JP2017500868A - 新規真核細胞および目的の生成物を組換え発現させるための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、組換え発現技術の分野に関する。本開示は、特に、目的の生成物の生産を増強することができる変化した真核細胞ならびに組換え発現法におけるその使用を提供する。さらに、選択プロセスの初期に、真核細胞の発現プロファイルに基づいて高い収率および改善された安定性で組換え産物を発現する真核細胞の同定を可能にする手段が提供される。真核細胞は、好ましくは哺乳動物細胞である。
バイオ医薬品(biopharmaceuticals)は今日の医学にとって益々重要になっているため、バイオ医薬品に関する市場は高い割合で成長し続けている。現在、特に、哺乳動物細胞などの真核細胞において、数多くのバイオ医薬品が生産されている。したがって、哺乳動物細胞中でのバイオ医薬品の生産の成功および高収率の生産が重要である。目的の治療用タンパク質を生産するそのような細胞株を生成するための時間は、バイオ医薬品を診療所に持っていくのに必要とされる時間の必須部分である。さらに、バイオ医薬品のための生産コストも考慮すれば、高く、安定に発現する組換え真核細胞株、特に、哺乳動物細胞株を有することが重要である。
本開示は、特に、例えば、真核細胞中でC12orf35遺伝子の機能的発現を低下させるか、または消失させることによる、前記細胞中でのC12orf35遺伝子の発現産物の効果の減弱が、前記細胞中での目的の組換え産物の発現を有意に増加させることができるという予想外の知見に基づくものである。したがって、組換え発現に影響する鍵となる遺伝子が同定された。本明細書に記載の細胞中でのC12orf35遺伝子の発現産物の効果の減弱は、発現収率を増大させることにより目的の生成物の組換え生産を有意に改善することができる。したがって、本発明は、先行技術に対して大きく寄与する。
(a)目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞としての第1の態様による真核細胞を提供すること;および
(b)目的の生成物を発現する1つまたは複数の宿主細胞を選択すること
を含む方法が提供される。
本開示は、特に、C12orf35遺伝子の発現産物の効果が、例えば、内因性C12orf35遺伝子を欠失させることにより、または変異を導入することにより、前記遺伝子の機能的発現を低下させるか、または消失させることにより減弱された真核細胞が、有意に改善された収率で目的の組換え産物を発現することができるという驚くべき知見に基づくものである。C12orf35遺伝子が目的の組換え産物の発現に対する強い影響を有するという驚くべき知見に基づいて、本開示はまた、目的の生成物の組換え生産を改善することができる新規の選択および生産方法ならびに関連技術も提供する。したがって、本開示は、先行技術に対して大きく寄与する。
第1の態様によれば、本開示は、単離された真核細胞であって、C12orf35遺伝子の発現産物の効果が、前記細胞中で減弱される、単離された真核細胞を提供する。哺乳動物細胞に関する実施例により示されるように、それぞれ、改変された真核細胞は、実施例により示されるように、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターによる安定的トランスフェクション後ならびに一過的なトランスフェクション後に、有意により高い生産性を示す。さらに、トランスフェクトされた細胞の集団における高発現細胞の存在量は、それぞれ変化した真核細胞を用いた場合に改善される。実施形態においては、クローン安定性が改善されることも見出された。改善された発現安定性は、高発現細胞クローンの時間消費的な安定性研究を短縮するか、または省略することさえできる。さらなる利点も以下に記載され、また、実施例からも明らかである。したがって、目的の生成物の組換え生産のためにこれらの有利な新規真核細胞株を用いることは、高発現細胞または細胞クローンを同定するためのスクリーニング労力を軽減し、特に、大規模に目的の生成物を生産するのに好適な高発現細胞クローンを取得するのに必要とされる時間を減少させる。したがって、これらの真核細胞株は、組換え生産技術のための宿主細胞として用いられる場合に重要な利点を有する。
第2の態様によれば、目的の生成物を組換え発現する宿主細胞を選択するための方法であって、
(a)目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞として、第1の態様による真核細胞を提供すること;および
(b)目的の生成物を発現する1つまたは複数の宿主細胞を選択すること
を含む方法が提供される。
(a)約5000nM〜0.1nM;
(b)約2500nM〜0.1nM;
(c)約1500nM〜0.1nM;
(d)約1000nM〜0.1nM;
(e)約750nM〜0.1nM;
(f)約500nM〜0.1nM;
(g)約250nM〜0.2nM;好ましくは、約250nM〜1nMまたは約250nM〜2.5nM;
(h)約150nM〜0.3nM;好ましくは、約150nM〜1nMまたは約150nM〜2.5nM;
(i)約100nM〜0.5nM;好ましくは、約100nM〜1nMまたは約100nM〜2.5nM;
(j)約75nM〜0.6nM;好ましくは、約75nM〜1nMまたは約75nM〜2.5nM;
(k)約50nM〜1nM;好ましくは、約50nM〜2.5nMまたは約50nM〜5nM;
(l)約35nM〜0.75nM;および
(m)約25nM〜1nMまたは約25nM〜2.5nM、約20nM〜3nM、約15nM〜4nMまたは10nM〜5nM
から選択される濃度の葉酸塩、特に、葉酸を含んでもよい。
(i)トランスフェクトされた宿主細胞により発現される1つまたは複数の選択可能マーカーについて選択的な条件下で少なくとも1回の選択を実施すること;および
(ii)フローサイトメトリーに基づく選択を実施すること
を含む。
(i)aa)目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
bb)目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの下流の少なくとも1つの停止コドン、ならびに
cc)膜アンカーおよび/または膜アンカーのためのシグナルをコードする停止コドンの下流のさらなるポリヌクレオチド
を含む異種発現カセット;ならびに
(ii)選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの異種発現カセット
を含み、段階(b)における選択は、
(i)少なくとも1つの選択可能マーカーについて選択的な条件下で前記宿主細胞を培養すること、および目的のポリペプチドの少なくとも一部が、膜アンカーを含む融合ポリペプチドとして発現され、前記融合ポリペプチドが前記宿主細胞の表面上に提示される、目的のポリペプチドの発現を可能にすること;
(ii)フローサイトメトリーを用いて細胞表面上に提示される融合ポリペプチドの存在または量に基づいて、所望の収率で目的のポリペプチドを発現する複数の宿主細胞を選択することを含む、フローサイトメトリーに基づく選択を実施すること
を含む。
aa)ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの翻訳が目的のポリペプチドをもたらすポリヌクレオチド;
bb)前記ポリヌクレオチドの下流の少なくとも1つの停止コドン;
cc)膜アンカーおよび/または膜アンカーのためのシグナルをコードする、前記停止コドンの下流のポリヌクレオチド
を含む転写物をもたらす。
第3の態様によれば、目的の生成物の組換え発現のための宿主細胞として、第1の態様による真核細胞を用いることを含む、目的の組換え産物を生産するための方法が提供される。
(a)目的の生成物をコードする異種ポリヌクレオチドを含む第1の態様による真核細胞および/または目的の生成物の発現を可能にする条件下で第2の態様による方法に従って選択された宿主細胞を培養すること;
(b)前記細胞培養培地および/または前記宿主細胞から目的の生成物を単離すること;ならびに
(c)場合により、単離された目的の生成物をプロセシングすること
を含む。
第4の態様によれば、真核細胞中でのC12orf35遺伝子の発現産物の効果を減弱させることを含む、目的の生成物の組換え生産にとって好適な前記細胞を生産するための方法が提供される。その結果を達成するための好適かつ好ましい実施形態は、第1の態様による真核細胞と共に上記されており、それは上記開示に付託され、ここにも当てはまる。非限定的実施形態を再度、以下で簡単に説明する。
a)切断点がIpo8遺伝子のセントロメアに位置する;
b)切断点がTmtc1遺伝子内に位置する
という特徴の1つまたは複数を有する。
第5の態様によれば、目的の生成物の組換え発現のための宿主細胞としてのその好適性について真核細胞を分析するための方法であって、C12orf35遺伝子の発現産物の効果が前記細胞中で減弱されるかどうかを直接的または間接的に分析することを含む方法が提供される。上記のように、真核細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞である。
第6の態様によれば、本開示は、C12orf35遺伝子の発現産物の効果が細胞中で減弱される、目的の生成物を組換え発現させるための単離された真核細胞の使用に関する。それぞれの真核宿主細胞および好ましくは、C12orf35遺伝子の機能的発現を低下させるか、または消失させることにより、前記細胞中でのC12orf35遺伝子の発現産物の効果の減弱を達成するのに好適な実施形態に関する詳細は、上に詳細に記載されており、それは上記開示に付託され、ここにも当てはまる。非限定的実施形態を、以下で簡潔に説明する。
C12orf35遺伝子の発現の低下が容量生産性または特異的生産性(volumetric or specific productivity)の増大をもたらすことを証明するために、分析されるチャイニーズハムスターゲノム(CHO−K1)の第8染色体のテロメア領域に位置する異なる標的遺伝子に対するsiRNAを設計した。表2に列挙される以下の標的遺伝子に対するsiRNAを設計した。
第8染色体のq腕のテロメア領域中に欠失を含む、新規CHO細胞株(C8DEL)を生成した。欠失を、染色体切断により誘導した。欠失部分は、C12orf35遺伝子ならびにとりわけ、FAM60A遺伝子を含んでいた(図1を参照されたい)。前記新規細胞株を、CHO−K1から誘導される親細胞株から取得した。前記細胞株を、以下のように調製した。親CHO細胞を、0.5μM、1μMまたは2μMのMTXを含む培養培地中、2E5細胞/mlで分割した。6日後、細胞の生存能力は約30〜40%であった。細胞を180×gで5min遠心分離し、MTXを含まない培養培地中で培養して、生存能力が95%を超えるまで(約21日後)、細胞を回復させた。この手順をさらに2回繰り返した。単一細胞クローンを、細胞プールから取得した。全体で561個の細胞クローンを成長させ、「Extract−N−Amp Blood PCR Kit」を用いてDNAを単離した。Ipo8遺伝子を検出するプライマーを用いるPCRスクリーニングを実施した。561個のクローンのうちの3個が「IPO8陰性」であったが、これは、Ipo8遺伝子を含む第8染色体のテロメア領域の喪失を示している。Ipo8遺伝子は、C12orf35遺伝子のセントロメアに位置する(図1を参照されたい)。したがって、Ipo8遺伝子が染色体切断のため欠失された場合、Ipo8遺伝子のテロメアに位置する全ての遺伝子も(したがって、C12orf35遺伝子およびFAM60A遺伝子も)同様に欠失される。これらの3つのクローンを拡張し、さらに評価した。これらのクローンのうちの1個を、「C8DEL」細胞株と称する。PCR技術を用いて、C8DEL細胞株に由来する第8染色体のテロメア領域の切断点を決定することができた。切断点は、PCR20および28と呼ばれる、2つのPCRの間で決定された:
C8DEL細胞株を、目的のポリペプチドを組換え発現する場合のその性能について分析し、C8DEL細胞株が誘導された親細胞株と比較した。上記のように、前記親細胞株は、第8染色体のテロメア領域中に対応する欠失を含まない。
C8DELの容量生産性を、それが誘導された親細胞株と比較して評価した。安定な、ならびに一過的なトランスフェクションを実施した。
細胞培養、トランスフェクションおよびスクリーニングを、化学規定培養培地中でCHO細胞を成長させる懸濁液を用いて振盪フラスコ中で実行した。細胞に、様々な抗体および治療用タンパク質をコードする異なる発現ベクターをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。用いられた発現ベクターは、選択可能マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットおよび選択可能マーカーとしてDHFRをコードする発現カセットを含んでいた。抗体を発現させるために用いられた発現ベクターは、抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットおよび抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットをさらに含み、完全な抗体が前記発現ベクターから発現された。抗体ではないポリペプチドを発現させるために用いられた発現ベクターは、選択マーカーに加えて、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含んでいた。発現ベクター中の全ての発現カセットは、同じ方向を向いていた。このベクターは、FACS選択にとって好適であったが、そのようなベクターの詳細は上記されている。
培養培地中で成長させたC8DEL細胞および親細胞株細胞に、目的のモデルタンパク質としてeGFPまたはFc融合タンパク質をコードする発現プラスミドを3組、一過的にトランスフェクトした。ポリエチレンイミン(PEI)をトランスフェクション試薬として用いた。培地上清中のモデルタンパク質の力価を、トランスフェクション後3日目および6日目に、プロテインA HPLCにより測定した。モデルタンパク質の発現は、C8DELにおいて約3倍高かった。eGFP発現細胞のパーセンテージを、陰性対照として作用する非トランスフェクト細胞を用いるフローサイトメトリーにより、トランスフェクションの48h後に測定した。陰性対照細胞の99%を超える蛍光レベルを示す細胞を、「トランスフェクトされた」と見なした。陰性対照細胞の1000倍を超える強度の蛍光レベルを示す細胞を、「高蛍光」と見なした。高蛍光細胞の数は、C8DELが誘導された親細胞株と比較してC8DEL細胞株を用いた場合に2〜3倍多かった。
46個のC8DEL由来クローンおよび37個の親細胞株由来クローン(IPO8陽性であると試験され、したがって、第8染色体のテロメア領域を失っていない)の安定性特徴を、安定的トランスフェクションの後に分析した。全てのクローンが、目的の生成物として同じ抗体を組換え発現し、それらが12週で25%を超える抗体力価(容量)を失っていなかった場合、それらを安定であると分類した。親細胞株に由来する分析したクローンの76%が、培養から12週間以内に25%を超える力価(容量)を失った。分析したクローンの24%のみが、安定であると分類された。したがって、不安定率は高かった。比較して、表6に示されるように、67%のC8DELクローンを、安定であると分類することができ、33%のみが不安定であった。
欠失がC12orf35遺伝子を含む、第8染色体のテロメア領域中の前記欠失を含むCHO細胞株の特徴を、さらなる実験において分析し、前記細胞株のさらなる利点を証明した。
C8DEL細胞株の有利な特徴は、単一細胞クローニング後のより高い割合の高生産クローンである。C8DELプールは、CHO−K1から誘導された親細胞株と比較して、拡大された割合の高生産細胞(容量プール力価の増大をもたらす)を含有することが見出された。FACS技術を用いるC8DELプールの単一細胞クローニングの後、親細胞株から誘導されたプールと比較して、多量の抗体を発現する有意により高い割合のクローンが選択された。表7は、親細胞株から誘導された多くのクローンが0〜20mg/Lの容量「96ウェル力価」を有していたことを示す。対照的に、C8DEL細胞株から誘導されたクローンの大部分は、80〜100mg/Lの平均容量力価を有していたが、これは有意な改善である。C8DELプールを用いる1つの利点は、同等量の高生産クローンを得るために生成する必要があるクローンの数が少ないということである。これはスクリーニング労力を有意に軽減する。
CHO−K1から誘導される親細胞株と比較してC8DEL細胞株を評価するためのさらなる試験を、特に、規模拡大のためのその好適性を決定するために実施した。バイオリアクター稼働は、C8DEL細胞株が規模拡大にとって好適であることを示した。バイオリアクター中で培養されたC8DEL細胞株は、大規模生産にとって好適である生細胞密度を有していた。さらに、生存能力が親細胞株のものよりも良好であることが見出された。全体として、C8DEL細胞株は、規模拡大にとって好適であり、生存能力に関してそれが誘導される親細胞株よりも性能が優れている。C8DEL細胞株の生存能力は、より高レベルでより長くとどまっている。
C8DEL細胞株の別の利点は、MTX選択からのより早い回復である。MTXインキュベーション後のプールの回復は、C12orf35遺伝子を含む第8染色体のテロメア領域の一部が欠失されない親細胞株と比較して7〜8日早く達成された。全体として、C12orf35遺伝子の発現が低下したか、または消失した細胞に関して、細胞危機が有意に少ないことが見出された。理論において束縛されることを望むものではないが、これは、選択マーカーを含む、異種遺伝子、すなわち、外来遺伝子がより高く発現されるという事実に起因する可能性が非常に高いと考えられる。
C8DEL細胞株を、選択可能マーカーとして葉酸受容体と共に異なる設定において用いたところ、それは前記選択系と共に特定の利点を示す。特に、選択可能マーカーとして葉酸受容体とDHFRに対する組み合わせた選択が有益である。ここで、トランスフェクトされた細胞は、選択可能マーカーとしてヒト葉酸受容体アルファとDHFRとを含み、抗体を発現した。非常に少量の葉酸(50nMの葉酸(FA)/50nMのMTX)を用いた親細胞株の選択は選択のストリンジェンシーのため困難に遭遇したが(細胞は常に回復するわけではなかった)、選択可能マーカーとしてのC8DELと葉酸受容体との組合せはそのようなストリンジェントな条件下で非常に強力であり、有意な容量力価の増大をもたらした。表8は、親細胞株とC8DELとの容量力価の差異ならびに500nMのMTXによる選択ステップの代わりに少量の葉酸と組み合わせた選択マーカーとして葉酸受容体を用いた場合に達成されるさらなる容量力価の増大を強調する。したがって、C12orf35遺伝子およびFAM60A遺伝子の発現が低下したか、または消失した本明細書に記載の真核細胞の使用は、葉酸受容体/DHFR選択系と共に、多量の毒性薬剤の使用を必要としない非常にストリンジェントな選択条件を用いることを可能にする。
FAM60A遺伝子中にノックアウト変異を含む、CHO−K1細胞株から誘導されたCHO細胞に基づく2つの細胞クローンを作製した。FAM60A変異細胞を作出するために、TALEN(転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ)技術を用いた。FAM60Aのノックアウトのために、FAM60A遺伝子のコード領域(推定エクソン1)を標的化した。親細胞として用いられるCHO−K1細胞は、1コピーのFAM60Aしか含有しない。したがって、前記細胞中のFAM60Aの効果を減弱させるためには、細胞あたり単一のノックアウトで十分である。
CHO親細胞株のFAM60A遺伝子の以下のゲノムDNAエクソン配列を標的化した:
95%を超える生存能力を有する指数増殖期にある親CHO細胞および5μgのそれぞれのTALENプラスミドを用いるエレクトロポレーションを含む標準的なトランスフェクションプロトコールを用いて、トランスフェクションを実行した。
Cel−l−アッセイを、SAFC Biosciencesのマニュアルに従って実施した。Cel−l−アッセイは、切断高率を決定するための標準的なアッセイである。簡単に述べると、数日間の培養後、細胞からゲノムDNAを単離し、プライマー1および2を用いてPCRを実施した(表10を参照されたい)。増幅産物を変性させ、復元させた。次いで、ヌクレアーゼSおよびヌクレアーゼSエンハンサーを添加し、インキュベートした。消化された産物を分析した。TALEN活性が存在した場合、2つのより小さいバンドが存在し、ゲノムのその領域内のTALEN活性を示し、したがって、FAM60A遺伝子がノックアウトされた細胞が分析された細胞プール中に存在することを支持する。陽性細胞プールから、単一の細胞を、限界希釈により96ウェルプレート中で選別した。
ゲノムDNA(gDNA)を、96ウェルプレート中、各クローンから抽出した。gDNAを標準的な手順により分析して、PCR分析によりノックアウトクローンを同定した。この目的のために、プライマー3および4(表10を参照されたい)を用いた。切断領域中の変異の場合、プライマー3は結合せず、PCR産物は生成されない。陽性クローンのgDNAのプライマー1および2を用いるPCRから得られるPCR産物(上記参照)を配列決定して、導入された変異を分析した。
FAM60Aノックアウトクローンが得られた親WT細胞株および得られたFAM60Aノックアウト細胞に、目的のポリペプチドとして抗体をコードする発現ベクターを安定にトランスフェクトした。トランスフェクトされた発現ベクターは、選択可能マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、選択可能マーカーとしてDHFRをコードする発現カセット、抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットおよび抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含み、完全な抗体が前記発現ベクターから発現された。発現ベクター中の全ての発現カセットは、同じ方向に向いていた。重鎖の一部が、停止コドンリードスルーのため、膜アンカーを含む融合ポリペプチドとして発現されるように、重鎖のために用いられる発現カセットを設計した。融合タンパク質は細胞表面上に提示され、それによって、FACS分析を単純化した(説明を参照されたい)。トランスフェクトされた細胞を、G418およびMTX(1μM)選択を用いる組換え発現のために選択した。それぞれの安定にトランスフェクトされた細胞株(CHO WT、s16およびs23)の選択されたプールから、良好な収率で目的の生成物を発現した細胞クローンを取得し、数週間(WO CHO親細胞株(45個のクローン)については7週間およびFAM60Aノックアウト細胞(s16については13個のクローンおよびs23については18個のクローン)については8週間)培養して、長期培養中のその発現安定性を分析した。生産細胞株を高容量バイオリアクターに規模拡大することができることを確保するために、12週間の安定性研究、特に、12週間の培養中の発現安定性のさらなる分析も実施した。クローンが、分析される安定性期間にわたって25%を超えるその初期容量発現力価を失った場合、それらを不安定であると分類した。通常の変動レベル内で、いくつかのクローンは25%の境界線のすぐ上であるか、または下である。親細胞株に関する12週目と比較して、7/8週目におけるより高い割合の不安定クローンを、25%閾値に近いクローンに関する生産性アッセイにおける変動を用いて説明することができる。
リアルタイムRT−PCR分析手段を開発して、開発パイプラインプロセスの初期段階でのクローン生産性および安定性を予測した。リアルタイムRT−PCRを、4つの遺伝子:C12orf35、Dennd5b、FAM60AおよびIpo8(全て第8染色体のq腕上のテロメア領域に局在化する)について実行した。選択およびクローン生成の後、目的のポリペプチドとして抗体を安定に発現する数百個のクローンを、第8染色体のテロメア領域のこれらの4つの遺伝子の存在および発現レベルならびに発現収率に関して分析した。容量抗体生産性と、第8染色体のテロメア領域における喪失との間には明確な相関が認められた。さらに、これらの細胞はより高レベルの重鎖および軽鎖mRNAを示すことが見出された。したがって、高発現細胞クローンを、前記分析方法を用いて同定することができる。
C12orf35遺伝子の発現低下が他の哺乳動物細胞株においても容量生産性の増大をもたらすことを証明するために、2つのsiRNAを、ヒト(Homo sapiens)のC12orf35に対して設計した。siRNA配列を、表13に列挙する。RNAi陰性対照(siRNA陰性対照)として、Silencer(登録商標)Negative Control No.1 siRNA(AM4611)を用いた。
CHO−K1由来細胞に基づく3つのC12orf35ノックアウト(「KO」)細胞クローンを、TALEN(転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ)技術を用いて生成した。ノックアウトのために、C12orf35を、5’領域で標的化した。5’領域でのフレームシフト変異の付加は、トランケートされたタンパク質が短いという利点を有する。
5’領域を標的化する2つのトランケートされたTAL FokIヌクレアーゼを設計した。各TALENは、それぞれ、5’(フォワード)または3’(リバース)DNA鎖のいずれかの上の19ヌクレオチドを標的化し、それに結合する。2つの結合部位は、切断部位の16ヌクレオチドにより隔てられている。それぞれの設計されたTALを合成し、好適なエントリーベクター中にクローニングし、pcDNA3.3_DEST_A343デスティネーションベクター中にサブクローニングした。製品の説明および方法は、Life Technology/GeneArtから入手可能である。
95%を超える生存能力を有する指数増殖期にある親CHO細胞を、トランスフェクションのために用いた。エレクトロポレーション(ヌクレオフェクション)を、製造業者(Lonza)の説明書に従ってAmaxa(商標)、Nucleofector(商標)Technologyを用いて実施した。トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクション後5日目に拡張し、単一の細胞を20×96ウェルプレート中、8日目に分離した。モノクローン性および集密度を、CloneSelect(商標)Imager(Genetix)を用いて制御した。
Cel−l−アッセイを、SAFC Biosciencesのマニュアルに従って実施した。Cel−l−アッセイは、切断高率を決定するための標準的なアッセイである。簡単に述べると、6日間の培養後、ゲノムDNAを細胞から単離し、PCRを以下のプライマー:
Fwd:GCATCCAGTGAACTTACTTATCCAGAT(配列番号65)
Rev:GCTCTGCCACTGCTGTTGAAAG(配列番号66)
を用いて実施した。
CHO野生型細胞株、上記のC8DELおよびC12orf35ノックアウトCHO細胞クローン(表17および18を参照されたい)に、モノクローナル抗体(mAb)および2つの選択可能マーカー遺伝子、すなわち、neoおよびDHFRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトした。2つの異なる例示的抗体(抗体1および抗体2)をコードする2つのベクターを評価した。トランスフェクションのために、細胞を指数期まで成長させ、5×106個の細胞に3μgのベクターDNAをトランスフェクトした。3つのトランスフェクション複製を実施した。目的のタンパク質をコードするベクターを安定にトランスフェクトされた細胞の選択を、G418(G418濃度0.8mg/ml)、次いで、MTX選択(500nM)を用いて実施した。選択条件は全てのプールについて同一であった。選択プロセスの間に、培地中の発現されたmAbの容量力価を決定した。C12orf35ノックアウトクローンの上清中の容量力価を、CHO野生型の容量力価と比較した。細胞を、化学規定培地を含有する振盪器中で培養した。バッチ式培養を、37℃の温度で、振盪条件下で実施した。フェドバッチ式培養中に、細胞を、アミノ酸が富化された化学規定培地を含有する振盪器中で培養した。フェドバッチ式培養を、37℃の温度で、振盪しながら実施し、温度シフトを5日目に33℃に向かって実施した。さらに、グルコースおよびアミノ酸を含有する供給液を、プロセスに沿って規則的に添加した。フェドバッチ式培養プロセスの間に、フェドバッチ式培養材料の試料を規則的に収集して、Vi−Cell細胞生存能力分析装置(Beckman Coulter)を用いて生細胞密度(vcd)を決定し、細胞培養培地中のタンパク質力価を決定した。バッチおよびフェドバッチの終わりに(14日目)、培養プロセスを停止した。バッチ式およびフェドバッチ式培養物の分析により、14日の培養期間にわたって、C12orf35 KOプールの培養培地中の発現されたmAbの容量力価は、C8DELの容量力価と類似しており、CHO野生型細胞プールの培養培地におけるよりも有意に高いことが示された。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
[1]
単離された真核細胞であって、C12orf35遺伝子の発現産物の効果が、前記細胞中で減弱される、単離された真核細胞。
[2]
C12orf35遺伝子の機能的発現が前記細胞中で低下するか、または消失するため、前記C12orf35遺伝子の発現産物の効果が減弱される、上記[1]に記載の単離された真核細胞。
[3]
C12orf35遺伝子の機能的発現が、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前記のいずれかの組合せにより低下するか、または消失する、上記[2]に記載の単離された真核細胞。
[4]
前記C12orf35遺伝子が、遺伝子変異として、非機能的な、またはあまり機能的でない発現産物を提供する前記C12orf35遺伝子中の1つまたは複数の変異を含む、上記[3]に記載の単離された真核細胞。
[5]
C12orf35遺伝子の少なくとも1コピーまたは全コピーが、前記真核細胞のゲノム中で欠失されるか、または機能的に不活化される、上記[3]または[4]に記載の単離された真核細胞。
[6]
前記真核細胞が、後生動物細胞、脊椎動物細胞または哺乳動物細胞である、上記[1]〜[5]の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
[7]
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、上記[6]に記載の単離された真核細胞。
[8]
染色体の一部が欠失し、前記欠失した部分がC12orf35遺伝子を含む、上記[1]〜[7]の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
[9]
a)前記真核細胞がハムスター細胞であり、第8染色体のテロメア領域の少なくとも一部が欠失し、前記欠失した部分がC12orf35遺伝子を含む;または
b)前記真核細胞がマウス細胞であり、第6染色体のテロメア領域の少なくとも一部が欠失し、前記欠失した部分がC12orf35遺伝子を含む、
上記[8]に記載の単離された真核細胞。
[10]
a)前記欠失したテロメア領域が、C12orf35遺伝子を含み、かつ、Bicd1、Amn1、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質20、Dennd5b、FAM60A、Caprin2、Ipo8およびRPS4Y2からなる群から選択される1つまたは複数の遺伝子を含む;
b)前記欠失が染色体切断により誘導され、切断点が前記Ipo8遺伝子のセントロメア、好ましくは、前記Tmtc1遺伝子内に位置する;
c)前記テロメア領域の少なくとも一部がそれぞれの染色体対の両方の染色体において欠失し、前記欠失した部分がC12orf35遺伝子を含む
という特徴の1つまたは複数を有する、上記[9]に記載の単離された真核細胞。
[11]
a)前記真核細胞がげっ歯類細胞である、
b)前記真核細胞がハムスター細胞、好ましくは、CHO細胞である、
c)前記真核細胞が内因的にDHFRおよび葉酸受容体を発現する、ならびに/または
d)前記真核細胞が細胞クローンもしくは細胞株として提供される
という特徴の1つまたは複数を有する、上記[1]〜[10]の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
[12]
前記C12orf35遺伝子が、配列番号1〜7に示されるアミノ酸配列の1つもしくは複数または配列番号8によりコードされるタンパク質と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の相同性または同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、上記[1]〜[11]の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
[13]
さらに、好ましくはFAM60A遺伝子の機能的発現を低下させるか、または消失させることにより、FAM60Aタンパク質の効果が前記細胞中で減弱される、上記[1]〜[12]の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
[14]
前記FAM60Aタンパク質が、配列番号11〜18に示されるアミノ酸配列の1つまたは複数と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の相同性または同一性を有する、上記[13]に記載の単離された真核細胞。
[15]
a)前記C12orf35遺伝子の機能的発現が、前記細胞中で低下するか、もしくは消失し、前記低下もしくは消失が、前記C12orf35遺伝子の機能的発現が低下せず、消失していない対応する細胞と比較して目的の組換え産物の容量生産の増加をもたらす;および/または
b)前記真核細胞のゲノムが、前記細胞中での前記C12orf35遺伝子の発現産物の効果を減弱させるように変化する、
上記[1]〜[14]の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
[16]
前記細胞が目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含み、好ましくは、目的の生成物をコードする前記異種ポリヌクレオチドが前記真核細胞のゲノム中に組み込まれる、上記[1]〜[15]の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
[17]
a)前記真核細胞が、そのゲノム中に組み込まれた、目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドと、選択可能マーカーもしくはリポーターポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドとを含み、前記異種ポリヌクレオチドが、同じか、もしくは異なる発現ベクター上に位置する;
b)前記真核細胞が、選択可能マーカーとして葉酸受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、および/もしくは選択可能マーカーとしてジヒドロ葉酸リダクターゼ(DHFR)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む;
c)前記細胞が、目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含み、前記目的の生成物がポリペプチドである;
d)前記細胞が、目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含み、前記目的の生成物がポリペプチドであり、前記真核細胞が前記目的のポリペプチドを細胞培養培地中に分泌する;ならびに/または
e)前記細胞が、目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを
含み、前記目的の生成物が治療用ポリペプチドおよび診断用ポリペプチドから選択されるポリペプチドである
という特徴の1つまたは複数を有する、上記[1]〜[16]の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
[18]
前記真核細胞が、目的の生成物をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない、上記[1]〜[15]の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
[19]
目的の生成物を組換え発現する宿主細胞を選択するための方法であって、
(a)前記目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞として上記[1]〜[17]の1つまたは複数に記載の真核細胞を提供すること;および
(b)前記目的の生成物を発現する1つまたは複数の宿主細胞を選択すること
を含む、方法。
[20]
段階(a)が、上記[18]に記載の真核細胞に、前記目的の生成物をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドをトランスフェクトして、前記目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む真核細胞を提供することを含む、上記[19]に記載の方法。
[21]
a)前記真核細胞が哺乳動物細胞である;
b)段階(a)で提供された前記宿主細胞が、選択可能マーカーをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドをさらに含み、段階(b)が、前記選択可能マーカーにとって選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養することを含む;
c)異種ポリヌクレオチドが、1つまたは複数の発現ベクターをトランスフェクトすることにより前記真核細胞中に導入される;
d)目的の組換え産物がポリペプチドである;
e)段階(b)が複数の選択ステップを含む;
f)段階(b)がフローサイトメトリーに基づく選択を実施することを含む;
g)前記選択された宿主細胞が免疫グロブリン分子を組換え発現する
という特徴の1つまたは複数を有する、上記[19]または[20]に記載の方法。
[22]
段階(a)で提供される前記宿主細胞が、選択可能マーカーをそれぞれコードする少なくとも2つの異種ポリヌクレオチドを含み、第1の選択可能マーカーが葉酸受容体であり、第2の選択可能マーカーがDHFRであり、段階(b)が、限定濃度の葉酸塩とDHFR阻害剤とを含む選択培養培地中で前記複数の宿主細胞を培養することを含む、上記[19]〜[21]の1つまたは複数に記載の方法。
[23]
目的の生成物を組換え生産するための方法であって、前記目的の生成物の組換え発現のための宿主細胞として上記[1]〜[18]の1つまたは複数に記載の真核細胞を用いることを含む、方法。
[24]
上記[18]に記載の真核細胞中に、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドおよび選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチドを導入すること、ならびに前記目的の生成物を発現する少なくとも1つの宿主細胞を生産宿主細胞として選択することを含む、上記[23]に記載の方法。
[25]
(a)目的の生成物の発現を可能にする条件下で、前記目的の生成物をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること;
(b)細胞培養培地からおよび/または前記宿主細胞から、前記目的の生成物を単離すること;ならびに
(c)場合により、前記単離された目的の生成物をプロセシングすること
を含む、上記[23]または[24]に記載の方法。
[26]
生産のために、さらに、好ましくはFAM60A遺伝子の機能的発現を低下させるか、または消失させることにより、FAM60Aの効果が減弱されている真核細胞を用いる、上記[23]〜[25]の1つまたは複数に記載の方法。
[27]
a)前記真核細胞が後生動物細胞、脊椎動物細胞または哺乳動物細胞である;
b)前記真核細胞が哺乳動物細胞、好ましくは、げっ歯類細胞である;
c)前記目的の生成物がポリペプチドである;
d)前記目的の生成物がポリペプチドであり、前記宿主細胞が前記目的のポリペプチド
を前記細胞培養培地中に分泌する
という特徴の1つまたは複数を有する、上記[23]〜[26]の1つまたは複数に記載の方法。
[28]
上記[1]〜[18]の1つまたは複数に記載の真核細胞を生産するための方法であって、前記細胞中でのC12orf35遺伝子の発現産物の効果を減弱させることを含む、方法。
[29]
C12orf35遺伝子の機能的発現を低下させるか、または消失させることによって、前記真核細胞中での前記C12orf35遺伝子の発現産物の効果を減弱させることを含む、上記[28]に記載の方法。
[30]
目的の生成物の組換え発現のための宿主細胞としてのその好適性について真核細胞を分析するための方法であって、内因性C12orf35遺伝子の発現産物の効果が前記細胞中で減弱されるかどうかを直接的または間接的に分析することを含む、方法。
[31]
直接的に分析することが、C12orf35遺伝子の機能的発現が前記細胞中で低下するか、または消失するかどうかを分析することを含む、上記[30]に記載の方法。
[32]
分析の前に、前記真核細胞が染色体切断を誘導する薬剤で処理され、前記分析が、前記薬剤を用いる処理がC12orf35遺伝子を含む染色体の一部の欠失をもたらしたかどうかを分析することを含む、上記[30]または[31]に記載の方法。
[33]
前記真核細胞がハムスター細胞であり、前記方法が、第8染色体のテロメア領域中に位置し、Tmtc1遺伝子およびTmtc1遺伝子のテロメアに位置する遺伝子からなる群から選択される1つまたは複数の遺伝子の発現が消失するか、または低下するかどうかを分析することを含み、それによって、C12orf35遺伝子の発現が前記細胞中で低下するか、または消失するかどうかを分析することを含む、上記[30]〜[32]の1つまたは複数に記載の方法。
[34]
FAM60Aの効果が前記細胞中で減弱されるかどうかを直接的または間接的にさらに分析することを含む、上記[30]〜[33]の1つまたは複数に記載の方法。
[35]
分析の前に、前記真核細胞に、目的の生成物をコードする異種ポリヌクレオチドおよび選択可能マーカーをコードする異種ポリヌクレオチドをトランスフェクトし、分析の前に、少なくとも1つの選択ステップを実施して、うまくトランスフェクトされた宿主細胞を同定する、上記[30]〜[34]の1つまたは複数に記載の方法。
[36]
複数の細胞クローンが、安定な生産細胞クローンと不安定な生産細胞クローン、および/または高生産細胞クローンと低生産細胞クローンを識別するために分析され、C12orf35遺伝子および場合によりFAM60A遺伝子の発現が低下するか、または消失する1つまたは複数の細胞クローンが、生産クローンとして選択される、上記[30]〜[35]の1つまたは複数に記載の方法。
Claims (36)
- 単離された真核細胞であって、C12orf35遺伝子の発現産物の効果が、前記細胞中で減弱される、単離された真核細胞。
- C12orf35遺伝子の機能的発現が前記細胞中で低下するか、または消失するため、前記C12orf35遺伝子の発現産物の効果が減弱される、請求項1に記載の単離された真核細胞。
- C12orf35遺伝子の機能的発現が、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前記のいずれかの組合せにより低下するか、または消失する、請求項2に記載の単離された真核細胞。
- 前記C12orf35遺伝子が、遺伝子変異として、非機能的な、またはあまり機能的でない発現産物を提供する前記C12orf35遺伝子中の1つまたは複数の変異を含む、請求項3に記載の単離された真核細胞。
- C12orf35遺伝子の少なくとも1コピーまたは全コピーが、前記真核細胞のゲノム中で欠失されるか、または機能的に不活化される、請求項3または4に記載の単離された真核細胞。
- 前記真核細胞が、後生動物細胞、脊椎動物細胞または哺乳動物細胞である、請求項1〜5の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
- 前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項6に記載の単離された真核細胞。
- 染色体の一部が欠失し、前記欠失した部分がC12orf35遺伝子を含む、請求項1〜7の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
- a)前記真核細胞がハムスター細胞であり、第8染色体のテロメア領域の少なくとも一部が欠失し、前記欠失した部分がC12orf35遺伝子を含む;または
b)前記真核細胞がマウス細胞であり、第6染色体のテロメア領域の少なくとも一部が欠失し、前記欠失した部分がC12orf35遺伝子を含む、
請求項8に記載の単離された真核細胞。 - a)前記欠失したテロメア領域が、C12orf35遺伝子を含み、かつ、Bicd1、Amn1、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質20、Dennd5b、FAM60A、Caprin2、Ipo8およびRPS4Y2からなる群から選択される1つまたは複数の遺伝子を含む;
b)前記欠失が染色体切断により誘導され、切断点が前記Ipo8遺伝子のセントロメア、好ましくは、前記Tmtc1遺伝子内に位置する;
c)前記テロメア領域の少なくとも一部がそれぞれの染色体対の両方の染色体において欠失し、前記欠失した部分がC12orf35遺伝子を含む
という特徴の1つまたは複数を有する、請求項9に記載の単離された真核細胞。 - a)前記真核細胞がげっ歯類細胞である、
b)前記真核細胞がハムスター細胞、好ましくは、CHO細胞である、
c)前記真核細胞が内因的にDHFRおよび葉酸受容体を発現する、ならびに/または
d)前記真核細胞が細胞クローンもしくは細胞株として提供される
という特徴の1つまたは複数を有する、請求項1〜10の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。 - 前記C12orf35遺伝子が、配列番号1〜7に示されるアミノ酸配列の1つもしくは複数または配列番号8によりコードされるタンパク質と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の相同性または同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項1〜11の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
- さらに、好ましくはFAM60A遺伝子の機能的発現を低下させるか、または消失させることにより、FAM60Aタンパク質の効果が前記細胞中で減弱される、請求項1〜12の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
- 前記FAM60Aタンパク質が、配列番号11〜18に示されるアミノ酸配列の1つまたは複数と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の相同性または同一性を有する、請求項13に記載の単離された真核細胞。
- a)前記C12orf35遺伝子の機能的発現が、前記細胞中で低下するか、もしくは消失し、前記低下もしくは消失が、前記C12orf35遺伝子の機能的発現が低下せず、消失していない対応する細胞と比較して目的の組換え産物の容量生産の増加をもたらす;および/または
b)前記真核細胞のゲノムが、前記細胞中での前記C12orf35遺伝子の発現産物の効果を減弱させるように変化する、
請求項1〜14の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。 - 前記細胞が目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含み、好ましくは、目的の生成物をコードする前記異種ポリヌクレオチドが前記真核細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項1〜15の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
- a)前記真核細胞が、そのゲノム中に組み込まれた、目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドと、選択可能マーカーもしくはリポーターポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドとを含み、前記異種ポリヌクレオチドが、同じか、もしくは異なる発現ベクター上に位置する;
b)前記真核細胞が、選択可能マーカーとして葉酸受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、および/もしくは選択可能マーカーとしてジヒドロ葉酸リダクターゼ(DHFR)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む;
c)前記細胞が、目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含み、前記目的の生成物がポリペプチドである;
d)前記細胞が、目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含み、前記目的の生成物がポリペプチドであり、前記真核細胞が前記目的のポリペプチドを細胞培養培地中に分泌する;ならびに/または
e)前記細胞が、目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含み、前記目的の生成物が治療用ポリペプチドおよび診断用ポリペプチドから選択されるポリペプチドである
という特徴の1つまたは複数を有する、請求項1〜16の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。 - 前記真核細胞が、目的の生成物をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない、請求項1〜15の1つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
- 目的の生成物を組換え発現する宿主細胞を選択するための方法であって、
(a)前記目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞として請求項1〜17の1つまたは複数に記載の真核細胞を提供すること;および
(b)前記目的の生成物を発現する1つまたは複数の宿主細胞を選択すること
を含む、方法。 - 段階(a)が、請求項18に記載の真核細胞に、前記目的の生成物をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドをトランスフェクトして、前記目的の生成物をコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む真核細胞を提供することを含む、請求項19に記載の方法。
- a)前記真核細胞が哺乳動物細胞である;
b)段階(a)で提供された前記宿主細胞が、選択可能マーカーをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドをさらに含み、段階(b)が、前記選択可能マーカーにとって選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養することを含む;
c)異種ポリヌクレオチドが、1つまたは複数の発現ベクターをトランスフェクトすることにより前記真核細胞中に導入される;
d)目的の組換え産物がポリペプチドである;
e)段階(b)が複数の選択ステップを含む;
f)段階(b)がフローサイトメトリーに基づく選択を実施することを含む;
g)前記選択された宿主細胞が免疫グロブリン分子を組換え発現する
という特徴の1つまたは複数を有する、請求項19または20に記載の方法。 - 段階(a)で提供される前記宿主細胞が、選択可能マーカーをそれぞれコードする少なくとも2つの異種ポリヌクレオチドを含み、第1の選択可能マーカーが葉酸受容体であり、第2の選択可能マーカーがDHFRであり、段階(b)が、限定濃度の葉酸塩とDHFR阻害剤とを含む選択培養培地中で前記複数の宿主細胞を培養することを含む、請求項19〜21の1つまたは複数に記載の方法。
- 目的の生成物を組換え生産するための方法であって、前記目的の生成物の組換え発現のための宿主細胞として請求項1〜18の1つまたは複数に記載の真核細胞を用いることを含む、方法。
- 請求項18に記載の真核細胞中に、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドおよび選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチドを導入すること、ならびに前記目的の生成物を発現する少なくとも1つの宿主細胞を生産宿主細胞として選択することを含む、請求項23に記載の方法。
- (a)目的の生成物の発現を可能にする条件下で、前記目的の生成物をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること;
(b)細胞培養培地からおよび/または前記宿主細胞から、前記目的の生成物を単離すること;ならびに
(c)場合により、前記単離された目的の生成物をプロセシングすること
を含む、請求項23または24に記載の方法。 - 生産のために、さらに、好ましくはFAM60A遺伝子の機能的発現を低下させるか、または消失させることにより、FAM60Aの効果が減弱されている真核細胞を用いる、請求項23〜25の1つまたは複数に記載の方法。
- a)前記真核細胞が後生動物細胞、脊椎動物細胞または哺乳動物細胞である;
b)前記真核細胞が哺乳動物細胞、好ましくは、げっ歯類細胞である;
c)前記目的の生成物がポリペプチドである;
d)前記目的の生成物がポリペプチドであり、前記宿主細胞が前記目的のポリペプチドを前記細胞培養培地中に分泌する
という特徴の1つまたは複数を有する、請求項23〜26の1つまたは複数に記載の方法。 - 請求項1〜18の1つまたは複数に記載の真核細胞を生産するための方法であって、前記細胞中でのC12orf35遺伝子の発現産物の効果を減弱させることを含む、方法。
- C12orf35遺伝子の機能的発現を低下させるか、または消失させることによって、前記真核細胞中での前記C12orf35遺伝子の発現産物の効果を減弱させることを含む、請求項28に記載の方法。
- 目的の生成物の組換え発現のための宿主細胞としてのその好適性について真核細胞を分析するための方法であって、内因性C12orf35遺伝子の発現産物の効果が前記細胞中で減弱されるかどうかを直接的または間接的に分析することを含む、方法。
- 直接的に分析することが、C12orf35遺伝子の機能的発現が前記細胞中で低下するか、または消失するかどうかを分析することを含む、請求項30に記載の方法。
- 分析の前に、前記真核細胞が染色体切断を誘導する薬剤で処理され、前記分析が、前記薬剤を用いる処理がC12orf35遺伝子を含む染色体の一部の欠失をもたらしたかどうかを分析することを含む、請求項30または31に記載の方法。
- 前記真核細胞がハムスター細胞であり、前記方法が、第8染色体のテロメア領域中に位置し、Tmtc1遺伝子およびTmtc1遺伝子のテロメアに位置する遺伝子からなる群から選択される1つまたは複数の遺伝子の発現が消失するか、または低下するかどうかを分析することを含み、それによって、C12orf35遺伝子の発現が前記細胞中で低下するか、または消失するかどうかを分析することを含む、請求項30〜32の1つまたは複数に記載の方法。
- FAM60Aの効果が前記細胞中で減弱されるかどうかを直接的または間接的にさらに分析することを含む、請求項30〜33の1つまたは複数に記載の方法。
- 分析の前に、前記真核細胞に、目的の生成物をコードする異種ポリヌクレオチドおよび選択可能マーカーをコードする異種ポリヌクレオチドをトランスフェクトし、分析の前に、少なくとも1つの選択ステップを実施して、うまくトランスフェクトされた宿主細胞を同定する、請求項30〜34の1つまたは複数に記載の方法。
- 複数の細胞クローンが、安定な生産細胞クローンと不安定な生産細胞クローン、および/または高生産細胞クローンと低生産細胞クローンを識別するために分析され、C12orf35遺伝子および場合によりFAM60A遺伝子の発現が低下するか、または消失する1つまたは複数の細胞クローンが、生産クローンとして選択される、請求項30〜35の1つまたは複数に記載の方法。
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