CN103333169B

CN103333169B - 一种巯基化叶酸及其制备方法

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Publication number: CN103333169B
Application number: CN201310009420.1A
Authority: CN
Inventors: 刘继宪; 孙燕; 唐建国; 王瑶; 黄震; 黄林军; 武鹏
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2013-01-10
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2033-01-10
Also published as: CN103333169A

Abstract

本发明涉及一种巯基化叶酸及其制备方法，属于有机合成技术领域。制备方法包括以下步骤：首先将带有双官能团（羟基和巯基）的巯基类化合物中的巯基氧化成二硫键得到多官能团二硫物；然后将该二硫物同叶酸（FA）进行酯化反应；最后采用还原剂再将二硫键断裂，制备出含有游离巯基的叶酸衍生物。该叶酸衍生物可以与纳米金属粒子形成牢固的硫金键（S—Me）而结合在一起，从而可以实现叶酸对纳米金属粒子的表面修饰。本发明具有制备工艺简单，成本低的优点。本发明的巯基化叶酸结构式如下式。

Description

一种巯基化叶酸及其制备方法

所属技术领域

本发明涉及一种巯基化叶酸及其制备方法，属于有机合成技术领域。

背景技术

提高疾病治疗的用药效率是医学界的永恒主题。多数药物进入人体内以后，随着血液循环到达人体的各个器官和组织，真正到达目标病灶组织的部分极低，大部分药物积聚在人体健康组织中，达不到治疗效果。同时，药物都具有一定的毒性，对健康细胞具有负面影响。近年来，药物的纳米负载及靶向输送得到了广泛的研究，大大提高了药物的利用率和疾病治疗效果。药物的纳米负载及靶向输送的靶向性是由同它们结合在一起的靶向试剂提供的。靶向试剂通常是生物抗原、抗体、DNA、RNA及生物配体，它们同肿瘤病灶所特有的且过渡表达的抗体、抗原及生物受体具有特异亲和性而配对结合，从而实现病灶的靶向给药。目前采用的靶向试剂多为生物大分子，它们只针对某种特定的肿瘤组织具有靶向性，贮存、制备条件苛刻，限制了材料的应用范围。叶酸是一种小分子生物配体，其生物受体（FR）在多种肿瘤组织中呈现过表达。近几年的研究发现，叶酸具有良好的生物活性和广谱的生物靶向性,具有良好的生物医用前景，基于叶酸的多种靶向药物以及药物运载系统应运而生，得到广泛的应用。

基于叶酸受体靶向型的金纳米粒子复合物是叶酸作为靶向试剂的一个典型应用研究领域。金属纳米粒子（尤其是金、银等）具有很强的表面等离子体吸收和拉曼散射增强效应，同时具有良好的结构稳定性和生物相容性，在免疫分析、生物传感器、DNA的识别与检测、肿瘤的诊断与光热治疗等生物医学领域具有广泛的应用。金属元素的另一大特点就是极易同含有巯基的化合物形成牢固的硫金键（S—Me）而结合在一起，利用这一原理可以实现金属纳米粒子的表面生物修饰，从而赋予金属纳米粒子生物应用潜能。国外学者潘迪（Pandey）等通过11-巯基十一烷酸实现叶酸与纳米金的偶联。中国专利201010566939.6以谷胱甘肽（GSH）作为偶联剂实现叶酸对金纳米粒子的修饰，从而制备出一种叶酸受体靶向型的金纳米粒子。迄今为止，多数叶酸修饰纳米金的方法中，都是先采用含巯基的偶联剂通过Au-S键与纳米金结合，然后偶联剂上的其他官能团再与叶酸发生化学反应，制备出叶酸修饰纳米金的复合物。这种方法得到的叶酸修饰纳米金的复合体，所有制备步骤都是在水溶液中进行，首先整个制备过程的起始阶段金纳米粒子的浓度就很低，而偶联剂和叶酸通常为有机物，在水溶液的溶解度较低，各种中间产物以及最终产物都不能高浓度的制备；再者，纳米金本身的制备条件和贮存条件要求严格，与之混合的所有溶剂和药品都需要高度纯化，否则极易造成纳米金属粒子的团聚，增加了操作难度，因此，产品制备效率低，分离纯化困难，目标产物不能大量制备。另外还有的方法先采用聚乙二醇包覆纳米金，然后通过物理吸附将叶酸吸附在纳米颗粒外层，这种方法很难实现叶酸对纳米金的单分子层修饰，修饰牢度也难以保证持久。以上方法制品的浓度非常低，难以实现规模化生产，产品的大规模储存、运输也将是难以克服的难题。如果能够得到一种叶酸衍生物，其分子链端带有巯基，这样在保持叶酸生物活性的同时，可以实现叶酸对多种金属纳米粒子的直接修饰。

迄今为止，尚没有一种叶酸的巯基化衍生物产品作为修饰试剂，使其可以直接用于纳米金属粒子的修饰。本发明提出一种制备巯基化叶酸的方法，拟以一种含有巯基的双官能团（羟基和巯基）化合物为巯基化试剂，同叶酸进行酯化反应而实现叶酸的巯基化。由于巯基是一种比较活泼的基团，在与叶酸进行酯化反应之前，首先要对巯基实施保护，反应之后再脱除保护。本发明设计了一个“二硫键（S-S）生成—断裂”工艺实现了上述目的。本发明通过特定的手段对巯基类化合物中的巯基进行保护和脱保护，以一种简单易行的操作流程，合成巯基化的叶酸衍生物，制备工艺简便，且产物可以大量制备，储存方便，为叶酸的进一步应用奠定材料基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种条件温和、易于操作、步骤简单、可以大量制备巯基化叶酸的合成方法。拟以一种含有巯基的双官能团（羟基和巯基）化合物为巯基化试剂，同叶酸进行酯化反应而实现叶酸的巯基化。由于巯基是一种比较活泼的基团，在与叶酸进行酯化反应之前，首先要对巯基实施保护，反应之后再脱除保护。本发明设计了一个“二硫键（S-S）生成—断裂”工艺实现了上述目的。

本发明采用弱氧化剂将双官能团（羟基和巯基）化合物中的巯基氧化成S-S键得到二硫物，从而实现对具有高反应活性的巯基的保护；然后在催化剂和脱水剂的存在下，二硫物上的其他基团与叶酸发生酯化反应，得到含有二硫键的叶酸衍生物；该叶酸衍生物中的二硫键通过还原反应而断裂，产物中重新形成巯基，从而得到目标产物巯基化叶酸。

该方法具体包括以下步骤：

1）双官能团（羟基和巯基）化合物氧化制备二硫物

将巯基醇类化合物溶于有机溶剂中，在低温条件下，加入适量的氧化剂，搅拌反应2 ~ 6小时。反应结束，向反应液中加入脱水剂无水硫酸钠或氧化钙，搅拌半小时，减压蒸馏，之后高速离心收集产物，离心条件为2000 ~ 10000 rpm，5 ~ 20 min，分离纯化后的产物即为二硫物。采用红外光谱对巯基醇类化合物及其二硫物进行测试表征，研究产物的结构。

可采用的的巯基类化合物有二硫赤藓醇、3-巯基-1,2-丙二醇、2,3-二巯基丙醇、3-巯基己醇、2-巯基-3-丁醇、3-巯基丙醇等。

可采用的有机溶剂有正己烷、乙醇、甲醇、丙酮、丁酮、乙睛、乙醚等。

反应物中巯基类化合物与氧化剂的摩尔比为1：（0.5 ~ 2）。

二硫物合成的反应方程式见式（1）：

式（1）中R为

、

、

、

、

、

等。

2）叶酸与二硫物的酯化反应

将叶酸溶于溶剂中，加入脱水剂和催化剂，再加入上述二硫物，搅拌反应6 ~ 20小时，离心（2000 ~ 10000 rpm，5 ~ 20 min），保留上清液，将其加入到水中析出沉淀，再离心（2000 ~ 10000 rpm，5 ~ 20 min），并将沉淀用蒸馏水洗涤、离心三次，得到的沉淀放入真空干燥箱中干燥，温度设为15 ~ 50 ℃，最后得到含二硫键的叶酸衍生物。采用红外光谱对叶酸及含二硫键的叶酸衍生物进行测试表征，研究产物的结构。

可采用的溶剂为二甲基亚砜（DMSO）、二氯甲烷、氢氧化碱溶液、碳酸碱溶液，反应温度为20 ~ 40 ℃。

可采用的脱水剂为无水硫酸钠、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、2,4,6-三氯苯甲酰氯，所述的催化剂为苯乙烯系阳离子交换树脂、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，脱水剂和催化剂两者配合使用。

实验中叶酸、脱水剂、二硫物的摩尔比为1：（0.5 ~ 4)：（1 ~ 4）。

叶酸与二硫物的酯化反应方程式见式（2）：

其中R同式（1）中的结构。

3）叶酸衍生物中二硫键的裂解

将上述含二硫键的叶酸衍生物溶于溶剂中，加入还原剂，搅拌反应6 ~ 24小时，反应产物加入到水中析出沉淀，离心洗涤三次，将沉淀物放入真空干燥箱中干燥，真空干燥箱设定为15 ~ 50 ℃，最终得到巯基化叶酸。分别采用红外光谱和核磁共振波谱对叶酸和巯基化叶酸进行测试表征，研究产物的结构。

可采用的溶剂为二甲基亚砜（DMSO）、二氯甲烷、氢氧化碱、碳酸碱溶液，溶解温度为20 ~ 40 ℃。

可采用的还原剂为二硫苏糖醇（DTT）、亚硫酸氢钠、三丁基磷、三羧乙基磷、三苯基磷。

反应物叶酸与还原剂的摩尔比为1：（1 ~ 4）。

分离采用的离心条件为2000 ~ 10000 rpm，5 ~ 20 min，洗涤剂为乙醚、乙醇和水任选其一或配合使用。

叶酸衍生物中二硫键的裂解反应方程式见式（3）：

其中R同式（1）中的结构。

本发明设计了一个“二硫键（S-S）生成—断裂”工艺实现了对巯基类化合物中的巯基的保护和脱保护，以一种简单易行的操作流程，合成具有巯基的叶酸衍生物，可以直接用于对金属纳米粒子的表面修饰。本发明制备工艺简便，可以批量制备产物，储存方便，为叶酸的进一步应用奠定了材料基础。本发明的巯基化叶酸制备方法，填补了国内外在该领域的空白，所得产物可以直接用于多种金属纳米材料的修饰复合，使用方便，具有广阔的应用前景。利用本发明制备的巯基化叶酸对银纳米粒子进行了修饰，并利用透射电镜和x 射线能谱仪进行了分析表征，实验结果表明叶酸分子均匀地修饰在了银纳米粒子表面。

附图说明

图1为巯基丙醇的红外谱图，其特征吸收峰为：3364 cm^-1（O-H）、2935 cm^-1，2875 cm^-1（C-H）、2568 cm^-1（S-H st）、1053 cm^-1，1015 cm^-1（C-O）、908 cm^-1（S-H δ）。

图2为3,3’-二巯基二丙醇的红外谱图，其特征吸收峰为：3320 cm^-1（O-H）、2930 cm^-1，2870 cm^-1（C-H）、1040 cm^-1，999 cm^-1（C-O）。

图3为纯叶酸的红外谱图，3545 cm^-1（O-H）、3416 cm^-1，3333 cm ^-1（N-H）、2924 cm^-1，2856 cm^-1（-CH₂-）、1692 cm^-1（C=O）、1113 cm^-1（C-O）。

图4为3,3’-二巯基二丙醇改性的叶酸的红外谱图，2920 cm^-1，2860 cm^-1（-CH₂-）、1700 cm^-1（C=O）、1050 cm^-1（C-O）、642 cm^-1（C-S）。

图5为巯基化的叶酸的红外谱图，3460 cm^-1（O-H）、3330 cm^-1（N-H）、2930 cm^-1，2850 cm^-1（-CH₂-）、2360 cm^-1（S-H）、1720 cm^-1（C=O）。

图6为纯叶酸的核磁共振氢谱图，1.9 ppm（-CH₂-），2.0 ppm（-CH₂-），2.34 ppm（-CH₂-），4.36 ppm（-CH-），4.5 ppm（-CH₂-），6.67 ppm（苯环上CH），7.0 ppm(NH)，7.68 ppm（苯环上CH），8.17 ppm(NH)，8.67 ppm（喋呤啶上CH），11.45 ppm(OH)。

图7为巯基化的叶酸的核磁共振氢谱图，1.15 ppm（-CH₂-），1.51 ppm（SH），1.9 ppm（-CH₂-），2.0 ppm（-CH₂-），2.40 ppm（-CH₂-），3.61 ppm（-CH₂-），4.0 ppm（-CH₂-），4.36 ppm（-CH-），4.49 ppm（-CH₂-），6.64 ppm（苯环上CH），7.00 ppm(NH)，7.64 ppm（苯环上CH），8.26 ppm(NH)，8.65 ppm（喋呤啶上CH）。

图8为巯基化叶酸的X射线能谱图

图9为巯基化叶酸修饰纳米金属的透射扫描电镜

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的内容及实施方案进行详细说明。

实施例1

3-巯基丙醇氧化偶联制备二硫物

在装有磁子、恒压漏斗的100 mL锥形瓶中加入9.216 g（0.100 mol，2.50 mol/L）3-巯基丙醇的乙醇溶液，在恒压漏斗中加入浓度为30%的双氧水11.337 g（0.100 mol），将锥形瓶放入冰水混合物中，双氧水逐滴加入到锥形瓶中的溶液中，搅拌反应2小时。反应结束后将盛有混合溶液的烧瓶放入旋转蒸发仪中，温度设为80 ℃，直至溶液不再产生气泡时停止旋蒸，剩余液体即为制备的二硫物3,3’-二巯基二丙醇。采用红外光谱对3-巯基丙醇、产物3,3’-二巯基二丙醇进行测试表征，红外谱图见附图1、图2。从产物的红外谱图可以看出，硫氢键的特征红外吸收峰2568 cm^-1（S-H st）、908 cm^-1（S-H δ）消失，出现了二硫键的特征吸收峰642 cm^-1（S-S），产物的红外谱图与3,3’-二巯基二丙醇的标准谱图一致，表明氧化偶联反应成功。

实施例2

2-巯基-3-丁醇氧化偶联制备二硫物

在装有磁子、恒压漏斗的100 mL锥形瓶中加入7.433 g（0.070 mol，2.30 mol/L）2-巯基-3-丁醇的丁酮溶液，在恒压漏斗中加入浓度为30%的双氧水3.968 g（0.035 mol），将锥形瓶放入低温恒温槽中，控制反应温度在10℃，双氧水逐滴加入到锥形瓶中的溶液中，搅拌反应4小时。反应结束后加入1.988 g（0.014 mol）无水硫酸钠，无水硫酸钠吸水结晶，过滤收集滤液即得到二硫物2,2’-二巯基二-3-丁醇。采用红外光谱对2-巯基-3-丁醇、产物2,2’-二巯基二-3-丁醇进行测试表征，从产物的红外谱图可以看出，硫氢键的特征红外吸收峰2568 cm^-1（S-H st）、908 cm^-1（S-H δ）消失，出现了二硫键的特征吸收峰642 cm^-1（S-S），表明氧化偶联反应成功。

实施例3

3-巯基己醇氧化偶联制备二硫物

在装有磁子、恒压漏斗的100 mL锥形瓶中加入6.712 g（0.050 mol，2.20 mol/L）3-巯基己醇的丙酮溶液，在恒压漏斗中加入浓度为30 %的双氧水11.337 g（0.100 mol），将锥形瓶放入低温恒温槽中，控制反应温度在10℃，双氧水逐滴加入到锥形瓶中的溶液中，搅拌反应6小时。反应结束后将混合溶液进行减压蒸馏，在80℃温度下旋蒸至烧瓶中的溶液不再有起泡冒出为止，得到二硫物3,3’-二巯基二己醇。采用红外光谱对3-巯基己醇、产物3,3’-二巯基二己醇进行测试表征，从产物的红外谱图可以看出，硫氢键的特征红外吸收峰2568 cm^-1（S-H st）、908 cm^-1（S-H δ）消失，出现了二硫键的特征吸收峰642 cm^-1（S-S），表明氧化偶联反应成功。

实施例4

叶酸与3,3’-二巯基二丙醇的酯化反应

将0.221 g（0.5 mmol）叶酸、15 mL二甲基亚砜、0.103 g（0.5 mmol）N,N-二环己基碳二亚胺、磁子加入到50 mL的单口圆底烧瓶中，将烧瓶放入温度为20 ℃的水浴中，待叶酸、DCC完全溶于DMSO后，再加入0.365 g（2 mmol）实施例1制备的二硫物3,3’-二巯基二丙醇和少许催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌加热反应12 h。反应结束后将烧瓶中的混合溶液过滤，滤渣为白色粉末，收集橙红色滤液，将该滤液滴加至100 mL的蒸馏水中，有沉淀析出，将浑浊液转移至离心管中，在8000 rpm下离心10min，倒掉上清液，保留下层不溶物，再用蒸馏水洗涤、离心三次，放入真空干燥箱中干燥得到二硫物3,3’-二巯基二丙醇改性的叶酸衍生物。采用红外光谱对叶酸及产物进行测试表征，红外谱图见图3、图4。产物的红外谱图中出现了二硫键和酯羰基的特征吸收峰642 cm^-1（S-S）、1700 cm^-1（C=O），表明叶酸与3,3’-二巯基二丙醇成功地进行了酯化反应，得到了含二硫键的叶酸衍生物。

实施例5

叶酸与2,2’-二巯基二-3-丁醇的酯化反应

将0.441 g（1 mmol）叶酸、30 mL二甲基亚砜、0.284 g（2 mmol）无水硫酸钠、磁子加入到100 mL的单口圆底烧瓶中，将烧瓶放入温度为30 ℃的水浴中，待叶酸完全溶于DMSO后，再加入0.421 g（2 mmol）实施例2制备的2,2’-二巯基二-3-丁醇和少许催化剂苯乙烯系阳离子交换树脂，搅拌加热反应16小时。反应结束后将烧瓶中的混合溶液滴加到200 mL的蒸馏水中，有沉淀析出，将浑浊液转移至离心管中，在6000 rpm下离心15 min，倒掉上清液，保留下层不溶物，再用蒸馏水洗涤、离心三次，放入真空干燥箱中干燥得到2,2’-二巯基二-3-丁醇改性的叶酸衍生物。采用红外光谱对叶酸及产物进行测试表征，产物的红外谱图中出现了二硫键和酯羰基的特征吸收峰642 cm^-1（S-S）、1700 cm^-1（C=O），表明叶酸与2,2’-二巯基二-3-丁醇成功地进行了酯化反应，得到了含二硫键的叶酸衍生物。

实施例6

叶酸与3,3’-二巯基二己醇的酯化反应

将0.441 g（1 mmol）叶酸、40 mL二甲基亚砜、磁子加入到100 mL的单口圆底烧瓶中，将烧瓶放入温度为40 ℃的水浴中，待叶酸完全溶解后，再加入0.488 g（2 mmol）2,4,6-三氯苯甲酰氯，继续搅拌加热至2,4,6-三氯苯甲酰氯完全溶解，再加入1.066 g（4 mmol）实施例3制备的3,3’-二巯基二己醇和少许催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌加热反应20小时。反应结束后将烧瓶中的混合溶液滴加到150 mL的蒸馏水中，有沉淀析出，放置一夜，将浑浊液转移至离心管中，在10000 rpm下离心5分钟，倒掉上清液，保留下层不溶物，再用蒸馏水洗涤、离心三次，放入真空干燥箱中干燥得到3,3’-二巯基二己醇改性的叶酸衍生物。采用红外光谱对叶酸及产物进行测试表征，产物的红外谱图中出现了二硫键和酯羰基的特征吸收峰642 cm^-1（S-S）、1700 cm^-1（C=O），表明叶酸与3,3’-二巯基二己醇成功地进行了酯化反应，得到了含二硫键的叶酸衍生物。

实施例7

3-巯基丙醇改性叶酸的制备

将0.311 g（0.5 mmol）实施例4制备的3,3’-二巯基二丙醇改性的叶酸、15 mL二甲基亚砜、磁子加入到50 mL的圆底烧瓶中，烧瓶放入温度为40 ℃的水浴中，加热搅拌使该叶酸衍生物完全溶解，再加入0.308 g（2 mmol）二硫苏糖醇，继续加热搅拌反应12 h。反应结束后将混合溶液加入到100 mL蒸馏水中，有沉淀析出，将浑浊液转移至离心管中，在6000 rpm条件下离心20 min，倒掉上清液，保留下层不溶物，将不溶物用蒸馏水洗涤、离心三次，放入真空干燥箱中干燥，最终得到3-巯基丙醇改性的叶酸。分别采用红外光谱和核磁共振波谱对叶酸和产物进行测试表征，产物巯基化叶酸的红外谱图见图5，叶酸、产物巯基化叶酸的核磁谱图见图6、图7。同图3、图4相比，产物巯基化叶酸的红外谱图中出现了巯基的特征吸收峰2368 cm^-1（S-H），表明二硫键已打开还原为巯基，核磁共振测试结果（图6、图7）也证明了这一点，产物为3-巯基丙醇改性的叶酸衍生物。

实施例8

2-巯基-3-丁醇改性叶酸的制备

将0.325 g（0.5 mmol）实施例5制备的2,2’-二巯基二-3-丁醇改性的叶酸、15 mL二甲基亚砜、磁子加入到50 mL的圆底烧瓶中，烧瓶放入温度为40 ℃的水浴中，加热搅拌使该叶酸衍生物完全溶解，再加入0.202 g（1 mmol）三丁基磷，继续加热搅拌反应12 h。反应结束后将混合溶液加入到100 mL蒸馏水中，有沉淀析出，将浑浊液转移至离心管中，在8000 rpm条件下离心10分钟，倒掉上清液，保留下层不溶物，将不溶物用蒸馏水洗涤、离心三次，放入真空干燥箱中干燥，最终得到2-巯基-3-丁醇改性的叶酸。分别采用红外光谱和核磁共振波谱对叶酸和产物进行测试表征，结果表明，产物为2-巯基-3-丁醇改性的叶酸衍生物。

实施例9

3-巯基己醇改性叶酸的制备

将0.353 g（0.5 mmol）实施例6制备的3,3’-二巯基二己醇改性的叶酸、5 mL二甲基亚砜、磁子加入到50 mL的圆底烧瓶中，烧瓶放入温度为37 ℃的水浴中，加热搅拌使该叶酸衍生物完全溶解，再加入0.131 g（0.5 mmol）三苯基磷，继续加热搅拌反应12h。反应结束后将混合溶液加入到50 mL的蒸馏水中，有沉淀析出，将浑浊液转移至离心管中，在10000 rpm条件下离心5 min，倒掉上清液，保留下层不溶物，将不溶物用蒸馏水洗涤、离心三次，放入真空干燥箱中干燥，最终得到3-巯基己醇改性的叶酸衍生物。分别采用红外光谱仪和核磁共振波谱仪对叶酸和产物进行测试表征，结果表明，产物为3-巯基己醇改性的叶酸衍生物。

实施例10

巯基化叶酸对纳米银粒子的表面修饰

称取0.1 g实施例7制备的巯基化叶酸，加入到5 mL pH=7.5的稀氨水中，然后将巯基化叶酸溶液加入到60 mL 0.4 mM的纳米银溶液中，在常温下超声分散1 h，然后常温下静置24小时，使其充分自组装，得到巯基化叶酸修饰的纳米银溶液。取该溶液10 mL，在8000 rpm下离心10 min，去除上层清液，保留下层黑紫色固体，再用10 mL pH=7.5的稀氨水洗涤三次，去除游离的巯基化叶酸，最后得到的黑紫色固体即为巯基化叶酸修饰的纳米银。将得到的黑紫色固体超声分散于10 mL pH=7.5的稀氨水中，4℃下保存。采用X射线能谱仪和透射电镜对得到的产物进行测试表征，实验结果见图8、图9。结果表明，巯基化叶酸结合到纳米银粒子的表面，实现了对纳米银粒子的表面修饰。

Claims

1.一种巯基化叶酸的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：（1）采用双氧水作为氧化剂将带有羟基和巯基的双官能团化合物中的巯基氧化成二硫键得到多官能团二硫物，（2）将该二硫物同叶酸进行酯化反应，得到含二硫键的叶酸衍生物，（3）最后采用还原剂再将二硫键断裂，制备出含有游离巯基的叶酸衍生物。

2.权利要求1所述的一种巯基化叶酸的制备方法，其特征在于氧化反应中，巯基类化合物采用二硫赤藓醇、3-巯基-1,2-丙二醇、二巯基丙醇、3-巯基-1-己醇、2-巯基-3-丁醇或者巯基丙醇，巯基类化合物和氧化剂的摩尔比为1：（0.5 ~ 2），溶解巯基类化合物的溶剂为正己烷、乙醇、甲醇、丙酮、丁酮、乙睛或者乙醚，制备二硫物的反应温度为-10 ~ 10 ℃。

3.权利要求1所述的一种巯基化叶酸的制备方法，其特征在于酯化反应中，叶酸与二硫物的摩尔比为1：（1 ~ 4），反应温度为20 ~ 40 ℃。

4.权利要求1所述的一种巯基化叶酸的制备方法，其特征在于还原反应中，含二硫键的叶酸衍生物所采用的还原剂为二硫苏糖醇（DTT）、亚硫酸氢钠、三丁基磷、三羧乙基磷或者三苯基磷，该叶酸衍生物和还原剂的摩尔比为1：（1 ~ 4）。