CN104225595B

CN104225595B - 一种乳腺癌诊疗一体化纳米粒子及其制备方法

Info

Publication number: CN104225595B
Application number: CN201310222239.9A
Authority: CN
Inventors: 鞠熀先; 田蒋为; 丁霖; 于俊生; 沈珍
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2013-06-06
Filing date: 2013-06-06
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2033-06-06
Also published as: CN104225595A

Abstract

本发明涉及一种乳腺癌诊疗一体化纳米粒子(Apt‑TNP)及其制备方法。Apt‑TNP以聚乳酸‑聚乙二醇为载体，内部包埋酸性pH响应荧光探针BDP‑688及近红外光敏剂R16FP，表面共价偶联乳腺癌特异核酸适体制得。Apt‑TNP能特异结合乳腺癌细胞并到达溶酶体，溶酶体酸性pH环境触发BDP‑688产生荧光，实现癌细胞的精确成像；用808nm光激活R16FP产生活性氧，引发溶酶体内组织蛋白酶释放，使癌细胞凋亡，实现光动力学治疗；细胞凋亡过程伴随pH的变化，导致BDP‑688荧光减弱，实现疗效的实时监测。Apt‑TNP同时具备乳腺癌靶向成像、高效治疗及疗效监测功能，具有很好的临床应用潜力。

Description

一种乳腺癌诊疗一体化纳米粒子及其制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种乳腺癌诊疗一体化纳米粒子及其制备方法。

二、背景技术

传统的癌症诊断和治疗是两个独立过程，时间间隔长，易贻误最佳治疗时机，并导致疗效不佳或过度治疗，增加患者的痛苦和风险。为解决这一问题，将诊断和治疗两个过程合二为一而发展起来的诊疗一体化技术引起广泛关注。该技术可对疗效进行实时反馈，提高了诊治效率，减少了药物的毒副作用。然而，作为该技术核心之一---诊疗一体化试剂---的滞后严重限制了其发展。主要归因于：(1)诊疗一体化试剂缺乏特异的靶向性；(2)诊疗一体化试剂大多是将现有的诊断试剂和治疗药物进行简单组装，在功能上缺乏协同性；(3)诊疗一体化试剂很难对癌症的治疗效果进行准确、无损地快速实时监测。因此，开发新型的诊疗一体化试剂成为解决这一问题的关键，而这一试剂的开发需要充分考虑肿瘤细胞的生理学特征，并对诊断和治疗用的分子进行以功能为导向的设计和组装，提高诊疗效率。

首先要提高对癌细胞或癌组织的靶向性。核酸适体(aptamer)是能高特异性地结合某种生物靶标的单链寡核酸分子，它通过分子内碱基堆积、疏水相互作用、氢键和静电相互作用折叠形成独特的三维空间结构，与靶分子特异性结合。利用癌细胞及其表面靶分子筛选的核酸适体可对相应的癌细胞或癌组织进行选择性识别。

准确、无损地快速实时监测可通过原位荧光成像实现。理想的原位成像荧光探针应设计成“开-关”模式，即探针在正常组织中无荧光(荧光“关闭”)，而在肿瘤组织中产生强的荧光信号(荧光“打开”)。肿瘤细胞溶酶体内的pH(4.5-4.7)明显低于其它细胞器(细胞质，pH7.2)，设计的荧光探针在到达溶酶体可显示强的荧光，用于癌细胞/组织的靶向成像。而且，一旦肿瘤细胞凋亡或坏死，体系的pH升高，使探针的荧光减弱，从而可实现准确的疗效监测。

光动力治疗是一种肿瘤治疗的新手段。它用对人体组织穿透力较强的近红外光激发光敏剂，通过破坏癌细胞溶酶体而有效杀死癌细胞，进行癌症的选择性治疗。因此，溶酶体不仅是靶向成像与疗效监测的场所，也是癌症治疗的靶点，可将诊治功能有机结合。在光动力治疗过程中，随着溶酶体被破坏，其pH发生变化，这个过程可用pH触发型荧光探针进行检测，从而实现疗效的实时监测，为精准治疗提供依据。

三、发明内容

本发明的目的是：充分利用探针分子的化学性质及癌细胞的生理特征，以MDA-MB-231乳腺癌细胞系为模型，合成对乳腺癌细胞具有特异识别功能的核酸适体、酸性pH触发的荧光探针BDP-688和在近红外区有强吸收及高单线态氧量子产率的卟啉光敏剂R16FP，并以两亲性嵌段共聚物聚乳酸-聚乙二醇为纳米载体，利用纳米组装技术将三者有机结合，得到可用于MDA-MB-231乳腺癌靶向识别、高信噪比近红外荧光成像、光动力治疗以及疗效实时监测的诊疗一体化纳米粒子。

本发明提出的诊疗一体化纳米粒子如图1所示，以两亲性嵌段共聚物聚乳酸-聚乙二醇为载体，形成外层亲水、内层疏水的核-壳纳米结构，通过疏水作用将酸性BDP-688和R16FP包埋到疏水核内部，而核酸适体则通过共价键偶联到纳米粒子表面。

本发明通过以下技术方案来实现：

1)乳腺癌特异核酸适体是利用CELL-SELEX技术，以乳腺癌细胞MDA-MB-231为靶细胞，正常乳腺上皮细胞MCF-10A为反筛细胞，经过15轮筛选获得的。

2)酸性pH触发型近红外荧光探针BDP-688包含pH敏感基团(邻羟基苯胺基)和噻吩基融合的BODIPY荧光母体，其合成过程如图2所示。

3)近红外激活型卟啉光敏剂R16FP是一个在β位有菲环修饰和meso位有十六烷氧基苯修饰的卟啉环，其吸收峰在近红外区，合成过程如图3所示。

4)乳腺癌诊疗一体化纳米粒子Apt-TNP的制备首先用乳液/溶剂挥发法合成聚乳酸-聚乙二醇包埋BDP-688和R16FP的纳米粒子，再用5′端氨基修饰的乳腺癌核酸适体与纳米粒子表面的羧基偶联，如图1所示。

本发明的工作原理：

本发明的工作原理如图4所示，所述的诊疗一体化纳米粒子Apt-TNP在癌细胞外无荧光(pH7.4)。它在核酸适体的靶向识别作用下，特异性地与MDA-MB-231乳腺癌细胞表面受体结合，并经过受体介导的内吞途径到达溶酶体，在溶酶体内的低pH环境下，Apt-TNP内BDP-688上的氨基结合质子而触发其产生荧光，可对癌细胞进行精确成像定位。同时，在808nm近红外光的照射下，光敏剂R16FP被激活而产生大量的活性氧，破坏癌细胞的溶酶体，引发溶酶体组织蛋白酶释放，从而激活癌细胞凋亡或坏死途径，杀死癌细胞或使癌组织消亡。由于溶酶体维持其内部低pH环境依赖于其膜上消耗能量的质子泵，溶酶体的破坏也伴随着BDP-688所在环境的pH升高，使其荧光减弱，因而可对癌细胞的凋亡或癌组织的治疗效果进行实时监测。本发明通过有效整合核酸适体、BDP-688和R16FP，实现了对MDA-MB-231乳腺癌细胞(组织)的靶向成像、光动力治疗及疗效实时监测。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

本发明充分利用分子的化学性质及肿瘤细胞的生理学特征，制得的乳腺癌诊疗一体化纳米粒子能同时实现对乳腺癌细胞(组织)进行靶向识别、近红外荧光成像、光动力治疗以及疗效实时监测。相对于现有的诊疗一体化试剂，具有以下特点：

1.利用乳腺癌核酸适体对相应癌细胞表面受体的特异性识别，实现了诊疗一体化纳米粒子的靶向识别。

2.本发明涉及的荧光报告分子采用酸性pH触发型近红外荧光探针BDP-688，以BODIPY为荧光母体，摩尔吸收系数大，吸收和发射位于近红外区(最大吸收位于660nm，最大发射位于688nm)，降低了生物体自发荧光的干扰；所带有的pH敏感基团(邻羟基苯胺基)能以荧光“开-关”模式可逆地快速响应pH变化，实现对乳腺癌细胞(组织)的荧光成像定位。

3.本发明涉及的光敏剂R16FP吸收800-900nm的光后与溶解氧作用，高效产生活性氧，从而诱导癌细胞凋亡或坏死，实现癌组织的光动力学治疗。相对于现有的光敏剂，该光敏剂吸收明显红移。

4.本发明所述的Apt-TNP能对光动力学治疗过程中细胞内发生的pH变化进行实时监测，进而反映治疗效果。相对于现有的诊疗一体化试剂，它的开关功能和特异性靶向作用，具有明显优势。

四、附图说明

图1.乳腺癌诊疗一体化纳米粒子Apt-TNP的结构及合成示意图

图2.pH触发型近红外荧光探针BDP-688的合成示意图

图3.近红外激活型卟啉光敏剂R16FP的合成示意图

图4.诊疗一体化纳米粒子Apt-TNP用于乳腺癌细胞的靶向成像、光动力治疗以及疗效监测的工作原理图

五、具体实施方式

实施例1：体外筛选MDA-MB-231乳腺癌细胞特异性核酸适体：

利用CELL-SELEX技术，以乳腺癌细胞MDA-MB-231为靶细胞，正常乳腺上皮细胞MCF-10A为反筛细胞，经过15轮筛选得到乳腺癌细胞的核酸适体，经测序后进行该核酸适体的合成。

实施例2：结合图2，合成酸性pH触发型荧光探针BDP-688

1)化合物I合成：100mg2-(噻吩-2-yl)-4H-噻吩[3，2-b]并吡咯(化合物a)在氩气保护下溶于50mL二氯甲烷，避光搅拌溶解。向a溶液中加入41mg间硝基对羟基苯甲醛，1滴三氟乙酸(TFA)，室温下搅拌12小时。加入55mg2，3-二氯-5，6-二氰-1，4-苯醌(DDQ)，继续搅拌1小时，再加入3mL三乙胺(TEA)和3mL三氟化硼乙醚(BF₃·Et₂O)，搅拌3小时。加适量蒸馏水淬灭反应，过滤，收集滤液，用氯仿萃取，蒸馏水洗涤，有机层用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，柱色谱分离得到化合物I，产率53％。¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)分析结果：δ10.79(s，1H)，8.39(s，1H)，7.84(d，J＝7.1Hz，1H)，7.45(d，J＝4.9Hz，2H)，7.42(d，J＝3.3Hz，2H)，7.39-7.32(m，3H)，7.14-7.08(m，2H)，6.75(s，2H)。

2)BDP-688合成：88.1mg化合物I溶解于15mL甲醇/四氢呋喃/水(v/v/v＝7∶5∶3)混合溶剂中，加入112mg铁粉，加热回流。向反应体系中逐滴加入2mL0.6M盐酸溶液，继续加热回流。5小时后，加适量蒸馏水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，蒸馏水洗涤，有机层用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，柱色谱分离得到暗红色BDP-688，产率76％。¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)分析结果：δ7.41-7.39(m，4H)，7.35(s，2H)，7.12-7.06(m，2H)，7.01(s，1H)，6.92(d，J＝11.3Hz，3H)，6.85(d，J＝7.9Hz，1H).MS(MALDI-TOF)：m/z：574.076[M-H]⁺.

实施例3：结合图3，合成近红外光激活型光敏剂R16FP

217mg菲并[9，10-c]吡咯在氩气保护下溶于350mL干燥的二氯甲烷，搅拌使之溶解。将反应体系避光处理并冷却至-50℃，加入346mg4-十六烷氧基苯甲醛，搅拌过夜。向反应体系中加入40mL三氟化硼乙醚(BF₃·Et₂O)，搅拌反应2小时，然后反应体系恢复至室温，继续搅拌48小时。向溶液中加入227mg DDQ及3滴三乙胺(TEA)，搅拌反应1小时后减压除去有机溶剂，柱色谱分离，得到深红色固体。用氯仿/甲醇溶液重结晶，得到暗红色产物R16FP，产率13％。¹H-NMR(500MHz，CD₂C1₂)分析结果：δ8.43(d，J＝8.1Hz，4H)，7.74-7.59(m，8H)，7.35-7.17(m，8H)，7.04(d，J＝8.0Hz，8H)，6.92-6.77(m，8H)，4.10(d，J＝20.9Hz，8H)，1.89-1.80(m，28H)，1.48-1.16(m，104H)，0.87(t，J＝6.8Hz，12H).MS(MALDI-TOF)：m/z：2177[M].

实施例4：结合图1，合成诊疗一体化纳米粒子

20mg聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG-COOH)、0.3mg BDP-688和0.7mg R16FP溶于2mL二氯甲烷，搅拌并微热使之溶解。将该溶液滴入4mL含2％F-127的水溶液，超声30秒，形成乳液，与20mL含0.5％F-127的水溶液混合，磁力搅拌5分钟，旋转蒸发除去残余的有机溶剂。所制得的纳米粒子在14,000g高速离心15分钟，蒸馏水洗涤，得到包埋BDP-688和R16FP的纳米粒子。5mg/mL纳米粒子的水溶液与200mM碳二亚胺(EDC)、100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温反应30分钟，得到羟基丁二酰亚胺活化的纳米粒子，超滤除去残余的EDC和NHS。活化的纳米粒子与0.5mg/mL5′氨基修饰的核酸适体混合，磁力搅拌6小时，离心除去未反应的核酸适体，得到诊疗一体化纳米粒子，于4℃条件下保存。

Claims

1.一种乳腺癌诊疗一体化纳米粒子，其特征在于以两亲性嵌段共聚物聚乳酸-聚乙二醇为载体，表面有对乳腺癌细胞具有特异识别功能的核酸适体，内部包埋酸性pH触发型近红外荧光探针中位-(3-氨基-4-羟基苯基)联噻吩并吡咯氟化硼和近红外光激活型卟啉光敏剂5，10，15，20-四(对-十六烷氧基苯基)-菲并卟啉。

2.根据权利要求1所述的乳腺癌诊疗一体化纳米粒子，其特征在于同时具备乳腺癌靶向识别、酸性pH触发型荧光成像、近红外光动力治疗及疗效实时监测的功能。

3.根据权利要求2所述的乳腺癌诊疗一体化纳米粒子，其特征在于通过对纳米粒子进行乳腺癌细胞核酸适体的功能化实现对乳腺癌的靶向特异性。

4.根据权利要求2所述的乳腺癌诊疗一体化纳米粒子，其特征在于对乳腺癌细胞或组织成像与疗效监测是通过癌细胞微环境pH升高使酸性pH触发型近红外荧光探针的荧光发生变化实现的；所述荧光探针的分子结构如下：

5.根据权利要求2所述的乳腺癌诊疗一体化纳米粒子，其特征在于对乳腺癌的光动力治疗是通过近红外光激活卟啉光敏剂产生活性氧，进而引发溶酶体内组织蛋白酶释放，激活癌细胞凋亡或坏死途径来实现的；所述近红外光激活型卟啉光敏剂的分子结构如下：