化合物的数个实施方式和变化为本领域已知并能用于降低基因C12orf35表达。能使用适当计算方法、应用某些设计-算法鉴定在RNA水平上针对靶基因中选定/鉴定的靶序列的合适siRNA。为获得针对靶转录本的siRNA，双链分子可被直接转染到细胞中。如实施例所示，这种降低基因C12orf35表达的短暂方法有效增加感兴趣产物的重组表达。或者，siRNA可通过dicer加工产生，dicer是将长dsRNA或小发夹RNA(shRNA)转变成siRNA的酶。这些前体或终siRNA分子能外源(人工)生产且随后能通过多种转染方式引入真核细胞。根据另一个实施方式，RNAi诱导化合物由转染入真核细胞的载体表达。对于siRNA能如下进行：例如通过在2条链之间引入环，从而生产单一转录本，其随后可在真核细胞中加工成功能siRNA。这类转录盒一般使用通常指导小核RNA(shRNA)转录的RNA聚合酶3启动子(例如U6或H1)。假定从载体得到的shRNA转录本之后由dicer加工，从而生产双链siRNA分子，优选具有特征性3’突出端。根据一个实施方式，这类shRNA提供载体被稳定整合入真核细胞基因组。此实施方式是有利的，因为基因C12orf35的下调由于持续产生的siRNA而相当稳定且非短暂。然后，含相应shRNA提供载体的细胞能用含有编码感兴趣产物的多核苷酸的表达载体转染。或者，能采用共转染策略，其中产生shRNA的载体与含编码感兴趣产物的多核苷酸的表达载体共转染。

例如，转录基因沉默可包括表观遗传修饰。根据一个实施方式，基因C12orf35的表达通过表观遗传沉默而降低。鉴定哺乳动物细胞，其中基因C12orf35的表达通过表观遗传沉默(推测为DNA甲基化)而降低，且所述细胞的重组生产率非常高。此外，该基因序列能改变成缩短mRNA半衰期。这也实现了C12orf35蛋白在相应改变细胞中的效果降低。

根据一个实施方式，通过靶向参与调节基因C12orf35表达的调控元件，减少或消除基因C12orf35的功能表达。例如，通过敲除、缺失、下调或使所述调控元件失活或活性下降的任何其它改变，能靶向转录因子、启动子(也见上文)、增强子、UTR或其它调控元件，从而阻止或减少基因C12orf35的功能表达并因此削弱内源表达产物的效果。

根据一个实施方式，真核细胞基因组改变成通过异源表达突变C12orf35来削弱C12orf35的效果，所述突变C12orf35相比内源表达的C12orf35蛋白无功能或功能较少。在此实施方式中，在编码感兴趣多肽的异源多核苷酸以外，经分离真核细胞还包括编码突变C12orf35的另一异源多核苷酸。通过过表达相应的无功能或较少功能的突变型C12orf35，能产生显性负调节表型。另一削弱并因而降低C12orf35在细胞中效果的选择是异源表达蛋白，例如中和C12orf35并因而削弱C12orf35在细胞中效果的抗体。根据一个实施方式，通过减少或消除与C12orf35功能性相互作用的分子功能表达来削弱C12orf35在细胞中的效果。

根据另一个实施方式，使用如下抑制C12orf35基因表达的低分子量化合物：其特异性抑制转录因子与启动子中调控区的结合，或抑制靶基因转录所需的转录激活子。

根据一个实施方式，基因C12orf35的表达下降至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少125倍、至少250倍、至少500倍、至少750倍、至少1000倍、至少1250倍、至少1500倍、至少1750倍或至少2000倍。例如，能用实时RT-PCR或其它灵敏的RNA检测法测定。这种下降可通过例如与基因C12orf35表达未减少的未修饰参照细胞比较来得到。根据一个实施方式，相较同一细胞中18S RNA的表达(设为100％)，基因C12orf35的表达为0.05％或更少、0.0475％或更少、0.045％或更少、0.0425％或更少、0.04％或更少、0.0375％或更少、0.035％或更少、0.0325％或更少、0.03％或更少、0.0275％或更少、0.025％或更少、0.0225％或更少、0.02％或更少、0.0175％或更少、0.015％或更少。根据一个实施方式，相较同一细胞中18S RNA的表达(设为100％)，基因C12orf35的表达甚至更少，如0.001％或更少、0.0001％或更少或者甚至0.00001或更少。相较基因C12orf35功能表达未减少或消除的对应细胞，如果所述经修饰真核细胞转染有编码感兴趣产物的表达载体，基因C12orf35的功能表达减少，引起感兴趣重组产物的表达增加。根据一个实施方式，相较基因C12orf35功能表达未减少或消除的对应细胞的表达，感兴趣重组产物的表达为至少1.5倍、至少1.75倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。根据实施方式，相较基因C12orf35表达未减少或消除的对应细胞的表达，所得表达率为至少8倍、至少10倍或至少15倍。例如，用G418选择后测定的表达率是基因C12orf35表达未减少或消除的对应细胞速率的多至35倍。重组产物的表达率可被测得，例如用实施例所述的试验检测。

根据另一个实施方式，通过使用抵消或抑制C12orf35基因表达产物效果的化合物，C12orf35基因表达产物的效果被减少或消除。相应的抑制化合物可以是任何性质，包括但不限于化合物如特定小分子、蛋白和肽。另一可能性是例如通过刺激蛋白泛素化，用化合物如低分子量化合物刺激蛋白产物降解。

根据一个实施方式，选自Bicd1、Amn1、甲基转移酶样蛋白20、Dennd5b、FAM60A、Caprin2、Ipo8、RPS4Y2和Tmtc1的一个或多个基因或者位于上述基因端粒端的一个或多个基因的表达产物效果额外受损。前述含同源物和直向同源物的个体基因和/或编码蛋白的非限制性别称也示于上表1，且上面用于个体基因的术语范围涵盖编码相应蛋白的相应基因。受损效果同样可例如通过减少或消除相应基因的功能表达实现。上文结合C12orf35基因描述了合适的技术和实施方式，它们同样应用于任何其它靶基因。如上所述，所述基因位于中国仓鼠染色体8和小鼠染色体6的端粒区。如果一部分所述端粒区例如通过上述的诱导染色体断裂而缺失，缺失的区域通常包括一个或多个上述基因。

根据一个优选实施方式，在C12orf35效果受损的所述细胞中，额外削弱蛋白FAM60A的效果，优选通过减少或消除FAM60A基因的功能表达。另一意外发现是例如通过减少或消除FAM60A基因的功能表达削弱FAM60A在真核细胞中的效果，引起在用感兴趣产物编码多核苷酸稳定转染后所得以改善的稳定特性表达重组产物的细胞克隆丰度显著增加。因此，对于FAM60A基因，鉴定了影响重组表达稳定性的另一关键基因。额外削弱FAM60A在细胞中的效果，能通过增加表达稳定性来显著提高感兴趣产物的重组生产。如实施例所示，削弱FAM60A效果(例如通过基因敲除)，可显著提高稳定特性。就相应宿主细胞而言，相较其中基因组未改变以削弱蛋白FAM60A在细胞中效果的细胞，长时间培养期间表达稳定性的明显损失更少见；而且若出现，引起的生产率减少不太显著。稳定转染后稳定克隆的丰度增加。因此，可缩短或甚至跳过鉴定不倾向或不太倾向于在长时间培养期间不稳定的宿主细胞的稳定性分析。这是一个重要优势，因为其缩短获得稳定表达型细胞克隆所需的时间，所述细胞克隆在延长时间段中以高产率表达感兴趣的重组产物并因而适合大规模生产目的。这能显著减少筛选工作。因此，在同一细胞中削弱FAM60A和C12orf35的效果尤其有利，因为提供的宿主细胞在表达稳定性和产率方面显示改善的特性。由此，提供具有特别有利特性以生产感兴趣重组产物的真核宿主细胞。如本文所述，所述真核细胞优选是哺乳动物细胞。

FAM60A是作用于转录抑制的SIN3-组蛋白脱乙酰酶(HDAC)复合体(SIN3/HDAC复合体)的亚基(Munoz等,2012,THE Journal of Biological Chemistry卷287,第39期,32346-32353页；Smith等,2012,Mol Cell Proteomics11(12):1815-1828)。组蛋白脱乙酰酶(HDAC)催化从组蛋白移除乙酰基。赖氨酸上的组蛋白乙酰化是调节染色质构象的主要机制。组蛋白乙酰化促进松弛的转录活性染色质状态，而组蛋白脱乙酰酶(HDAC)催化的脱乙酰作用有利于沉默、失活状态。数据库分析揭示在大部分后生动物中存在至少一种FAM60A直向同源物，但线虫中没有。FAM60A基因在后生动物中保守，且可见于已完整测序的所有脊椎动物和大部分无脊椎动物基因组。例如，在人、大鼠、小鼠和牛之间可发现FAM60A蛋白的100％序列同一性。FAM60A同源物的序列相似性研究表明基因组中主要仅有此家族的单一代表性成员。少有例外。根据Smith等(2012)，FAM60A蛋白具有缺乏任何已知蛋白结构域的独特序列。此外，Smith等(2012)描述其不显示与人蛋白质组中其它已知蛋白的任何序列同源性。来自不同物种的FAM60A蛋白之间的序列比较显示FAM60A蛋白一般包括3个区域：(1)含所有后生动物中高度保守区段的N-末端(2)在脊椎动物中高度保守、而在无脊椎动物中由可变长度的非保守间隔子组成的中间区(3)含所有后生动物中高度保守区段的C-末端。因此，在FAM60A N-和C-末端中观察到最高保守性。如上所述，研究表明FAM60A在多种真核细胞类型(例如尤其是哺乳动物细胞)中与SIN3/HDAC复合体相关联。然而，迄今为止，关于FAM60A的功能信息相当有限。最新功能研究(参见Smith等,2012)表明FAM60A可抑制基因表达并调节特定基因亚群。Smith等(2012)报道FAM60A在调节TGF-β信号通路中的作用，该通路在诸如癌症进展、转移、细胞迁移和免疫监视等过程中起关键作用。发现FAM60A担当TGF-β信号通路组分的转录抑制子，而此FAM60A功能看来通过其在SIN3-HDAC复合体中的作用而实现。用针对FAM60A的siRNA耗尽不同癌细胞系中的FAM60A，引起正常癌细胞形态变化。此外，发现FAM60A蛋白水平确实在U2OS细胞的细胞周期进程中周期性变化(Munoz等,2012)。U2OS人骨肉瘤细胞中用FAM60A siRNA的FAM60A敲减实验揭示FAM60A限制细胞周期蛋白D1基因表达。针对此科学背景，非常意外地发现在真核细胞(例如优选哺乳动物细胞)中削弱蛋白FAM60A的效果，可显著增加异源基因表达在所述细胞中的稳定性，而不会消极影响对重组表达重要的其它细胞特性。细胞长时间培养期间蛋白FAM60A效果与表达稳定性之间的这种关联是出乎意料的。

如所述，FAM60A基因在后生动物并由此在哺乳动物如人、小鼠、大鼠和仓鼠中内源表达，FAM60A的氨基酸序列在哺乳动物以及脊椎动物中高度保守。FAM60A效果受损的经改变真核细胞获自内源表达FAM60A的真核细胞。为了方便简单，蛋白FAM60A以及编码蛋白FAM60A的FAM60A基因在本文中以大写字母拼写，即使在一些物种中所述基因和/或蛋白使用不同的拼写。序列表显示以下不同脊椎动物种的已知和/或预测FAM60A蛋白的示范性氨基酸序列：智人(Homo sapiens)(SEQ ID NO:11)、褐家鼠(Rattus norvegicus)(SEQ IDNO:12)、小家鼠(Mus musculus)(SEQ ID NO:13)、灰仓鼠(Cricetulus griseus)(SEQ IDNO:14)、原鸡(Gallus gallus)(SEQ ID NO:15)、黑猩猩(Pan troglodytes)(SEQ ID NO:16)、苏门答腊猩猩(Pongo abelii)(SEQ ID NO:17)和家牛(Bos taurus)(SEQ ID NO:18)。灰仓鼠的预测FAM60A cDNA如SEQ ID NO:19所示(来自14-679的编码序列；还参见NCBI参考序列:XM_003505482.1)。不同物种中的蛋白FAM60A或FAM60A基因能赋予不同名称，非限制性别称(别名)也列于上表1。本文所用的术语“FAM60A”还包括具有与FAM60A相同功能的任何FAM60A同源物和直向同源物。根据一个实施方式，本文所用的术语“FAM60A”具体指与一种或多种SEQ ID NO:11-18所示氨基酸序列共有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的蛋白。根据一个实施方式，前述百分值指多肽同一性，而不是同源性。同源性、相应同一性可根据参考蛋白的全长计算。相应的蛋白优选与具有SEQ ID NO:11所示或一种或多种SEQ ID NO:12-18优选SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的蛋白具有相同的功能。FAM60A蛋白未在文献中被详细描述。因此，非常令人惊讶的是如果宿主细胞基因组改变成内源蛋白FAM60A在细胞中的效果受损，如通过减少或消除FAM60A基因在所述细胞中的功能表达来实现，则重组宿主细胞的表达稳定性可提高。出乎意料的是FAM60A影响感兴趣重组产物的表达稳定性。根据一个实施方式，改变编码FAM60A蛋白的FAM60A基因以削弱FAM60A在细胞中的效果。例如，这能通过如本文所述的遗传工程技术如基因敲除技术来实现。不同哺乳动物的基因组基因序列已知，且例如描述于智人(NCBI Gene-ID:58516)；褐家鼠(NCBI Gene-ID:686611)；小家鼠(NCBI Gene-ID:56306)；家牛(NCBI Gene-ID:538649)等。转录变体可以物种依赖性方式和不同数目存在。例如，人FAM60A基因表达3种UTR有差异但编码同一蛋白的假定转录本同种型。

根据一个实施方式，基因FAM60A的表达下降至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少125倍、至少250倍、至少500倍、至少750倍、至少1000倍、至少1250倍、至少1500倍、至少1750倍、至少2000倍、至少2500倍、至少3000倍或至少3500倍。表达能被测定，例如用实时RT-PCR或其它灵敏的RNA检测法。这种下降可实现，例如与内源基因FAM60A表达未减少的未修饰参照细胞相比较。根据一个实施方式，相较同一细胞中18S RNA的表达(设为100％)，基因FAM60A的表达为0.05％或更少、0.04％或更少、0.03％或更少、0.02％或更少、0.01％或更少、0.005％或更少或者0.0025％或更少。根据一个实施方式，相较同一细胞中18S RNA的表达(设为100％)，基因FAM60A的表达甚至更少，如0.001％或更少、0.0005％或更少或者甚至0.0002％或更少。

根据一个实施方式，经分离真核细胞源自真核细胞群，其改变成蛋白FAM60A的效果在所述细胞中额外受损且其中所述细胞包括稳定整合入其基因组的编码感兴趣产物的异源多核苷酸，其中源自所述群的平均至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的细胞在至少8周、优选10周、更优选12周的时间段中损失不超过30％、优选不超过25％的感兴趣产物表达效价。如实施例所示，转染和鉴定稳定转染的细胞后，当使用本文所述的经改变细胞时，在长时间培养期间不显示生产率逐步损失的细胞量增加，也就是从选定细胞群获得更多稳定细胞克隆。稳定特性能通过将来自所述群的个体细胞作为细胞克隆培养并测定指定时间段中的效价来检测。稳定性能够测得，例如用实施例所述的方法。根据表达的蛋白以及其例如密码子是否优化，稳定率可因项目不同而不同。然而，用本公开所述经改变真核细胞时，相较FAM60A效果未受损的野生型细胞，在分析的所有项目中观察到稳定表达克隆显著增加。有稳定表达特性的细胞丰度在成功转染的宿主细胞群中显著增加。因此，在细胞中FAM60A和C12orf35效果受损的这种实施方式中，选出长时间培养期间生产率逐步损失的不稳定克隆用于大规模生产的风险在此实施方式中明显减少。此重要优点能显著减少甚至完全跳过通常用于去除不稳定克隆的长期稳定性分析。

所述真核细胞衍生自内源表达C12orf35基因的物种。此外，所述真核细胞衍生自通常表达所述基因的细胞类型。示例如下所述。术语“经分离”用于清楚表明所述真核细胞不是包含在活生物体如动物或人内。如本文所述，该细胞能作为细胞培养物、细胞系、细胞克隆等提供。示例也如下所述。如上所述，与内源表达C12orf35的对应未修饰真核细胞相比，所述真核细胞修饰成削弱基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果。削弱优选通过减少或消除基因C12orf35的功能表达来实现。实施方式如上所述。为了提供均一并因而具有可预测特性的生产细胞系，优选改变真核细胞基因组以实现削弱。合适的实施方式如上所述。随后，相应改变的真核细胞可转染有含编码感兴趣产物的多核苷酸的表达载体。所述真核细胞可以是后生动物细胞如脊椎动物细胞，优选哺乳动物细胞。因此，本文所述的真核细胞的全部实施方式通常可应用于使用哺乳动物细胞的优选实施方式。例如，真核细胞可选自啮齿动物细胞、人细胞和猴细胞。优选的真核细胞是啮齿动物细胞，如衍生自仓鼠或小鼠的细胞。其能选自下组：中国仓鼠细胞如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、C127细胞、小鼠3T3成纤维细胞和SP2/0细胞。尤其优选CHO细胞。CHO细胞的示例是CHO-K1、CHO-S、CHO-K1SV、CHO-SSF3、CHO-DG44、CHO-DUXB11，或从中衍生的细胞系。如实施例所示，减少或消除基因C12orf35在CHO细胞中的表达可提供能以显著增加的产率生产重组产物的CHO细胞。C12orf35基因还在人细胞中表达。因此，根据一个实施方式，所述真核细胞衍生自人细胞，可例如选自HEK293细胞、MCF-7细胞、PerC6细胞、CAP细胞、造血细胞和HeLa细胞。另一替代是猴细胞，可例如选自COS细胞、COS-1、COS-7细胞和Vero细胞。根据一个实施方式，所述真核细胞(优选哺乳动物细胞)作为细胞克隆或细胞系提供。

根据一个实施方式，所述真核细胞不包括异源多核苷酸来编码感兴趣产物、异源多核苷酸来编码选择标记和/或异源多核苷酸来编码报告多肽，其由所述细胞表达、特别是分泌。例如，相应的“空的”真核细胞能用作重组生产技术的克隆细胞系。相应细胞能被稳定转染有编码感兴趣产物的异源多核苷酸，例如使用合适表达载体。基因C12orf35表达产物的效果受损且尚不表达且尤其不分泌重组产物的此类“空的”真核细胞因而能用不同表达载体转染，这取决于应被重组生产的所需感兴趣产物。因此，这类真核细胞系能用于不同项目，即用于生产不同感兴趣产物，尤其是分泌型感兴趣多肽。转染可以是瞬时或稳定的，且如实施例所证明，在两中实施方式中都观察到表达产率提高。

根据一个实施方式，所述真核细胞包括编码感兴趣产物的异源多核苷酸。感兴趣产物是应当由真核细胞大量表达的重组产物。感兴趣产物优选是多肽。此外，真核细胞可额外包括编码选择标记的异源多核苷酸和/或编码报告子的异源多核苷酸。这简化了对成功转染并因而表达感兴趣产物的宿主细胞的选择。此外，真核细胞可包括编码不同选择标记和/或报告多肽的数个多核苷酸。根据一个实施方式，编码感兴趣产物的异源多核苷酸稳定整合入真核细胞基因组，如第一方面所述。

本文所用的“异源多核苷酸”或“异源核酸”等表达具体指例如通过采用重组技术(如转染)引入真核细胞的多核苷酸序列。根据上下文，“多核苷酸”具体指通常从一个脱氧核糖或核糖连接到另一个的核苷酸聚合物，指代DNA以及RNA。术语“多核苷酸”不包括任何尺寸限制。

表达载体能用于引入异源多核苷酸。多核苷酸能包含于表达盒中。编码感兴趣产物的多核苷酸和编码选择标记或报告多肽的多核苷酸可位于相同或不同的表达载体。例如，引入真核细胞可通过将合适表达载体转染入宿主细胞来完成，所述载体包括编码感兴趣产物的多核苷酸。表达载体优选整合到宿主细胞基因组内(稳定转染)。在异源核酸不插入基因组的情况中，该异源核酸可在后期如当细胞经历有丝分裂时消失(瞬时转染)。如实施例所示，本文所述新型真核细胞对这两种实施方式即瞬时转染和稳定转染都有利。稳定转染优选用于产生高表达克隆，从而以工业规模生产感兴趣产物如感兴趣多肽。这对感兴趣的治疗或诊断多肽尤其重要。本领域已知数种合适方法用于引入异源核酸如表达载体到真核生物(如哺乳动物)宿主细胞，并因此不需要本文任何详述。相应方法包括但不限于磷酸钙转染、电穿孔、脂质转染、基因枪或聚合物介导的基因转移等。在传统的基于随机整合的方法以外，重组介导方法也能用于将异源多核苷酸转入宿主细胞基因组。相应方法为本领域熟知，不需要本文任何详述。合适载体设计的非限制性实施方式也于随后描述并参考各公开。

用于实现感兴趣重组产物表达的表达载体通常包含适合驱动转录的转录控制元件，如通常作为表达盒元件的启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、转录暂停或终止信号。如果所需产物是多肽，载体优选包括合适的翻译控制元件，如产生适于募集核糖体的5’帽结构的5’非翻译区，和终止翻译过程的终止密码子。所得转录本含有促进蛋白表达(即翻译)和适当翻译终止的功能翻译元件。能适当驱动所纳入多核苷酸表达的功能表达单元也称为“表达盒”。技术人员熟知表达盒应如何设计以能在真核细胞如优选哺乳动物细胞中表达。

表达盒优选包括如本文所述的编码感兴趣产物的多核苷酸以及编码选择标记和/或报告多肽的多核苷酸。数个实施方式是合适的。例如，各所述多核苷酸能包括在分开的表达盒中。这也称为单顺反子设置。本发明范围也涵盖：各多核苷酸中的至少2种包括在一个表达盒中。根据一个实施方式，至少一个内部核糖体进入位点(IRES)元件功能性位于从同一表达盒表达的多核苷酸之间。因此，确保从所述转录本获得单独翻译产物。基于IRES的相应表达技术以及其它双顺反子和多顺反子系统都是已知的，因而不需在此更多描述。

如所述，表达载体可包括至少一个启动子和/或启动子/增强子元件作为表达盒元件。启动子能分成两类：组成型发挥功能的启动子和由诱导或去阻遏调节的启动子。两者都适合。在许多细胞类型中驱动表达的强组成型启动子包括但不限于腺病毒主要晚期启动子、人巨细胞病毒立即早期启动子、SV40和劳斯肉瘤病毒启动子、鼠3-磷酸甘油激酶启动子、EF1a。根据一个实施方式，启动子和/或增强子获自CMV和/或SV40。转录启动子能选自下组：SV40启动子、CMV启动子、EF1α启动子、RSV启动子、BROAD3启动子、鼠rosa 26启动子、pCEFL启动子和β-肌动蛋白启动子。如果可以引起感兴趣产物在真核细胞(优选哺乳动物细胞)中表达，也能使用其它启动子。

此外，表达盒可包括至少一个内含子。通常，内含子位于开放阅读框5’末端，但也可位于3’末端。所述内含子可位于启动子和/或启动子/增强子元件与编码待表达感兴趣产物的多核苷酸开放阅读框5’末端之间。目前技术水平已知数个能与本公开联用的合适内含子。

感兴趣产物可以是任何能通过转录、翻译或任何其它遗传信息表达事件生产的生物产物，所述遗传信息由编码感兴趣产物的多核苷酸编码。感兴趣产物可选自多肽和核酸，尤其是RNA。所述产物可以是药物或治疗活性化合物，或待用于试验等的研究工具。感兴趣产物优选是多肽。能用本发明方法表达任何感兴趣多肽。术语“多肽”指含由肽键连接在一起的氨基酸聚合物的分子。多肽包括任何长度的多肽，包括蛋白(如具有大于50个氨基酸)和肽(如2-49个氨基酸)。多肽包括具有任何活性、功能或尺寸的蛋白和/或肽，且可包括例如酶(如蛋白酶、激酶、磷酸酶)、受体、转运蛋白、杀菌和/或内毒素结合蛋白、结构多肽、膜结合多肽、糖蛋白、球状蛋白质、免疫多肽、毒素、抗生素、激素、生长因子、血液因子、疫苗等。所述多肽可选自肽激素、白介素、组织纤溶酶原激活物、细胞因子、免疫球蛋白，尤其是抗体或功能抗体片段或其变体以及Fc-融合蛋白。根据本文所述的教导内容表达的感兴趣多肽还可以是多肽的亚基或结构域，如抗体重链或轻链或其功能片段或衍生物。术语“感兴趣产物”或“感兴趣多肽”可根据上下文指所述个体亚基或结构域或者由多个相应亚基或结构域组成的终蛋白。在一个优选实施方式中，感兴趣多肽是免疫球蛋白分子，更优选抗体或其亚基或结构域，如抗体重或轻链。本文所用的术语“抗体”具体指含由二硫键连接的2至少条重链和2条轻链的蛋白。术语“抗体”包括天然产生的抗体以及所有抗体重组形式，如人源化抗体、完全人抗体和嵌合抗体。各重链通常包括重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。各轻链通常包括轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。然而，术语“抗体”也包括其它抗体类型，如单域抗体，重链抗体(即仅由一条或多条特别是两条重链组成的抗体)，以及纳米抗体(即仅由单个单体可变域组成的抗体)。如上所述，编码感兴趣多肽的多核苷酸还可编码一个或多个抗体亚基或结构域作为感兴趣多肽，如重链或轻链或其功能片段或衍生物。所述亚基或结构域能表达自相同或不同表达盒。抗体的“功能片段或衍生物”具体指衍生自抗体并能与抗体结合相同抗原、尤其是相同表位的多肽。已显示抗体的抗原结合功能由全长抗体片段或其衍生物实现。抗体片段或衍生物的示例包括(i)Fab片段，由各重链和轻链的可变区及第一恒定结构域组成的单价片段；(ii)F(ab)₂片段，含由二硫键在铰链区连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由重链的可变区及第一恒定结构域CH1组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的重链和轻链可变区组成；(v)scFv片段，由单一多肽链组成的Fv片段；(vi)(Fv)₂片段，由共价连接在一起的2个Fv片段组成；(vii)重链可变结构域；和(viii)多抗体，由共价方式连接在一起的重链可变区和轻链可变区组成，其连接方式使重链和轻链可变区的相联仅发生在分子间而非分子内。根据一个实施方式，真核细胞分泌感兴趣的重组多肽到细胞培养基中。根据一个实施方式，感兴趣多肽不是C12orf35蛋白或不包括C12orf35蛋白。

真核细胞可包括或不包括与编码感兴趣产物的多核苷酸对应、相应一致的内源多核苷酸。根据一个实施方式，真核细胞不包括对应感兴趣产物的内源基因。

如所述，在优选实施方式中，在编码感兴趣产物的异源多核苷酸以外，所述真核细胞包括至少一种编码选择标记的异源多核苷酸和/或编码报告多肽的异源多核苷酸。

“选择标记”允许在合适选择培养条件下，选择表达所述选择标记的宿主细胞。选择标记提供在选择条件下具有存活和/或生长优势的所述标记的载体。因此，成功转染有表达载体的宿主细胞能在合适选择条件下选出。通常，选择标记基因会赋予对筛选剂(如药物、抗生素或其它毒剂)的抗性，或补偿宿主细胞中的代谢或异化作用缺陷。其可以是正或负选择标记。为了选择成功转染的宿主细胞，可用于培养宿主细胞的培养基含筛选剂，所述筛选剂能选择所用选择标记。在其它实施方式中，选择标记能使宿主细胞在下述化合物缺乏或减少的情况下存活并增殖，所述化合物对缺少该选择标记的宿主细胞的存活和/或增殖是必需的。通过在不含浓度高到足以使宿主细胞存活和/或增殖的必需化合物或包含降低量所述必需化合物的培养基中培养宿主细胞，只有表达选择标记的宿主细胞能存活和/或增殖。根据一个实施方式，所述选择标记是药物抗性标记，编码的蛋白赋予对涉及所述药物选择条件的抗性。已描述了多种选择标记基因(参见例如WO 92/08796,WO 94/28143,WO2004/081167,WO2009/080759,WO2010/097240)。例如，可使用至少一种赋予针对一或多种抗生素抗性的选择标记。根据一个实施方式，选择标记是可扩增选择标记。可扩增选择标记能选择含载体的宿主细胞并促进所述载体在宿主细胞中的基因扩增。常用于真核细胞(例如特别是哺乳动物细胞)的选择标记基因包括：氨基糖苷磷酸转移酶(APH)、潮霉素磷酸转移酶(hyg)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(tk)、谷氨酰氨合成酶、天冬酰胺合成酶，以及编码对新霉素(G418)、嘌呤霉素、潮霉素、抗菌素(zeocin),乌本苷、杀稻瘟菌素、组氨醇D、博莱霉素、腐草霉素和霉酚酸具有抗性的基因。根据一个实施方式，与本文所述新型真核细胞优选哺乳动物细胞联合用叶酸受体作选择标记(参见例如WO2009/080759)。根据一个实施方式，所述真核细胞包括编码叶酸受体作为选择标记的异源多核苷酸和/或包括编码二氢叶酸还原酶(DHFR)作为选择标记的异源多核苷酸。此实施方式还结合第二方面所述选择方法详述于下。所述真核细胞可内源表达DHFR和叶酸受体。

“报告多肽”使得能基于报告特性(如荧光)鉴定表达所述报告多肽的细胞。报告基因通常不为宿主细胞提供存活优势。然而，报告多肽的表达能用于区分表达报告多肽的细胞与不表达的细胞。因此，报告基因也能选择成功转染的宿主细胞。合适的报告多肽包括但不限于例如绿色荧光蛋白(GFP)、YFP、CFP和萤光素酶。根据一个实施方式，所述报告多肽具有允许通过流式细胞术选择的特性。

如所述，含编码感兴趣产物的多核苷酸的表达载体还可包括多于一个选择标记和/或报告基因。此外，一种或多种编码选择标记的多核苷酸和/或一种或多种编码报告多肽的多核苷酸还可在一个或多个不同表达载体上提供，所述载体与含编码感兴趣产物的多核苷酸的表达载体共转染。这种同样能够选择的共转染策略为现有技术熟知。

真核细胞所含的表达载体或至少2种表达载体的组合可额外包括其它载体元件。例如，能包括至少一种编码其它感兴趣产物的额外多核苷酸。如上所解释且从本教导内容所述可表达多肽的上述示例所显见，待由从宿主细胞生产且优选分泌的最终多肽还可以是由数个单独亚基或结构域构成的蛋白。相应蛋白的优选示例是免疫球蛋白分子，尤其是含例如重链和轻链的抗体。有数种选择用于生产由不同个体亚基或结构域构成的相应蛋白，且本领域已知合适的载体设计。根据一个实施方式，所述蛋白的2个或更多亚基或结构域从1个表达盒表达。在此实施方式中，从含蛋白个体亚基或结构域编码区的相应表达盒获得一个长转录本。根据一个实施方式，至少一个IRES元件(内部核糖体进入位点)功能性定位于这些个体亚基或结构域的编码区之间，各编码区之前是分泌前导序列。因此，确保从所述转录本获得单独翻译产物，且终蛋白能正确组装并分泌。相应技术在现有技术中已知，因此不需本文任何详述。

对于一些实施方式如抗体表达，还优选从不同表达盒表达个体亚基或结构域。根据一个实施方式，用于表达感兴趣产物的表达盒是单顺反子表达盒。所述表达载体或表达载体组合所含全部表达盒可以是单顺反子的。因此，根据一个实施方式，设计用于表达感兴趣产物的各表达盒包括待表达为感兴趣多肽的蛋白的一个亚基或结构域的编码多核苷酸。例如，在抗体的情况中，一个表达盒可编码抗体轻链而另一表达盒可编码抗体重链。个体亚基或结构域从个体表达盒表达后，终蛋白如抗体从所述亚基或结构域组装并由宿主细胞分泌。此实施方式特别适于表达免疫球蛋白分子如抗体。此情况中，编码感兴趣产物的第一异源多核苷酸编码例如免疫球蛋白分子的重链或轻链，编码感兴趣产物的第二异源多核苷酸编码免疫球蛋白分子的另一链。根据一个实施方式，用于转染哺乳动物宿主细胞的表达载体或至少2个表达载体的组合包括至少一个含免疫球蛋白分子重链或其功能片段编码多核苷酸的表达盒以及至少一个含免疫球蛋白分子轻链或其功能片段编码多核苷酸的表达盒。在使用至少2个表达载体的组合的情况下，所述多核苷酸可位于相同或不同的表达载体。所述多核苷酸在转染的宿主细胞中表达后，获得功能性免疫球蛋白分子，并优选是从宿主细胞中分泌的。如实施例所示，使用本文所述的基因C12orf35表达产物的效果受损的新型细胞和细胞系，特别适于表达蛋白，尤其是由数个亚基或结构域构成的蛋白如抗体，所述受损优选由减少或消除所述基因的功能表达所致。如实施例所示，由所述真核细胞表达的抗体总量增加。此外，在实施方式中，尤其是其中细胞内的FAM60A效果额外受损时，表达稳定性也提高。因此，本文所述新型真核细胞系在用于重组表达多肽包括由数个结构域亚基构成的蛋白(如抗体)时，具有特殊优势。还结合实施例描述其它优势。

B.选择方法

根据第二方面，提供选择重组表达感兴趣产物的宿主细胞的方法，包括

a)提供第一方面所述真核细胞作为宿主细胞，其中所述宿主细胞包括至少一种编码感兴趣产物的多核苷酸；和

b)选择一个或多个表达感兴趣产物的宿主细胞。

第一方面(包括合适和优选的实施方式)所述真核细胞以及其优点如上详述并参考在此同样适用的相应公开。如所述，脊椎动物细胞尤其是哺乳动物细胞，优选被用作宿主细胞。例如，所述真核细胞的优良特性能简化合适生产克隆的选择并因而简化其鉴定。此外，使用本文所述的真核细胞时，由于转染细胞群中高生产细胞比例显著增加，用于鉴定稳定生产克隆的生产特性的分析和筛选所需的克隆更少。这节省时间进而允许平行处理更多项目。此外，如实施例所证明，用所述新型真核细胞时，在转染和选择步骤后，高表达细胞的数量对应比例有增加。这些表达细胞也称为细胞库，生产大量感兴趣产物。因此，含高表达细胞的这类细胞库能例如被用于在短时间范围内生产感兴趣多肽。因此，感兴趣产物能在相应细胞中迅速生产。

根据一个实施方式，第二方面所述选择方法的阶段(a)包括用编码感兴趣产物的异源多核苷酸转染第一方面所述真核细胞，其优选尚不包括编码感兴趣产物的异源多核苷酸，由此提供含编码感兴趣产物的异源多核苷酸的真核细胞。如所述，哺乳动物细胞优选用作真核宿主细胞。编码感兴趣产物的多核苷酸可包括在随后转染入真核细胞的表达载体中。

为选择并因此鉴定高产率表达感兴趣产物的宿主细胞，选择阶段(b)可以是包括数个选择步骤的多步式选择过程。例如，阶段(b)可包括一个或多个选择步骤以鉴定成功转染的细胞以及一个或多个后续选择步骤以从成功转染的细胞库中选择高表达细胞。合适的选择策略取决于用于引入感兴趣产物编码多核苷酸的表达载体设计，且尤其取决于所用选择标记和/或报告子。非限制性实施方式描述于下。

如上所述，所述真核细胞可包括至少一种编码选择标记的异源多核苷酸。可使用相同或不同的共转染表达载体，将编码选择标记的多核苷酸与编码感兴趣产物的多核苷酸一起引入宿主细胞。然后，阶段(b)包括在向宿主细胞提供选择压力的条件下，例如用合适选择性培养基培养所述多个宿主细胞以鉴定成功转染的宿主细胞。如本文所述，“选择性培养基”具体指用于选择表达选择标记的宿主细胞的细胞培养基。例如，其可包括筛选剂，例如能鉴定成功转染的宿主细胞的毒性药品。或者，选择性培养基中可缺失必需化合物或其浓度可降低。根据一个实施方式，未成功转染并因此不表达选择标记或其中表达较低的宿主细胞在选择性培养条件下无法增殖或死亡。相反，成功转染有表达载体且以充足产率表达选择标记(和相应的共引入感兴趣产物)的宿主细胞耐受选择压力或不太受其影响，并因此可增殖，从而生长超过未成功转染或其中细胞基因组内整合位点不利的宿主细胞。根据一个实施方式，所述选择标记选自抗生素抗性标记、药物抗性标记和代谢标记。选择标记和选择原则的合适示例如上结合第一方面所述，且个体选择标记的合适选择条件也为技术人员熟知。非限制性但有利的实施方式于后文简述。

如实施例所示，本文所述新型真核细胞的一个优点是在一个标准选择步骤如G418/neo选择后，高生产细胞百分比就有显著增加，所述真核细胞例如尤其是包括含基因C12orf35的染色体8端粒区缺失的CHO细胞系。例如，转染基因C12orf35表达未减少或消除的正常CHO细胞系时，通常G418/neo选择后存活细胞中60％或甚至多至80％是非生产细胞。使用本公开所述的新型真核细胞系时，非生产细胞或低产细胞的数目显著降低。这使得能通过仅使用一种选择标记并因而仅用一个选择步骤，例如G418/neo选择(若需要)，来有效进行阶段(b)的选择。这增加选择速度并因而减少获得表达感兴趣产物的转染细胞所需时间。此外，由于高产细胞的数目增加，发现甚至在未特异性选择高产细胞时，仍可(因此在极短时间内)产生有克隆样性能的细胞群。由此，感兴趣产物甚至能从所述库中制成。因此，对于例如其中仅迅速需要特定量蛋白的应用，例如用于研究或测试目的，快速产生良好生产细胞或生产细胞库的这种迅速选择系统非常有利。

然而，如果需要进一步增加生产率，优选阶段(b)的多步式选择。当预计建立克隆细胞系以大规模尤其是工业规模生产感兴趣产物时，这尤其如此。

如上所述，一种或多种引入真核细胞的表达载体可包括2种或更多选择标记基因，且选择不同选择标记可同时或顺序完成，以选择成功转染有表达载体且高产率表达感兴趣产物的宿主细胞。用于培养的选择性培养基可包括用于全部所用选择标记的筛选剂。在另一个实施方式中，培养能首先用仅包括所用选择标记基因中一种或其亚群的筛选剂的选择性培养基进行，然后加入一种或多种剩余选择标记基因的筛选剂。在另一个实施方式中，宿主细胞用第一选择性培养基培养，所述培养基仅包括载体选择标记基因的一种或其亚群的筛选剂，然后用包括剩余选择标记基因的一种或多种筛选剂的第二选择性培养基培养。根据一个实施方式，第二选择性培养基不包括用于第一选择性培养基的选择剂。

根据一个实施方式，阶段(a)提供的真核细胞包括编码二氢叶酸还原酶(DHFR)作为选择标记的异源多核苷酸，且阶段(b)包括进行DHFR的选择步骤。相应的选择步骤通常涉及含DHFR抑制剂的选择性培养基。数个合适的DHFR酶和相应DHFR基因在现有技术中已知，能用作选择标记。术语DHFR指野生型DHFR以及下述：DHFR酶，相较对应野生型DHFR酶氨基酸序列具有一个或多个氨基酸序列交换(如缺失、取代或添加)；融合蛋白，包括一种和多种修饰成提供额外结构和/或功能的DHFR酶以及上述的功能片段，其仍具有至少一种DHFR酶的功能。这些实施方式为现有技术熟知，因而不需详细描述。例如，DHFR酶可用作选择标记，其相比野生型DHFR酶和/或宿主细胞内源表达的DHFR酶(若表达)，对叶酸拮抗剂如MTX更敏感或较不敏感。相应的DHFR酶为现有技术熟知，例如描述于EP 0 246 049和其他文献。DHFR酶能源自任何物种，只要其在本发明内有功能，即与所用哺乳动物宿主细胞相容。例如，主抗MTX的突变小鼠DHFR已广泛用作真核细胞中的显性选择标记。DHFR酶可用作选择标记，其相比DHFR⁺(+)宿主细胞和因而含功能内源DHFR基因的宿主细胞中内源表达的DHFR酶，对DHFR抑制剂如MTX较不敏感。根据一个实施方式，内含子或其片段置于DHFR基因开放阅读框3’末端。DHFR表达盒所用的内含子产生更小、无功能性的DHFR基因变体(Grillari等.,2001,J.Biotechnol.87,59-65)。由此，DHFR基因表达水平降低，这进一步提高选择严谨性。采用内含子降低DHFR基因表达水平的替代方法参见EP0 724639且也能使用。

“DHFR抑制剂”具体指抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)活性的化合物。例如，相应抑制剂可与DHFR底物竞争结合DHFR。例如，合适的DHFR抑制剂是叶酸拮抗剂如氨甲蝶呤(MTX)。因此，根据一个实施方式，阶段(b)包括如下进行DHFR选择步骤：在选择性培养基中培养所述多个宿主细胞，所述培养基包括至少一种DHFR抑制剂，如优选叶酸拮抗剂。相应的选择条件为技术人员已知。根据一个实施方式，阶段(b)使用的选择性培养基所含叶酸拮抗剂浓度如下：1500nM或更少、1250nM或更少、1000nM或更少、750nM或更少、500nM或更少、250nM或更少、200nM或更少、150nM或更少、125nM或更少、100nM或更少或者75nM或更少。所述抑制剂在选择性培养基中的使用浓度(也可逐步增加)决定选择条件的严谨性。叶酸拮抗剂的优选浓度范围可选自500nM-0.1nM,350nM-1nM,200nM-2.5nM,150nM-5nM,100nM-7.5nM和75nM-10nM。根据一个实施方式，所述选择性培养基包括MTX作为叶酸拮抗剂。如实施例所示，低MTX浓度能与本文所述新型真核细胞联用以进行DHFR选择，尤其是如果与极限浓度的叶酸盐联合进行所述选择。

根据一个实施方式，阶段(a)提供的本公开所述宿主细胞包括编码叶酸转运子作为选择标记的异源多核苷酸。当与依赖叶酸摄取的真核细胞如哺乳动物细胞联用时，基于叶酸转运子的选择系统有数个优点。叶酸转运子能从培养基输入至少一种叶酸盐到宿主细胞，优选哺乳动物细胞。根据一个实施方式，叶酸转运子是还原叶酸载体(RFC)或包括RFC。RFC是泛表达的膜糖蛋白，担当摄取还原叶酸如5-甲基-THF和5-甲酰基-THF到细胞的主要转运子。然而，RFC显示对氧化叶酸、叶酸的亲和性极弱。由此，缺乏RFC表达或已从基因组去除RFC基因座的细胞能充当转染选择标记基因RFC的受体，在还原叶酸如5-甲酰基-THF从生长培养基中逐步去除的条件下，从而能鉴定此叶酸转运子和相应感兴趣产物表达水平增加的细胞。当RFC被用作选择标记时，合适选择条件为技术人员已知并例如描述于WO2006/059323。

根据一个在下面和实施例部分详述的实施方式，用作选择标记的叶酸转运子是叶酸受体。基于叶酸受体的选择系统有数个优点。例如，对于选择，无需毒性物质(尽管其能使用)，且宿主细胞的内源叶酸受体不需敲除。此外，该表达系统联合本文所述基因C12orf35表达产物的效果被减少或消除的新型真核细胞系时效果极好，所述减少或消除优选通过减少或消除C12orf35基因表达实现。一种解释是所引入基因如感兴趣多肽和选择标记基因以更高速率表达，使选择简化。

本文所用的“叶酸受体”指具有功能并因而能输入或摄取叶酸盐或其衍生物到真核细胞中的叶酸受体。优选地，所述受体能单向输入或摄取叶酸盐或其衍生物到真核细胞中。此外，本文所用的叶酸受体是膜结合型。因此，本文所述叶酸受体是功能性膜结合叶酸受体。例如，通过跨膜锚或GPI锚能获得膜锚定。优选GPI锚，因为其对应于膜结合叶酸受体的自然设定。叶酸受体(FR)是高亲和性叶酸结合糖蛋白。其由3种不同基因FRα、FRβ和FRγ编码。FRα和FRβ是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定、细胞表面糖蛋白，而FRγ缺乏GPI锚且是分泌蛋白。然而，其能经基因改造以包括跨膜域或GPI锚。只要其能输入或摄取叶酸盐或其衍生物到真核细胞中，这种含膜锚的改变型FRγ也被认为是膜结合叶酸受体。术语“叶酸受体”还包括能摄取叶酸的野生型叶酸受体的膜结合突变体，以及含相应叶酸受体的融合蛋白。

所用叶酸受体能衍生自任何物种的叶酸受体，只要其在本发明内有功能，即与所用宿主细胞相容，且在转染宿主细胞中表达时能将叶酸物质尤其是叶酸从培养基纳入依赖叶酸摄取的宿主细胞。一般，引入宿主细胞作为选择标记的叶酸受体可与宿主细胞内源叶酸受体同源或异源(如果存在内源叶酸受体，则优选)。如果同源，其衍生自与宿主细胞相同的物种。如果异源，其衍生自宿主细胞以外的另一物种。例如，人叶酸受体可用作啮齿动物宿主细胞例如仓鼠细胞如CHO细胞的选择标记。优选使用衍生自哺乳动物的叶酸受体，例如衍生自啮齿动物，如小鼠、大鼠或仓鼠，或更优选衍生自人。用作选择标记的膜结合叶酸受体能选自叶酸受体α、叶酸受体β和叶酸受体γ。根据一个实施方式，人叶酸受体α用作选择标记。

膜结合叶酸受体用作叶酸转运子是有利的，因为能使用内源表达其自身叶酸受体的细胞且叶酸能由叶酸受体加工。合适的膜结合叶酸受体以及合适选择条件也描述于WO2009/080759，所述叶酸受体能用作依赖叶酸摄取的真核细胞(如哺乳动物细胞)的选择标记，所述专利通过引用纳入本文。根据一个实施方式，使用成熟野生型人叶酸受体α，其包括以下SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列(1字母代码，以N末端到C末端方向显示)。

叶酸受体α通过GPI锚自然锚定到细胞膜。GPI锚的信号序列未示于SEQ ID NO:20。根据一个实施方式，源自SEQ ID NO:20或包括SEQ ID NO:20的叶酸受体α包含C末端处的GPI锚信号。可使用任何合适的GPI锚信号。人叶酸受体α的天然GPI锚信号序列如SEQ IDNO:21所示(1字母代码，以N末端到C末端方向显示)。

通过用膜锚如跨膜锚可另外实现膜锚定。在此实施方式中，叶酸受体包括C末端的膜锚。合适锚在现有技术中已知。源自SEQ ID NO:20或包括SEQ ID NO:20的叶酸受体α可包括N末端的前导序列。能使用任何合适的前导序列，确保叶酸受体的功能表达。

包括野生型人叶酸受体α的天然前导序列(N末端)和天然GPI锚信号序列(C末端)的氨基酸全序列如SEQ ID NO:22所示(1字母代码，以N末端到C末端方向显示)。

根据一个实施方式，膜结合叶酸受体具有或包括SEQ ID NO:20或22的氨基酸序列，或是上述的功能变体，其与SEQ ID NO:20或22有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性或同一性，是膜结合型且能将叶酸摄入细胞中。

使用依赖叶酸摄取的真核细胞如哺乳动物宿主细胞且所述细胞包括编码叶酸转运子(优选叶酸受体)的异源多核苷酸时，阶段(b)包括选择步骤，其中所述多个宿主细胞在含极限浓度叶酸物质的选择性培养基中培养。本文所用的“极限浓度叶酸物质”具体指对宿主细胞提供选择压力的选择性培养基中的叶酸(盐)浓度。这种选择条件下，仅纳入表达载体并因而表达叶酸转运子作为选择标记的宿主细胞生长和增殖。因此，选择性培养基不包括丰富的叶酸物质，培养基中的所述叶酸(盐)限制对宿主细胞提供选择压力。选择性培养基所含极限浓度的叶酸物质能由宿主细胞吸收并加工，尤其是纳入叶酸转运子用作选择标记的宿主细胞。不会或不能由宿主细胞加工的叶酸物质和尤其是叶酸衍生物不影响选择压力，所述压力施加用于选择纳入叶酸转运子作为选择标记的宿主细胞，并因此不影响叶酸物质的极限浓度。然而，如果进行下述的DHFR组合选择，相应叶酸物质如叶酸拮抗剂可存在，甚至优选存在。选择性培养基中存在的极限浓度叶酸物质可以是例如氧化叶酸物质或还原叶酸物质或其衍生物。氧化叶酸物质如叶酸以及称为还原叶酸或四氢叶酸(THF)的叶酸还原衍生物，是维生素B9族，其在依赖叶酸摄取的真核细胞如哺乳动物细胞中是生物合成嘌呤、胸苷酸和某些氨基酸的必需辅因子和/或辅酶。THF辅因子对DNA复制并因此对细胞增殖尤其关键。优选地，选择性培养基中所含的极限浓度叶酸物质是叶酸。提供极限浓度叶酸物质的合适浓度范围如下所述。

基于叶酸转运子的选择系统是基于叶酸物质(优选叶酸)在细胞培养基中的有限可用度。在选择性培养条件下，相较成功纳入表达载体的宿主细胞，未成功纳入表达载体并因而不能表达足量叶酸转运子(优选叶酸受体)的宿主细胞将死亡或有生长缺陷。如实施例所示，将基于叶酸受体的选择与本文所述新型真核细胞联用，能加速选择、筛选并建立真核细胞克隆，所述克隆过表达高水平的感兴趣重组产物如多肽。

阶段(b)所用、用于阶段(b)的子步骤，针对作为选择标记的叶酸受体进行选择所用的选择性培养基可包括叶酸物质且尤其是叶酸，浓度选自：

(a)约5000nM-0.1nM；

(b)约2500nM-0.1nM；

(c)约1500nM-0.1nM；

(d)约1000nM-0.1nM；

(e)约750nM-0.1nM；

(f)约500nM-0.1nM；

(g)约250nM-0.2nM；优选约250nM-1nM或约250nM-2.5nM；

(h)约150nM-0.3nM；优选约150nM-1nM或约150nM-2.5nM；

(i)约100nM-0.5nM；优选约100nM-1nM或约100nM-2.5nM；

(j)约75nM-0.6nM，优选约75nM-1nM或约75nM-2.5nM；

(k)约50nM-1nM；优选约50nM-2.5nM或约50nM-5nM；

(l)约35nM-0.75nM；和

(m)约25nM-1nM或约25nM-2.5nM，约20nM-3nM，约15nM-4nM或10nM-5nM。

上述浓度和浓度范围特别适合快速生长的哺乳动物细胞如CHO细胞悬液，其是商业生产细胞系的优选实施方式。然而，不同细胞系可具有不同叶酸消耗特性。但合适浓度能由技术人员经实验方便测定。选择性培养基所含叶酸物质优选是叶酸，且根据一个实施方式，叶酸是选择性培养基所含的影响叶酸物质极限浓度的唯一叶酸物质。

根据一个实施方式，阶段(a)提供的宿主细胞包括编码叶酸转运子作为第一选择标记的异源多核苷酸以及编码第二选择标记的异源多核苷酸，所述第二选择标记处理以下底物：叶酸物质、叶酸衍生物和/或能通过叶酸处理获得的产物。例如，第二选择标记可以是二氢叶酸还原酶(DHFR)或者在DHFR下游或与DHFR联合运作的酶如胸苷酸合成酶(TS)和丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)。优选地，膜结合叶酸受体用作第一选择标记且第二选择标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)。根据此实施方式，阶段(b)包括在选择性培养基中培养宿主细胞，所述培养基包括极限浓度的叶酸物质优选叶酸且包括至少一种DHFR抑制剂如MTX。如实施例所示，将本文所述新型真核细胞系作为重组表达的宿主细胞与这类基于叶酸受体/DHFR的选择联用时，在细胞库水平已获得高且均匀的表达结果。如实施例部分所示，用低DHFR抑制剂浓度就能在库水平获得7-8倍的表达。此显著增加的库效价是有利的，例如当想要快速生产少量的感兴趣多肽时，可使用选定细胞库用于生产，这能节约建立克隆细胞系的时间。此外，从所述细胞库获得高生产细胞克隆由于库中的高表达细胞数目显著增加而简化。需要制备的细胞克隆更少，减少筛选工作。叶酸受体和DHFR的合适实施方式以及合适选择条件和浓度如上所述并参考在此同样适用的上述公开。上述叶酸物质和叶酸拮抗剂的浓度和浓度范围可相互组合。在一个实施方式中，将约0.1nM-150nM、1nM-125M、5nM-100nM或7.5nM-75nM的叶酸物质浓度与选择性培养基内0.1nM-150nM、1nM-125nM、2.5nM-100nM、5nM-75nM或7.5nM-50nM的叶酸拮抗剂浓度联用。如所述，优选叶酸用作叶酸物质且MTX用作叶酸拮抗剂。

使用叶酸受体和DHFR的相应组合作为选择标记并通过采用合适选择性培养基在阶段(b)同时应用针对2种标记的选择条件，可形成非常严谨的选择系统，其能从转染的宿主细胞群中有效富集高产细胞。如果2种选择标记都强表达，宿主细胞活力在选择条件下显著增加。因此，能选出显示感兴趣产物表达率增加的依赖叶酸摄取的真核细胞如哺乳动物细胞。作为选择标记的叶酸受体与涉及叶酸盐代谢的另一选择标记(如优选DHFR)联用的概念公开于WO2010/097240，所述专利通过引用纳入本文。如实施例所示，此实施方式所述选择系统的高严谨性可与本文所述基因C12orf35表达产物的效果受损的新型真核细胞有利组合，优选通过减少或消除所述基因的表达造成所述受损。此组合进一步减少低产细胞数目，且选择后能获得更均匀的高产细胞群。这尤其简化高产细胞的单细胞克隆。此外，该组合能显著降低DHFR选择所需的MTX浓度。

根据一个实施方式，在阶段(b)中进行2个或更多选择步骤，其中所述2个或更多选择步骤基于相同或不同的选择原则。例如，如果在叶酸受体和/或DHFR以外还使用额外选择标记，针对所述额外选择标记的选择条件能在应用针对叶酸受体和/或DHFR的选择条件之前(如在预选择步骤中)应用或与之同时应用。例如，在新霉素磷酸转移酶基因(neo)用作额外选择标记的情况中，阶段(b)可包括首先使细胞生长于例如含G418的培养基中，以选择纳入表达载体或至少2个表达载体组合的细胞，随后用选择性培养基进行选择步骤，所述选择性培养基包括极限浓度叶酸物质和第二选择标记的抑制剂，例如使用DHFR作为第二选择标记时为MTX。

根据一个实施方式，在阶段(b)中进行基于流式细胞术的选择。采用流式细胞术尤其是荧光激活细胞分选术(FACS)的选择步骤具有以下优点：能就所需特征性表达产率迅速筛选大量细胞。

根据一个实施方式，在针对一个或多个选择标记的一个或多个选择步骤以外，优选在其后，还进行所述基于流式细胞术的选择。因此，能在成功转染的细胞群中鉴定高表达细胞克隆并分离出来。

根据一个实施方式，高表达细胞通过检测以下表达来鉴定：共表达的报告多肽如绿色荧光蛋白(GFP)、CFP、YFP、萤光素酶或其它能通过流式细胞术检测的常见报告多肽。根据此实施方式，阶段(a)包括提供多个含至少一种编码报告子的异源多核苷酸的宿主细胞，阶段(b)包括根据所述报告多肽的至少一种特征使用流式细胞术来鉴定表达报告子的宿主细胞。在这种基于报告子的选择中，报告基因的表达与感兴趣产物的表达相关联。报告多肽可位于细胞内，从而标记表达细胞。根据一个实施方式，报告多肽的表达与感兴趣产物的表达紧密相连，所述感兴趣产物是多肽。例如，报告多肽和感兴趣多肽可表达为单独多肽，但来自同一表达盒，却由IRES元件(内部核糖体进入位点)分开。此外，报告多肽和感兴趣多肽可表达为融合蛋白。根据一个实施方式，在表达感兴趣多肽的表达盒中，编码感兴趣多肽的多核苷酸通过至少一个终止密码子与编码报告子的多核苷酸隔开。仅在翻译通读该终止密码子时才表达含报告多肽的融合蛋白。由于终止密码子通读仅在一定程度上发生，其可能受终止密码子数目和设计以及培养条件影响，因此一定比例的感兴趣多肽生产为能由流式细胞术检测的含报告多肽的融合蛋白。用相应策略能紧密连接报告多肽表达与感兴趣多肽表达。下面还结合实施方式解释通过终止密码子通读获得融合蛋白的原理，所述实施方式中融合蛋白(不必定含报告子)展示在细胞表面且例如用检测化合物染色。为表达感兴趣的分泌多肽，可额外将编码膜锚的多核苷酸纳入终止密码子和编码报告子的多核苷酸之间或在编码报告子的多核苷酸下游。膜锚确保报告多肽保持与表达细胞联合。因此，融合蛋白中所含报告多肽为表达细胞提供可由流式细胞术选择的特性。感兴趣多肽表达到培养基内。报告多肽(例如其荧光)越高，生产的融合蛋白越多，相应地，感兴趣多肽的表达率越高。例如，引用的WO 03/014361公开了一种相应方法。

根据一个实施方式，阶段(b)包括：

(i)在针对一种或多种选择标记的选择性条件下进行至少一次选择，所述选择标记由经转染的宿主细胞表达；和

(ii)进行基于流式细胞术的选择。

可任选地，能在步骤(i)和/或步骤(ii)之前或之后进行一个或多个其它选择步骤。

根据一个实施方式，基于流式细胞术的选择包括选择多个以所需产率表达感兴趣多肽的宿主细胞，这是基于感兴趣多肽的存在或含量。感兴趣多肽优选是分泌多肽。根据一个实施方式，使用结合感兴趣多肽的检测化合物在细胞表面检测感兴趣多肽。根据一个实施方式，感兴趣的分泌多肽在通过细胞膜并因此在多肽分泌期间与质膜短暂联合时得以检测。例如，基于流式细胞术的一种相应选择系统公开于所引用的WO03/099996。

根据一个实施方式，一部分感兴趣多肽与膜锚融合表达，并因此表达为膜结合融合多肽。由此，一部分所述多肽在细胞表面展示为融合多肽并能用检测化合物染色。此类选择不需要报告多肽，即使其可额外使用。由于存在膜锚，感兴趣多肽紧密锚定表达细胞。由于生产的融合多肽量与表达细胞的总表达率相关，能根据经细胞表面膜锚展示的融合多肽量通过流式细胞术选择宿主细胞。这能快速选择高产宿主细胞。为能用流式细胞术(优选用FACS)有效选择，采用特殊表达盒设计以表达感兴趣多肽是有利的。因此，根据一个实施方式，编码感兴趣多肽的多核苷酸包括在表达盒中，所述表达盒设计成一部分表达的感兴趣多肽包括膜锚。融合膜锚的感兴趣多肽也称为融合多肽或融合蛋白。存在数个选择可达到该结果。

根据一个实施方式，阶段(a)提供的宿主细胞包括

(i)异源表达盒，包括

aa)编码感兴趣多肽的多核苷酸，

bb)在编码感兴趣多肽的多核苷酸下游的至少一个终止密码子，和

cc)在终止密码子下游的编码膜锚和/或膜锚信号的另一多核苷酸；

和

(ii)至少一个异源表达盒，包括编码选择标记的多核苷酸；

以及阶段(b)的选择包括

(i)在针对至少一个选择标记的选择性条件下培养所述宿主细胞，并允许表达感兴趣多肽，其中至少一部分感兴趣多肽表达为含膜锚的融合多肽，其中所述融合多肽展示在所述宿主细胞表面上；

(ii)进行基于流式细胞术的选择，包括根据细胞表面所展示融合多肽的存在或含量，采用流式细胞术选择多个以所需产率表达感兴趣多肽的宿主细胞。

转录上述表达盒所含感兴趣多肽的编码多核苷酸产生转录本，其按连续顺序包括至少

aa)多核苷酸，其中所述多核苷酸的翻译产生感兴趣多肽；

bb)在所述多核苷酸下游的至少一个终止密码子；

cc)在所述终止密码子下游的多核苷酸，编码膜锚和/或膜锚信号。

通过翻译通读至少一个终止密码子，至少一部分转录本被翻译成含感兴趣多肽和膜锚的融合多肽。用于此实施方式的所述表达盒设计具有以下效果：通过翻译通读过程(终止密码子“渗漏”)，一定部分的感兴趣多肽生产为含膜锚的融合多肽。因此，通过翻译通读至少一个终止密码子，至少一部分转录本被翻译成含感兴趣多肽和膜锚的融合多肽。翻译通读可由于终止密码子的选择/翻译终止信号的设计而自然发生，或能通过改变培养条件例如用终止抑制剂来诱导。此通读水平产生一定比例的融合多肽。这些融合多肽包括膜锚，其紧密锚定融合多肽到细胞表面。因此，融合多肽展示在细胞表面，显示高水平膜锚定融合多肽的细胞能通过流式细胞术选出，优选FACS。由此，选出以高产率表达感兴趣多肽的宿主细胞。基于终止密码子通读的这一技术的细节和优选实施方式参见WO2005/073375和WO2010/022961，本文参考其细节。

根据一个实施方式，所述表达盒额外包括(iv)编码报告多肽如GFP的多核苷酸。所述编码报告多肽的多核苷酸位于终止密码子下游。终止密码子通读后，获得含报告子的融合多肽，从而能通过基于报告多肽特征(例如其荧光)的流式细胞术进行选择。所述实施方式的细节如上所述且参考上面的公开。优选地，编码报告多肽的多核苷酸位于编码膜锚的多核苷酸下游。

根据另一实施方式，通过用WO2007/131774所述的技术，一部分感兴趣多肽表达为细胞表面展示的融合多肽。在此，通过转录和转录本加工，从编码感兴趣多肽的表达盒中获得至少2种不同成熟mRNA(mRNA-感兴趣多肽)和(mRNA-感兴趣多肽-锚)。翻译mRNA-感兴趣多肽可产生感兴趣多肽。翻译mRNA-感兴趣多肽-锚可产生含感兴趣多肽和膜锚的融合多肽。因此，此融合多肽再次展示于细胞表面，显示高水平膜锚定融合多肽的细胞能通过流式细胞术选出，优选FACS。由此，还能选出有高表达率的宿主细胞。根据一个实施方式，所述表达盒额外包括编码报告多肽如GFP的多核苷酸。所述编码报告多肽的多核苷酸位于内含子下游。因此，获得含报告多肽的融合多肽，从而能通过基于报告多肽特征(例如其荧光)的流式细胞术进行选择。优选地，编码报告多肽的多核苷酸位于编码膜锚的多核苷酸下游。因而报告子位于宿主细胞内。

上述2种示范性实施方式都使得一部分感兴趣多肽表达为宿主细胞表面展示的融合多肽，且显示高水平膜锚定融合多肽(指示高水平分泌多肽)的细胞能例如通过流式细胞术、尤其是荧光激活细胞分选术(FACS)选出。在此，不同实施方式是可用的。例如，若报告多肽包括在融合多肽中，能根据报告多肽特征(例如其荧光)来选择高表达宿主细胞。此外，如下简述，能使用适当标记的检测化合物。

根据一个实施方式，阶段(b)包括根据细胞表面所展示融合多肽的存在或含量，通过使宿主细胞与结合细胞表面所展示融合多肽的检测化合物接触，使用流式细胞术选择多个以所需产率表达感兴趣多肽的真核宿主细胞，以及根据所结合检测化合物的存在或含量用流式细胞术选择多个以所需产率表达感兴趣多肽的宿主细胞。因此，细胞可接触适当标记、结合融合蛋白(例如对应于感兴趣多肽的部分)的检测化合物。用于结合融合多肽的检测化合物可具有至少一个以下特征：所述化合物可带标记，尤其是荧光标记；其可以是抗原；可以是免疫球蛋白分子或其结合片段或者可以是蛋白-A、-G或-L。例如，用于在细胞表面结合融合多肽的检测化合物可以是免疫球蛋白分子或其片段，如识别融合多肽的抗体或抗体片段。融合多肽的几乎所有可及部分都能检测到，据此还能检测对应感兴趣多肽与融合多肽平行以可溶形式分泌的部分，。为能检测和选择，可标记用于结合融合多肽的所述检测化合物。因此，结合细胞表面所展示融合多肽的经标记检测化合物能标记并相应染色细胞表面。宿主细胞所表达融合多肽的量越高，结合的经标记检测化合物就越多且染色越强。这具有如下优点：基于流式细胞术的宿主细胞选择能容易进行，因为结合的检测化合物的存在和量都可测定。为选择高产宿主细胞，这些宿主细胞能选自被检测化合物最有效且相应最强烈标记的宿主细胞群。所述标记适合基于流式细胞术的选择，尤其是FACS选择。优选荧光标记，因为这能通过流式细胞术容易检测。

根据一个实施方式，构建表达盒，从而获得约≤50％,≤25％,≤15％,≤10％,≤5％,≤2.5％,≤1.5％,≤1％或小于≤0.5％的融合多肽。剩余部分生产为不含膜锚的分泌多肽形式。

只要能将感兴趣多肽锚定到细胞膜并因而能在细胞表面展示融合多肽，所述膜锚可以是任何种类。合适的实施方式包括但不限于GPI锚或跨膜锚。优选跨膜锚以确保融合多肽紧密结合到细胞表面并防止融合蛋白脱落。特别优选使用免疫球蛋白跨膜锚，当抗体表达为感兴趣多肽时尤其如此。WO2007/131774、WO2005/073375和WO 2010/022961描述其它膜锚和免疫球蛋白跨膜锚的优选实施方式。

根据一个实施方式，宿主细胞表达免疫球蛋白分子(如抗体)作为感兴趣多肽。如上结合第一方面所述，编码免疫球蛋白分子重链的多核苷酸和编码免疫球蛋白分子轻链的多核苷酸可包括在同一表达盒中，或优选包括在分开的表达盒中。当使用上述表达盒设计时，通过翻译通读或选择性剪接使一部分感兴趣多肽生产为膜锚定融合多肽，这类设计用于表达抗体重链。

根据一个实施方式，可在阶段(b)中进行2或更多轮基于流式细胞术的选择周期以选择和富集高表达宿主细胞。

在一个实施方式中，使用荧光激活细胞分选术(FACS)分选表达大量感兴趣多肽并相应显示高信号的宿主细胞。FACS分选是有利的，因为其能快速筛选大量宿主细胞以鉴定和富集高产率表达感兴趣多肽的那些细胞。如果根据上述融合蛋白表达来选择细胞，此实施方式尤其适合。显示最高荧光率的那些细胞能通过FACS鉴定和分离。发现FACS所测定荧光与所生产多肽量之间正相关且统计上显著。因此，FACS分选不仅通常能用于定性分析以鉴定表达感兴趣多肽的细胞，而且确实能定量用于鉴定表达高水平感兴趣多肽的那些宿主细胞。由此，最佳生产细胞能在阶段(b)中选择/富集。

根据一个实施方式，选择以所需产率表达感兴趣多肽的细胞作为库，例如产率高于某一阈值和/或前15％、前10％、前5％或前2％的宿主细胞。例如，以下数个高表达细胞能在阶段(b)中选择并分选到细胞库中：如至少10、至少20、至少30、至少50、至少100、至少200、至少300、至少500、至少1000或至少5000个高表达细胞。含多个不同高表达细胞的该细胞库也称为高表达细胞库。含不同个体高表达细胞的所述细胞库随后能用于获得个体细胞克隆以大规模生产感兴趣多肽。如实施例所示，使用其中基因C12orf35表达减少或消除的本发明哺乳动物宿主细胞，可在针对一个或多个选择标记选择和FACS选择后提供具有利特征的细胞库。例如，测定的FACS分布显示这种高表达细胞库的FACS分布通常与获自细胞克隆的细胞很类似。减少或消除基因C12orf35表达可在所述转染和选择后提供相当一致的以高产率表达感兴趣产物的宿主细胞。这引起选定细胞群中低产克隆或非生产克隆显著下降。此外，这些细胞库还可直接用于生产感兴趣多肽，例如，用于分析目的或在需要较少量多肽时，因为使用本发明所述新型真核细胞时实现了显著更高的库效价。然而，发现即使未经FACS选择富集高表达细胞库，当用本公开的细胞系时，具有克隆样性能的细胞群仍能在极短时间中产生。这是一个重要优势，例如在需要快速生产感兴趣多肽时。所得库适于生产目的。另一优点是选择时间也减少。

根据一个实施方式，阶段(a)提供的真核细胞是哺乳动物细胞，优选啮齿动物细胞，更优选仓鼠细胞如CHO细胞。合适且优选的实施方式如上结合第一方面所述并参考上面的公开内容。如上所述，根据一个实施方式，所述CHO细胞已失去部分染色体8端粒区，其中所述失去的部分包括基因C12orf35。替代的实施方式也如上所述。尤其有利的是其中所述失去的部分额外包括基因FAM60A的实施方式。这些细胞在产率和稳定性方面具有特别有利的特征。根据一个实施方式，第二方面所述方法包括分析基因C12orf35表达是否减少或消除的步骤。这种分析可在选择尤其是DHFR选择后进行。这种分析方法的细节如上结合本公开第一方面所述，且也如下所述结合第五方面所述方法，并参考相应公开。

特定涉及第一方面所述真核细胞优选哺乳动物细胞、表达载体或表达载体组合的其它优选实施方式如上详述。参考上面的公开。

通过第二方面所述选择方法获得的细胞能被分离并培养为个体细胞。然而，在下游过程中也能使用经富集的不同宿主细胞群，即细胞库。所得宿主细胞还能接受额外的定性或定量分析，或能用于例如开发蛋白生产用克隆细胞系。克隆细胞系可从高产率稳定表达感兴趣产物的选定宿主细胞中建立。

因此，根据一个实施方式，培养选定细胞以提供细胞克隆，特别是以克隆性(clonal)细胞培养物形式。克隆性细胞培养物是获自单一祖细胞的细胞培养物。在克隆性细胞培养物中，所有细胞是彼此的克隆。优选地，细胞培养物中的所有细胞含有相同或基本相同的遗传信息。在某些实施方式中，测定细胞培养物中感兴趣多肽的量或浓度以确定生产率。例如，通过分析培养物上清能测量效价。根据一个实施方式，测定各单独克隆的生产率性能后，进行效价排名以选择最佳生产克隆作为生产克隆。此外，能用所得细胞克隆进行稳定性研究。然而，如实施例所示，使用本文所述失去部分染色体8端粒区的新型真核细胞作为宿主细胞且尤其是CHO细胞，可在选择后提供显示稳定性明显提高的重组细胞克隆，细胞失去的那部分端粒区含C12orf35基因和FAM60A基因。因此，用相应宿主细胞时表达稳定性损失是罕见的，而且若发生，通常与用基因C12orf35和FAM60A功能表达未减少或消除的细胞相比，仅导致不那么剧烈的生产率下降。由此，在实施方式尤其是其中C12orf35和FAM60A的效果受损的那些中，例如因为至少一部分含C12orf35基因和FAM60A基因的端粒区丧失，稳定性分析可缩短或甚至跳过，这是一个重要优点，因为其缩短了获得能用于大规模生产感兴趣产物的稳定表达细胞克隆所需的时间。

C.生产感兴趣产物的方法

根据第三方面，提供生产感兴趣重组产物的方法，包括使用第一方面所述真核细胞作为宿主细胞以重组表达感兴趣产物。

如上所述，本文提供的新型真核细胞尤其适合作为生产宿主细胞以重组生产感兴趣产物，如感兴趣多肽。所述真核细胞的合适和优选实施例以及感兴趣产物的合适和优选实施例如上详述并参考在此同样适用的各公开，所述细胞中基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果受损，优选通过减少或消除基因C12orf35的功能表达而受损。如上所述，所述真核细胞优选是脊椎动物细胞，更优选是哺乳动物细胞。尤其有利的是如下实施方式，在C12orf35以外，所述细胞中FAM60A的效果也例如通过减少或消除FAM60A基因的功能表达而受损，因为发现表达稳定性能由此显著提高。稳定表达克隆的丰度增加。通过削弱蛋白FAM60A以及蛋白C12orf35的效果，能提供显示涉及以下2个性质的改善特征的真核宿主细胞(优选哺乳动物宿主细胞)：长期稳定性以及生产率，且由此是对大规模生产感兴趣产物尤其是感兴趣多肽重要的关键特性。

根据一个实施方式，所述方法包括向所述真核细胞引入编码感兴趣产物的多核苷酸并选择表达感兴趣产物的宿主细胞。引入能通过上述的转染实现。选择可用第二方面所述方法完成。优选选择编码感兴趣产物的异源多核苷酸被稳定整合入宿主细胞基因组的宿主细胞。

根据一个实施方式，所述方法包括

(a)在允许感兴趣产物表达的条件下培养第一方面所述真核细胞和/或根据第二方面所述方法选定的宿主细胞，所述真核细胞包括编码感兴趣产物的异源多核苷酸；

(b)从所述细胞培养基和/或所述宿主细胞中分离感兴趣产物；和

(c)可任选地加工经分离感兴趣产物。

根据一个实施方式，所述宿主细胞在无血清条件下培养。表达的感兴趣产物可通过破坏宿主细胞来获得。感兴趣产物优选是多肽。所述多肽优选被表达例如分泌到培养基中，并能从中获得。出于此目的，在感兴趣多肽中提供合适前导肽。实现分泌的前导序列和表达盒设计为现有技术所熟知。相应方法的组合也可行。因此，多肽如蛋白能以高产率有效生产并获得/分离。

所生产的感兴趣产物(优选感兴趣多肽)可通过本领域已知方法回收、进一步纯化、分离、加工和/或修饰。例如，所述多肽可通过常规程序从营养培养基回收，包括但不限于离心、过滤、超滤、提取或沉淀。其它加工步骤如纯化步骤可通过本领域已知的多种过程进行，包括但不限于色谱(如离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和体积排阻)、电泳法(如制备式等电聚焦)、差异溶解度(如硫酸铵沉淀)或提取。此外，分离并纯化的感兴趣多肽可进一步加工，例如，配制成组合物如药物组合物。

D.生产真核细胞系的方法

根据第四方面，提供适合重组产生感兴趣产物的真核细胞的生产方法，包括削弱基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果。达到该结果的合适和优选实施方式如上文结合第一方面的真核细胞所述，并参考在此同样适用的上述公开。非限制性实施方式也简述于下。

根据一个实施方式，所述方法包括减少或消除基因C12orf35的功能表达，从而削弱C12orf35基因表达产物在所述细胞中的效果。合适方法如上所述，结合并参考本公开第一方面所述真核细胞。根据一个实施方式，改变真核细胞基因组以减少或消除基因C12orf35的功能表达。例如，可在C12orf35基因中引入基因敲除。根据一个实施方式，在所有C12orf35基因拷贝中引入这种基因敲除。根据一个实施方式，缺失C12orf35基因。基因组中可缺失所有C12orf35基因拷贝。根据一个实施方式，所述方法包括缺失一部分染色体，其中缺失的部分包括基因C12orf35。缺失的部分可对应端粒区。这种缺失可被诱发，例如通过使用诱导染色体断裂的试剂来诱发。在此，所述细胞能用这种试剂反复处理以获得其中基因C12orf35的功能表达减少或消除的细胞，例如因为所述基因的全部拷贝由于诱导的染色体断裂而缺失。

根据一个实施方式，所述真核细胞是后生动物细胞，优选脊椎动物细胞，更优选哺乳动物细胞。根据一个实施方式，所述哺乳动物细胞是啮齿动物细胞。优选地，所述啮齿动物细胞是仓鼠细胞如CHO细胞，如衍生自CHO-K1的CHO细胞。根据一个实施方式，所述方法包括缺失仓鼠细胞中至少一部分染色体8端粒区，其中缺失的部分包括C12orf35基因。如实施例所示，染色体8端粒区(这里是q臂)中含相应缺失的CHO细胞具有特别有利的表达特征，并因此尤其适合作为重组生产的宿主细胞。根据一个实施方式，缺失的端粒区包括C12orf35基因和一个或多个或所有选自Bicd1、Amn1、甲基转移酶样蛋白20、Dennd5b、FAM60A、Caprin2、Ipo8和RPS4Y2的基因。根据一个实施方式，缺失的区域额外包括至少一部分或所有Tmtc1基因。根据一个实施方式，所述方法包括缺失染色体对8的两条染色体中至少相应部分的端粒区。前述个体基因和所编码蛋白的非限制性别称也示于上表1，它们以及同源物和直向同源物都涵盖在上面就个体基因和/或编码蛋白所用术语的范围内。

如上所述，小鼠染色体6的端粒区对应于中国仓鼠染色体8的端粒区。因此，上面关于仓鼠染色体8端粒区的公开内容相应地适用于小鼠染色体6的端粒区。

根据一个实施方式，所述方法包括引起仓鼠基因组染色体8(或小鼠基因组染色体6)端粒区的染色体断裂，其中染色体8(或小鼠基因组染色体6)上的断点位于甲基转移酶样蛋白20基因(小鼠中称为4833442J19Rik)的着丝粒端、Dennd5b基因的着丝粒端、FAM60A基因的着丝粒端、Caprin2基因的着丝粒端、Ipo8基因的着丝粒端或RPS4Y2基因的着丝粒端。因此，存在于其端粒端即进一步位于端粒末端方向的全部基因缺失。前述个体基因的非限制性别称也示于上表1，且上面用于个体基因的术语范围涵盖相应基因和所编码蛋白。根据一个实施方式，含端粒区染色体断裂的所得细胞具有一个或多个以下特征：

a)断点位于Ipo8基因着丝粒端；

b)断点位于Tmtc1基因内。

如上所述，缺失位于断点端粒端即进一步进入端粒末端方向的所有基因。这包括基因C12orf35。鉴定具有这类断点的相应真核细胞的方法如上所述，并结合本公开第五方面描述于下。根据一个实施方式，Ergic2基因未缺失。

根据一个实施方式，CHO细胞(优选衍生自细胞系K1)用于生产C12orf35基因表达产物的效果(优选通过减少或消除基因C12orf35的功能表达而)受损的真核细胞系。根据一个实施方式，缺失含基因C12orf35的染色体8q臂端粒区。关于如何达到该结果的细节为技术人员已知，本文也描述合适的实施方式并参考相应公开。尤其有利的是如下实施方式，其中FAM60A在所述细胞中的效果例如通过减少或消除FAM60A基因的功能表达而额外受损，因为发现表达稳定性能由此显著提高。细节如上所解释并参考上面的公开。改变成C12orf35和FAM60A在所述细胞中效果都受损的哺乳动物宿主细胞具有特别有利的表达特征。因此，提供哺乳动物宿主细胞，其显示涉及以下2个性质的改善特征：长期稳定性和生产率，并由此是对大规模生产感兴趣产物尤其是感兴趣多肽重要的关键特性。

根据一个实施方式，第四方面所述方法包括向基因C12orf35的表达被减少或消除的真核细胞引入至少一种编码感兴趣产物的多核苷酸和优选至少一种编码选择标记的多核苷酸。根据一个实施方式，编码感兴趣产物的多核苷酸和编码选择标记的多核苷酸位于相同或分开的表达载体。表达载体能通过转染引入，优选稳定转染。合适和优选的实施方式也如上所述并参考在此同样适用的各公开。成功转染并表达感兴趣产物的宿主细胞能用第二方面所述方法选择。参考上述公开。

E.分析真核细胞的方法

根据第五方面，提供方法分析真核细胞作为宿主细胞以重组表达感兴趣产物的适宜性，包括直接或间接分析基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果是否受损。如上所述，所述真核细胞优选是哺乳动物细胞。

此分析方法可有利使用，例如联合本公开第四方面所述方法以鉴定是否生成细胞内基因C12orf35表达产物的效果受损的真核细胞。此外，所述方法能另外用于区分高产克隆和低产克隆。此外，在实施方式中，此方法还能用于在选择/筛选过程中区分表达稳定或不稳定克隆。通过使用此分析方法，能在选择过程早期鉴定具有利表达特征的克隆。这提高了选择稳定且高生产克隆的概率，产生更高比例的高产且稳定生产克隆。因而，此分析方法具有重要的应用并进一步改进重组表达技术。

根据一个优选实施方式，所述方法包括分析基因C12orf35在所述细胞中的功能表达是否减少或消除。关于基因C12orf35的功能表达是否减少或消除的分析能直接或间接进行。非限制性实施方式如下所述。哪个分析方法合适也取决于细胞如何改变以实现内源基因C12orf35功能表达的减少或消除。

例如，将基因敲除引入C12orf35基因以减少或消除基因C12orf35表达时，可扩增对应DNA区段并测序扩增的DNA以确认基因敲除被引入基因C12orf35。如果基因C12orf35的功能表达通过完全或部分缺失所述基因来减少或消除，可在DNA水平检测缺失，例如使用基于扩增的合适检测方法(这类方法为技术人员已知)。

根据一个实施方式，分析真核细胞的表达分布以测定基因C12orf35的功能表达是否减少或消除。例如，所述分析可包括进行定性或定量RT(反转录)PCR以检测C12orf35mRNA的存在、缺失、量或长度。这会是直接分析的示例，因为该分析直接涉及基因C12orf35的转录本。间接分析中通过分析基因C12orf35以外的基因表达分布来间接测定基因C12orf35的表达状态且其中该分析因此不直接涉及分析基因C12orf35或其转录本，这种分析也是合适的并因此由术语“分析基因C12orf35的功能表达是否减少或消除”涵盖。例如，如果含基因C12orf35(和其它基因)的染色体部分通过染色体断裂而缺失，这种间接分析是合适的，并随后描述。对于定量分析，能与参照(如未改变的对应细胞)进行比较。

根据一个实施方式，另外直接或间接分析蛋白FAM60A在所述细胞中的效果是否受损。这能通过测定内源基因FAM60A在所述细胞中的功能表达是否减少或消除来分析。此分析能比照就基因C12orf35所述来进行。参考上述讨论。

根据一个实施方式，在分析前，细胞用诱导染色体断裂的试剂处理以缺失含C12orf35基因的部分染色体。如上所述，所有基因C12orf35拷贝能因而缺失。然后，所述分析可包括分析用所述试剂处理是否导致含基因C12orf35的部分染色体缺失。细胞用诱导染色体断裂的试剂以合适浓度处理，从而发生染色体断裂。这里，可进行数轮处理。染色体断裂可在选择过程中诱发，如果选择中涉及以足够高的浓度使用诱导染色体断裂的试剂。合适试剂的非限制性实施例是例如MTX。在此情况中，为了能在MTX处理下生存，所述细胞可包括编码DHFR作为选择标记的异源多核苷酸。然而，如上所讨论，还能使用其它试剂如潮霉素，且这已通过实施例确认。

为诱导染色体断裂而处理细胞后，所得细胞能用第五方面所述方法分析以确定用所述试剂处理是否导致含基因C12orf35的部分染色体缺失。不同实施方式适合此目的。根据一个实施方式，分析经处理细胞的表达分布。例如，可分析基因C12orf35或位于基因C12orf35着丝粒端(即染色体内更远离端粒末段)的一个或多个基因是否表达。例如，在小鼠或中国仓鼠细胞的情况中，可分析基因C12orf35是否表达，并且相应地，如果其mRNA能检测(直接分析的示例)，且替代或补充地，能分析一个或多个选自甲基转移酶样蛋白20基因(小鼠中称为4833442J19Rik)、Dennd5b、FAM60A、Caprin2、Ipo8、Tmtc1的基因或者位于上述基因端粒端的基因是否由细胞表达(间接分析的示例)。前述个体基因的非限制性别称也示于上表1，且上面就个体基因和编码产物所用术语范围涵盖相应基因。如果诱导的断点位于相应基因的着丝粒端，缺失所述基因消除或减少(如果他处存在其它表达的基因拷贝)其表达。如图1所见，基因C12orf35位于上述基因的端粒端。因此，如果上述基因缺失，缺失区域还包括基因C12orf35。由此，上述基因能有效用作标记物以基本上间接确定诱导的染色体断裂是否引起基因C12orf35缺失并因而引起基因C12orf35的表达减少或消除。因此，分析基因C12orf35的表达是否减少或消除不必定基于例如C12orf35mRNA的直接分析，且第五方面的方法也涵盖这类间接方法。此外，发现即使位于基因C12orf35的端粒端(即进一步向下进入端粒末段方向)，基因Bicd1也能用作标记物以确定是否诱导引起基因C12orf35缺失的染色体断裂。结合中国仓鼠细胞如CHO细胞的分析发现，如果基因Bicd1由于染色体断裂而缺失，所述缺失的端粒区通常还包括C12orf35。通过分析数百个克隆的表达特征确认，上述基因能有效用作标记物以区分具有高且稳定表达特性的细胞克隆与具有低且不稳定表达特性的细胞克隆。图2显示上述基因在CHO细胞中的相对表达。

根据一个实施方式，第五方面所述方法用于分析仓鼠细胞优选CHO细胞，且所述方法包括通过分析位于染色体8端粒区且选自Tmtc1基因和位于Tmtc1基因端粒端基因的一个或多个基因在所述细胞中的表达是否减少或消除，分析基因C12orf35在所述细胞中的表达是否减少。如上所述，用引入染色体断裂的试剂处理后，不再表达Tmtc1基因和/或位于Tmtc1基因端粒端基因的相应细胞通常包括染色体8端粒区的缺失，该缺失区包括所述基因且尤其包括C12orf35基因。断点端粒端的遗传物质丧失。

根据一个实施方式，具有上述特征的选定宿主细胞转染有表达载体，包括至少一种编码感兴趣产物的多核苷酸且优选包括至少一种选择标记。合适的实施方式如上结合其它方面所述并参考上述公开。

根据一个实施方式，在用第五方面所述方法进行分析前，所述真核细胞转染有至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸和至少一种编码选择标记的异源多核苷酸，并且在分析前，进行至少一个选择步骤以鉴定成功转染的宿主细胞。合适的实施方式如上详述。根据一个实施方式，选择涉及使用诱导染色体断裂的筛选剂。在此实施方式中，所述选择标记可以是DHFR，且筛选剂可以是MTX。或者所述筛选剂可以是潮霉素，且选择标记可以是赋予对潮霉素抗性的基因，如hph基因。在所述方法在选择过程期间或之后进行的这些应用中，第五方面所述方法能用作分析工具以在选定细胞群内鉴定基因C12orf35的表达被减少或消除的那些细胞。如所述，这种减少或消除可由选择条件引起或支持，例如若诱导染色体断裂导致基因C12orf35缺失，并且第五方面所述方法能例如基于其表达分布来鉴定这些细胞。这能鉴定由于其表达分布尤其是由于基因C12orf35的表达减少或消除而特别适于建立重组生产细胞系的那些细胞或细胞克隆，因为感兴趣产物的高表达保持稳定是可预期的。如所述，在仓鼠细胞如CHO细胞的情况中，其中基因FAM60A位于染色体8端粒区，优选细胞失去染色体8端粒区(优选q臂)，从而减少或消除基因C12orf35的表达。从高表达细胞群所含细胞产生细胞克隆后，可进行所述分析方法。根据一个实施方式，分析多个细胞克隆以区分稳定与不稳定和/或高产与低产细胞克隆。

根据一个实施方式，第五方面所述方法包括选择至少一个细胞用于重组表达感兴趣产物，优选感兴趣多肽，所选细胞中基因C12orf35表达产物的效果受损，优选通过减少或消除基因C12orf35的功能表达而受损。如实施例所示，具有相应特征的细胞尤其适合重组表达。相应细胞的其它实施方式也如上详述。如所述，优选脊椎动物细胞用作真核宿主细胞，例如最优选哺乳动物细胞。

F.使用经改变真核细胞以重组生产感兴趣产物

根据第六方面，本公开涉及使用经分离真核细胞以重组表达感兴趣产物，其中基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果受损。关于相应真核宿主细胞和实施方式的细节如上详述并参考在此同样适用的上述公开，所述实施方式适于实现基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果受损，优选通过减少或消除基因C12orf35的功能表达来实现。非限制性实施方式简述于下。

优选用第一方面所述真核宿主细胞作为真核宿主细胞。所述细胞如上详述并参考上面的公开。所述真核细胞可选自后生动物、脊椎动物或哺乳动物细胞。所述真核细胞优选是哺乳动物细胞如啮齿动物细胞。优选CHO细胞。如上所详述，真核细胞基因组可改变以实现受损。根据一个实施方式，额外地，蛋白FAM60A在所述细胞中的效果受损，优选通过减少或消除内源基因FAM60A的功能表达而受损。关于此实施方式的细节和相关优点如上详述并参考上面的公开。

根据一个实施方式，感兴趣产物是多肽。优选地，感兴趣多肽在真核细胞中表达后，分泌入细胞培养基。关于感兴趣多肽的细节如上所述并参考各公开。为能表达感兴趣产物，真核宿主细胞可瞬时转染或优选稳定转染有表达载体，所述载体包括编码感兴趣多肽的多核苷酸。细节如上所述并参考上面的公开。

本文所述数值范围包含定义该范围的数字。本文提供的标题不对本公开多个方面或实施方式构成限制，本公开可整体参考说明书理解。根据一个实施方式，本文所述含某些元素的主题也指由相应元素组成的主题。特别地，本文所述含某些序列的多核苷酸还可由相应序列组成。优选选择并组合本文所述的优选实施方式，且从相应优选实施方式组合产生的特定主题也属于本公开。

本申请要求2013年12月20日提交的在先美国临时申请(申请号US 61/919313)的优先权，其完整公开内容通过引用纳入本文。

实施例

下列实施例用于说明本发明，而不以任何方式限制其范围。实施例特定涉及本发明的优选实施方式。

实施例1：通过RNA干扰(RNAi)在CHO细胞中减少C12orf35基因表达可增加表达产率

为证明降低基因C12orf35表达可引起体积生产率或比生产率增加，针对位于所分析中国仓鼠基因组(CHO-K1)染色体8端粒区的不同靶基因设计siRNA。设计针对以下表2所列靶基因的siRNA：

表2：针对不同靶基因的siRNA

所用siRNA用实时RT-PCR验证以确认其通过基因沉默降低靶基因表达。基因表达根据18S RNA标准化。转染siRNA阴性对照时，观察到的基因表达设为100％。针对靶基因C12orf35的2种不同siRNA的靶基因表达相对减少示于下表3：

表3

浓度	基因表达(siRNA 1)	基因表达(siRNA 2)
			100pmol	约28％	约37％
125pmol	约25％	约38％
			150pmol	约35％	约30％

此外，证实用于此实验的靶siRNA不抑制转染细胞生长。而且，基于可用中国仓鼠基因组数据的BLAST(基本局部比对搜索工具)分析不指示任何脱靶效应。

转染以下细胞系：衍生自CHO-K1的CHO细胞系用作亲本细胞系。所述细胞系表达如图2所示的以上基因。此亲本细胞系未用表达载体转染并作为对照。衍生自所述亲本细胞系的CHO细胞(克隆和库)用于测定siRNA效果，所述细胞系包括稳定整合入基因组的编码抗体作为感兴趣蛋白的表达载体。所述细胞克隆所含表达载体包括选择标记基因，且抗体重链和抗体轻链表达自不同表达盒。用于重链的表达盒设计成部分重链由于终止密码子通读而表达为含膜锚的融合多肽。所述融合蛋白在细胞表面上展示，从而简化FACS分析(参见说明书)。所述CHO细胞与亲本细胞系类似表达上述siRNA靶基因，这通过用微阵列对数以百计的克隆和库的来测定。使用重组表达抗体的CHO克隆以确定下调一个或多个上述靶基因是否引起感兴趣多肽的表达增加。如果情况如此，会发现所述细胞克隆的体积抗体生产率增加，这用FACS分析可检测。

包括稳定整合入基因组的表达载体的CHO克隆转染以siRNA对照(对基因表达没有影响)或上述针对靶基因的siRNA之一。转染siRNA后，分析靶基因表达降低是否引起抗体表达增加。转染细胞用荧光检测化合物染色并通过FACS分析以测定抗体的表达率。生产的抗体越多，能用标记化合物染色的展示融合蛋白越多，相应地，FACS检测的荧光信号就越高。因此，FACS分布中的强度越高，表达的抗体越多。

测试的不同siRNA的结果示于图3A-L。图中左峰对应不表达抗体的亲本细胞系所得信号。另2条曲线代表表达抗体细胞克隆的所得结果，所述克隆转染有siRNA阴性对照(对表达无影响)或减少其靶基因表达的测试siRNA。如果测试siRNA和相应的下调靶基因对抗体表达无影响(即不上调体积生产率)，则siRNA阴性对照所得荧光曲线和靶siRNA所得荧光曲线重叠并因此基本相同。在克隆水平上对于所有的测试靶基因而言基本如此，除了基因C12orf35。然而对于FAM60A，在库水平上发现轻微偏移，推测这可归因于表达稳定性增加(数据未显示)。

如用针对C12orf35的siRNA所得的结果所示(见图3B和C)，就siRNA阴性对照和针对基因C12orf35的siRNA所得的荧光峰在用RNAi沉默基因C12orf35后明显分开。转染有针对基因C12orf35的siRNA的细胞克隆所得荧光峰明显右移(标有箭头)，意味着荧光显著增加。此观察到的荧光增加归因于抗体表达更高，因为存在更多融合蛋白并因此在细胞表面染色。因此，此实验清楚显示下调基因C12orf35的功能表达可直接引起抗体重组表达(抗体产率)显著上调。使用所有3种浓度的所述针对C12orf35的siRNA时，都观察到FACS分布中相同的显著移动。如本说明书所述，通过RNA干扰可实现基因C12orf35表达的长时间减少，例如，若稳定整合入表达RNAi诱导转录本的表达载体。此外，如本说明所述，减少或消除基因C12orf35表达可通过基因敲除或基因缺失/突变实现，根据一个实施方式，在仓鼠细胞如CHO细胞情况中通过缺失部分染色体8端粒区实现。此外，如本文所述，例如通过引入导致蛋白无功能或功能更少的一个或多个突变，减少或消除表达产物效果也是可行的。

所实现的感兴趣重组多肽表达增加也通过对重链和轻链的mRNA表达水平(表达自分开的表达盒，见上)的分析来确认。图4和5显示2种不同感兴趣多肽(抗体1和2)的结果。所示数据根据siRNA阴性对照(125pmol)标准化。发现基因C12orf35表达降低引起表达抗体的重链和轻链的显著更高mRNA水平。相比之下，其它所测靶基因的表达降低不影响重链和轻链的mRNA表达水平。因此，基因C12orf35表达降低引起感兴趣重组多肽mRNA水平的显著增加。此外还观察到，如果基因C12orf35沉默，其它所引入基因如选择标记也上调。在从第3天开始随着时间推移测量基因沉默效果的实验显示siRNA1(见表4的siRNA C12orf35_1)的效果相较siRNA2(见表4的siRNA C12orf35_2)更久。另外，细胞数和效价通过时程实验测定，显示下调C12orf35引起显著更高的比生产率和体积生产率(见图6和7)。

此外，在抗体表达克隆中分析siRNA 1和2抑制后C12orf35基因相对18S RNA的表达，并与不同对照比较。结果示于下表4：

表4

	18S	C12orf35	重链	轻链
					siRNA C12orf35_1	97％	0.0129％	0.8517％	3.4639％
siRNA C12orf35_2	91％	0.0186％	1.0643％	2.9623％
					siRNA对照	93％	0.0617％	0.3098％	0.9195％
未处理细胞	100％	0.0782％	0.2713％	0.7840％
					细胞脂质体	114％	0.0648％	0.2633％	0.8019％

实施例2：产生含染色体8端粒区缺失的CHO细胞系

产生新型CHO细胞系(C8DEL)，其包括染色体8q臂的端粒区缺失。缺失由染色体断裂诱导。缺失的部分包括基因C12orf35以及基因FAM60A等(见图1)。所述新型细胞系从衍生自CHO-K1的亲本细胞系获得。所述细胞系如下制备。亲本CHO细胞在培养基中以2E5细胞/ml传代，所述培养基包括0.5μM、1μM或2μM MTX。6天后，细胞活力约为30-40％。细胞以180xg离心5分钟并在无MTX的培养基中培养以允许细胞恢复，直至活力大于95％(约21天后)。此过程再重复2次。单细胞克隆获自细胞库。培育总共561个细胞克隆并用“Extract-N-AmpBlood PCR试剂盒”分离DNA。用检测基因Ipo8的引物进行PCR筛选。561个克隆中的3个是“IPO8阴性”，表明失去含Ipo8基因的染色体8端粒区。Ipo8基因位于C12orf35基因着丝粒端(见图1)。因此，如果Ipo8基因由于染色体断裂而缺失，所有位于Ipo8基因端粒端的基因同样缺失(且相应地，C12orf35基因和FAM60A基因也如此)。这3个克隆被扩增并进一步评估。这些克隆之一称为“C8DEL”细胞系。采用PCR技术，能测定来自C8DEL细胞系染色体8端粒区的断点。断点在2个PCR即PCR20和28之间测定：

PCR20:正5’-ACC AGT GAA TAA TCG TGT TT-3’(SEQ ID NO:47),反5’-CTA TGA GTCAAT GTC CCA AG-3’(SEQ ID NO:48)；

PCR28:正5’-CAC ACA CAA CCT CCT AAC AAC CC-3’(SEQ ID NO:49),反5’-TTC CGCACC GAC TCA GTT CT-3’(SEQ ID NO:50)

断点位于Tmtc1基因内。另外，能(通过PCR测定)证明所鉴定的C8DEL细胞系断点在数周的培养中稳定。如以下所示，用编码感兴趣产物的表达载体转染此新型真核细胞，相较亲本细胞系(不含所述端粒区缺失)产生显著更高的体积产品效价以及选择稳定生产克隆的更高可能性。如基于转染克隆的分析所测，转染和MTX处理C8DELL细胞系显然不会影响断点(没有进一步的遗传物质丧失)。

实施例3：分析细胞系C8DEL的特征

分析细胞系C8DEL在重组表达感兴趣多肽时的性能并与从中获得细胞系C8DEL的亲本细胞作比较。如上所述，所述亲本细胞系不包括染色体8端粒区的对应缺失。

3.1生产率分析

与其源起的亲本细胞系相比评估C8DEL的体积生产率。进行稳定以及瞬时转染。

稳定转染

细胞培养、转染和筛选在使用化学限定培养基中悬浮生长的CHO细胞的摇瓶中完成。细胞通过电穿孔用编码多种抗体和治疗蛋白的不同表达载体来转染。所用表达载体包括含编码新霉素磷酸转移酶作为选择标记的多核苷酸的表达盒，和编码DHFR作为选择标记的表达盒。用于表达抗体的表达载体额外包括含编码抗体轻链的多核苷酸的表达盒和含编码抗体重链的多核苷酸的表达盒，从而从所述表达载体中表达完整抗体。用于表达非抗体多肽的表达载体包括含编码多肽以及选择标记的多核苷酸的表达盒。表达载体中的所有表达盒方向一致。所述载体适合FACS选择且这类载体的细节如上所述。

根据细胞活力，转染后24-48h通过向细胞加入G418选择性培养基而开始第一选择步骤。一旦细胞恢复到活力大于80％，通过将细胞传代入500nM MTX或1μM MTX来应用第二选择步骤。

在G418和MTX选择步骤后，通过有G418或MTX的培养基中的过生长摇瓶分批培养物来分析选定细胞群的体积生产率。G418批次在30ml(125ml瓶)中完成，MTX流加培养在100ml(500ml瓶)中完成。G418分批培养物以1E5vc/ml接种于摇瓶并在摇瓶柜(未加湿)中于150rpm和10％CO2下培养。补料分批培养以4E5vc/ml接种。开始试验时，细胞活力必须>90％。效价测定在第14天进行。培养开始后14天，通过蛋白-A HPLC测定细胞培养上清中的抗体效价。

第一选择步骤(G418选择)后，相较稳定转染的亲本库，稳定转染的C8DEL库检测到体积效价大幅增加(12-35倍)。如2种抗体(抗体1和2)所例示，第二选择步骤(MTX选择)后，C8DEL补料分批培养库相较经转染亲本细胞表达4-7倍的感兴趣多肽。与不含染色体8端粒区缺失的亲本CHO细胞系相比，在下表5.a和5.b中就2种抗体项目示例性展示C8DEL的体积G418和MTX(补料分批)培养效价。表5.a和5.b显示与亲本库相比(显示4个库/条件的平均)，C8DEL中产生的体积G418和MTX补料分批培养库效价(抗体)。

表5.a：示例抗体1的库效价

表5.b：示例抗体2的库效价

结果支持以下结论：含C12orf35基因的染色体8端粒区的缺失与更高体积生产率相关。在体积库效价方面已显示，C8DEL细胞系优于不含染色体8端粒区各缺失的亲本细胞系。分析C8DEL库和亲本库的核型内整合位点的频率和分布。两个库都在200个分析细胞中显示有大于100个不同的整合位点，强调两个库中都存在巨大变化，但两个细胞系之间没有差异。这表明体积生产率提高不归因于任何整合失真。

瞬时转染

用编码eGFP或Fc融合蛋白作为感兴趣模型蛋白的表达质粒，对生长于培养基的C8DEL细胞和亲本细胞系一式三份瞬时转染。聚乙烯亚胺(PEI)用作转染试剂。培养基上清中的模型蛋白效价通过蛋白A HPLC在转染后第3天和第6天测量。模型蛋白在C8DEL中的表达约3倍高。eGFP表达细胞的百分比通过流式细胞术在转染后48h测量，用非转染细胞作为阴性对照。显示荧光水平高于99％阴性对照的细胞视作“已转染”。显示荧光水平比阴性对照强度大1000倍的细胞视作“高荧光”。用C8DEL细胞系时，高荧光细胞数相较获得C8DEL的亲本细胞系为2-3倍高。

此实施例显示，用一部分染色体8端粒区由于染色体断裂而失去的C8DEL细胞系进行瞬时转染时，也能实现体积生产率增加的优点。

3.2稳定性分析

稳定转染后分析46个C8DEL衍生克隆和37个亲本细胞系衍生克隆(其测试为IPO8阳性并因此未失去染色体8端粒区)的稳定特性。所有克隆重组表达相同抗体作为感兴趣产物，并且如果其在12周内不失去大于25％抗体效价(体积)，则归类为稳定。来自亲本细胞系的所分析克隆有76％在12周培养内失去大于25％抗体效价(体积)。仅24％所分析克隆归类为稳定。因此，不稳定率较高。相比之下，如表6所示，67％的C8DEL克隆能归类为稳定且仅33％不稳定：

表6：稳定性研究结果

使用有耶茨校正的χ2检验，可计算出p值为0.0002，这支持C8DEL衍生克隆成为稳定生产者的倾向显著更高。因此，C8DEL细胞系发现明显更高数量的稳定生产克隆。这进一步支持缺失一部分也含基因FAM60A的染色体8端粒区的仓鼠细胞如CHO细胞显示优越的稳定特性，在结合实施例5的敲除实验时尤其如此。因此，采用这类细胞系用于重组表达可增加鉴定高且稳定生产重组细胞的可能性。此外，分析所述克隆的体积生产率(见3.3.)。

3.3C8DEL特征的进一步分析

其它实验中分析了含染色体8端粒区缺失的CHO细胞系的特征，证明所述细胞系的其它优点，其中所述缺失包括基因C12orf35。

选择高产者所需的单细胞克隆更少

C8DEL细胞系的优势特征是单细胞克隆后高产克隆的比例更高。发现相较衍生自CHO-K1的亲本细胞系，C8DEL库含有比例增大的高产细胞(引起体积库效价增加)。用FACS技术进行C8DEL库单细胞克隆后，相较衍生自亲本细胞系的库，选出显著更高比例的表达大量抗体的克隆。表7显示大部分衍生自亲本细胞系的克隆具有0-20mg/L的体积“96孔效价”。相反，大部分衍生自C8DEL细胞系的克隆具有80-100mg/L的平均体积效价，这是一个显著改善。使用C8DEL库的一个优点是为获得相当量高产克隆而必须产生的克隆数降低。这能显著减少筛选工作。

表7

96孔效价(mg/L)	亲本细胞系	C8DEL
			0-20	80.3％	0.8％
20-40	6.1％	3.1％
			40-60	5.4％	5.3％
60-80	6.1％	28.2％
			80-100	1.4％	32.1％
100-120	0.0％	17.6％
			120-140	0.7％	7.6％
140-160	0.0％	3.1％
			160-180	0.0％	1.5％
180-200	0.0％	0.8％

使用C8DEL细胞系作为生产细胞系，不仅使高产克隆比例增大，个体C8DEL克隆的体积效价也更高。图8显示从抗体项目的来自从CHO-K1衍生的亲本细胞系(都为Ipo8阳性)和C8DEL的各45个最高产克隆的体积效价(这些克隆的稳定性分析结果示于3.2)。可见，衍生自C8DEL的克隆的平均体积效价高于亲本细胞系，另外，那些最高抗体生产克隆也源自C8DEL细胞系。

生物反应器适宜性

相较衍生自CHO-K1的亲本细胞系进行评估C8DEL细胞系的额外试验，以确定其放大的适宜性。生物反应器运行显示C8DEL细胞系适合放大。生物反应器中培养的C8DEL细胞系具有适合大规模生产的活细胞密度。此外，发现活力优于亲本细胞系。总体上，C8DEL细胞系适合放大并在活力方面优于其源起的亲本细胞系。C8DEL细胞系的活力在更高水平上保持更久。

从转染到稳定库生产的时间线改善

C8DEL细胞系的另一优点是从MTX选择中恢复更快。MTX孵育后库的恢复比亲本细胞系快7-8天，所述亲本细胞系中没有含基因C12orf35的染色体8端粒区缺失。总体上，发现使用基因C12orf35表达减少或消除的细胞时，细胞危象显著更低。不受理论约束地，认为这很可能是由于包括选择标记的异源基因即外源基因表达更高。

实施例4：用叶酸受体作为选择标记来选择

C8DEL细胞系与作为选择标记的叶酸受体联用于不同背景，并与所述选择系统结合后显示特定优势。具体地，针对作为选择标记的叶酸受体和DHFR的组合选择是有益的。在此，转染细胞包括人叶酸受体α和DHFR作为选择标记并表达抗体。尽管用极低量叶酸(50nM叶酸(FA)/50nM MTX)选择亲本细胞系由于选择严谨性而遇到困难(细胞不总是恢复)，C8DEL和作为选择标记的叶酸受体的组合在这种严谨条件下极强，并能引起体积效价显著增加。表8凸显亲本细胞系与C8DEL之间的体积效价差异，以及将作为选择标记的叶酸受体与低量叶酸而非500nM MTX选择步骤联用时达到的额外体积效价增加。因此，使用本文所述基因C12orf35和基因FAM60A的表达被减少或消除的真核细胞，能联合叶酸受体/DHFR选择系统以采用不需要使用大量毒剂的极严谨选择条件。

表8

此外，C8DEL细胞用表达载体转染(核转染)，所述载体包括含编码人叶酸受体α的多核苷酸的表达盒和含编码DHFR的多核苷酸的表达盒。因此，选择标记FRα和DHFR在同一表达载体上。此外，该表达载体包括含编码抗体轻链的多核苷酸的表达盒和含编码抗体重链的多核苷酸的表达盒。用于抗体重链的表达盒设计成使部分重链由于终止密码子通读生产为膜锚定融合物，从而促进FACS选择(见上)。测试用100nM叶酸(FA)和不同MTX浓度的5种不同选择条件。选择性培养基如下表9所概括。选择后，选定细胞库转至完全培养基并在摇瓶分批培养物中生长。在培养第13天，取培养基样品并通过蛋白-A HPLC分析抗体含量。结果也示于表9。

表9

选择条件	大致抗体浓度[g/L]
		100nM FA/无MTX	0.13
100nM FA/1nM MTX	0.12
		100nM FA/5nM MTX	0.46
100nM FA/10nM MTX	1.44
		100nM FA/50nM MTX	1.57

可见，低至5nM的MTX浓度已提供选择优势。增加选择严谨性也提高体积库效价。因此，体积抗体生产率显著增加。此外，相较标准MTX选择，选择期间能使用显著更低的MTX浓度。鉴于MTX是毒剂，这是一个重要优点。此外，分析选择严谨性如何影响体积库效价和选择时间。发现通过提高MTX浓度增加选择严谨性使恢复时间延长。因此，选择严谨性能根据不同应用需求来调整(时间相比效价)。对于较少感兴趣蛋白总量已足够的某些应用，能使用不太严谨的选择条件，从而仍获得生产率足够高的库以能纯化充足量的各蛋白。为建立能用于工业规模生产感兴趣蛋白的克隆细胞系，优选应用更高的选择严谨性，以获得表达率极高以及稳定率良好的单细胞克隆。

此外，通过FACS对叶酸/MTX选择后所得库的抗体表面表达的分析显示，将此选择系统与所述新型细胞系联用显著增加细胞库中的高产者丰度，这从如图9A-E所示的所得荧光分布可显见。MTX浓度从A到E增加(A:无MTX；B:1nM MTX；C:5nM MTX；D:10nM MTX；E:50nMMTX)。如可从右边峰尺寸增加推定(更高的荧光关联更高的抗体表达率)，增加MTX浓度时，细胞库中的高表达细胞克隆数增加。联用50nM叶酸与10nM MTX(见图9D)已得到主要含高产细胞克隆的细胞库(右边的一个主峰)。此外，MTX浓度增加到50nM时(见图9E)，基本上只有高产细胞包括在所得库中。这些结果是显著的，因为在联用C8DEL细胞系与叶酸受体/DHFR选择系统时，在FACS分析后可获得库分布，其更类似于(包括遗传上相同细胞的)细胞克隆而不是(包括遗传上不同细胞的)细胞库。看来失去的细胞系C8DEL端粒区所含C12orf35基因缺失会引起体积生产率显著增加，从而根据FACS分布，在合适条件下进行叶酸/MTX选择后所得细胞库中的大部分细胞是高产者。

此外，发现在选择性培养基(50nM叶酸、10nM MTX)中培养获自C8DEL细胞系(失去基因FAM60A，见上)的稳定转染克隆时，项目中能获得多至80％和多至几乎100％的稳定率。还在半选择性培养基中达到显著高稳定性结果，所述培养基仅包括极限浓度叶酸(50nM)，却没有MTX。在此，用该细胞系实现多至87％的稳定率。在某些项目中，获得多至几乎100％的稳定率。

实施例5：用TALEN技术在CHO细胞中敲除FAM60A

在衍生自细胞系CHO-K1的CHO细胞基础上，制备包括FAM60A基因的敲除突变的2个细胞克隆。为产生FAM60A突变细胞，使用TALEN(转录激活子样效应物核酸酶)技术。为敲除FAM60A，靶向基因FAM60A的编码区(推测的外显子1)。用作亲本细胞的CHO-K1细胞仅包含一个FAM60A拷贝。因此，每细胞的单个敲除都足以削弱FAM60A在所述细胞中的效果。

5.1FAM60A特异性TALEN的设计/生产和应用

靶向以下CHO亲本细胞系基因FAM60A的基因组DNA外显子序列：

atgtttggttttcacaagccaaagatgtaccgaagtatagagggctgctgtatctgcagagccaagtcctccagctctcggttcacggacagtaaacgttatgaaaaggacttccagagctgttttgg(SEQ ID NO:51)

TALEN结合位点的核苷酸以粗体标记。设计靶向上述FAM60编码序列(SEQ ID NO:51)的2个TAL Fok I。如上面SEQ ID NO:51所示(也参见表10，其另外显示后续用于鉴定敲除的引物序列)，TALEN TAL-L靶向并结合基因FAM60A 5’(正向)DNA链的25个标记核苷酸，TALEN TAL-R靶向并结合3’(反向)DNA链的25个标记核苷酸。2个结合位点由切割位点的16个核苷酸分开。获得编码2个TALEN(TAL-L和TAL-R)的质粒。

表10：用于FAM60A基因敲除的TALEN靶序列和引物序列

基因FAM60A的部分基因组DNA序列涵盖SEQ ID NO:51所示的被靶向编码序列，且还延伸到引物1、2和4的引物结合位点，其位于如SEQ ID NO:58所示的内含子区段内。

5.2转染TALEN质粒

采用处于指数生长期、活力超过95％的亲本CHO细胞和5μg的各TALEN质粒，转染用涉及电穿孔的标准转染操作完成。

5.3Cel-I-测定和细胞分选

Cel-I-测定根据SAFC生物科学公司(SAFC Bioscience)手册进行。Cel-I-测定是用于测定切割效率的标准检测。简言之，培养数天后，从细胞分离基因组DNA，并用引物1和2实施PCR(见表10)。扩增产物变性并使之复性。随后，加入核酸酶S和核酸酶S增强剂并孵育。分析消化产物。如果出现TALEN活性，则存在2个更小带，指示该基因组区内的TALEN活性，并因此支持所分析细胞库中存在FAM60A基因敲除的细胞。从阳性细胞库中，单细胞通过有限稀释在96孔板中分选。

5.4筛选策略

基因组DNA(gDNA)提取自96孔板的各克隆。通过标准程序分析gDNA以通过PCR分析鉴定敲除克隆。出于此目的，使用引物3和4(见表10)。在切割区突变的情况中，引物3不结合，从而不产生PCR产物。用阳性克隆gDNA以引物1和2(见上)进行PCR所得PCR产物进行测序以分析引入的突变。

获得有敲除突变的2个细胞克隆：缺失14个核苷酸的FAM60A_ko_s16(s16)，和缺失5个核苷酸的FAM60A-ko_s23(s23)。细胞克隆的突变序列示于表11。各缺失引起移码。由于FAM60A靶序列内的移码，在读框内提供终止密码子(表11中通过核苷酸以斜体字母和加下划线来突出)。因此，预期由所得FAM60A敲除克隆表达异常短且功能更少或无功能的FAM60A表达产物。

表11：CHO野生型((WT–衍生自CHO-K1)和2个衍生自所述WT的敲除细胞克隆(s16和s23)中FAM60A推测外显子1的DNA序列。TALEN结合位点的核苷酸以粗体突出，而提前终止密码子的核苷酸以斜体字母和下划线突出。

5.5稳定性分析

从中获得FAM60A敲除克隆的亲本WT细胞系和所得FAM60A敲除细胞稳定转染有编码抗体作为感兴趣多肽的表达载体。转染的表达载体包括含编码新霉素磷酸转移酶作为选择标记的多核苷酸的表达盒，编码DHFR作为选择标记的表达盒，含编码抗体轻链的多核苷酸的表达盒和含编码抗体重链的多核苷酸的表达盒，从而完整抗体从所述表达载体中表达。表达载体中的所有表达盒方向一致。用于重链的表达盒设计成部分重链由于终止密码子通读而表达为含膜锚的融合多肽。所述融合蛋白在细胞表面上展示，从而简化FACS分析(参见说明)。用G418和MTX(1μM)选择就重组表达选择转染的细胞。为在延长培养期间分析其表达稳定性，从各稳定转染细胞系(CHO WT、s16和s23)的选定库中，获得以良好产率表达感兴趣产物的细胞克隆并培养数周(对于WT CHO亲本细胞系(45个克隆)是7周和对于FAM60A敲除细胞(s16的13个克隆和s23的18个克隆)是8周)。为确保生产细胞系能被放大到高容量生物反应器，还进行12周的稳定性研究，尤其是12周培养期间表达稳定性的额外分析。如果克隆在分析的稳定期中失去大于25％的初始体积表达效价，其被归类为不稳定。在通常变化水平内，一些克隆正好在25％边界之上或之下。就亲本细胞系而言，7/8周中不稳定克隆的比例相较12周更高，这能用克隆生产率测试的变化解释，其接近25％荧光水平。

表12比较用细胞系获得的稳定性结果。可见，相较衍生自野生型细胞系的克隆，在衍生自FAM60A敲除细胞系的克隆中具有稳定体积效价的克隆百分比明显更高。这证明削弱内源FAM60A在细胞中的效果(在此是通过引入基因敲除)，可显著改善延长培养期间的稳定性结果。当使用本发明细胞时，稳定与不稳定克隆之比显著提高，从而获得在延长培养期间维持其有利的高表达特征的更多稳定克隆。此实施例中重组表达的抗体非密码子优化，且在亲本细胞系中显示极高的不稳定性。由于此显著不稳定性，选择该项目作为比较实施例，因为这甚至能在面临困难项目时证实用本发明实现的显著益处，其中用野生型未修饰细胞的不稳定率较高。然而，如上所讨论，其它项目中，亲本CHO野生型细胞系的不稳定率不那么高。然而，在所有分析的情况中，相较未修饰野生型，本公开所述宿主细胞实现稳定细胞量的显著增加，其中FAM60A在所述细胞中的效果受损。稳定率能达到高至60％或更高，70％或更高，80％或更高，85％或更高，或甚至或90％更高，这取决于项目。用本公开所述细胞，其例如包括FAM60A基因中的基因敲除或其中一部分含基因FAM60A的端粒区由于染色体断裂而失去，则无论所分析项目如何，不稳定克隆出现都不太频繁；甚至如果出现，体积生产率损失相较FAM60A在细胞中的效果未受损的对应细胞更不明显。因此，由于转染和选择后获得的稳定克隆百分比增加，本公开所述细胞能明显缩短或甚至跳过长期稳定性研究。FAM60A敲除克隆的稳定性研究证实了用本公开技术达到的有益结果。

表12：稳定性研究的结果

结果也示于图10并证明当(在此是通过基因敲除)削弱FAM60A在细胞中的效果时，取得的重要优势。因此，额外削弱蛋白FAM60A在真核细胞中的效果是有利的，例如通过改变真核细胞基因组来减少或消除FAM60A基因的功能表达，从而表达稳定性能提高。

实施例6：基于表达分布鉴定高且稳定生产者的验证工具

开发实时RT-PCR分析工具以预测在开发管线过程早期的克隆生产率和稳定性。就以下4个基因实施实时RT-PCR：C12orf35,Dennd5b,Fam60a和Ipo8(都位于染色体8q臂端粒区)。选择和克隆生成之后，就这4个基因在染色体8端粒区的存在和表达水平以及表达产率，分析数百个稳定表达抗体作为感兴趣多肽的克隆。发现在体积抗体生产率与染色体8端粒区损失之间有明显相关性。此外，发现这些细胞显示更高水平的重链和轻链mRNA。因此，高表达细胞克隆能用所述分析方法鉴定。

此外，进行研究以确定稳定性与染色体8端粒区的存在之间是否有关联。如果克隆在12周内不失去大于25％体积效价，则其被归类为稳定。在失去染色体8端粒区与克隆稳定性之间存在明显相关性(根据χ2检验，p值:4.67E-06)。因此，染色体8端粒区的损失能用作稳定性的预测工具。通过实时RT-PCR分析染色体8端粒区是否存在，可增加在管道项目中选择更高比例稳定克隆的概率。

此外，通过分析数百个失去部分染色体8端粒区的克隆发现，似乎在染色体8端粒区存在数个能诱导的断点。在大部分分析的情况中，断点位于Ipo8基因着丝粒。还在甲基转移酶样蛋白20(小鼠中称为4833442J19Rik)与Dennd5b之间、Dennd5b与FAM60A之间、FAM60A与Ipo8之间检测到断点。在所有情况中，缺失区域包括基因C12orf35(位于编码甲基转移酶样蛋白20的基因端粒)。所有断点与高体积生产率相关，从而证实基因C12orf35对体积生产率的相关性。

实施例7：通过RNA干扰(RNAi)在HEK293衍生细胞系中减少C12orf35基因表达可增加表达产率

为证明降低基因C12orf35表达还在其它哺乳动物细胞系中引起体积生产率增加，针对智人的C12orf35设计2个siRNA。表13列出siRNA序列。使用阴性对照1号siRNA(AM4611)作为RNAi阴性对照(siRNA阴性对照)。

表13：针对C12orf35和对照基因的siRNA

所用siRNA用实时RT-PCR验证以确认其通过基因沉默降低靶基因表达。基因表达根据18S RNA标准化。转染siRNA阴性对照时观察到的基因表达设为100％。针对靶基因C12orf35的2种不同siRNA的靶基因表达的相对减少示于下表14：

表14

浓度	基因表达(siRNA 1)	基因表达(siRNA 2)
			150pmol	约30％	约26％

此外，基于智人基因组数据的BLAST(基本局部比对搜索工具)分析不指示任何脱靶效应。

转染以下细胞系：HEK293衍生的CHO细胞系用作亲本细胞系。所述细胞系稳定表达内源基因C12orf35。用编码感兴趣重组治疗蛋白并稳定整合入基因组的表达载体，稳定转染获自HEK293衍生细胞系的库，用于测定siRNA效果。所述细胞库中的表达载体包括选择标记基因和重组治疗蛋白。重组表达重组蛋白的库用于确定C12orf35下调是否会引起感兴趣多肽表达增加。如果情况如此，会发现所述细胞克隆的靶蛋白体积抗体生产率增加。

包括稳定整合入基因组的表达载体的HEK衍生库转染有(对基因表达没有影响的)siRNA对照或上述针对C12orf35的siRNA之一。转染siRNA后，分析C12orf35表达降低是否引起重组蛋白表达增加。

不同的测试siRNA的结果示于表15。使用脂质体2000作为转染试剂，HEK293衍生细胞用各siRNA以6孔的规模转染。转染后5天，细胞培养上清中的重组靶蛋白浓度用亲和HPLC测量。对此，在感兴趣重组蛋白上使用短的专有标签。不依赖于采用2种评估siRNA中的哪一种，能检测感兴趣蛋白增加。如果例如在表达RNAi诱导转录本的表达载体中稳定整合，持续的基因C12orf35表达减少可通过RNA干扰实现。此外，减少或消除基因C12orf35表达可通过基因敲除或基因缺失/突变实现。而且如其中所述，例如，通过引入导致蛋白无功能或功能更少的一个或多个突变，减少或消除表达产物效果也可行。

表15：针对C12orf35的siRNA转染后体积效价增加

	效价重组蛋白
		siRNA C12orf35_3	37.3mg/L
siRNA C12orf35_5	28.9mg/L
		siRNA对照	16.1mg/L
未处理细胞	18.5mg/L

此外，分析siRNA 3和5抑制后在第3天和第5天的C12orf35基因表达。结果示于下表16：

表16

实施例8：通过C12orf35基因内的移码突变产生含C12orf35基因敲除的CHO细胞系

使用TALEN(转录激活子样效应物核酸酶)技术，生产基于CHO-K1衍生细胞的3个C12orf35敲除(“KO”)细胞克隆。对于敲除，C12orf35靶向5-prime区。在5-prime区加入移码突变具有以下优点：截断蛋白会较短。

8.1TALEN的设计/生产和应用

设计靶向5-prime区的2个截断TAL Fok I核酸酶。各TALEN分别靶向并结合5’(正向)或3’(反向)DNA链的19个核苷酸。2个结合位点由切割位点的16个核苷酸分开。合成各设计的TAL，克隆于合适的入门载体，并亚克隆于pcDNA3.3_DEST_A343目的载体。产品描述和方法可获自Life Technology/GeneArt。

8.2转染TALEN质粒

采用处于指数生长期、活力超过95％的亲本CHO细胞转染。用Amaxa^TM,Nucleofector^TM技术根据厂商(龙沙(Lonza))说明进行电穿孔(核转染)。在20x96孔板中，转染细胞在转染后第5天扩增，单细胞在第8天分离。单克隆性和细胞融合用CloneSelect^TM成像仪(Genetix)控制。

8.3Cel-I-测试和筛选策略

Cel-I-测定根据SAFC生物科学公司手册进行。Cel-I-测试是用于测定切割效率的标准检测。简言之，培养6天后，从细胞分离基因组DNA，并用以下引物实施PCR：

正:GCATCCAGTGAACTTACTTATCCAGAT(SEQ ID NO:65)

反:GCTCTGCCACTGCTGTTGAAAG(SEQ ID NO:66)

扩增产物变性并能复性。随后，加入并孵育核酸酶S和核酸酶S增强子。分析消化产物。存在2个更小带，其指示该基因组区内的TALEN活性，且因而支持所分析细胞库中存在C12orf35基因通过突变而改变的细胞。从大部分阳性的细胞库(2个更小带的更强强度)中，在96孔板中分选单个细胞。

使用Extract-N-Amp^TM Blood PCR试剂盒(cat.XNAB2R,西格玛(Sigma))，从96孔板的各克隆中提取基因组DNA(gDNA)。gDNA提取物用于筛选突变克隆，在PCR检测中采用正向引物(正)(SEQ ID NO 67:TGCTGGGATTAAAGGGGAAAGCTTT)以及结合切割位点的引物(“切割引物”)，所述引物具有以下序列：

切割引物:TCTAGAAACAGACTGAGAATTTTGCAC(SEQ ID NO:68)

有突变的克隆被转到125ml烧瓶并测序。在所述筛选试验中，鉴定10个克隆并选择3个克隆用于进一步分析。表17显示3个克隆的基因型，突出5-prime C12orf35序列，称为野生型和各突变。表18显示各氨基酸序列。

表17：编码5-prime末端的C12orf35基因序列来自CHO-K1衍生WT和不同KO克隆。Δ指示缺失。Δ后的数字指示有多少个核苷酸缺失。括号中显示缺失的核苷酸并带有所示的单独SEQ ID NO。TALEN结合位点和切割位点以粗体标记。TALEN结合和切割位点周围的序列通过桑格测序在KO克隆中确认，且剩余序列是基于与野生型序列相同的假设。

表18：CHO WT和KO克隆的部分C12orf35氨基酸序列。星号*代表由于各移码突变出现的第一个终止密码子。由于缺失8bp和20bp分别用于克隆“Δ8”和“Δ20”，仅部分TALEN结合位点的框内翻译仍存在并以粗体标记。克隆“Δ59”加核苷酸插入“C”和“A”表示由于在TALEN结合位点前插入核苷酸C而不再有TALEN结合位点以及所得的移码。

为确认siRNA实验结果，候选抗体在3个C12orf35敲除细胞克隆中以分批和流加培养表达，分析体积抗体效价并与内源表达完整C12orf35的对应CHO野生型细胞系所得结果作比较。

8.4转染mAb编码载体

CHO野生型细胞系、上述C8DEL和C12orf35敲除CHO细胞克隆(见表17和18)用表达载体转染，所述表达载体包括编码单克隆抗体(mAb)和2个选择标记(即neo和DHFR)的多核苷酸。评估编码2种不同示范性抗体(抗体1和抗体2)的2个载体。对于转染，细胞生长到指数期，且5x10⁶个细胞用3μg载体DNA转染。进行3次转染重复。用G418(G418浓度0.8mg/ml)然后是MTX选择(500nM)，对稳定转染有感兴趣蛋白编码载体的细胞进行选择。所有库的选择条件相同。在选择过程中，测定培养基内所表达mAb的体积效价。C12orf35敲除克隆上清的体积效价与CHO野生型的体积效价作比较。在含化学限定培养基的摇床中培养细胞。分批培养在37℃温度和振荡条件下进行。流加培养期间，在含化学限定培养基的摇床中培养细胞，所述培养基富集氨基酸。流加培养在37℃和振荡下进行，并在第5天将温度变换到33℃。另外，在所述过程中定期添加含葡萄糖和氨基酸的进料。在流加培养过程中，定期收集流加培养材料样品以用Vi-Cell细胞活力分析仪(贝克曼库尔特(Beckman Coulter))测定活细胞密度(vcd)并测定细胞培养基的蛋白效价。在分批和流加培养结束时(第14天)，停止培养过程。对分批和流加培养物的分析揭示在14天培养期中，C12orf35 KO库的培养基中所表达mAb的体积效价与C8DEL的体积效价类似，且显著高于CHO野生型细胞库的培养基。

第一选择步骤(G418选择)后，相较稳定转染的亲本库，稳定转染的C12orf35 KO库检测到体积效价大幅增加(4-10倍)。第二选择步骤(MTX选择)后，与转染的亲本细胞相比，C12orf35 KO库表达4-7倍更多的感兴趣多肽(分批)和2-6倍更多的多肽(流加培养)。下表19和20中展示与亲本CHO细胞系相比，示例性抗体项目1和2的C12orf35 KO库的体积G418和MTX(流加培养)效价。表19和20显示与亲本库(显示平均3个库/条件)相比，C12orf35 KO库中产生的G418和MTX分批和流加培养体积库效价(抗体)。

表19：如抗体1例示的库效价

表20：如抗体2例示的库效价

结果支持以下结论：失去C12orf35功能与高体积生产率相关。

另外，相较稳定转染的亲本库，稳定转染C12orf35KO库能检测到更短的选择时间(G418和MTX步骤)。对于C12orf35KO库，选择时间平均短7天。

Claims (36)

1.一种经分离真核细胞，其中基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果受损。

2.如权利要求1所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述基因C12orf35表达产物的效果受损，因为基因C12orf35在所述细胞中的功能表达减少或消除。

3.如权利要求2所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述基因C12orf35的功能表达通过基因敲除、基因突变、基因缺失、基因沉默或任意上述组合来减少或消除。

4.如权利要求3所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述C12orf35基因包括C12orf35基因中的一个或多个突变作为基因突变，其提供无功能或功能较少的表达产物。

5.如权利要求3或4所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述至少一个或所有基因C12orf35拷贝在真核细胞基因组中缺失或功能失活。

6.如权利要求1-5中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述真核细胞是后生动物细胞、脊椎动物细胞或哺乳动物细胞。

7.如权利要求6所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述真核细胞是哺乳动物细胞。

8.如权利要求1-7中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，一部分染色体缺失，其中缺失部分包括基因C12orf35。

9.如权利要求8所述的经分离真核细胞，其特征在于

a)所述真核细胞是仓鼠细胞且至少一部分染色体8端粒区缺失，其中所述缺失部分包括基因C12orf35；

或

b)所述真核细胞是小鼠细胞且至少一部分染色体6端粒区缺失，其中所述缺失部分包括基因C12orf35。

10.如权利要求9所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述细胞具有一个或多个以下特征：

a)所述缺失的端粒区包括基因C12orf35且包括一个或多个选自Bicd1、Amn1、甲基转移酶样蛋白20、Dennd5b、FAM60A、Caprin2、Ipo8和RPS4Y2的基因；

b)所述缺失由染色体断裂诱导且断点位于Ipo8基因着丝粒，优选位于Tmtc1基因内；

c)至少一部分端粒区在各染色体对的两条染色体中都缺失，其中缺失部分包括基因C12orf35。

11.如权利要求1-10中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述细胞具有一个或多个以下特征：

a)所述真核细胞是啮齿动物细胞，

b)所述真核细胞是仓鼠细胞，优选CHO细胞，

c)所述真核细胞内源表达DHFR和叶酸受体，和/或

d)所述真核细胞作为细胞克隆或细胞系提供。

12.如权利要求1-11中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述C12orf35基因是编码与一个或多个SEQ ID NO:1-7所示氨基酸序列或SEQ ID NO:8编码蛋白共有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性或同一性的蛋白的基因。

13.如权利要求1-12中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，额外削弱蛋白FAM60A在所述细胞中的所述效果，优选通过减少或消除基因FAM60A的功能表达削弱。

14.如权利要求13所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述FAM60A蛋白与一种或多种SEQ ID NO:11-18所示氨基酸序列共有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性或同一性。

15.如权利要求1-14中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，

a)基因C12orf35在所述细胞中的功能表达减少或消除且其中减少或消除引起感兴趣重组产物的体积生产相较基因C12orf35的功能表达未减少或消除的对应细胞增加；和/或

b)改变真核细胞基因组以削弱基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果。

16.如权利要求1-15中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述细胞包括至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸，且其中优选编码感兴趣产物的异源多核苷酸整合入真核细胞基因组。

17.如权利要求1-16中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述细胞具有一个或多个以下特征：

a)所述真核细胞包括整合入其基因组的至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸和至少一种编码选择标记或报告多肽的异源多核苷酸且其中所述异源多核苷酸位于相同或不同的表达载体；

b)所述真核细胞包括编码叶酸受体作为选择标记的异源多核苷酸和/或包括编码二氢叶酸还原酶(DHFR)作为选择标记的异源多核苷酸；

c)所述细胞包括至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸，其中所述感兴趣产物是多肽；

d)所述细胞包括至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸，其中感兴趣产物是多肽且所述真核细胞分泌所述感兴趣多肽到细胞培养基中；和/或

e)所述细胞包括至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸，其中感兴趣产物是选自治疗多肽和诊断多肽的多肽。

18.如权利要求1-15中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述真核细胞不包括编码感兴趣产物的异源多核苷酸。

19.一种选择重组表达感兴趣产物的宿主细胞的方法，所述方法包括

(a)提供如权利要求1-17中一项或多项所述的真核细胞作为宿主细胞，其中所述宿主细胞包括至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸；和

(b)选择一个或多个表达感兴趣产物的宿主细胞。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述阶段(a)包括用至少一种编码感兴趣产物的多核苷酸转染如权利要求18所述的真核细胞，以提供包括至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸的真核细胞。

21.如权利要求19或20所述的方法，其特征在于，所述方法具有一个或多个以下特征

a)所述真核细胞是哺乳动物细胞；

b)阶段(a)中提供的所述宿主细胞额外包括至少一种编码选择标记的异源多核苷酸且阶段(b)包括在对选择标记有选择性的条件下培养所述多个宿主细胞；

c)通过转染一个或多个表达载体向真核细胞引入异源多核苷酸；

d)所述感兴趣重组产物是多肽；

e)阶段(b)包括多个选择步骤；

f)阶段(b)包括进行基于流式细胞术的选择；

g)所述宿主细胞重组表达免疫球蛋白分子。

22.如权利要求19-21中一项或多项所述的方法，其特征在于，阶段(a)中提供的所述宿主细胞包括至少两种各自编码选择标记的异源多核苷酸，其中第一选择标记是叶酸受体且其中第二选择标记是DHFR，其中阶段(b)包括在含极限浓度的叶酸盐和DHFR抑制剂的选择性培养基中培养所述多个宿主细胞。

23.一种重组生产感兴趣产物的方法，包括使用如权利要求1-18中一项或多项所述的真核细胞作为宿主细胞以重组表达感兴趣产物。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述方法包括向如权利要求18所述的真核细胞引入编码感兴趣产物的多核苷酸和编码选择标记的多核苷酸，并选择至少一种表达感兴趣产物的宿主细胞作为生产宿主细胞。

25.如权利要求23或24所述的方法，所述方法包括

(a)在允许感兴趣产物表达的条件下培养包括编码感兴趣产物的异源多核苷酸的宿主细胞；

(b)从细胞培养基和/或所述宿主细胞中分离感兴趣产物；和

(c)可任选地加工感兴趣的分离产物。

26.如权利要求23-25中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述真核细胞用于生产，其中优选通过减少或消除FAM60A基因的功能表达来额外削弱FAM60A的效果。

27.如权利要求23-26中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述方法具有一个或多个以下特征：

a)所述真核细胞是后生动物细胞、脊椎动物细胞或哺乳动物细胞；

b)所述真核细胞是哺乳动物细胞，优选啮齿动物细胞；

c)所述感兴趣产物是多肽；

d)所述感兴趣产物是多肽且宿主细胞分泌感兴趣多肽到细胞培养基中。

28.一种生产如权利要求1-18中一项或多项所述真核细胞的方法，包括削弱基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述方法包括减少或消除基因C12orf35的功能表达，从而削弱基因C12orf35表达产物在真核细胞中的效果。

30.一种用于分析真核细胞作为宿主细胞重组表达感兴趣产物的适宜性的方法，所述方法包括直接或间接分析内源基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果是否受损。

31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述直接分析包括分析基因C12orf35在所述细胞中的功能表达是否减少或消除。

32.如权利要求30或31所述的方法，其特征在于，所述分析前，真核细胞用诱导染色体断裂的试剂处理且其中所述分析包括对用所述试剂处理是否引起含基因C12orf35的部分染色体缺失进行分析。

33.如权利要求30-32中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述真核细胞是仓鼠细胞，所述方法包括分析一个或多个位于染色体8端粒区的基因和选自Tmtc1基因以及位于Tmtc1基因端粒的基因的表达是否减少或消除，从而分析基因C12orf35在所述细胞中的表达是否减少或消除。

34.如权利要求30-33中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述方法包括另外直接或间接分析FAM60A在所述细胞中的效果是否受损。

35.如权利要求30-34中一项或多项所述的方法，其特征在于，在分析前，所述真核细胞转染有编码感兴趣产物的异源多核苷酸和编码选择标记的异源多核苷酸，且其中在分析前，进行至少一个选择步骤以鉴定成功转染的宿主细胞。

36.如权利要求30-35中一项或多项所述的方法，其特征在于，分析多个细胞克隆以区分稳定与不稳定和/或高与低生产细胞克隆，且其中选择一个或多个细胞克隆作为生产克隆，其中基因C12orf35和可任选的FAM60A的表达减少或消除。