CN101411879B - SiO2/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种SiO₂/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物，所述复合物是将SiO₂/Au核壳结构纳米材料通过Au-S键嫁接生物蛋白药物，并通过硫烷聚乙二醇封闭SiO₂/Au核壳结构纳米材料的剩余的非活性位点。其制备方法包括：(1)将氨基聚乙二醇与2-亚氨基硫烷按摩尔比1：1在碳酸钾溶液中反应1h，将反应物用二次蒸馏水透析提纯，得到硫烷聚乙二醇；(2)取SiO₂/Au核壳结构纳米材料、生物蛋白药物和2-亚氨基硫烷在碳酸钾溶液中混合，静置过夜，加入步骤(1)所得的硫烷聚乙二醇，在弱碱性的缓冲溶液条件下反应，得到复合物。本发明复合了无机纳米粒子的物理治疗与蛋白药物的生物治疗作用，显著提高了对肿瘤的治疗效果，可以作为一种新的抗癌药物。

Description

SiO2/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种SiO₂/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物及其制备方法，属于生物纳米技术领域。

背景技术

近年来，纳米技术在生物医药学方面的应用有着十分重要的地位及美好前景，纳米技术在生物医药学领域的应用主要包括如下几个领域：药物释放与靶向定位；细胞与蛋白质检测；疾病诊断与治疗；医用纳米机器人等。

核壳结构贵金属纳米材料近红外吸收特性的发现，引起了物理、化学、生物学等相关领域的广泛重视，使人们看到了金属纳米材料在生物医学领域里的广阔的应用前景。近红外区(800-1200nm)是肌体组织的透射窗口，近红外激光对人体的伤害与其它波段的激光相比要小得多。应用纳米技术制成的核壳结构纳米材料可吸收近红外光并把光转化为热。基于这个思路，世界上研究较多的是将核壳结构纳米金属组装为纳米给药系统并被肿瘤组织吸收并滞留，给药后在肿瘤部位进行近红外光照射。经近红外激光照射后，金属纳米材料将吸收的光能转化成热能，使局域范围内的温度升高，以杀死肿瘤细胞(肿瘤细胞在42℃左右可被杀死)。另外，将核壳结构纳米金属与抗体结合，赋予这种光热治疗肿瘤的纳米材料一定的靶向性，以提高抗癌效果。

一直以来，临床上癌症的治疗方案都是以手术、放疗、化疗为主。上个世纪70年代美国科学家提出了癌症的“饿死学说”，即通过阻断肿瘤新生血管的生成，切断肿瘤的营养供给，达到遏制肿瘤侵袭、复制和转移的目的。美国科学家Judah Folkman教授课题组首次发现一种叫做Endostatin(血管内皮抑制素)的蛋白质，具有强烈抑制新生血管生成的作用以及一定的靶向识别作用，然而在小鼠体内试验成功后却无法攻克蛋白质复性的难关，无法实现Endostatin的大规模生产。1999年末罗永章博士在新成立的烟台麦得津生物工程股份有限公司首次将Endostatin大规模成功复制，并通过改变氨基酸序列显著提高该蛋白的药用性和疗效，之后将其命名为Endostar即恩度。经过一系列技术攻关，于2005年9月12日被国家食品药品监督管理局批准为生物制品一类抗肿瘤新药，成为世界上首例血管内皮抑制素抗癌新药。“恩度”这一国家一类新药，在世界抗肿瘤领域占据绝对的领先地位。然而目前恩度的使用都是配用其它常规药物以期增强药效，还未见有将恩度药物与无机纳米材料复合使用的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种SiO₂/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物。

本发明的另一目的在于提供一种上述复合物的制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明提供的一种SiO₂/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物是将SiO₂/Au核壳结构纳米材料通过Au-S键嫁接生物蛋白药物，并通过硫烷聚乙二醇封闭SiO₂/Au核壳结构纳米材料的剩余的非活性位点，以增加体系的生物相容性，延长药物在体内的循环时间。

上述复合物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：

(1)将氨基聚乙二醇(PEG-NH₂)与2-亚氨基硫烷按摩尔比1：1在碳酸钾溶液中反应1～2h，将反应物用水透析提纯，得到硫烷聚乙二醇(PEG-SH)；

(2)取SiO₂/Au核壳结构纳米材料、生物蛋白药物和偶联剂在碳酸钾溶液中混合，静置过夜，加入步骤(1)所得的硫烷聚乙二醇，在弱碱性的缓冲溶液条件下反应1～2h，得到SiO₂/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物。

步骤(1)所述氨基聚乙二醇(PEG-NH₂)的制备方法包括以下操作步骤：将100mL环氧乙烷溶于50mL的四氢呋喃(THF)溶液中，加入76mL浓度为0.5mol/L的双(三甲基硅烷基)氨基钾甲苯溶液中，在氮气保护条件下，于18～25℃搅拌72～96h，加入1mL浓度为1mol/L的盐酸，将上述混合液倒入500～800mL二乙醚中，将沉淀物用二乙醚洗涤后真空干燥，得到分子量为4800～5200的氨基聚乙二醇。

步骤(2)所述生物蛋白药物是血管内皮抑制素；所述偶联剂的一端能够和蛋白质偶合，另一端含有巯基-SH或者S-S键能够与金属偶合，优选2-亚氨基硫烷、正吡啶基二硫化物-聚乙二醇-N-羟基琥珀亚酰胺；所述缓冲溶液是磷酸盐(PBS)缓冲液；所述SiO₂/Au核壳结构纳米材料、生物蛋白药物和偶联剂的摩尔比为1：100～200：100～200。

步骤(2)所述SiO₂/Au核壳结构纳米材料的制备方法包括以下步骤：

a、单分散的二氧化硅纳米粒子的制备：在磁力搅拌作用下，将体积比为20：50：3：10的水、无水乙醇、正硅酸乙酯和氨水混合反应，得到粒径为110～120nm的单分散的二氧化硅纳米粒子；

b、氨基化的二氧化硅纳米粒子的制备：将步骤a所得二氧化硅纳米粒子分散于17～19mL无水乙醇中，加入70～90μL氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，搅拌，静置8h，水浴煮沸，离心洗涤，得到氨基化的二氧化硅纳米粒子；

c、二氧化硅金种溶液的制备：将粒径为1～2nm金胶体与步骤b所得氨基化的二氧化硅纳米粒子混合，触点超声30s，于2～8℃沉化8h，离心洗涤，分散于18mL水中，得到二氧化硅金种溶液；

d、SiO₂/Au核壳结构纳米材料的制备：将40～60mg无水碳酸钾溶于200ml高纯水中，加入3mL浓度为25mmol/L的氯金酸溶液，沉化8h，得到氯金酸/碳酸钾沉化液；取体积比为1：1000的二氧化硅金种溶液和氯金酸/碳酸钾沉化液混合，加入还原剂，得到粒径为130～150nm的SiO₂/Au核壳结构纳米材料。

步骤d所述还原剂是甲醛、硼氢化钠、盐酸羟胺、四羟甲基氯化磷或抗坏血酸。

步骤d所述氯金酸和还原剂的摩尔比为1：100～300。控制氯金酸与还原剂的用量比，可以实现光学性质在近红外光区的调节。

上述方法制备的SiO₂/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物可用于制备抗癌药物。

本发明的原理是：首先使用St

ber法制备了单分散的纳米二氧化硅球，然后将氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)嫁接到二氧化硅球表面，在二氧化硅表面覆盖约为5-10层，其向外伸出的胺基作为氧化硅表面新的功能基团。洗涤后，加入细小的金胶体溶液(1-2nm)，SiO₂核球表面来自于APTMS中的-NH₂基通过静电作用吸附金胶体并作为金种，形成金的成核与还原部位。随后，通过加入还原剂引发HAuCl₄还原反应，生成的Au在金种部位不断生长、相连，最终在二氧化硅球表面形成完整的包覆金壳层，形成的纳米壳层连续性好、致密度高。然后将生物蛋白药物使用简单的偶联剂2-亚氨基硫烷嫁接到SiO₂/Au纳米核壳结构表面，2-亚氨基硫烷(2-iminothiolane)是常用的多肽药物偶联剂，蛋白质或者多肽上的NH₂首先进攻2-亚氨基硫烷中的C⁺，使之开环放出巯基，而多肽则连接在C⁺一端。释放出的巯基可以很容易偶联到金纳米壳层表面，最后用PEG-SH封闭SiO₂/Au上的残余非活性位点，增加体系的生物相容性，。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：(1)本发明提供了一种SiO₂/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物，复合了无机纳米粒子的物理治疗与蛋白药物的生物治疗作用，显著提高了对肿瘤的治疗效果，可以作为一种新的抗癌药物；(2)本发明使用简单的方法制成了包裹紧密、分布均匀的SiO₂/Au纳米核壳结构，通过简单可行的方法调谐其表面等离子共振吸收峰位在近红外光区移动；(3)充分利用我国恩度等生物蛋白药物在世界占据领先地位这一优势，将恩度药物的饿杀癌细胞作用与SiO₂/Au核壳结构的光热治疗肿瘤的作用复合到一起，填补了恩度药物在使用上与无机纳米材料复合这一项空白；(4)使用最简单的蛋白偶联剂(2-亚氨基硫烷)将蛋白药物嫁接到SiO₂/Au纳米核壳结构上，为实现以后更多的生物药物与无机纳米材料复合提供了简单、可行的方案。

附图说明

图1是粒径为120nm的氨基化的二氧化硅纳米粒子的透视电镜(TEM)形貌图。

图2是二氧化硅金种的透视电镜(TEM)形貌图；

图3是SiO₂/Au纳米核壳结构的透视电镜(TEM)形貌图；

图4是氯金酸与甲醛的摩尔比为1:100时制备的SiO₂/Au纳米核壳结构纳米材料的表面等离子共振吸收光谱图。

图5是氯金酸与甲醛的摩尔比不同时制备的SiO₂/Au纳米核壳结构纳米材料-恩度复合物的表面等离子共振吸收光谱图。

图6是SiO₂/Au核壳结构纳米粒子与SiO₂/Au-血管内皮抑制素复合粒子对A549肺腺癌细胞增殖的抑制率曲线图。

图7是SiO₂/Au-血管内皮抑制素复合粒子作用体外细胞48小时后经808nm红外光照射7分钟后的原子力显微镜图，其中：左图为正常细胞，中图为经浓度为1mg/L的SiO₂/Au-血管内皮抑制素复合粒子作用的细胞，右图为经浓度为3mg/L的SiO₂/Au-血管内皮抑制素复合粒子作用的细胞。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例1

SiO₂/Au核壳结构纳米材料的制备

a、单分散的纳米二氧化硅球的制备：取10ml高纯水加入到三角烧瓶中，加入25ml无水乙醇，5ml氨水，磁力搅拌均匀后加入1.5ml正硅酸乙酯，室温下搅拌12h，得到粒径为120nm的SiO₂纳米粒子；

b、氨基化的二氧化硅纳米粒子的制备：加入80ul氨丙基三甲氧基硅烷，搅拌10min，静置8h，水浴煮沸2h，以6000r/min的转速离心洗涤，得到氨基化的二氧化硅纳米粒子，TEM形貌图如图1所示，分布较均匀；

c、二氧化硅金种溶液的制备：将粒径为1-2nm金胶体与步骤b所得氨基化的二氧化硅纳米粒子混合，触点超声30s，于4℃下沉化8h，以3000r/min的转速离心洗涤，得到浓度为3.89×10¹²ml^-1的二氧化硅金种溶液，TEM形貌图如图2所示，可以清楚的看到细小的金纳米胶体均匀吸附在SiO₂表面，提供进一步包金所需的成核位点；

d、SiO₂/Au核壳结构纳米材料的制备：将200ml高纯水中加入50mg无水碳酸钾，然后加入3ml 25mmol/L的HAuCl₄溶液沉化8h，得到氯金酸/碳酸钾沉化液；取25uL步骤c所得二氧化硅金种溶液与24mL氯金酸/碳酸钾沉化液混合后，加入甲醛，所述氯金酸和甲醛的摩尔比为1：100，片刻即可观察到颜色变化，得到SiO₂/Au核壳结构纳米材料，TEM形貌图如图3所示；测定其表面等离子共振吸收光谱如图4所示，可以看到在近红外区出现较宽吸收峰，最高峰位在824nm处。

SiO₂/Au核壳结构纳米材料-血管内皮抑制素复合物的制备：

(1)将100mL环氧乙烷溶于50mL THF中，加入0.5M溶在甲苯溶液中的双(三甲基硅烷基)氨基钾76mL，混合液在氮气保护下，于20℃搅拌96h后，用1N的盐酸处理，将混合液倒入500mL二乙醚中，将沉淀物用二乙醚洗涤并真空干燥，得到分子量为4800-5200的氨基聚乙二醇；

(2)将氨基聚乙二醇与2-亚氨基硫烷按摩尔比1：1在碳酸钾水溶液中反应1h，将反应物用二次蒸馏水透析提纯，得到硫烷聚乙二醇；

(3)取SiO₂/Au核壳结构纳米材料、血管内皮抑制素和2-亚氨基硫烷在碳酸钾溶液中混合，其中SiO₂/Au、血管内皮抑制素与2-亚氨基硫烷反应的摩尔比为1：100：100，静置过夜，加入步骤(2)所得的硫烷聚乙二醇，在弱碱性的PBS缓冲溶液种反应，得到SiO₂/Au核壳结构纳米材料-血管内皮抑制素复合物。

将上述表面修饰好的样品真空干燥后，进行红外吸收光谱测定，可以确认恩度药物血管内皮抑制素已被成功嫁接到SiO₂/Au纳米核壳结构上。

将产物用PBS缓冲液洗涤，最后分散于PBS缓冲液中，4℃保存。

实施例2

步骤d采用氯金酸与甲醛的摩尔比分别为1:100、1:150、1:200、1:250；或1:300，其余步骤同实施例1，所得产物SiO₂/Au核壳结构纳米材料-恩度复合物测得表面等离子共振吸收光谱如图5所示，发现产物的吸收峰随着还原剂甲醛用量的提高而向长波方向移动，吸收峰红移了130nm。曲线a、b、c、d和e分别代表氯金酸与甲醛的摩尔比分别为1:100、1:150、1:200、1:250和1:300时的吸收曲线，说明此反应可进一步通过调节还原速率控制吸收峰位置，该现象未见文献报道。

实施例3

将实施例1所得SiO₂/Au-血管内皮抑制素复合物用于进行体外肺癌细胞杀灭试验：使用波长为808nm红外激光器，照射时间为7分钟，肺癌细胞抑制率采用MTT法测得，结果如图6所示：当用单纯SiO₂/Au核壳结构纳米材料进行体外肺癌细胞杀灭试验时，其对肺癌细胞的抑制率为30％；而SiO₂/Au核壳结构纳米材料-血管内皮抑制素复合物进行体外肺癌细胞杀灭试验时，其在相同条件下对肺癌细胞的抑制率提高到88％。可见，SiO₂/Au-血管内皮抑制素复合物对体外癌细胞的抑制率确实有非常显著的效果。

实施例4

将实施例1所得SiO₂/Au-血管内皮抑制素复合物作用体外细胞48小时后，经808nm红外光照射7分钟后，将体外细胞用原子力显微镜观察，如图7所示，左图为正常细胞，中图为经浓度为1mg/L的SiO₂/Au-血管内皮抑制素复合粒子作用的细胞，右图为经浓度为3mg/L的SiO₂/Au-血管内皮抑制素复合粒子作用的细胞，可以看出在灭杀试验前细胞表面光滑、平整；而在用SiO₂/Au-血管内皮抑制素复合纳米药物试验后，细胞变得坑洼，皱缩，细胞边缘绒毛掉落，当提高药物浓度时，细胞甚至出现孔洞，呈现死亡状态。所以SiO₂/Au-血管内皮抑制素复合粒子对癌细胞的抑制除具有一定的时间依赖性，还具有一定的浓度依赖性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种SiO₂/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物，其特征在于：所述复合物是将SiO₂/Au核壳结构纳米材料通过Au-S键嫁接生物蛋白药物，并通过硫烷聚乙二醇封闭SiO₂/Au核壳结构纳米材料的剩余的非活性位点，所述生物蛋白药物是血管内皮抑制素；所述复合物是由包括以下操作步骤的方法制备得到的：

(1)将氨基聚乙二醇与2-亚氨基硫烷按摩尔比1∶1在碳酸钾溶液中反应1～2h，将反应物用水透析提纯，得到硫烷聚乙二醇；

(2)取SiO₂/Au核壳结构纳米材料、生物蛋白药物和偶联剂在碳酸钾溶液中混合，静置过夜，加入步骤(1)所得的硫烷聚乙二醇，在弱碱性的缓冲溶液条件下反应1～2h，得到SiO₂/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物，所述生物蛋白药物是血管内皮抑制素。

2.根据权利要求1所述的复合物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：

(1)将氨基聚乙二醇与2-亚氨基硫烷按摩尔比1∶1在碳酸钾溶液中反应1～2h，将反应物用水透析提纯，得到硫烷聚乙二醇；

(2)取SiO₂/Au核壳结构纳米材料、生物蛋白药物和偶联剂在碳酸钾溶液中混合，静置过夜，加入步骤(1)所得的硫烷聚乙二醇，在弱碱性的缓冲溶液条件下反应1～2h，得到SiO₂/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物，所述生物蛋白药物是血管内皮抑制素。

3.根据权利要求2所述的复合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述氨基聚乙二醇的制备方法包括以下操作步骤：将100mL环氧乙烷溶于50mL的四氢呋喃溶液中，加入76mL浓度为0.5mol/L的双(三甲基硅烷基)氨基钾甲苯溶液中，在氮气保护条件下，于18～25℃搅拌72～96h，加入1mL浓度为1mol/L的盐酸，将上述混合液倒入500～800mL二乙醚中，将沉淀物用二乙醚洗涤后真空干燥，得到分子量为4800～5200的氨基聚乙二醇。

4.根据权利要求2所述的复合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述偶联剂是2-亚氨基硫烷或正吡啶基二硫化物-聚乙二醇-N-羟基琥珀亚酰胺；所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求2所述的复合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述SiO₂/Au核壳结构纳米材料、生物蛋白药物和偶联剂的摩尔比为1∶100～200∶100～200。

6.根据权利要求2所述的复合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述SiO₂/Au核壳结构纳米材料的制备方法包括以下步骤：

a、单分散的二氧化硅纳米粒子的制备：在磁力搅拌作用下，将体积比为20∶50∶3∶10的水、无水乙醇、正硅酸乙酯和氨水混合反应，得到单分散的二氧化硅纳米粒子；

b、氨基化的二氧化硅纳米粒子的制备：将步骤a所得二氧化硅纳米粒子分散于17～19mL无水乙醇中，加入70～90μL氨丙基三甲氧基硅烷，搅拌，静置8h，水浴煮沸，离心洗涤，得到氨基化的二氧化硅纳米粒子；

c、二氧化硅金种溶液的制备：将粒径为1～2nm的金胶体与步骤b所得氨基化的二氧化硅纳米粒子混合，触点超声30s，于2～8℃沉化8h，离心洗涤，得到二氧化硅金种溶液；

d、SiO₂/Au核壳结构纳米材料的制备：将40～60血g无水碳酸钾溶于200ml高纯水中，加入3mL浓度为25mmol/L的氯金酸溶液，沉化8h，得到氯金酸/碳酸钾沉化液；取体积比为1∶1000的二氧化硅金种溶液和氯金酸/碳酸钾沉化液混合，加入还原剂，得到SiO₂/Au核壳结构纳米材料。

7.根据权利要求6所述的复合物的制备方法，其特征在于：步骤a所得二氧化硅纳米粒子的粒径为110～120nm；步骤d所得SiO₂/Au核壳结构纳米材料粒径为130～150nm。

8.根据权利要求6所述的复合物的制备方法，其特征在于：步骤d所述还原剂是甲醛、硼氢化钠、盐酸羟胺、四羟甲基氯化磷或抗坏血酸。

9.根据权利要求6或8所述的复合物的制备方法，其特征在于：步骤d所述氯金酸和还原剂的摩尔比为1∶100～300。

10.根据权利要求1所述的复合物作为制备抗癌药物的用途。

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