CN103396557B

CN103396557B - 一种多功能阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用

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Publication number: CN103396557B
Application number: CN201310342956.5A
Authority: CN
Inventors: 周建平; 王伟; 鲍秀丽; 王玉; 丁学芳; 丁杨
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2013-08-08
Filing date: 2013-08-08
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2033-08-08
Also published as: CN103396557A

Abstract

本发明涉及一种多功能阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用，所述多功能阳离子聚合物以低分子量壳聚糖为骨架材料，经高碘酸钾氧化后与偶联有沙坦类药物的聚乙烯亚胺通过还原氨化反应合成。本发明所要解决的技术问题是提供一种新型的具有肿瘤细胞AT₁受体靶向性、多重质子缓冲能力、辅助肿瘤治疗作用的阳离子聚合物，并提供一种条件温和、成本低廉、适用可靠的上述阳离子聚合物的制备方法。本发明提供的阳离子聚合物与质粒DNA形成的复合物具有细胞毒性低、靶向性好、转染效率高、体外抗肿瘤效果显著等优点，该聚合物可用于制备同时传输基因药物与化学药物以协同治疗肿瘤的非病毒基因传输系统。

Description

一种多功能阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及阳离子聚合物基因载体和基因治疗领域，具体涉及一种多功能阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用。

背景技术

基因治疗是指将人体正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等，从而达到治病的目的。

目前常用的基因载体包括病毒载体和非病毒基因载体两类。病毒载体往往具有较高的转染效率，但因其高免疫原性、靶向性差、基因装载量有限、体内不能重复使用、制备复杂、引起细胞恶性转化和可能导致感染的潜在危险，临床应用受到很大限制。而非病毒基因载体因其具有免疫原性低、低毒、对外源基因的装载量大、易于组装等优势，已成为体外基因转染的重要手段。但非病毒载体的转染效率比病毒载体的低很多，体内应用还存在许多障碍，因此构建具有较高转染效率、特异靶向性和良好安全性的基因载体显得十分迫切。

壳聚糖(Chitosan，CS)是一种天然碱性阳离子多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性，用作基因载体的研究已有大量报道，但大多采用高分子量壳聚糖。高分子量壳聚糖可降解为低分子量壳聚糖，所得低分子量壳聚糖链长度缩短，分子构象发生变化，分子内的氢键作用减弱。因此，低分子量壳聚糖具有粘度低、粒径易控、水溶性好等优点；应用于体内转染时，在高浓度溶液中的自聚倾向小；更重要的是，其比高分子量壳聚糖更容易释放质粒DNA，因此可获得更高的转染效率。所以，低分子量壳聚糖可作为良好的基因载体用于基因转染。

聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)是目前应用较为广泛的一类非病毒基因载体，其中高分子量聚乙烯亚胺由于其高的电荷密度和强的内涵体/溶酶体逃逸能力，在多种细胞中显示出较高的转染效率，但同时也具有较高的细胞毒性；低分子量聚乙烯亚胺细胞毒性小，但其转染效率低下。为进一步提高其转染效率同时降低细胞毒性，有研究者在高分子量聚乙烯亚胺上引入可降解的小分子材料以降低其细胞毒性；或用可降解的交联键将小分子量聚乙烯亚胺连接起来形成含低分子量聚乙烯亚胺的大分子作为基因载体，进而降低细胞毒性，提高基因转染效率。此外也有研究者将壳聚糖与低分子量聚乙烯亚胺连接起来形成接枝共聚物，虽然该载体具有较低的细胞毒性、较高的基因转染效率，但该载体的细胞靶向性差，所以要对其进行修饰，以提高其特异性和转染效率。

近年来研究表明，乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等组织细胞高表达血管紧张素II1型受体(AT₁受体)。沙坦类药物如奥美沙坦、缬沙坦、坎地沙坦等，是一种特异性的AT₁受体拮抗剂，能够和肿瘤细胞表面的AT₁受体特异性结合，并起到减少血管内皮生长因子生成、抑制肿瘤生长、侵袭和转移的效果，在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。此外，沙坦类药物结构中的咪唑环和四氮唑环含有丰富的仲胺和叔胺，在酸性条件下具有质子海绵效应，而且，沙坦类药物结构中的羧基官能团为其连接高分子聚合物提供了可行性。

综上所述，本发明以低分子量壳聚糖为骨架材料，经高碘酸钾氧化后与偶联有沙坦类药物的聚乙烯亚胺通过还原氨化反应合成了优良的壳聚糖-g-聚乙烯亚胺-沙坦类药物阳离子聚合物，该聚合物作为基因载体具有以下特征：1)该聚合物中的沙坦类药物可特异性的和肿瘤细胞表面的AT₁受体结合，促进细胞膜对其内吞，实现对肿瘤细胞的高效靶向转染。2)沙坦类药物的质子海绵效应增强了该聚合物的质子缓冲能力，提高了其内涵体/溶酶体逃逸能力，有利于实现质粒DNA的胞内递送。3)该聚合物利用沙坦类药物的药理作用，起到辅助治疗肿瘤的作用。本发明通过纳米技术将基因药物与沙坦类药物载于同一纳米载体中，为肿瘤的基因药物与化学药物的联合治疗提供了一种全新的思路。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种具有AT₁受体靶向性、多重质子缓冲能力、辅助肿瘤治疗作用的多功能阳离子聚合物，同时该聚合物具有生物相容性好、组织细胞毒性低等优点，可充分提高基因表达效率和基因靶向传输。

本发明的目的之二在于提供上述多功能阳离子聚合物的制备方法，该方法条件温和、成本低廉、适用可靠。

本发明的目的之三在于提供上述多功能阳离子聚合物在制备基因药物与化学药物联合给药的非病毒基因传递系统中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种多功能阳离子聚合物，具体地，所述多功能阳离子聚合物为壳聚糖-g-聚乙烯亚胺-沙坦类药物阳离子聚合物，其中主链壳聚糖的分子量为10～50kDa，脱乙酰度为80～90％；聚乙烯亚胺为支链型，分子量为1800；沙坦类药物在聚乙烯亚胺上的取代度为6.76～20％，沙坦类药物-聚乙烯亚胺偶联物在主链壳聚糖上的接枝率为4～20％。

优选的：

所述沙坦类药物为奥美沙坦、缬沙坦、坎地沙坦或替米沙坦。

更优选的：

所述沙坦类药物为坎地沙坦。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：上述多功能阳离子聚合物的制备方法，包括以下步骤：

1)分别将沙坦类药物、碳二亚胺类缩合剂及酰化活化剂溶于N，N-二甲基甲酰胺中，将碳二亚胺类缩合剂及酰化活化剂的溶液逐滴加入到沙坦类药物的溶液中，室温下磁力搅拌反应1h，得到活化的沙坦类药物；

2)将聚乙烯亚胺溶于适当混合溶剂，滴加上述活化的沙坦类药物溶液于聚乙烯亚胺溶液中，室温下磁力搅拌反应24h，加入丙酮沉淀产物，沉淀物用水溶解，将所得溶液在去离子水中透析24h，冻干，得到沙坦类药物-聚乙烯亚胺偶联物；

3)将壳聚糖、高碘酸钾分别溶于pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，溶液混合前，先用N₂除气，并调整至4℃，混合后的溶液在该温度下磁力搅拌反应24h，添加乙二醇终止反应，将反应溶液在pH4.5的0.2MNaCl去离子水溶液中透析24h，接着在pH4.5的去离子水中透析24h，冻干，得到活性中间体氧化壳聚糖；

4)将上述沙坦类药物-聚乙烯亚胺偶联物及活性中间体氧化壳聚糖分别溶于去离子水中，两溶液混合后在室温下磁力搅拌反应48h，反应结束后，用硼氢化钠处理溶液，将反应溶液在pH4.5的0.2MNaCl去离子水溶液中透析24h，接着在pH4.5的去离子水中透析24h，冻干，得到终产物壳聚糖-g-聚乙烯亚胺-沙坦类药物阳离子聚合物。

优选的：

步骤1)中所述的碳二亚胺类缩合剂及酰化活化剂分别为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；所述的沙坦类药物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1∶1～5∶1～5。

步骤2)中所述的沙坦类药物与聚乙烯亚胺结构中游离氨基的摩尔比为1∶1～8；所述的混合溶剂为水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂，混合比例为1∶1～5。

步骤3)中所述的高碘酸钾与壳聚糖单元的摩尔比小于2∶1。

步骤4)中所述的沙坦类药物-聚乙烯亚胺偶联物含有游离氨基的结构单元与活性中间体氧化壳聚糖含有游离醛基的结构单元的摩尔比为1∶1.5～6；所述的透析袋的截留分子量为3500；所述的活性中间体氧化壳聚糖的氧化度为15％～50％。

本发明的第三个目的是提供上述多功能阳离子聚合物在制备基因药物与化学药物联合给药的非病毒基因传递系统中的应用。

优选的：

用于非病毒基因传递系统的质粒DNA为含报告基因或治疗基因的能在真核细胞中表达的质粒DNA。

本发明提供的阳离子聚合物可与质粒DNA形成纳米复合物，能保护质粒DNA免受核酸酶的降解，经细胞毒性实验和体外细胞转染实验证明，不仅细胞毒性小，而且可高效靶向转染。

本发明提供的聚合物/DNA复合物在体外可显著抑制肿瘤细胞的生长，非常适于作为基因载体应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)本发明提供的阳离子聚合物中沙坦类药物可与肿瘤细胞表而的AT₁受体特异性结合，使得该基因载体对高表达AT₁受体的肿瘤细胞具有靶向效果；

2)本发明提供的阳离子聚合物中壳聚糖和聚乙烯亚胺均含有大量的氨基，在酸性条件下能吸收H⁺而被质子化，具有质子海绵效应，再加之沙坦类药物的质子海绵效应，使得该阳离子聚合物的质子缓冲能力大大增强，提高了其逃逸内涵体/溶酶体的能力；

3)本发明提供的阳离子聚合物以低分子量壳聚糖作为主链，不但克服了高分子量壳聚糖难溶于水的缺陷，减少了对组织、细胞的刺激；而且改善了高分子量壳聚糖包裹DNA时因DNA难以释放而致转染效率低的现状。加之低分子量聚乙烯亚胺较低的细胞毒性、强的细胞粘附性及保护DNA不受酶降解的特性，最终该基因载体的转染效率得以提高；

4)本发明提供的阳离子聚合物可与含治疗基因的质粒DNA形成稳定的纳米给药系统，该纳米给药系统同时运载了基因药物与沙坦类药物，不但可以实现肿瘤的低毒、靶向、高效治疗，而且为肿瘤的基因药物与化学药物联合治疗提供一种新思路。

附图说明

图1为实施例一中阳离子聚合物壳聚糖-g-聚乙烯亚胺-坎地沙坦(CS-g-PEI-CD，CPC)的合成路线图；

图2为实施例一中CD及CD-PEI、CS及O-CS、CPC的¹H-NMR图谱；

图3为实施例二中CS-PEI、CPC、PEI25k的缓冲能力示意图；

图4为实施例三中CPC/DNA复合物的凝胶阻滞实验电泳图片；

图5为实施例四中CPC/DNA复合物的核酸酶降解实验电泳图片；

图6为实施例六中CS-PEI、CPC、PEI25k对MCF-7细胞及PANC-1细胞的毒性测定结果图；

图7为实施例七中CS-PEI/DNA、CPC/DNA、PEI25k/DNA、Lipofectamine^TM2000/DNA复合物在MCF-7细胞中的转染结果；

图8为实施例七中CS-PEI/DNA、CPC/DNA、PEI25k/DNA、Lipofectamine^TM2000/DNA复合物在PANC-1细胞中的转染结果。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：阳离子聚合物壳聚糖-g-聚乙烯亚胺-坎地沙坦(CS-g-PEI-CD，CPC)的合成

1)坎地沙坦(Candesartan，CD)的活化

称取0.0264g坎地沙坦溶于2mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，另称取2倍摩尔量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)及3倍摩尔量N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在4mlDMF中，将其逐滴加入到坎地沙坦溶液中，室温下磁力搅拌反应1h，得到活化的坎地沙坦。

2)坎地沙坦-聚乙烯亚胺偶联物(CD-PEI)的合成

称取0.0568g聚乙烯亚胺溶于6ml水-N，N-二甲基甲酰胺(1∶2)混合溶剂中，滴加上述坎地沙坦的活化溶液于聚乙烯亚胺溶液中，室温下磁力搅拌反应24h，加入丙酮沉淀产物，用水溶解沉淀物，蒸馏水透析24h，冷冻干燥，得到坎地沙坦-聚乙烯亚胺偶联物(CD-PEI)。

3)壳聚糖(CS)的氧化

称取0.1000g壳聚糖，加入pH4.5的醋酸钠缓冲液6ml，搅拌溶解，称取0.0579g高碘酸钾，加入pH4.5的醋酸钠缓冲液12ml，搅拌溶解，溶液混合之前，先用N₂除气，并调整至4℃，混合后的溶液在该温度下磁力搅拌反应24h，添加1.8ml乙二醇终止反应，将反应溶液在pH4.5的0.2MNaCl去离子水溶液中透析24h，接着在pH4.5的去离子水中透析24h，冷冻干燥，得到活性中间体氧化壳聚糖(O-CS)。

4)壳聚糖-g-聚乙烯亚胺-坎地沙坦(CS-g-PEI-CD，CPC)的合成

将0.0300gCD-PEI与0.0200gO-CS分别溶于5ml、3ml水中，将两溶液混合后，室温下磁力搅拌下反应48h，反应结束后，用硼氢化钠处理溶液，将反应液在pH4.5的0.2MNaCl去离子水溶液中透析24h(透析袋截留分子量3500)，接着在pH4.5的去离子水中透析24h，冷冻干燥，得到终产物壳聚糖-g-聚乙烯亚胺-坎地沙坦阳离子聚合物(CS-g-PEI-CD，CPC)(合成路线见附图1)。

CD及CD-PEI的核磁表征见附图2(A)：CD-PEI的¹H-NMR(300MHz，D₂O)图谱中，1.213～1.439ppm(t，3H)、6.668～7.693ppm(m，Ar-H)的峰分别为坎地沙坦中-CH₃及Ar-H的质子峰，2.486～3.469ppm(m，4H)的峰为PEI中-NHCH₂CH₂-的质子峰，证明PEI中化学接入了坎地沙坦。根据PEI亚甲基的积分面积与坎地沙坦甲基的积分面积的比值可计算出坎地沙坦取代度为7.6％。

CS及O-CS的核磁表征见附图2(B)：CS的¹H-NMR(300MHz，D₂O)图谱中，3.162ppm(s，H)、2.063ppm(s，3H)的峰分别为2-H、-COCH₃中-CH₃的质子峰，由于高碘酸钾氧化反应选择性断裂2，3-位氢键，所以O-CS的2-H(3.18ppm)信号强度变弱。通过计算壳聚糖和氧化壳聚糖2-H质子峰积分面积的比值，可得氧化度为29.8％。

CS-g-PEI-CD的核磁表征见附图2(C)：¹H-NMR(300MHz，D₂O)中1.272～1.391ppm(t，3H)、6.760～8.101ppm(m，Ar-H)，1.997ppm(s，3H)，2.409～3.453ppm(m，4H)的峰分别为坎地沙坦中-CH₃、Ar-H，壳聚糖-COCH₃中-CH₃，PEI中-NHCH₂CH₂-的质子峰，据此证明该物质为终产物CS-g-PEI-CD。聚合物中壳聚糖与CD-PEI的组成通过壳聚糖中-COCH₃与坎地沙坦中-CH₃质子峰的积分面积来计算，经计算得到CS-g-PEI-CD中CD-PEI的接枝率为11.4％。

实施例二：阳离子聚合物缓冲能力的测定

取6mg实施例一中制备获得的阳离子聚合物CPC溶于30ml150mMNaCl溶液中，然后使用0.1MNaOH调节溶液pH至10.0，之后使用0.1MHCl进行滴定直至pH降至3.0。记录加入的盐酸的总体积及此时溶液相应的pH，绘制盐酸体积-pH曲线。分别以150mMNaCl溶液、CS-PEI(详见对比例)和PEI25k作为空白对照、阴性对照和阳性对照，结果见附图3。聚合物的缓冲能力根据下式计算：

(ΔH^上 _样品-ΔH^上 _NaCl)/N_mol×100％

式中，ΔH^上为滴定时，样品溶液从pH7.4到5.0之间消耗的盐酸的摩尔数。N_mol为样品中所有可质子化的氨基的摩尔数。

结果表明，CS-PEI、CPC和PEI25k的缓冲能力分别为14.4％、24.3％、22.8％，说明本发明制备的阳离子聚合物CPC具有较强的质子缓冲能力，即具有优异的内涵体/溶酶体逃逸能力。

实施例三：CPC/DNA复合物的制备及凝胶阻滞实验

将实施例一中制备获得的聚合物CPC溶于PBS缓冲液(pH7.2～7.4)中，质粒DNA溶于去离子水中。固定质粒DNA的质量(2μgDNA)，按载体与质粒DNA质量比分别为0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2，将聚合物溶液和质粒DNA溶液混合后，涡旋15s，室温下静置30min即得CPC/DNA复合物溶液。分别取20μl复合物溶液进行琼脂糖凝胶电泳观察DNA阻滞情况。电泳条件：0.8％琼脂糖(含GoldViewer^TM)，0.5×TBE缓冲液，电压90V，电泳时间60min，结果见附图4。

附图4中泳道1为质粒DNA对照，泳道2～7分别对应载体与质粒DNA的质量比为0.25、0.5、0.75、1、1.5、2。结果表明，质量比为0.75时，泳道中条带消失，说明此时聚合物能完全压缩包裹DNA形成复合物。

实施例四：CPC/DNA复合物的核酸酶降解实验

按上述方法制备质量比分别为0.75、1、2、3的CPC/DNA复合物溶液，加入含有3unitDNaseI的1×反应缓冲液(pH7.5，100mMTris-HCl，1mMCaCl₂，25mMMgCl₂)，37℃孵育1h。孵育结束后，加入3μl50mMEDTA，37℃加热30min灭活DNaseI，终止酶解反应。然后加入6μl5mg/ml的肝素，涡旋30s，37℃静置60min，进行凝胶电泳实验，结果见附图5。

附图5中泳道1为质粒DNA对照，泳道2为经酶解后的裸质粒DNA，泳道3～6分别对应载体与质粒DNA的质量比为0.75、1、1.5、2。结果表明，当质量比≥1时，载体能够有效保护质粒DNA免受核酸酶降解，而没有载体保护的质粒DNA则被完全降解了。

实施例五：CPC/DNA复合物的理化性质表征

按实施例三中的制备方法，分别用水、PBS(pH7.2～7.4)做溶媒制备质量比分别为1、2、3、4、6、8的CPC/DNA复合物，使用激光粒度仪测定复合物的粒径及Zeta电位，结果见表1。

表1不同质量比复合物在不同溶媒中的粒径分布及电位情况(n＝3)

表1表明，阳离子聚合物CPC在质量比为3、4时可有效包裹质粒DNA，形成粒径～200nm的复合物，表面电位为+14～21mV，从粒径大小角度考虑，这有利于复合物的细胞内吞，基本符合体内外递送的要求。

实施例六：MTT法测定聚合物的细胞毒性

将处于对数生长期的MCF-7细胞及PANC-1细胞用0.02％EDTA+0.25％胰酶消化，制成细胞悬液，分别以1×10⁴/ml细胞浓度加入96孔酶标板内，每孔200μl，设五复孔，置37℃5％CO₂孵箱内培养24h左右。用200μl新鲜的培养基换掉培养基，然后每孔加入不同浓度的CPC溶液，孵育24h。而后每孔加入20μlMTT溶液(5mg/mlPBS中)，继续培养4h，弃去全部上清，加入DMSO100μl/孔，微型振荡器上振摇10min，溶解活细胞产生的MTT-甲瓒，于酶联仪570nm波长处测定吸光度值，吸光度值越高活细胞数也越多。分别以CS-PEI(详见对比例)和PEI25k作为阴性对照和阳性对照，结果见附图6。

细胞活力＝OD_样品/OD_control×100％

式中OD_样品为用聚合物溶液处理的细胞组在570nm处的吸光度值，OD_control为只用培养基处理的细胞组在570nm处的吸光度值。

附图6中，(A)为各聚合物对MCF-7细胞的毒性测定结果，(B)为各聚合物对PANC-1细胞的毒性测定结果。

从附图6可以看出，聚合物CPC对MCF-7细胞及PANC-1细胞的毒性都很小，当浓度达到100μg/ml时，细胞存活率仍在70％左右；虽然CPC组的细胞存活率均大于PEI25k组，但略小于CS-PEI组。

实施例七：CPC/DNA复合物的细胞转染实验

阳离子聚合物CPC与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA复合物在MCF-7细胞及PANC-1细胞中的转染。

将实施例一中制备获得的聚合物CPC配成溶液，滤菌后，与质粒DNA溶液混合配制成最优质量比的CPC/DNA复合物。将细胞接种到24孔板(细胞密度1.0×10⁵/孔)上，培养18～24h，使细胞融合度达到～70％。转染前细胞先用PBS缓冲液洗涤，随后加入500μl含复合物的无血清的培养基(100μl复合物/400μl无血清培养基)在37℃下孵育4h。然后将培养介质更换成新鲜含10％血清的培养基继续培养24h，用共聚焦显微镜观察细胞对GFP的表达情况。以CS-PEI/DNA复合物(详见对比例)作为阴性对照，以PEI25k/DNA、Lipofectamine^TM2000/DNA复合物(均是文献报道的最优氮磷比下形成的复合物)作为阳性对照，结果见附图7、8。

附图7中，(a)为质量比为8的CS-PEI/DNA复合物在MCF-7细胞中的转染结果。(b)为质量比为4的CPC/DNA复合物在MCF-7细胞中的转染结果。(c)为阳性对照PEI25k/DNA复合物在MCF-7细胞中的转染结果。(d)为阳性对照Lipofectamine^TM2000/DNA复合物在MCF-7细胞中的转染结果。

附图8中，(a)为质量比为8的CS-PEI/DNA复合物在PANC-1细胞中的转染结果。(b)为质量比为4的CPC/DNA复合物在PANC-1细胞中的转染结果。(c)为阳性对照PEI25k/DNA复合物在PANC-1细胞中的转染结果。(d)为阳性对照Lipofectamine^TM2000/DNA复合物在PANC-1细胞中的转染结果。

从附图7、8可以看出，上述四种复合物在MCF-7细胞及PANC-1细胞内均会表达一定强度和数量的GFP。CPC的转染效率比CS-PEI及PEI25k的高很多，比目前常用的阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000的稍低，但其细胞毒性明显低于阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000。

实施例八：CPC/pCMV-p53wt对PANC-1细胞的增殖抑制实验

将对数生长期的PANC-1细胞以1×10⁴/ml的细胞浓度接种于96孔板内，每孔100μl，设五复孔，置37℃、5％CO₂孵箱内培养24h，再分别将pCMV-p53wt、CPC/pCMV-p53wt复合物和CS-PEI/pCMV-p53wt复合物加入板中进行转染。转染24h、48h或72h后，每孔加入5mg/mlMTT20μl，继续培养4h，弃去全部上清，加入DMSO100μl/孔，振荡10min，使结晶完全溶解，在酶联免疫检测仪570nm波长处测定吸光度值，并计算细胞活力。

结果表明，相对于对照组，pCMV-p53wt组及CS-PEI/pCMV-p53wt复合物组细胞活力仅出现微小的下降；而CPC/pCMV-p53wt复合物可显著地抑制PANC-1细胞生长，且抑制效应呈时间依赖性；给药72h时，CPC/pCMV-p53wt复合物组的细胞活力仅有40％左右。

对比例：

称取0.1000g壳聚糖，加入pH4.5的醋酸钠缓冲液6ml，搅拌溶解，称取0.0579g高碘酸钾，加入pH4.5的醋酸钠缓冲液12ml，搅拌溶解；溶液混合之前，先用N₂除气，并调整至4℃，混合后的溶液在该温度下磁力搅拌反应24h，添加1.8ml乙二醇停止反应，再将反应溶液在pH4.5的0.2MNaCl去离子水溶液中透析24h，接着在pH4.5的去离子水中透析24h，冷冻干燥，得到活性中间体氧化壳聚糖(O-CS)。

将0.0170gPEI与0.0500g活性中间体氧化壳聚糖分别溶于2ml、5ml水中，将两溶液混合后，在4℃磁力搅拌下反应48h，反应结束后，用硼氢化钠处理溶液，将反应溶液在pH4.5的0.2MNaCl去离子水溶液中透析24h(透析袋截留分子量3500)，接着在pH4.5的去离子水中透析24h，冷冻干燥，得到终产物壳聚糖-聚乙烯亚胺共聚物(CS-PEI)。

将得到的CS-PEI溶于30ml150mMNaCl中，按照实施例二中的方法测定CS-PEI的缓冲能力，结果见附图3，CS-PEI的缓冲能力为15.4％，比CPC的缓冲能力小。

将得到的CS-PEI溶于PBS中，按照实施例六中的MTT法测定CS-PEI的毒性，结果见附图6，CS-PEI对MCF-7细胞及PANC-1细胞的毒性不明显，细胞存活率均高于70％。

将得到的CS-PEI溶于PBS中，滤菌，与含绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA的溶液混合配制成CS-PEI/DNA复合物，静置30min。按照实施例七中的方法检测CS-PEI/DNA复合物在MCF-7细胞及PANC-1细胞中的体外转染情况，其转染结果见附图7(a)、8(a)，其转染效率比CPC、PEI25k、Lipofectamine^TM2000都低。

将得到的CS-PEI溶于PBS中，滤菌，与质粒pCMV-p53wt的溶液混合配制成CS-PEI/pCMV-p53wt复合物，静置30min。按照实施例八所述的方法观察该复合物对PANC-1细胞的增殖抑制情况，结果CS-PEI/pCMV-p53wt复合物组细胞在给药72h时细胞活力仍高达75％，说明CS-PEI/pCMV-p53wt复合物对PANC-1细胞的增殖没有明显的抑制作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种多功能阳离子聚合物，其特征在于，该聚合物是由低分子量壳聚糖、聚乙烯亚胺和沙坦类药物组成，其中，主链壳聚糖的分子量为10～50kDa，脱乙酰度为80～90％；聚乙烯亚胺为支链型，分子量为1800；沙坦类药物在聚乙烯亚胺上的取代度为6.76～20％，沙坦类药物-聚乙烯亚胺偶联物在主链壳聚糖上的接枝率为4～20％。

2.根据权利要求1所述的多功能阳离子聚合物，其特征在于，所述的沙坦类药物优选为奥美沙坦、缬沙坦、坎地沙坦或替米沙坦。

3.权利要求1所述的多功能阳离子聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)将聚乙烯亚胺溶于适当混合溶剂，滴加上述活化的沙坦类药物溶液于聚乙烯亚胺溶液中，室温下磁力搅拌反应24h，加入丙酮沉淀产物，沉淀物用水溶解，将所得溶液在去离子水中透析24h，冷冻干燥，得到沙坦类药物-聚乙烯亚胺偶联物；

3)将壳聚糖、高碘酸钾分别溶于pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，N2除气并调整至4℃后，将两溶液混合并在该温度下磁力搅拌反应24h，添加乙二醇终止反应，将反应溶液在pH4.5的0.2MNaCl去离子水溶液中透析24h，接着在pH4.5的去离子水中透析24h，冷冻干燥，得到活性中间体氧化壳聚糖；

4)将上述沙坦类药物-聚乙烯亚胺偶联物及活性中间体氧化壳聚糖分别溶于去离子水中，两溶液混合后在室温下磁力搅拌反应48h，反应结束后，用硼氢化钠处理溶液，将反应溶液在pH4.5的0.2MNaCl去离子水溶液中透析24h，接着在pH4.5的去离子水中透析24h，冷冻干燥，得到终产物壳聚糖-g-聚乙烯亚胺-沙坦类药物阳离子聚合物。

4.根据权利要求3所述的多功能阳离子聚合物的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的碳二亚胺类缩合剂及酰化活化剂分别为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺；所述的沙坦类药物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1～5∶1～5。

5.根据权利要求3所述的多功能阳离子聚合物的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述的沙坦类药物与聚乙烯亚胺结构中游离氨基的摩尔比为1∶1～8；所述的混合溶剂为水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂，混合比例为1∶2。

6.根据权利要求3所述的多功能阳离子聚合物的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的高碘酸钾与壳聚糖单元的摩尔比小于2∶1。

7.根据权利要求3所述的多功能阳离子聚合物的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述的沙坦类药物-聚乙烯亚胺偶联物含有游离氨基的结构单元与活性中间体氧化壳聚糖含有游离醛基的结构单元的摩尔比为1∶1.5～6；所述的透析袋的截留分子量为3500；所述的活性中间体氧化壳聚糖的氧化度为15％～50％。

8.权利要求1所述的多功能阳离子聚合物的应用，其特征在于，它在制备基因药物与化学药物联合给药的非病毒基因传输系统中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，用于非病毒基因传输系统的质粒DNA，所述质粒DNA为含报告基因或治疗基因的能在真核细胞中表达的质粒DNA。