CN102030754B - 非病毒载体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种非病毒载体及其制备方法与应用。该非病毒载体，是聚乙烯亚胺与式V所示化合物共混而得的纳米颗粒。本发明提供的药物，其中，该药物的载体是上述本发明提供的非病毒载体。该药物包括上述本发明提供的非病毒载体和包裹在所述非病毒载体中的治疗性的DNA；所述药物的靶向肿瘤为叶酸受体FRα高表达的肿瘤；所述药物能被动靶向的肿瘤为叶酸受体FRα阴性表达的肿瘤和心脏。通过静脉注射接种有叶酸受体阳性细胞的肿瘤的荷瘤小鼠，本发明提供的非病毒载体能够携带基因特异到达肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内持续高效表达目的基因。
Description
技术领域
本发明属于高分子化学和生物医学工程领域，涉及一种非病毒载体及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤是基因病，肿瘤发生的遗传背景是癌基因或抑癌基因的异常，基因治疗是对肿瘤细胞或正常细胞转移一个或几个正常基因，它的表达产物有利于直接或间接的杀伤肿瘤细胞；或保护正常细胞免受化疗与放疗的严重伤害，但是传统的基因导入系统存在的问题在于：(1)缺乏靶向性，而且具有较高的细胞毒性和免疫原性，如以携带p53基因的腺病毒治疗恶性肿瘤的方案中，只能直接将腺病毒注射到肿瘤局部。若静脉注射，病毒颗粒将很快被清除，真正能够到达肿瘤组织的目的基因很少，难以达到治疗效果，且增加了副作用；(2)存在安全性问题，目前针对遗传性疾病的基因治疗方案大多采用逆转录病毒载体，其插入或整合到染色体的位置是随机的，有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险。(3)转染和表达效率低，质粒载体因为含有CpG序列，进入细胞后能够被机体沉默而不能持续高效的表达。
非病毒载体作为肿瘤基因治疗的载体优势在于具有较高的安全性和较低的免疫原性，并且由于肿瘤血管表皮的特殊构造，能够被动靶向肿瘤组织，目前主要应用的非病毒载体有脂质体，多聚阳离子，树枝状高分子等，非病毒载体与DNA一般通过电荷的相互作用形成聚阳离子复合物，由于聚阳离子复合物对细胞的毒性较大，容易形成肺部栓塞，并且与蛋白非特异性结合，如静脉注射，不容易到达靶器官等。为减少聚阳离子的细胞毒性和增加聚阳离子复合物的生物相溶性，可以对高分化合物进行相应的修饰，如PEG的修饰等。
由于遗传物质的变异，在一些肿瘤细胞表面高表达叶酸受体分子，叶酸受体是一个特异的抗肿瘤药物传送靶位，在大部分来源于上皮组织的恶性肿瘤如卵巢癌，子宫内膜癌，肾癌，乳腺癌，肺癌，结肠癌和鼻炎癌中均有高度表达，特别是妇科肿瘤，90％的卵巢癌细胞系都有叶酸受体的高度表达，而叶酸受体在正常组织中缺失或只在极化上皮细胞的顶点表达，所以叶酸在正常组织中通常不会积累。
因为叶酸与叶酸受体具有高亲和力，并且叶酸分子自身稳定性高，免疫原性低，与纳米有机材料相容性好，是肿瘤靶标的理想配体。
FA-PEG-PEI纳米材料是一种理想的肿瘤靶向纳米材料。之前人们应用的FA-PEG-PEI材料在细胞水平取得良好的效果，但是在动物体内通过系统注射时发现在质粒浓度高的情况下形成的纳米颗粒容易发生聚沉，注射后容易导致肺部血管栓塞而致动物死亡，由于颗粒的聚沉导致注射后不能很好的透过肿瘤血管内皮，进而不能有效靶向肿瘤器官。叶酸配体在材料表面的丰度对材料在肿瘤部位的聚集具有一定的影响，所以选取合适的叶酸接枝率有利于提高纳米颗粒在肿瘤部位的富集。
研究表明，外源基因表达盒与细菌质粒骨架之间的共价连接会导致外源基因的沉默，这是造成质粒载体所携带的外源基因在体内只能瞬时表达的主要原因，也是质粒载体临床应用的主要限制因素。小环DNA(minicircleDNA)载体是一种自1997年发展起来的新型的基因载体，与常用的非病毒载体质粒载体相比，小环DNA载体仅由外源基因的表达盒构成，不含有来自细菌质粒的骨架结构。因为它仅由外源基因的表达盒构成，不含来自细菌质粒的骨架结构，从而减少了CpG模序甲基化所致的免疫反应，提高了安全性；而且更有效的提高了转基因的表达和生物利用度。
发明内容
本发明的目的是提供一种非病毒载体和非病毒载体及其制备方法与应用。
本发明提供的非病毒载体，是聚乙烯亚胺与式V所示化合物共混而得的纳米颗粒。
其中，m＝145，n为小于m的正整数；式V所述化合物的相对数均分子量为20600，分子量分布为1.73。
该非病毒载体中，所述纳米颗粒的粒径为70-90纳米；所述聚乙烯亚胺与式V所示化合物的摩尔比为10-15∶85-90；所述聚乙烯亚胺的分子量为25kDa；共混的温度为20-30℃，共混的时间为15-20分钟。
本发明提供的制备上述非病毒载体的方法，包括如下步骤：将聚乙烯亚胺与式V所示化合物进行共混，得到上述非病毒载体。
该方法中，所述聚乙烯亚胺与式V所示化合物的摩尔比为10-15∶85-90；所述聚乙烯亚胺的分子量为25kDa；共混的温度为20-30℃，共混的时间为15-20分钟。
本发明还提供了一种药物，其中，该药物的载体是上述本发明提供的非病毒载体。
该药物包括上述本发明提供的非病毒载体和包裹在所述非病毒载体中的治疗性的DNA；所述药物的靶向肿瘤为叶酸受体FRα高表达的肿瘤；所述药物能被动靶向的肿瘤为叶酸受体FRα阴性表达的肿瘤和心脏。
本发明提供的制备上述药物的方法，包括如下步骤：
1)往治疗性的DNA中加入浓度为10-50克/100毫升的葡萄糖溶液，加水稀释至所述葡萄糖溶液的终浓度为5-10克/100毫升，所述治疗性的DNA的终浓度为0-50μg/mL，不包括0，得到DNA稀释液；
往所述非病毒载体中加入浓度为10-60克/100毫升的葡萄糖溶液，加水稀释至所述葡萄糖溶液的终浓度为5-10克/100毫升，所述非病毒载体的终浓度为0-5μg/ml，不包括0，得到非病毒载体稀释液；
2)将步骤1)得到的非病毒载体稀释液与DNA稀释液等体积混匀，室温静置孵育后浓缩，得到本发明提供的药物。
该方法的步骤1)中，任一所述葡萄糖溶液的终浓度优选为5克/100毫升，所述治疗性的DNA的终浓度优选为20μg/mL；所述非病毒载体的终浓度优选为0.39μg/ml。
所述步骤2)中，孵育的时间为15-30分钟，优选15分钟；浓缩步骤是用超滤杯进行浓缩的；所述超滤膜的截留分子量为30-90kDa。
此外，本发明提供的式V所示化合物，是按照如下流程制备得到的：
其中，FA为叶酸，式I为叶酸琥珀酸酯，式II为叶酸巯基乙胺，式I、式II、式III及式V化合物的制备方法如下：
1、制备式I所示化合物的方法，包括如下步骤：在惰性气氛中，将叶酸与三乙胺混匀至完全溶解后，在避光及惰性气氛的条件下，再加入N羟基琥珀酸胺酯和N，N′-二环己基碳二亚胺进行反应，得到式I所示化合物。
该方法中，叶酸、三乙胺的摩尔比为2-2.5∶30-40，优选2.26∶36，反应温度为25-30℃，优选28℃，反应时间为12-16小时，优选14小时；所述N羟基琥珀酸胺酯与叶酸的摩尔比为2-2.5∶2-2.5，优选2.26∶2.26，N，N′-二环己基碳二亚胺与叶酸的摩尔比为的2-2.5∶2-2.5，优选2.26∶2.4，反应时间为45-50小时，优选48小时；反应温度为25-30℃，优选28℃；反应介质选自无水二甲基亚砜和无水N，N-二甲基甲酰胺中的至少一种。
2、制备式II所示化合物的方法，包括如下步骤：在避光及惰性气氛的条件下，将式I所示化合物与三乙胺、2-巯基乙胺盐酸盐进行反应，得到式II所示化合物。
该方法中，式I所示化合物与2-巯基乙胺盐酸盐的摩尔比为0.55-0.60∶0.60-0.65，优选0.56∶0.62；所述三乙胺与2-巯基乙胺盐酸盐的用量比为2mL-4mL∶60mg-80mg；反应温度为25-30℃，优选28℃，反应时间为15-20小时，优选18小时；反应介质选自无水二甲基亚砜和无水N，N-二甲基甲酰胺中的至少一种。
3、制备式III所示化合物的方法，包括如下步骤：将式II所示化合物、式IV所示化合物与三乙胺进行反应，得到式III所示化合物；所述式IV化合物的分子量为3500±350Da。
该方法中，式II所示化合物与式IV所示化合物的摩尔比为0.112-0.118∶0.055-0.060，优选0.115∶0.057；所述三乙胺与所述式IV化合物的用量比为0.01mL-0.03mL∶0.055mol-0.060mol，优选0.02mL∶0.057mol；反应温度为30-40℃，优选35℃；反应时间为45-50小时，优选48小时；反应介质为pH值为7.2～7.4的磷酸盐缓冲溶液；其中，所述磷酸盐缓冲溶液中，NaCl的浓度为137mmol/L，KCl的浓度为2.7mmol/L，Na2HPO4的浓度为4.3mmol/L，KH2PO4的浓度为1.4mmol/。
4、制备式V所示化合物的方法，包括如下步骤：将式III所示化合物与式VI所示化合物进行反应，得到式V所述化合物；所述式VI中，m＝145，n为小于m的正整数，式VI所示化合物的相对数均分子量为25000Da。
该方法中，式III所示化合物与式VI所述化合物的质量比为56-60∶315-325，优选59.6∶320；反应介质选自二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺中的至少一种；反应的温度为30-40℃，优选35℃；反应的时间为6-48小时，优选48小时。
本发明提供的非病毒载体纳米颗粒能够克服病毒载体的高免疫原性，PEG对纳米材料表面的修饰能够增加纳米颗粒在体内的相容性，降低聚阳离子的细胞毒性，减少蛋白的非特异性吸附，靶向基团的引入使得纳米颗粒能够在被动靶向肿瘤组织的基础上，主动靶向肿瘤细胞，质粒DNA或小环DNA不但能够克服病毒载体安全性的问题，而且能增加基因在体内的表达效率，延长基因表达持续时间。靶向材料包裹质粒或小环DNA形成的纳米颗粒经静脉注射能通过血液循环靶向肿瘤组织，在肿瘤细胞中持续高效表达目的基因，从而减小对正常组织细胞伤害。
本发明具有以下优点：
1、本发明制备的纳米颗粒在高浓度质粒条件(100-400μg/mL)下不形成聚沉，并且有较好的分散性和颗粒均一性，颗粒大小在70-90纳米之间，能够很好的用于体内试验。
2、本发明制备的纳米颗粒由于调整了叶酸在材料中的比例，具有更好的肿瘤富集效果，基本上80％的颗粒都聚集到肿瘤部位。
3、本发明制备的纳米颗粒由于合适的尺寸大小和PEG的保护作用，显示出较低的毒性，注射含100μgDNA的纳米颗粒后，所有动物均为出现由于颗粒毒性造成的死亡。
4、本发明制备的包裹小环的纳米颗粒具有在体内持续高效表达的特征，克服了当前非病毒载体在体内表达效率低下的缺陷。
5、本发明制备的包裹质粒和小环的纳米颗粒能够在荷瘤动物肿瘤部位有较高的表达，并且与未经修饰的材料相比，减少了在肺部和其他非肿瘤组中的聚集，降低对正常组织的毒性，增加对肿瘤的杀伤力。
6、本发明制备的包裹质粒和小环的纳米颗粒能够被动靶向到叶酸受体阴性的肿瘤部位，所以可以用于叶酸受体阴性瘤的治疗。
7、在没有肿瘤的情况下，纳米颗粒能够集中心脏部位，所以可以用于心血管疾病的治疗。
本发明提供的非病毒载体，靶向纳米颗粒能够携带目的基因特异到达肿瘤部位，进入肿瘤细胞的目的基因在细胞内能够持续高效的表达，从而增加了治疗基因对肿瘤的杀伤效果，减少了对正常细胞的毒副作用，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为市售叶酸产品的核磁表征图。
图2为叶酸分子的重结晶后叶酸分子的核磁表征图。
图3为式I化合物的核磁表征图。
图4为式II化合物的核磁表征图。
图5为式III化合物的核磁表征图。
图6为纳米颗粒透射电镜图和粒径分布图，其中，图6A-图6D为纳米颗粒的透射电镜图，其中，图6A、6C和6D中标尺长度为1μm，图6B中标尺长度为200nm；图6E为纳米颗粒的粒径分布图。
图7为非病毒载体复合DNA的能力。
图8为核酸酶降解实验，检测非病毒载体(非病毒载体)对质粒DNA(pUC-EGFP)或小环DNA(mc-GFP)的保护作用。
图9为纳米颗粒对细胞毒性的影响，A为HeLa细胞，B为SKOV3，C为HepG2，D为A431。
图10为非病毒载体体外转染荧光素酶实验结果。A为HeLa细胞，B为SKOV3，C为HepG2，D为A431转染小环DNA；E为HeLa细胞，F为SKOV3细胞，G为HepG2细胞转染质粒DNA。
图11为非病毒载体体外转染绿色荧光蛋白实验。
图12为叶酸阻断实验验证纳米材料的靶向性。
图13为靶向纳米颗粒在叶酸受体阳性肿瘤的荷瘤小鼠体内的分布。
图14为小环DNA与质粒DNA在体内表达量和表达时间比较。
图15为mc-GFP和mc-luciferase的构建流程图。
图16为p2ΦC31载体质粒图谱。
图17为活体动物成像检测目的基因在小鼠体内的分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1、制备式I所示化合物
由于市售叶酸产品含有相当的杂质，其核磁表征如图1所示，故在制备之前，先将叶酸按照下述步骤进行重结晶：将5.0g叶酸原料溶于400mL 0.2N NaOH的水溶液中，加热至沸，使叶酸全部溶解，溶液为橙黄色，保持溶液温度，慢慢滴加1N的盐酸水溶液至pH值为5，有部分沉淀析出，冷却，离心(离心转速为3800rpm，离心时间为5min)，除去粘稠状棕色不溶物，继续加热余液，再用上述稀盐酸调至pH值为3，过夜冷却后，过滤得到产物，用纯水清洗2次，乙醇清洗2次，真空干燥，得到亮黄色粉末状固体(FA)，收率为71％。
核磁表征如图2所示，由图可知，该化合物结构正确。
取1.0g(2.26mmol)重结晶后的叶酸，溶于40mL无水处理的DMSO中加入5mL无水三乙胺，鼓入N210分钟，28℃暗处搅拌12小时至全部溶解。次日加入0.26g(2.26mmol)NHS(N羟基琥珀酸胺酯)，0.5g(2.4mmol)DCC(N，N′-二环己基碳二亚胺)，鼓入N2十分钟，28℃避光反应48h，过滤除去DCU(1，3-二环己基脲)，将溶液沉于300mL乙酸乙酯中，过滤，用乙醇冲洗两次，再将产物溶于DMSO中，沉于乙醚两次。真空干燥，得到亮黄色固体粉末1.8g(FA-NHS)，收率为77％。
该产物的核磁表征见图3。由图可知，该化合物结构正确。
实施例2、制备式II所示化合物
取0.3g(0.56mmol)实施例1制备所得式I所示化合物(FA-NHS)，溶于15mL无水DMSO中，再加入3mL无水三乙胺，加入70mg(0.62mmol)2-巯基乙胺盐酸盐，鼓入N2，28℃避光反应18h。将溶液沉于无水乙腈中，过滤。再溶于DMSO中，沉于乙醚中两次，真空干燥，得到亮黄色固体粉末0.21g，收率为75％。
该产物的核磁表征见图4。由图可知，该化合物结构正确。
实施例3、制备式III所示化合物
将200mg(0.057mmol)分子量为3500Da的式IV所示化合物(Mal-PEG-NHS)溶解于8mL PBS中，再将56mg(0.115mmol)实施例2制备得到的式II所示化合物溶于8mL PBS溶液中，将上述两种溶液在N2气氛中混合，加入一滴三乙胺Et3N，在磷酸缓冲溶液作为反应介质的体系中密封进行反应，在35℃下反应48h。该磷酸缓冲溶液的pH值为7.2-7.4，其中，NaCl的浓度为137mmol/L，KCl的浓度为2.7mmol/L，Na2HPO4的浓度为4.3mmol/L，KH2PO4的浓度为1.4mmol/L。反应完成后，将体系冻干，加入氯仿，过滤，将有机相浓缩，沉于冷的乙醚中，得到乳白色固体粉末0.16g，收率为60％。该产物的核磁表征如图5。由图可知，该化合物结构正确。
实施例4、制备式V所示化合物
将式VI所示化合物(中文名称为树枝状聚乙烯亚胺，英文名称为Branched-Polyethylenimine，简称BPEI，购自sigma公司，产品编号为21195-U，式VI中m＝145，n＜m，该化合物的相对数均分子量为25000Da)溶于无水DMSO中，制成320mg/mL溶液。将实施例3制备得到的式III所示化合物溶于无水DMSO中，制成100mg/mL溶液。取式VI所示化合物的溶液1mL，式III所示化合物的溶液0.596mL，在N2保护下分别加入到1mL DMSO中反应48小时。反应完成后，用去离子水进行稀释，采用透析袋的截留分子量为12000-14000Da，在N2保护下，于超纯水中透析2天，将反应体系冻干，得到黄色粉末状产品。加入氯仿，过滤，将溶液于冷乙醚中沉淀两次，得到式V所示化合物。
对所得式V所示产物进行核磁表征，可知2.5到2.8ppm处的式VI所示化合物(BPEI)的特征峰与3.5到3.8ppm处PEG的特征峰比例，计算得到FA-PEG(FA为叶酸)结构单元为BPEI结构单元摩尔数的2.3倍。式V所示化合物的相对重均分子量为20600，分子量分布为1.73。
实施例5、制备本发明提供的非病毒载体FA-PEG-PEI
将聚乙烯亚胺(PEI)与实施例4制备得到的式V所示化合物以摩尔比为15∶85，在20℃共混15分钟，得到本发明提供的非病毒载体，该载体为纳米颗粒。其中，所用聚乙烯亚胺(PEI)的分子量为25kDa。图6为纳米颗粒透射电镜图和粒径分布图，其中，图6A-图6D为纳米颗粒的透射电镜图，其中，图6A、6C和6D中标尺长度为1μm，图6B中标尺长度为200nm；图6E为纳米颗粒的粒径分布图。
实施例6、制备本发明提供的治疗性药物
该治疗性药物由非病毒载体与DNA复合而得。
一、DNA的制备
1、pUC-EGFP的制备
(1)从pEGFP-N1质粒(GenBank Accession#：U55762)上通过PCR的方法克隆CMV-EGFP-polyA的片段，上游引物引入SpeI酶切位点，下游引物引入SpeI酶切位点，上下游引物如下：
上游引物：GGACTAGTGTAATCAATTACGGGGTCATTAG(SpeI)
下有引物：GGACTAGTCGCCTTAAGA TACATTGATG AGT(SpeI)
(2)将上述PCR产物链接到pBS-T载体(购自天根公司，目录号：VT201-01)上，命名为pBS-EGFPN1。
(3)SpeI酶切步骤(2)得到的pBS-EGFPN1，将得到的携带EGFP的酶切产物与上述步骤(1)中的PCR产物连接，得到的连接产物命名为pBS-EGFPN1-d1。
(4)用Bgl II与BamHI酶切步骤(3)得到的pBS-EGFPN1-d1，将得到的载体酶切产物回收、纯化、自连，得到的自连产物命名为pBS-EGFPN1-d2。
(5)用XbaI酶切pUC19C(GenBank Accession#：L09137)，得到pUC19C的酶切产物。
(6)用SpeI酶切步骤(4)得到的pBS-EGFPN1-d2载体，得到的携带EGFP的酶切产物。
(7)将步骤(6)与步骤(7)中的酶切产物连接，得到的连接产物命名为pUC-EGFP。
2、p2ΦC31-EGFPN1
(1)用XhoI和SpeI酶切步骤1中步骤(4)得到的pBS-EGFPN1-d2载体，回收纯化得到携带EGFP的酶切产物。
(2)用XhoI和SpeI酶切p2ΦC31(由斯坦福大学陈志英教授惠赠)，得到载体的酶切产物，其中p2ΦC31载体质粒图谱如图16所示，构建请参见以下文献：“ChenZY，He CY，Ehrhardt A，Kay MA.Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNAresult in persistent and high-level transgene expression in vivo.Mol Ther 2003Sep；8(3)：495-500.”
(3)将步骤(1)得到的酶切产物与步骤(2)得到的酶切产物连接，得到的连接产物命名为p2ΦC31-EGFPN1-d2。
3、mc-GFP的制备
构建流程如图15所示(注：图15中minicircle的缩写即mc)
(1)将步骤2得到的p2ΦC31-EGFPN1-d2转化TOP菌株(购自Invitrogen公司)，经验证正确后，接种到3mL含氨苄青霉素(100微克/毫升)的抗性LB培养基(胰蛋白胨(Tryptone)10g/L酵母提取物(Yeast extract)5g/L氯化钠(NaCl)5g/L)中，37℃，250rpm，振荡10小时，
(2)将上述菌液接种到200mLTB培养基(TB，培养基配置：配制每升培养基，在900ml去离子水中加入：胰化蛋白胨12g、酵母提取物24g、甘油4ml)，摇动容器使溶质完全溶解。然后在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。当溶液冷至60℃或60℃以下时加入100ml无菌的0.17mol/L KH2PO4，0.72mol/LK2HPO4溶液[该溶液的配制方法是：用90ml去离子水溶解2.31g KH2PO4和12.54g K2HPO4，完全溶解后，用去离子水定容至100ml并在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min)中，37℃，250rpm，振荡培养至OD260＝2.5
(3)20℃，3000rpm离心收集菌液
(4)用50mL(原培养液的1/4体积)含1.5％阿拉伯糖的具有氨苄青霉素抗性的LB(pH＝7.0)培养基重悬细菌，32℃，250rpm振荡2-4小时，
(5)加入25mL体积的含1.5％阿拉伯糖的pH＝8.0的具有氨苄青霉素抗性LB，将培养温度升至37℃，250rpm，振荡2小时，
(6)4℃，6000rpm离心30分钟收菌，
(7)用质粒抽提试剂盒(购自Qiagen公司)提取小环mc-GFP，至此，得到mc-GFP。
4、pShuttle-luciferase(简称pShuttle-luc)的制备
(1)从载体pSh pGL3-Control(GenBank Accession#：U47296)上扩增萤火虫的luciferase基因(1683bp)，引物为：
luc-F GGACTAGTGCATTCCGGTACTGTTGGT (Spe I)
luc-R TTGCGGCCGCCCGCCCCGACTCTAGAATTA (Not I)
(2)用Nhe I和Not I双酶切pshuttle(GenBank Accession#：AF334399)(4135bp)，Spe I和Not I双酶切上述PCR得到的luciferase基因，并纯化、连接转化后得到重组质粒pshuttle-luciferase。
5、p2ΦC31-luciferase的制备
(1)pBS-T-[Spe I-cmv-luciferase-BGHpolyA-Xho I]以及pBS-T-luciferase的制备
用Spe I和EcoR I双酶切步骤4中步骤(2)得到的pshuttle-luciferase得到2.7kb的[Spe I-cmv-luciferase-BGHpolyA-EcoR I]片断；用Spe I和EcoR I双酶切pBS-T载体；切胶回收/纯化后两者连接转化获得pBS-T-luciferase，
(2)用Spe I和Xho I双酶切p2Φc31以及pBS-T-[SpeI-cmv-luciferase-BGHpolyA-Xho I]，连接转化得到p2Φc31-luciferase。
6、mc-luciferase(mc-luc)
该mc-luciferase的构建流程图如图15所示。
(1)步骤5得到的p2Φc31-luciferase转化TOP菌株(购自Invitrogen公司)，接种到3mL含氨苄青霉素(100微克/毫升)的抗性LB培养基(胰蛋白胨(Tryptone)10g/L酵母提取物(Yeast extract)5g/L氯化钠(NaCl)5g/L)中，37℃，250rpm，振荡10小时。
(2)将上述菌液接种到200mLTB培养基(TB，培养基配置：配制每升培养基，在900ml去离子水中加入：胰化蛋白胨12g、酵母提取物24g、甘油4ml)，摇动容器使溶质完全溶解。然后在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。当溶液冷至60℃或60℃以下时加入100ml无菌的0.17mol/L KH2PO4，0.72mol/L K2HPO4溶液[该溶液的配制方法是：用90ml去离子水溶解2.31g KH2PO4和12.54g K2HPO4，完全溶解后，用去离子水定容至100ml并在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min)中，37℃，250rpm，振荡培养至OD260＝2.5。
(3)20℃，3000rpm离心收集菌液
(4)用50mL(原培养液的1/4体积)含1.5％阿拉伯糖的具有氨苄青霉素抗性的LB(pH＝7.0)培养基重悬细菌，32℃，250rpm振荡2-4小时，
(5)加入25mL体积的含1.5％阿拉伯糖的pH＝8.0的具有氨苄青霉素抗性LB，将培养温度升至37℃，250rpm，振荡2小时，
(6)4℃，6000rpm离心30分钟收菌，
(7)用质粒抽提试剂盒(购自Qiagen公司)提取小环mc-luc，至此得到mc-luc。
二、非病毒载体与DNA共混成的复合物(FA-PEG-PEI/pUC-EGFP、FA-PEG-PEI/mc-GFP、FA-PEG-PEI/pShuttle-luc和FA-PEG-PEI/mc-luc)的制备
1、FA-PEG-PEI/pUC-EGFP的制备
1)制备N/P＝15的FA-PEG-PEI/pUC-EGFP
a、往本实施例步骤一得到的pUC-EGFP中加入浓度为10克/100毫升的葡萄糖溶液，加水稀释至所述葡萄糖溶液的终浓度为5克/100毫升，得到pUC-EGFP的终浓度为20μg/mL的pUC-EGFP稀释液；
b、往所述实施例5制备所得非病毒载体中加入浓度为10克/100毫升的葡萄糖溶液，加水稀释至所述葡萄糖溶液的终浓度为5克/100毫升，得到非病毒载体的终浓度为0.39μg/mL的非病毒载体稀释液；
c、将步骤b所得所述非病毒载体稀释液等体积加入到步骤a所得pUC-EGFP稀释液中，边滴加边振荡，滴加完后继续振荡30s，室温静置孵育15-30分钟后，10-50KDa的超滤杯(购自millipore公司)进行浓缩，得到本发明提供的治疗性药物(N/P＝15)，其中，因上述浓缩程度不同，制备浓度为20-200μg/mL pUC-EGFP。
图6为该药物(复合物)中纳米颗粒(非病毒载体)的透射电镜图和粒径分布图，其中A、C是现有技术制备的纳米颗粒；B图是A图箭头所示颗粒的放大图，D是本步骤得到的纳米颗粒的透射电镜图，图E是本步骤得到的纳米颗粒的粒径分布图。如图所示该纳米颗粒未出现聚沉，分布均匀，粒径均一。A，C图为根据现有文献(Boussif O，Lezoualc′h F，Zanta MA，Mergny MD，Scherman D，Demeneix B，et al.A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in cultureand in vivo：polyethylenimine.Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 1995 Aug 1；92(16)：7297-7301.)的制备方法所得质粒浓度分别为20μg/mL，和200μg/mL的纳米颗粒电镜图，由图可知在在低质粒浓度(20μg/mL)条件下，颗粒大小均以，分布均匀，但在高浓度200μg/mL下，现有制备方法得到的纳米颗粒将出现明显的聚沉。
综上所述，在进行动物实验时，要求质粒浓度限制在100-200μg/mL，但现有制备方法不能满足制备高质粒浓度纳米颗粒的要求，本方法克服了现有制备技术的缺陷，在高质粒浓度条件下能够制备分布均匀，粒径均一的70-90纳米的纳米颗粒。
2)制备不同N/P的FA-PEG-PEI/pUC-EGFP
按照步骤1)中步骤b的方法，制备浓度为0.013，0.026，0.039，0.052，0.065，0.077，0.090，0.10，0.13，0.26，0.39，0.52，0.65，0.77μg/mL的非病毒载体稀释液，然后与步骤1)中步骤a得到的pUC-EGFP的稀释液等体积混合，混合条件与步骤1)中步骤c相同，制备出N/P比为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、10、15、20、25、30的治疗性药物，命名为FA-PEF-PEI/pUC-EGFP。
2、FA-PEG-PEI/mc-GFP的制备
按照上述步骤1的方法，将pUC-EGFP换成mc-GFP，制备出N/P为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、10、15、20、25、30的非病毒载体与DNA共混成的复合物，命名为FA-PEG-PEI/mc-GFP。
3、FA-PEG-PEI/pShuttle-luc的制备
按照上述步骤1的方法，将pUC-EGFP换成pShuttle-luc，制备出N/P为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、10、15、20、25、30的非病毒载体与DNA共混成的复合物，命名为FA-PEG-PEI/pShuttle-luc。
4、FA-PEG-PEI/mc-luc的制备
按照上述步骤1的方法，将pUC-EGFP换成mc-luc，制备出N/P为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、10、15、20、25、30的非病毒载体与DNA共混成的复合物，命名为FA-PEG-PEI/mc-luc。
四组对照的制备：
按照上述步骤1的方法，制备出N/P为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、10、15、20、25、30的四组对照：PEI/pUC-EGFP、PEI/mc-GFP、PEI/pShuttle-luc和PEI/mc-luc。
实施例7、非病毒载体复合DNA的能力
按照下述步骤进行本发明提供的非病毒载体复合DNA的凝胶阻滞实验：
1)将实施例6得到的N/P为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4的FA-PEG-PEI/pUC-EGFP、FA-PEG-PEI/mc-GFP在一克/100mL的琼脂糖凝胶Biowest，Spain中进行电泳，电泳缓冲液为Tris-acetate(TAE)(缓冲液浓度：0.04摩尔/升TrisHAc、0.002摩尔/升EDTA)，电压为140伏，电泳时间为30分钟；
2)电泳完成后在0.5μg/mL的溴化乙锭水溶液(EB)中染色五分钟；
3)在312纳米的紫外光下进行观察并拍照，所得结果如图7所示。其中，图7A表示非病毒载体FA-PEG-PE在所给定的N/P下复合pUC-EGFP的能力，图7B表示非病毒载体FA-PEG-PE在所给定的N/P下复合mc-GFP的能力。由于该非病毒载体完全复合DNA需要该材料与DNA具有适当N/P比(N/P比为非病毒载体中所含N原子数与核酸分子中所含P原子数的比例)。由图7可知，非病毒载体在N/P比为4时能将pUC-EGFP或mc-GFP完全复合，随着N/P比的增加，复合能力也随之增加。
实施例8、非病毒载体对DNA的保护作用
按照下述步骤进行降解实验。
1)取90微升实施例6得到的N/P比15的FA-PEF-PEI/pUC-EGFP，FA-PEG-PEI/mc-GFP，PEI/pUC-EGFP，PEI/mc-GFP复合物溶液(其中，pUC-EGFP或mc-GFP的量为1.2微克)以及裸露的1.2微克pUC-EGFP和1.2微克mc-GFP。
2)分别向上述复合物溶液以及裸露的DNA中加入10微升含有0.05酶活单位的DNA酶液，该DNA酶液是将DNase I(无RNase酶)(购于TAKAR公司，产品编号为D2215)溶于DNase I缓冲溶液(详情请参见产品说明说)；以小牛胸腺DNA为底物，在25℃、pH5.0的条件为下，1分钟内使反应液的260nm吸光度增加0.001所需要的酶量定义为1个活性单位(Kunitz Unit)
3)反应开始后用紫外分光光度计在260纳米光源下记录吸光值的变化，每隔10秒记录一次，记录20分钟，其中，吸光值的变化率按照下述公式进行计算：
变化率＝[A260-A260(初始)]/[A260(20min)-A260(初始)]
因为组织液、血液中含有核酸酶，裸DNA进入机体后容易被核酸酶消化，纳米材料包裹DNA后形成纳米颗粒能够对DNA有保护作用，大幅度降低DNA的降解。如图8所示，裸DNA在DNA酶存在的情况下很快被降解，经纳米材料包裹的DNA能够阻止DNA被DNA酶消化。
实施例9、非病毒载体对细胞毒性的影响
按照下述步骤对经过PEG修饰的纳米材料(FA-PEG-PEI/mc-GFP)和未经修饰的纳米材料(PEI/mc-GFP)进行细胞毒性实验。
1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测四株细胞密度为10000个每孔(边缘孔用无菌PBS填充)。所用四株细胞均购自美国菌种保藏中心，其中，HeLa(人宫颈癌细胞，ATCC号：CCL-2TM)，SKOV3(人卵巢癌细胞，ATCC号：HTB-7TM)，HepG2(人肝癌细胞，ATCC号：HB-8065TM)，A431(人表皮癌细胞，CRL-2592TM)；
2)在5％CO2、37℃的条件下进行孵育，至细胞单层铺满80％-90％的96孔平底板的孔底，加入具有实施例6制备得到的6个浓度梯度的不同N/P比(N/P比分别为5、10、15、20、25和30)的PEI/mc-GFP和FA-PEG-PEI/mc-GFP复合物，每孔加50μl复合物，50μl复合物中所含的DNA的量为0.2微克，50μl无血清1640培养基(购自Gibco公司)，，复孔设为5个；
3)在5％CO2、37℃的条件下孵育6小时，换上100ul有血清(胎牛血清，购自Gibco公司)的培养基(培养基中血清浓度为10％)，继续培养24小时，倒置显微镜下观察。
4)每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5)终止培养，小心吸去孔内培养液。
6)每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570处测量各孔的吸光值。
7)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，按照下述公式对细胞存活率进行计算：
存活率＝(给药-空白)]/(对照-空白)X100(这里的给药组就是步骤2)加复合物的实验组吧，空白组是凋零孔组，对照就是对照孔组)
所得结果如图9所示，由图9可知，经过PEG修饰的纳米材料(FA-PEG-PEI/mc-GFP)比未经修饰的纳米材料(PEI/mc-GFP)毒性显著降低。
实施例10、非病毒载体对细胞的转染效率
1、体外转染荧光素酶实验
1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞密度为10000每孔(边缘孔用无菌PBS填充)。其中，所述待测细胞HeLa(人宫颈癌细胞，ATCC号：CCL-2TM)和SKOV3(人卵巢癌细胞，ATCC号：HTB-7TM)是叶酸受体阳性细胞，A431(人表皮癌细胞，CRL-2592TM)和HepG2(人肝癌细胞，ATCC号：HB-8065TM)是叶酸受体阴性细胞。
2)5％CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满80％-90％孔底(96孔平底板)，吸除旧培养基，加入50ul无叶酸无血清1640培养基，加入N/P比为5、10、15、20的FA-PEF-PEI/pShuttle-luc，FA-PEG-PEI/mc-luc，PEI/pshuttle-luc，PEI/mc-luc复合物，复合物中DNA量为0.2微克每孔，每孔加入50ul上述复合物，设3个复孔，3.5％CO2，37℃孵育6小时，换上100ul有血清(胎牛血清，购自Gibco公司)的培养基(血清浓度为10％)，继续培养30小时
3)检测荧光素酶的活性，参照Promega公司产品E1500的说明书步骤
图10为本发明提供的非病毒载体的体外转染荧光素酶实验结果。其中，图A，B，C，D为非病毒载体(FA-PEG-PEI，PEI)包裹小环DNA(mc-luc)形成的纳米颗粒转染细胞(A：HeLa，B：SKOV3，C：HepG2，D：A431)的结果；图10E、F和G分别为非病毒载体(FA-PEG-PEI，PEI)包裹质粒DNA(pShuttle-luc)形成的纳米颗粒转染HeLa，SKOV3，HepG2的结果，由图可知，在不同的N/P比下纳米材料的转染效率有所不同，其中本发明提供的非病毒载体的转染效率均低于PEI/DNA的转染效率，但是在叶酸受体阳性的细胞中所降低的幅度明显小于在叶酸受体阴性细胞中降低的幅度，说明在叶酸受体阳性的细胞中叶酸受体介导了一部分纳米材料的内吞。
表2、荧光素酶的表达量列表
从图10和表2中可以看出，靶向材料FA-PEG-PEI/mc-GFP在叶酸受体阳性的细胞HeLa，SKOV3的转染效率比较PEI/mc-GFP的转染效率稍低，但是靶向材料FA-PEG-PEI/mc-GFP在叶酸受体阴性的细胞HepG2和A431中转染效率显著低于PEI/mc-GFP的转染效率，说明叶酸受体参与了FA-PEG-PEI/mc-GFP进入细胞的过程，证明FA-PEG-PEI/mc-GFP具有叶酸靶向性。
2、体外转染绿色荧光蛋白实验
1)重复本实施例步骤1的步骤1)；
2)5％CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满80％-90％孔底(96孔平底板)，吸除旧培养基，加入50ul无叶酸无血清1640培养基，加入N/P比为5、10、15、20，的，FA-PEG-PEI/mc-GFP，，PEI/mc-GFP复合物，复合物中DNA量为0.2微克每孔，每孔加入50ul上述复合物，设3个复孔，3.5％CO2，37℃孵育6小时，换上100ul有血清(胎牛血清)的培养基(血清浓度为10％)，继续培养30小时，倒置显微镜下观察。
3)检测GFP(绿色荧光蛋白)的表达，在荧光倒置显微镜下检测，激发光为488nm，发生光为507nm。
PEG的修饰能够降低多聚阳离子表面的电荷，从而降低了转染效率，但是叶酸靶向基团的引入能够介导一部分纳米颗粒通过叶酸受体介导进入细胞，能够增强PEG修饰的纳米颗粒的转染效率，并且具备靶向性。
图11(F是在荧光显微镜下观察的图片，B是在明场下观测的图片)为本发明提供的非病毒载体进行体外转染绿色荧光蛋白实验的结果。从图11中可以看出，靶向材料FA-PEG-PEI/mc-GFP在叶酸受体阳性的细胞HeLa，SKOV3的转染效率比较PEI/mc-GFP的转染效率稍低，但是靶向材料FA-PEG-PEI/mc-GFP在叶酸受体阴性的细胞HepG2和A431中转染效率显著低于PEI/mc-GFP的转染效率，说明叶酸受体参与了FA-PEG-PEI/mc-GFP进入细胞的过程，证明FA-PEG-PEI/mc-GFP具有叶酸靶向性，该结果应证图10的结果。
实施例11、非病毒载体叶酸受体靶向性的验证
将本发明提供的非病毒载体分别置于叶酸浓度分别为0、0.01、0.1和1毫克/升的培养基中进行转染，所用培养基为1640+folate free(无叶酸)(购自Gibco公司)，所用转染细胞为中转染细胞叶酸受体阳性的HeLa细胞(人宫颈癌细胞，ATCC号：CCL-2TM)和SKOV3细胞(人卵巢癌细胞，ATCC号：HTB-7TM)。具体步骤如下：
1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞密度为10000个每孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。
2)5％CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满80％-90％孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物(N/P比为5，10，15，20的PEI/mc-luc和FA-PEG-PEI/mc-luc复合物，mc-luc量为0.2微克每孔)，每孔50ul复合物，50ul 1640-folate free(购自Gibco公司)无血清培养基，设3个复孔.3.5％CO2，37℃孵育6小时，换上100ul有血清(10％胎牛血清，购自Gibco公司)的培养基，继续培养30小时，倒置显微镜下观察。
3)检测荧光素酶的活性，参照Promega公司产品E1500的说明书步骤。
随着叶酸剂量浓度的增加，非病毒载体的转染效率随之减小，呈现叶酸阻断的剂量依赖关系，而在非靶向材料中叶酸的存在对转染效率无显著影响，如图12所示。
实施例12、动物实验
1、制备荷瘤小鼠
在4-6周的裸鼠(购自北京大学医学部实验动物中心)左掖接种200微升1*106HeLa细胞，右掖接种200微升1*104H22细胞，当肿瘤体积长至0.5-1cm时，用于下述实验。
2、将实施例6制备的N/P等于6的PEI/mc-luc和FA-PEG-PEI/mc-luc复合物的溶液，其中非病毒载体包裹的mc-luc 50μg，通过尾静脉注射到接种有叶酸受体阳性和叶酸受体阴性的荷瘤小鼠中，24h小时后检测基因表达，不带靶向的纳米材料做为阴性对照。
结果如图13所示，可知本发明提供的治疗肿瘤的药物能够在叶酸受体阳性的肿瘤中富集，而在其他组织器官积累很少，证明本发明提供的治疗肿瘤的药物能将目的基因高效特异的运送到肿瘤部位！图13的数据所对应的具体数值如表3所示。
表3、荧光素酶的表达量
实施例13、动物实验
证明纳米材料携带小环的比携带质粒DNA在肿瘤内的表达量更高，持续时间更长。具体步骤如下：
将实施例6制备的N/P等于6的FA-PEG-PEI/mc-luc和FA-PEG-PEI/pShuttle-luc复合物的溶液，其中非病毒载体包裹的mc-luc或pShuttle-luc 50μg，通过尾静脉注射到接种有叶酸受体阳性荷瘤裸鼠中，7天以后检测目的基因的表达，荧光素酶的表达量如表4所示，图14为mc-luc与pShuttle-luc在体内表达量和表达时间比较。由图可知，目的基因在肿瘤部位富集，而且小环DNA(mc-luc)的表达量和持续时间明显优于质粒DNA(pShuttle-luc)。在受体阳性的肿瘤部位富集比较多，而在受体阴性的肿瘤部位富集很少。
表4、荧光素酶的表达量
实施例14、动物实验
1)用EMA(ethidium monoazide，叠氮乙锭，购自博麦德)标记pShuttle-luc或mc-luc，得到能够产生红色荧光的pShuttle-luc或mc-luc，将pShuttle-luc或mc-luc用Tris Buffer(pH 8.5)稀释到到1ug/ul，将EMA(10ug/ul)储备液稀释到0.1ug/ul，1∶10(v/v)避光反应30min，UV照射1h(365nm，铺展均匀，较大面积激活)，无水乙醇稀释到60％进行DNA沉淀，室温放置15min，21000g离心20min，弃上清，适当去离子水复溶。得到的带红色荧光的小环命名为EMA-mc-luc，得到的带红色荧光的质粒命名为EMA-pShuttle-luc。红色荧光的激发光为488纳米，发生光为630纳米。
2)按照实施例6的方法制备FA-PEG-PEI/EMA-pShuttle-luc，FA-PEG-PEI/EMA-mc-luc复合物，复合物中质粒浓度为200μg/mL，N/P比为6；
3)制备荷瘤小鼠
在4-6周的裸鼠(购自北京大学医学部实验动物中心)左掖接种200微升1*106HeLa细胞，右掖接种200微升1*104H22细胞，当肿瘤体积长至0.5-1cm时，用于下述实验。
4)将步骤1)和2)制备的N/P等于6的FA-PEG-PEI/EMA-mc-luc和FA-PEG-PEI/EMA-pShuttle-luc复合物的溶液，其中非病毒载体包裹的EMA-mc-luc或EMA-pShuttle-luc为50μg，通过尾静脉注射到接种有叶酸受体阳性和叶酸受体阴性的荷瘤小鼠中，3-5小时后，通过活体动物成像检测目的基因在小鼠体内的分布。结果如图17所示，左侧小鼠为FA-PEG-PEI/EMA-pShuttle-luc复合物注射的小鼠，从图中可以看出EMA-pShuttle-luc在左掖肿瘤(叶酸受体阳性肿瘤)部位大量富集，而在右掖(叶酸受体阴性肿瘤部位)分布相对较弱，说明靶向纳米材料主要通过叶酸受体介导的途径进入肿瘤细胞。
右侧小鼠为FA-PEG-PEI/EMA-mc-luc复合物注射的小鼠，从图中可以看出EMA-mc-luc在左掖肿瘤(叶酸受体阳性肿瘤)部位大量富集，而在右掖(叶酸受体阴性肿瘤部位)分布相对较弱，说明靶向纳米材料主要通过叶酸受体介导的途径进入肿瘤细胞。
Claims (14)
1.式V所示化合物，
其中，m=145，n为小于m的正整数，式V所述化合物的相对数均分子量为20600，分子量分布为1.73。
2.一种制备权利要求1所述化合物的方法，包括如下步骤：将式III所示化合物与式VI所示化合物进行反应，得到权利要求1所述化合物；
式VI中，m=145，n为小于m的正整数，式VI所示化合物的相对数均分子量为25000Da；
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述式III所示化合物与式VI所示化合物的质量比为56-60：315-325；反应介质选自二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺中的至少一种；反应的温度为30-40℃；反应的时间为6-48小时。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述式III所示化合物与式VI所示化合物的质量比为59.6：320；反应的温度为35℃；反应的时间为48小时。
5.一种非病毒载体，是聚乙烯亚胺与权利要求1所述化合物共混而得的纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的非病毒载体，其特征在于：所述纳米颗粒的粒径为70-90纳米；所述聚乙烯亚胺与权利要求1所述化合物的摩尔比为10-15：85-90；所述聚乙烯亚胺的分子量为25kDa；共混的温度为20-30℃，共混的时间为15-20分钟。
7.一种制备权利要求5或6所述非病毒载体的方法，包括如下步骤：将聚乙烯亚胺与权利要求1所述化合物进行共混，得到所述非病毒载体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述聚乙烯亚胺与权利要求1所述化合物的摩尔比为10-15：85-90；所述聚乙烯亚胺的分子量为25kDa；共混的温度为20-30℃，共混的时间为15-20分钟。
9.一种药物，其特征在于：所述药物的载体是权利要求5或6所述非病毒载体。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于：所述药物包括权利要求5或6所述非病毒载体和包裹在所述非病毒载体中的治疗性的DNA。
11.根据权利要求9或10所述的药物，其特征在于：所述药物的靶向肿瘤为叶酸受体FRα高表达的肿瘤；所述药物能被动靶向的肿瘤为叶酸受体FRα阴性表达的肿瘤和心脏。
12.一种制备权利要求9-11任一所述药物的方法，包括如下步骤：
1）往治疗性的DNA中加入浓度为10-50克/100毫升的葡萄糖溶液，加水稀释至所述葡萄糖溶液的终浓度为5-10克/100毫升，所述治疗性的DNA的终浓度为0-50μg/mL，不包括0，得到DNA稀释液；
往所述权利要求5或6所述非病毒载体中加入浓度为10-60克/100毫升的葡萄糖溶液，加水稀释至所述葡萄糖溶液的终浓度为5-10克/100毫升，所述非病毒载体的终浓度为0-5μg/ml，不包括0，得到非病毒载体稀释液；
2）将步骤1）得到的非病毒载体稀释液与DNA稀释液等体积混匀，室温静置孵育后浓缩，得到所述药物。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，任一所述葡萄糖溶液的终浓度为5克/100毫升，所述治疗性的DNA的终浓度为20μg/mL；所述非病毒载体的终浓度为0.39μg/ml；
所述步骤2）中，孵育的时间为15-30分钟；浓缩步骤是用超滤杯进行浓缩的；所述超滤膜的截留分子量为30-90kDa。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中，孵育的时间为15分钟。
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| Atkinson Sarah F.等."Conjugation of folate via gelonin carbohydrate residues retains ribosomal-inactivating properties of the toxin and permits targeting to folate receptor positive cells".《Journal of Biological Chemistry》.2001,第276卷(第30期),第27931页第1栏第3段、图1和第2栏第3段. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102030754A (zh) | 2011-04-27 |
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