CN101812178B - 还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种含双硫键改性的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其化学组成式：PEI-(ASSA-PEI)n-(ASSB-PEI)m，式中PEI为聚乙烯亚胺，A的组成为C10H14O4N4，B的组成为C3H5ON，n＝0-30；m＝0-30；n和m不同时为零。所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物重均分子量为5千-8万。本发明通过简单的特定修饰和点击化学，将聚乙烯亚胺通过可还原降解的双硫键连接成高分子量的改性聚乙烯亚胺。该方法简单，结构控制容易，反应消失的氨基少，氨基利用率较高。得到的产品具有生物还原可降解的特性，细胞毒性小，在生理条件下能很好地绑定和复合基因DNA，进入细胞内由于细胞内的还原环境可较快断裂而释放出所载基因，具有较高基因表达转染效率。结果表明该改性聚乙烯亚胺衍生物比25kDa PEI具有较高的转染效率和较低的细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及一种还原敏感性的阳离子聚合物及其制备方法和应用。具体是涉及一类可降解的聚乙烯亚胺的衍生物及其制备方法和作为基因载体的应用。
背景技术
基因治疗是指将可以产生特异性蛋白的基因插入病人细胞来纠正遗传缺损或治疗后天性疾病，包括癌症、艾滋病、糖尿病等，是近二十年来兴起的新型治疗方法，有很好的发展前景。基因载体是基因药物的重要组成部分，也是目前基因治疗的关键和瓶颈。基因载体主要包括病毒载体和非病毒载体。其中病毒载体因为转染效率高而被首先应用于基因治疗的临床研究；然而，病毒载体的安全隐患和复杂昂贵的制备过程都限制了病毒载体的应用和推广。因此，人们将越来越多地关注非病毒基因载体的发展。阳离子高分子基因载体作为一类新型非病毒载体，具有很多优点，如安全，分子可选择性修饰，大量制备简单便宜，较低的免疫原性，而且可携带的治疗基因的大小范围很灵活，被认为是目前最具发展潜力的基因传递系统。
目前研究的较多的阳离子高分子基因载体包括壳聚糖及其衍生物，聚赖氨酸(polylysine，PLL)，聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)，聚酰胺-胺(polyamidoamine，PAMAM)树形分子高分子和聚甲基丙烯酸酯阳离子衍生物等。其中PEI是迄今为止研究得最多的阳离子高分子基因载体，PEI在作为基因载体方面取得的成功已使它成为设计新的阳离子高分子基因载体的参考标准。有研究报道分子量低于1.8kDa的PEI几乎没有转染效果，比较适宜基因载体的PEI分子量范围大致为11.9-70kDa[Godbey W.T.；Wu K.K.；Mikos A.G.Size matters：molecular weight affects the efficiency of poly(ethylenimine)as a gene delivery vehicle.J.Biomed.Mater.Res.1999，45，268]，最常用的分子量是25kDa，因此，在大多数研究中都是选用25KDa的枝化PEI作为对照。但现有传统的高分子基因载体由于相对低的转染效率和高的毒性而不能用于临床，例如不可降解的阳离子高分子在细胞内累积会导致很高的毒性等。高分子基因载体转染效率和毒性一般随分子量的增加而都提高，例如，以PEI为载体的DNA复合物在研究的分子量范围0.6-70kDa内随着分子量的增大其转染效率增大[Godbey W.T.，et al.，J.Biomed.Mater.Res.1999，45，268]，PEI的细胞毒性也随着分子量的增大而提高。
为了解决这个矛盾，即合成出具有较高转染效率又具有较低细胞毒性的高分子基因载体，Lee课题组首先报道了引入可还原降解的双硫键连接，通过与活泼氨基反应交联分子量为0.8kDa的PEI制得高分子量的PEI衍生物[M.A.Gosselin，W.-J.Guo，R.J.Lee，Efficient gene transfer using reversibly cross-linked low molecularweight polyethylenimine，Bioconjugate Chem.12(2001)989-994]，该PEI衍生物具有较高转染效率和很低的毒性。类似的研究使用1.8kDa PEI[Y.-X.Wang，P.Chen，J.-C.Shen，The development and characterization of a glutathione-sensitive cross-linkedpolyethylenimine gene vector，Biomaterials 27(2006)5292-5298]和2.6，3.1，4.6kDa的PEI[M.Breunig，U.Lungwitz，R.Liebl and A.Goepferich，Breaking up thecorrelation between efficacy and toxicity for nonviral gene delivery，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104(36)(2007)14454-14459.]合成了具有低毒性的高分子量的可还原降解的PEI衍生物。后者通过七种不同细胞的实验结果表明该类双硫键交联的PEI衍生物具有较高转染效率。最近香港学者报道这类方法合成的双硫键交联的PEI衍生物交联度不易控制，得到的聚合物溶解性不好，含有的微凝胶必须用柱子除去，工艺复杂，产率低[R.Deng，Y.N.Yue，F.Jin，Y.C.Chen，H.F.Kung，M.C.M.Lin，C.Wu，Revisit the complexation of PEI and DNA-How to make low cytotoxic andhighly efficient PEI gene transfection non-viral vectors with a controllable chain lengthand structure？J.Control.Release 140(2009)40-46.]，他们发现过度的交联会大大降低聚合物绑定和保护DNA的能力，基因转染效率也会较低，因而控制合适的聚合物的结构对于高分子基因载体非常重要。
本发明以低分子量聚乙烯亚胺为主要原料，通过简单的特定修饰和点击化学，制备出同时具有较高基因转染效率和较低细胞毒性的生物可降解的高分子基因载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备工艺简单、结构易控制和含有双硫键的还原敏感性聚乙烯亚胺的衍生物及其制备和应用。该含双硫键的改性聚乙烯亚胺具有较高基因转染效率和较低细胞毒性。
本发明提供的技术方案是：一种含双硫键改性的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其化学组成具有下列通式：
用简式PEI-(ASSA-PEI)n-(ASSB-PEI)m表示；或者
用简式PEI-(ASSA-PEI)n-(BSSA-PEI)m表示。
式中PEI为重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺，结构示意图为：
A的组成为C10H14O4N4，结构单元为：
B的组成为C3H5ON，结构单元为：
S代表硫，其中PEI氨基与A单元或者B单元的羰基相连接时形成酰胺结构，PEI减少一个H；PEI一端的NH2少一个H；一个PEI分子中可以有多个氨基分别与多个A单元或者B单元的羰基相连接时形成多个酰胺结构；A单元与A单元或者A单元与B单元的连接是通过双硫键。
n＝0-30；m＝0-30；n和m不同时为零。所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物重均分子量为5千-8万。
本发明进一步的方案是：所述n＝2-25；m＝0；所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物重均分子量在5千-6万之间。
或者，所述n＝0；m＝2-25；所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物重均分子量在5千-6万之间。
上述PEI为重均分子量在800-2500之间的聚乙烯亚胺。
本发明还提供了上述还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物(n＝2-25，m＝0；重均分子量在5千-6万之间)的制备方法，包括如下步骤：
a)双(烯丙基氨基甲酸酯乙基)二硫化合物2的制备方法：将炔丙酯羰基咪唑化合物1和胱胺按摩尔比1-4∶1加入有机溶剂中，在20-60℃下搅拌反应2-48小时，纯化得到化合物2；
b)叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(N3)X的制备方法：
将叠氮丙酯羰基咪唑化合物3和重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺PEI按摩尔比1-5∶1溶于有机溶剂中，在25-80℃下搅拌反应2-48小时，减压除去溶剂，得到产物4含咪唑小分子的叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(N3)X，其中的每个聚乙烯亚胺含叠氮端基的数量X取值范围为2-5；
所述PEI-(N3)X的结构示意图为：
c)还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备方法：
将上述产物4和化合物2按叠氮端基与炔基的摩尔比0.5-3∶1溶于有机溶剂或者水中或者水和有机溶剂的混合物中，在20-80℃下进行反应1-48小时得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物产物5，其结构示意图为：
本发明还提供了所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物(n＝0；m＝2-25；重均分子量在5千-6万)的制备方法，包括如下步骤：
a)(烯丙基氨基甲酸酯乙基)二硫乙基1-碳酰胺咪唑化合物7的制备方法：将炔丙酯羰基咪唑化合物1和胱胺按摩尔比0.5-1.5∶1加入有机溶剂中，在20-60℃下搅拌反应2-48小时，纯化得到(烯丙基氨基甲酸酯乙基)二硫乙胺化合物6；再将化合物6与1，1′-羰基二咪唑按摩尔比0.4-0.75∶1加入有机溶剂中，在20-70℃下搅拌反应2-48小时，纯化得到化合物7；
b)叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺的制备方法：
将叠氮丙酯羰基咪唑化合物3和重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺PEI按摩尔比0.9-1.1∶1溶于有机溶剂中，在25-60℃下搅拌反应2-24小时，减压除去溶剂，得到含咪唑小分子的叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺，其中的每个聚乙烯亚胺含叠氮端基的数量为0.9-1.1；
c)炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(Cyst-CI)Y的制备方法：
将化合物7和重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺按摩尔比2-25∶1溶于有机溶剂中，在25-80℃下搅拌反应2-48小时，减压除去溶剂，得到产物8含咪唑小分子的炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(Cyst-CI)Y，其中的每个聚乙烯亚胺含炔端基的数量取值Y为2-25；产物8的结构示意图为：
d)还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备方法：
将上述b)中制得的叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺和产物8按叠氮端基与炔基的摩尔比0.6-2∶1溶于有机溶剂或者水中或者水和有机溶剂的混合物中，在20-80℃下进行反应1-48小时得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其结构示意图为：
式中2≤m≤Y。
本发明还提供了所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物(n＝0；m＝2-25；重均分子量在5千-6万)的另一种制备方法，包括以下步骤：
a)(烯丙基氨基甲酸酯乙基)二硫乙基1-碳酰胺咪唑化合物7的制备方法：
将炔丙酯羰基咪唑化合物1和胱胺按摩尔比0.5-1.5∶1加入有机溶剂中，在20-60℃下搅拌反应2-48小时，纯化得到(烯丙基氨基甲酸酯乙基)二硫乙胺化合物6；再将化合物6与1，1′-羰基二咪唑按摩尔比0.4-0.75∶1加入有机溶剂中，在20-70℃下搅拌反应2-48小时，纯化得到化合物7；
b)叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(N3)X的制备方法：
将化合物3叠氮丙酯羰基咪唑和重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺PEI按摩尔比2-25∶1溶于有机溶剂中，在25-80℃下搅拌反应2-48小时，减压除去溶剂，得到含咪唑小分子的叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺，其中的每个叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(N3)X含叠氮端基的数量X取值范围为2-25；
c)炔端基功能化的聚乙烯亚胺的制备方法：
将化合物7和重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺按摩尔比0.9-1.1∶1溶于有机溶剂中，在20-60℃下搅拌反应2-48小时，减压除去溶剂，得到含咪唑小分子的炔端基功能化的聚乙烯亚胺，其中的每个聚乙烯亚胺含炔端基的数量取值范围为0.9-1.1(绝大多数的每个聚乙烯亚胺含炔端基为1个，聚乙烯亚胺PEI含炔端基的平均数量值为0.9-1.1)；
d)还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备方法：
将上述c)中炔端基功能化的聚乙烯亚胺和PEI-(N3)X按炔基端基与叠氮端基的摩尔比0.6-2∶1溶于有机溶剂或者水中或者水和有机溶剂的混合物中，在20-80℃下进行反应1-48小时得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物产物，其结构示意图为：
式中2≤m≤X。
本发明所述的含双硫键改性的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物作为基因载体的应用。
所述基因载体为用于人体或者动植物细胞基因传导的载体。
对含双硫键改性的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，引入靶向基团和/或引入可以交联的组分。
本发明提供的具有还原敏感性的改性聚乙烯亚胺(PEI)衍生物基因载体，是以低分子量聚乙烯亚胺为主要原料，通过简单的特定修饰和点击化学，将低分子量聚乙烯亚胺通过可还原降解的双硫键连接成高分子量的改性聚乙烯亚胺，它具有生物还原可降解的特性，在细胞外能很好地绑定和复合基因DNA，进入细胞内由于细胞内的还原环境可较快断裂成近似原料低分子量PEI而释放出所载基因，因而同时具有较高基因转染效率和较低细胞毒性。因为低分子量PEI如分子量为1.8kDa和0.8kDa，虽毒性低，但不能有效绑定压缩DNA，其与DNA复合物粒径较大，基因转染效率较低。
本发明的优点在于方法简单，由于使用了点击化学，结构控制容易，反应消失的氨基少，氨基利用率很高。
通过核磁共振谱测试改性聚乙烯亚胺的结构，通过凝胶渗透色谱(GPC)测试聚合物的分子量。其中m、n的值主要通过所加原料的组成来控制。
当m＝0时，上述聚合物为微交联型改性聚乙烯亚胺；当n＝0时，上述聚合物为超支化改性聚乙烯亚胺。
原料低分子量聚乙烯亚胺的重均分子量范围在600-5000之间，因为本发明的具有还原敏感性的改性聚乙烯亚胺(PEI)衍生物基因载体在进入细胞后的降解产物的分子量很接近原料低分子量聚乙烯亚胺的分子量。原料低分子量聚乙烯亚胺的重均分子量优选范围在800-2500之间，这样制得的还原敏感性的改性聚乙烯亚胺(PEI)衍生物基因载体具有较低的细胞毒性。
本发明披露了一种含双硫键扩链剂改性的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和作为基因载体的应用，该方法简单，结构控制容易，反应消失的氨基少，氨基利用率很高。该改性聚乙烯亚胺衍生物具有生物还原可降解的特性，细胞毒性小，在细胞外该改性聚乙烯亚胺能很好地绑定和复合基因DNA，进入细胞内由于细胞内的还原环境可较快断裂而释放出所载基因，具有较高基因转染表达效率。基因转染实验结果表明该改性聚乙烯亚胺衍生物比25kDa PEI具有较高的转染效率和较低的细胞毒性，原因很可能是由于它的细胞内还原敏感性，该类改性PEI是一种很有应用前景的高分子基因载体。
附图说明
图1为本发明合成的含双硫键的改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物PEI-SS-C1在D2O的核磁氢谱图
图2为本发明合成的含双硫键的改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物PEI-SS-C1和PEI-SS-C3及参照聚合物PEI 25kDa和1.8kDa对293T的细胞毒性比较(图示数据为4孔平行实验的平均值和标准方差)。
图3为本发明合成的含双硫键的改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物PEI-SS-C1和PEI-SS-C3复合物在不同的氮磷比时对293T(A)和HeLa(B)细胞在无血清存在时的荧光素酶转染表达(图示数据为3孔平行实验的平均值和标准方差)。
图4为本发明合成的含双硫键的改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物PEI-SS-HP2复合物在不同的氮磷比时对HeLa细胞在无血清(A)和有血清(B)存在时的荧光素酶转染表达(图示数据为3孔平行实验的平均值和标准方差)。
图5为本发明合成的含双硫键的改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物PEI-SS-C1和PEI-SS-C3复合物在不同的氮磷比时对293T细胞在有血清存在时的荧光素酶转染表达(图示数据为3孔平行实验的平均值和标准方差)。
具体实施方式
本发明上述还原敏感性的微交联型改性聚乙烯亚胺衍生物(用简式PEI-(ASSA-PEI)n表示，PEI1800-(ASSA-PEI1800)n，表示其使用PEI的重均分子量为1800，也用PEI-SS-C表示)的制备方法，包括如下三个步骤：
在上述a)步骤中，可以制得含双硫键的扩链剂(交联剂)：将化合物1炔丙酯羰基咪唑和脱了盐酸盐的胱胺按摩尔比1-4∶1加入无活泼质子的有机溶剂如氯仿，二氯甲烷，丙酮，四氢呋喃，DMF中，在20-60℃下搅拌反应2-48小时，纯化得到双(烯丙基氨基甲酸酯乙基)二硫(bis[(propargyl carbamate)ethyl]disulfide，BPPA-Cyst，化合物2)(见实施例1)，也可以调整化合物1和胱胺的加料摩尔比为0.5-1.5∶1制得(烯丙基氨基甲酸酯乙基)二硫乙胺((propargyl carbamate)ethyldisulfide ethylamine，PPA-Cyst，化合物6)(见实施例2)。
在上述b)步骤中，根据PEI和叠氮丙酯羰基咪唑(3-azidopropyl ester ofcarbonylimidazole，AP-CI，化合物3)的加料比可以控制产物4叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(N3)X每个聚乙烯亚胺分子含有的叠氮基团的数目(见实施例3-6，X取值范围为1-10)。反应温度可以在25-80℃，反应时间2-48小时，反应介质为无活泼质子的有机溶剂如氯仿，二氯甲烷，丙酮，四氢呋喃，DMF。
在上述c)步骤中，根据叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(N3)X中的X取值范围(每个聚乙烯亚胺含叠氮端基的数量2-5)以及PEI-(N3)X和双(烯丙基氨基甲酸酯乙基)二硫BPPA-Cyst的比例合成不同分子量的还原敏感性的微交联型改性聚乙烯亚胺(见实施例10-14)，产物PEI-SS-C1的核磁氢谱见图1，由该图可知，在7.8ppm处有明显的峰为三唑环的H，说明通过点击化学生成了三唑环；红外光谱分析表明该产物在2099和2126cm-1处没有明显的吸收峰，说明叠氮端基和炔端基基本反应；通过凝胶渗透色谱(GPC)联用多角度光散射检测器测得其重均分子量为9.4kDa，多分散指数PDI为3.12。这些表征结果说明该反应按设想方式完成。X取值范围优选3-4，该步骤的反应温度可为25-80℃，优选50℃，优选在催化剂如溴化亚铜存在下进行。
本发明还原敏感性超支化改性聚乙烯亚胺聚合物(用简式PEI-(BSSA-PEI)m表示；PEI1800-(BSSA-PEI800)m，表示该超支化聚合物的芯使用PEI的重均分子量为1800，该超支化聚合物的壳使用PEI的重均分子量为800；也用PEI-SS-HP1表示)的制备方法：包括如下四个步骤：
d)点击化学：PEI-(Cyst-CI)Y+PEI-(N3)1→PEI-(BSSA-PEI)m
在上述a)步骤中将化合物6与1，1′-羰基二咪唑按摩尔比0.4-0.75∶1加入无活泼质子的有机溶剂如氯仿，二氯甲烷，丙酮，四氢呋喃，DMF中，在20-70℃下搅拌反应2-48小时，纯化得到化合物7。
在上述b)步骤中将叠氮丙酯羰基咪唑化合物3和重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺按摩尔比0.9-1.1∶1溶于无活泼质子的有机溶剂如氯仿，二氯甲烷，丙酮，四氢呋喃，DMF中，在25-60℃下搅拌反应2-24小时，减压除去溶剂，得到含咪唑小分子的叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(N3)1，其中绝大多数的每个聚乙烯亚胺含叠氮端基为1个，聚乙烯亚胺PEI含叠氮端基的平均数量值为0.9-1.1。
c)炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(Cyst-CI)Y的制备方法：
将化合物7和重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺按摩尔比2-25∶1溶于无活泼质子的有机溶剂如氯仿，二氯甲烷，丙酮，四氢呋喃，DMF中，在25-80℃下搅拌反应2-48小时，减压除去溶剂，得到含咪唑小分子的产物8多炔端基功能化的聚乙烯亚胺，其中的每个聚乙烯亚胺含炔端基的数量取值范围Y为2-25(见实施例7-9)。
d)步骤，产物8多炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(Cyst-CI)Y作为超支化聚合物的芯，而含一个叠氮端基的PEI作为壳，反应温度可为20-80℃，优选50℃，该反应中的催化剂CuBr可改用CuCl；该反应也可以不使用CuBr，而采用提高反应温度(80℃)和延长反应时间(48小时)。优选在催化剂如溴化亚铜存在下进行；2≤m≤Y。
本发明还提供了另一种制备还原敏感性超支化改性聚乙烯亚胺聚合物的方法：其中炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(Cyst-CI)Y的Y取值范围为1(平均每个聚乙烯亚胺含一个炔端基)，它作为超支化聚合物的壳，而多叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(N3)X作为超支化聚合物的芯。
其反应示意图为：
PEI-(Cyst-CI)1+PEI-(N3)X→PEI-(ASSB-PEI)m
该点击化学反应温度可为25-70℃，优选50℃，优选在催化剂如溴化亚铜存在下进行；该反应中的CuBr可改用CuCl；该反应也可以不使用CuBr，而采用提高反应温度(80℃和延长反应时间(48小时)；2≤m≤X。
加入二硫代苏糖醇(DTT，100mM)与聚合物PEI-SS-C1混合在室温下2小时后进行GPC分析表明，聚合物的重均分子量从9.4kDa(分子量分布3.1)降低到2.1kDa(分子量分布3.3)，降解产物的分子量与所用原料PEI的分子量(1.8kDa)较接近说明该含双硫键的改性聚合物具有还原敏感特性。加入DTT与聚合物DNA复合物混合进行电泳实验也表明该含双硫键的改性聚合物具有还原敏感特性。
本发明所述的含双硫键改性的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物与外源基因结合作为基因载体的应用。
含双硫键改性的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物作为基因载体，用合适的复合方法，可以将目标基因(DNA或者RNA)复合形成稳定的复合物小颗粒。将该复合物与人体或者动物细胞共同培养，可以将目标基因(DNA或者RNA)带入人体或者动物细胞内释放，并转染表达，用于人体基因治疗和动植物的基因传导。结果表明本发明提供的具有还原敏感性的改性聚乙烯亚胺衍生物可以有效传导基因，并且改性聚乙烯亚胺衍生物如PEI-SS-C1，PEI-SS-C2和PEI-SS-HP2的复合物的基因转染效率大大高于原料1.8kDa PEI的复合物(2-3个数量级，见图3)，也高于常用高分子基因载体参照聚合物25kDa PEI的复合物的基因转染效率(图3-5)；而对细胞的毒性，改性聚乙烯亚胺衍生物比25kDa PEI低(表1和图2)。这些结果表明本发明提供的具有还原敏感性的改性聚乙烯亚胺衍生物具有较高基因转染效率和较低细胞毒性。
本发明所述的含双硫键扩链剂改性的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，可引入靶向基团如叶酸和抗体，提高基因载体系统的靶向传递特性，靶向进入肿瘤细胞后由于细胞内还原环境会很快降解释放出所载的基因药物。可引入少量可以交联的组分，在该改性的聚乙烯亚胺衍生物装载基因药物后进行交联，可提高装载基因药物体系的稳定性。
从以下说明性实施例将进一步接解释本发明，但它们不是对权利要求的限制。
实施例
实施例1双(烯丙基氨基甲酸酯乙基)二硫(bis[(propargyl carbamate)ethyl]disulfide，BPPA-Cyst，2)的合成：
根据文献[X.L.Jiang，M.C.Lok，W.E.Hennink，Degradable-BrushedpHEMA-pDMAEMA synthesized via ATRP and click chemistry for gene delivery，Bioconjugate Chem.18(2007)2077-2084]通过炔丙醇和1，1′-羰基二咪唑合成炔丙酯羰基咪唑(propargyl ester of carbonyl-imidazole，PPA-CI，1)。先将胱胺盐酸盐脱盐，称4.40克脱了盐酸盐的胱胺和6.93克炔丙酯羰基咪唑溶于50毫升二氯甲烷，室温下搅拌反应24小时，除去溶剂，加入100毫升磷酸二氢钠溶液(pH 4.0)溶解，再用乙醚萃取3次，得到BPPA-Cyst，收率80％.1H-NMR in CDCl3：δ(ppm)2.48(s，2H，CH≡C)，2.82(t，4H，S-CH2-C)，3.51(app.quartet，4H，NH-CH2-C)，4.69(s，4H，O-CH2-C≡C)，5.31(s，2H，NH-C＝O).红外光谱分析表明该产物在3293和2126cm-1处有明显的吸收峰，也说明其含炔基。该反应的二氯甲烷换成无活泼质子的其它有机溶剂如氯仿，丙酮，四氢呋喃，DMF也同样进行并可得到类似的结果。
实施例2(烯丙基氨基甲酸酯乙基)二硫乙基1-碳酰胺咪唑((propargylcarbamate)ethyl disulfide ethyl 1-carbamide-imidazole，PPA-Cyst-CI，7)的合成先合成(烯丙基氨基甲酸酯乙基)二硫乙胺((propargyl carbamate)ethyl disulfideethylamine，PPA-Cyst，6)：如实施例1步骤合成炔丙酯羰基咪唑(PPA-CI，1)。先将胱胺盐酸盐脱盐，称4.40克的胱胺和3.47克炔丙酯羰基咪唑溶于50毫升氯仿，室温下搅拌反应24小时，除去溶剂，加入80毫升磷酸二氢钠溶液(pH 4.0)溶解，用乙醚萃取3次，将所得下层水相部分调节pH到9.0，再用40毫升的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用40毫升pH＝9磷酸钠溶液洗一次，得到的有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏得到黄色油状液体1.9克，产率为35％。1H-NMRin CDCl3：δ(ppm)2.45(s，1H，CH≡C)，2.75(m，4H，S-CH2-C)，2.98(m，2H，NH2-CH2-C)，3.50(m，2H，NH-CH2-C)，4.37(b，2H，NH2-C)，4.64(s，2H，O-CH2-C≡C)，5.58(s，1H，NH-C＝O)。该反应的氯仿换成无活泼质子的其它有机溶剂如二氯甲烷，丙酮，四氢呋喃，DMF也同样进行并可得到类似的结果。
再合成(烯丙基氨基甲酸酯乙基)二硫乙基1-碳酰胺咪唑((propargylcarbamate)ethyl disulfide ethyl 1-carbamide-imidazole，PPA-Cyst-CI，7)：称取1，1′-羰基二咪唑(CDI)3.94克溶于40ml氯仿中，将上述的PPA-Cyst 1.9克滴入CDI的氯仿溶液中，常温反应4h，反应液由浑浊变为透明。加水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏得白色固体PPA-Cyst-CI 1.9克，产率为71％。1H-NMR in CDCl3：δ(ppm)2.49(s，1H，CH≡C)，2.78(t，2H，S-CH2-CH2-NH-COO)，3.00(t，2H，S-CH2-CH2-NH-CON)，3.50(m，2H，-OCO-NH-CH2-C)，3.55(m，2H，-NCO-NH-CH2-C)，4.66(s，2H，O-CH2-C≡C)，5.39(b，1H，NH-COO)，7.05(s，1H，CH＝N-CH＝CH)，7.49(b，1H，NH-CON)，7.56(s，1H，CH＝CH-N)，8.25(s，1H，N-CH＝N)。该反应的氯仿换成无活泼质子的其它有机溶剂如二氯甲烷，丙酮，四氢呋喃，DMF也同样进行并可得到类似的结果。
实施例3叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI1800-(N3)4的合成(下标数字1800表示PEI重均分子量为1800，下标数字4表示每个聚乙烯亚胺的叠氮端基平均数约为4)：
参照文献[2008-033s Chem Comm，20071219，N2，190-192，Biodegradablemicrocapsules designed via‘click’chemistry，Bruno G.De Geest；Wim Van Camp，FilipE.Du Prez；Stefaan C.De Smedt；Jo Demeester；Wim E.Hennink]通过叠氮丙醇和1，1′-羰基二咪唑合成液体叠氮丙酯羰基咪唑(3-azidopropyl ester ofcarbonylimidazole，AP-CI，3)。
将2.17克叠氮丙酯羰基咪唑溶于20毫升氯仿，5.0克重均分子量为1800的聚乙烯亚胺溶于100毫升氯仿，将它们在室温下混合反应2小时，再升温回流反应10小时，减压除去溶剂氯仿，得到含咪唑小分子的叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺。红外光谱分析表明该产物在2099cm-1处有明显的吸收峰，说明其含叠氮。核磁氢谱表明原料叠氮丙酯羰基咪唑已反应完全，并测得每个聚乙烯亚胺分子含4个叠氮基团。该反应的氯仿换成无活泼质子的其它有机溶剂如二氯甲烷，丙酮，四氢呋喃，DMF也同样进行，反应温度在30-80℃下搅拌反应2-48小时，并可得到类似的结果。
实施例4叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI1800-(N3)3的合成(下标数字1800表示PEI重均分子量为1800，下标数字3表示每个聚乙烯亚胺的叠氮端基平均数约为3)
步骤同实施例3，区别在于叠氮丙酯羰基咪唑的用量减少为1.62克，重均分子量为1800的聚乙烯亚胺还是5克溶于100毫升氯仿，制得的改性聚乙烯亚胺通过核磁氢谱测得每个聚乙烯亚胺分子含3个叠氮基团。
实施例5叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI800-(N3)1的合成(下标数字800表示PEI重均分子量为800，下标数字1表示每个聚乙烯亚胺的叠氮端基平均数约为1)
与实施例3相同，将0.30克叠氮丙酯羰基咪唑(AP-CI)溶于60毫升氯仿，1.23克重均分子量为800的聚乙烯亚胺溶于20毫升氯仿，将它们在室温下混合反应2小时，再升温回流反应10小时，减压除去溶剂氯仿，得到含咪唑小分子的叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺黄色液体1.0克。红外光谱分析表明该产物在2099cm-1处有明显的吸收峰，说明其含叠氮。核磁氢谱表明原料叠氮丙酯羰基咪唑已反应完全，并测得每个聚乙烯亚胺分子含1个叠氮基团。
实施例6叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI1800-(N3)10的合成(下标数字1800表示PEI重均分子量为1800，下标数字10表示每个聚乙烯亚胺的叠氮端基平均数约为10)
将2.2克叠氮丙酯羰基咪唑溶于40毫升氯仿，2.07克重均分子量为1800的聚乙烯亚胺溶于40毫升氯仿，将它们在室温下混合反应2小时，再升温回流反应24小时，减压除去溶剂氯仿，得到黄色油状粘稠液体3.5克，为含咪唑小分子的叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺。红外光谱分析表明该产物在2099cm-1处有明显的吸收峰，说明其含叠氮。核磁氢谱表明原料叠氮丙酯羰基咪唑已反应完全，并测得每个聚乙烯亚胺分子含10个叠氮基团。
实施例7炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI800-(PPA-Cyst-CI)1的合成(下标数字800表示PEI重均分子量为800，下标数字1表示每个聚乙烯亚胺的炔端基平均数约为1)
将实施例2制得的PPA-Cyst-CI 1.26克溶于100毫升氯仿，3.07克重均分子量为800的聚乙烯亚胺溶于50毫升氯仿，将它们在室温下混合反应2小时，再升温回流反应24小时，减压除去溶剂氯仿，得到含咪唑小分子的炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI800-(PPA-Cyst-CI)1黄色粘稠液体4.07g，产率为94％。核磁氢谱表明原料PPA-Cyst-CI已反应完全，并测得每个聚乙烯亚胺分子含1.0个炔基团。该反应的氯仿换成无活泼质子的其它有机溶剂如二氯甲烷，丙酮，四氢呋喃，DMF也同样进行，反应温度在30-80℃下搅拌反应2-48小时。
实施例8炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI1800-(PPA-Cyst-CI)1的合成(下标数字1800表示PEI重均分子量为1800，下标数字1表示每个聚乙烯亚胺的炔端基平均数约为1)
将实施例2制得的PPA-Cyst-CI 0.50克溶于50毫升氯仿，2.74克重均分子量为1800的聚乙烯亚胺溶于50毫升氯仿，将它们在室温下混合反应2小时，再升温回流反应24小时，减压除去溶剂氯仿，得到含咪唑小分子的炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI1800-(PPA-Cyst-CI)1黄色粘稠液体2.96g。核磁氢谱表明原料PPA-Cyst-CI已反应完全，并测得每个聚乙烯亚胺分子含1.0个炔基团。该反应的氯仿换成无活泼质子的其它有机溶剂如二氯甲烷，丙酮，四氢呋喃，DMF也同样进行，反应温度在30-80℃下搅拌反应2-48小时。
实施例9炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI1800-(PPA-Cyst-CI)10的合成(下标数字1800表示PEI重均分子量为1800，下标数字10表示每个聚乙烯亚胺的炔端基平均数约为10)
步骤同实施例7，将0.58克PPA-Cyst-CI溶于10毫升氯仿，0.32克重均分子量为1800的聚乙烯亚胺溶于10毫升氯仿，将它们在室温下混合反应2小时，再升温回流反应24小时，减压除去溶剂氯仿，得到含咪唑小分子的炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI1800-(PPA-Cyst-CI)10黄色粘稠液体0.65g，产率为83％。核磁氢谱表明原料PPA-Cyst-CI已反应完全，并测得每个聚乙烯亚胺分子含约10.0个炔基团。
实施例10-14均为点击化学合成含双硫键的微交联的PEI衍生物(PEI1800-(ASSA-PEI1800)n，下标数字表示PEI重均分子量为1800，用PEI-SS-C表示)系列的制备
实施例10点击化学合成含双硫键的PEI衍生物PEI-SS-C1：
将实施例3制得的产物4，PEI1800-(N3)4，0.75g，实施例1制得的含双硫键的扩联剂(化合物2，BPPA-Cyst)0.16g溶解于10毫升DMF中，加入CuBr 56毫克，在氮气保护下，在50℃油浴中反应1天。制得的聚合物溶液装入透析袋(MWCO 3.5kDa)用水透析，冷冻干燥得改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物，用PEI-SS-C1表示。其核磁氢谱见图1，由该图可知，在7.8ppm处有明显的峰为三唑环的H，说明通过点击化学生成了三唑环，红外光谱分析表明该产物在2099和2126cm-1处没有明显的吸收峰，说明叠氮端基和炔端基基本反应；通过凝胶渗透色谱(GPC)联用多角度光散射检测器测得其重均分子量为9.4kDa，多分散指数PDI为3.12，说明PEI1800-(ASSA-PEI1800)n中n平均约为4。使用溶剂DMSO代替DMF，该点击化学反应也可以进行。该反应中的CuBr可改用CuCl；该反应也可以不使用CuBr，而采用提高反应温度(80℃)和延长反应时间(48小时)。
实施例11点击化学合成含双硫键的PEI衍生物PEI-SS-C2：
步骤同实施例10，区别在于含双硫键的扩联剂BPPA-Cyst的用量减少为0.12g，CuBr 30毫克，制得的改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物，用PEI-SS-C2表示。核磁氢谱图在7.8ppm处有明显的三唑环的H峰，说明通过点击化学生成了三唑环，通过GPC联用多角度光散射检测器测得其重均分子量为6.2kDa，多分散指数PDI为2.2，说明PEI1800-(ASSA-PEI1800)n中n平均约为2。
实施例12点击化学合成含双硫键的PEI衍生物PEI-SS-C3：
步骤同实施例10，区别在于含双硫键的扩联剂BPPA-Cyst的用量减少为0.08g，CuBr 28毫克，制得的改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物，用PEI-SS-C3表示。核磁氢谱图在7.8ppm处有明显的三唑环的H峰，说明通过点击化学生成了三唑环，通过GPC联用多角度光散射检测器测得其重均分子量为14.2kDa，多分散指数PDI为1.85，说明PEI1800-(ASSA-PEI1800)n，中n平均约为7。
实施例13点击化学合成含双硫键的PEI衍生物PEI-SS-C4：
步骤同实施例10，区别在于PEI-(N3)4的用量减少为0.56克，含双硫键的扩联剂BPPA-Cyst的用量仍为0.16g，CuBr 36毫克，点击化学反应的介质在含水的DMF溶剂中(DMF与水体积比4∶1，10毫升)进行，制得的改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物，用PEI-C4表示。核磁氢谱图在7.8ppm处有明显的三唑环的H峰，说明通过点击化学生成了三唑环，通过GPC联用多角度光散射检测器测得其重均分子量为31.2kDa，多分散指数PDI为2.5，说明PEI1800-(ASSA-PEI1800)n中n平均约为16。
实施例14点击化学合成含双硫键的PEI衍生物PEI-SS-C5：
步骤同实施例10，区别在于使用实施例4制得的PEI-(N3)3，其用量为1.06克，含双硫键的扩联剂BPPA-Cyst的用量为0.11克，CuBr 40毫克，点击化学反应的介质在含水的DMF溶剂中(DMF与水体积比4∶1，10毫升)进行，制得的改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物，用PEI-SS-C5表示。核磁氢谱图在7.8ppm处有明显的三唑环的H峰，说明通过点击化学生成了三唑环，通过GPC联用多角度光散射检测器测得其重均分子量为32kDa，多分散指数PDI为2.8，说明PEI1800-(ASSA-PEI1800)n中n平均约为17。
实施例15点击化学合成含双硫键的超支化PEI衍生物(PEI1800-(BSSA-PEI800)m，用PEI-SS-HP1表示)：
将实施例9制得的产物8，含多炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI1800-(PPA-Cyst-CI)100.20克，和实施例5制得的叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI800-(N3)10.50克溶解于含水的DMF溶剂中(DMF与水体积比10∶1，10毫升)，加入CuBr 20毫克，在氮气保护下，在50℃油浴中反应1天。制得的聚合物溶液装入透析袋(MWCO 3.5kDa)用水透析，冷冻干燥得含双硫键的改性超支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物(PEI1800-(BSSA-PEI800)m)0.15克，m≤10，用PEI-SS-HP1表示。核磁氢谱图在7.8ppm处有明显的三唑环的H峰，说明通过点击化学生成了三唑环，通过GPC测得其数均分子量为8.8kDa，说明PEI1800-(BSSA-PEI800)m中m平均约为7。该反应中的CuBr可改用CuCl；该反应也可以不使用CuBr，而采用提高反应温度(80℃)和延长反应时间(48小时)。
实施例16点击化学合成含双硫键的超支化PEI衍生物(PEI1800-(ASSB-PEI800)m，用PEI-SS-HP2表示)：
将实施例6制得的含多叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI1800-(N3)100.32克，和实施例7制得的炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI800-(PPA-Cyst-CI)11.13克溶解于含水的DMF溶剂中(DMF与水体积比4∶1，20毫升)，加入CuBr 20毫克，在氮气保护下，在50℃油浴中反应1天。制得的聚合物溶液装入透析袋(MWCO 3.5kDa)用水透析，冷冻干燥得含双硫键的改性超支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物(PEI1800-(ASSB-PEI800)m)，m≤10，用PEI-SS-HP2表示。核磁氢谱图在7.8ppm处有明显的三唑环的H峰，说明通过点击化学生成了三唑环，通过GPC测得其数均分子量为11.7kDa，说明PEI1800-(ASSB-PEI800)m中m平均约为9。该反应中的CuBr可改用CuCl；该反应也可以不使用CuBr，而采用提高反应温度(80℃)和延长反应时间(48小时)。
实施例17点击化学合成含双硫键的超支化PEI衍生物(PEI1800-(ASSB-PEI1800)m，用PEI-SS-HP3表示)：
将实施例6制得的含多叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI1800-(N3)100.10克，和实施例8制得的炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI1800-(PPA-Cyst-CI)10.69克溶解于含水的DMF溶剂中(DMF与水体积比4∶1，10毫升)，加入CuBr 15毫克，在氮气保护下，在50℃油浴中反应1天。制得的聚合物溶液装入透析袋(MWCO 3.5kDa)用水透析，冷冻干燥得含双硫键的改性超支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物(PEI1800-(ASSB-PEI1800)m)，m≤10，用PEI-SS-HP3表示。核磁氢谱图在7.8ppm处有明显的三唑环的H峰，说明通过点击化学生成了三唑环，通过GPC测得其数均分子量为15.8kDa，说明PEI1800-(ASSB-PEI1800)m中m平均约为7。该反应中的CuBr可改用CuCl；该反应也可以不使用CuBr，而采用提高反应温度(80℃)和延长反应时间(48小时)。
实施例18含双硫键的改性超支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物(PEI1800-(ASSA-PEI1800)n-(ASSB-PEI800)m)的合成
将实施例12制得的含双硫键的PEI衍生物PEI-SS-C3进一步改性，称取0.20克PEI-SS-C3溶于4毫升DMF，0.3克叠氮丙酯羰基咪唑溶于10毫升DMF，将它们在室温下混合反应2小时，再升温在60℃反应48小时，制得含多叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺；再将实施例7制得的炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI800-(PPA-Cyst-CI)11.4克溶解于含水的DMF溶剂中(DMF与水体积比1∶1，7毫升)，与含多叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺DMF溶液混合，加入CuBr 30毫克，在氮气保护下，在50℃油浴中反应1天。制得的聚合物溶液装入透析袋(MWCO3.5kDa)用水透析，冷冻干燥得含双硫键的改性超支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物(PEI1800-(ASSA-PEI1800)n-(ASSB-PEI800)m)，其中3＜n＜8，5＜m≤10，通过GPC测得其重均分子量为46kDa，用PEI-SS-CHP表示。使用不同的含双硫键的微交联的PEI衍生物(PEI-SS-C系列)和叠氮丙酯羰基咪唑反应，再和炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI800-(PPA-Cyst-CI)1或者PEI800-(PPA-Cyst-CI)1进行点击化学反应，可以同样合成制得多种含双硫键的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物PEI-(ASSA-PEI)n-(ASSB-PEI)m，其中n的取值范围为3-17，m的取值范围为0-30。
实施例19阳离子聚合物体外细胞毒性
阳离子高分子对细胞的毒性是高分子基因传递载体的一个重要评价指标，一般测试在不同浓度高分子作用下对细胞的抑制率和半数抑制浓度IC50来衡量。这里将实施例10-13中合成的微交联型聚乙烯亚胺PEI-SS-C1，PEI-SS-C2，PEI-SS-C3和PEI-SS-C4对293T细胞的体外细胞毒性通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法来法测量。
293T细胞在96孔培养板中以3000细胞/孔接种并加入100μL含血清的DMEM培养基，在5％CO2培养箱中于37℃培养48小时。向每孔细胞中分别加入过滤灭菌的不同浓度的聚合物溶液(0.01 to 0.20mg/mL)100μL和100μL新鲜DMEM培养基)。继续培养48h至材料作用期结束，去除所有含有细胞的孔中的培养基，加入200μL新鲜的DMEM培养基。所有孔中各加入20μL MTT(5mg/ml)。用铝箔包裹培养板，于37℃湿润环境中温育4h。弃去孔中的培养基和MTT，各加入200μL DMSO其中并在室温下振荡，用酶标仪(550BIO-RAD，美国)在570nm处记录吸光值。根据吸光值计算细胞相对成活率。聚合物PEI-SS-C1和PEI-SS-C3及对照聚合物PEI 25kDa和1.8kDa的毒性见图2，该图说明当聚合物的浓度低于0.03毫克/毫升，加入含双硫键的微交联改性聚乙烯亚胺PEI-SS-C1和PEI-SS-C3时相对细胞存活率均高于80％，而加入0.03毫克/毫升25kDa PEI时相对细胞存活率大约只有5％。这些聚合物的半数抑制浓度IC50结果见表1。从表1可知合成的微交联型聚乙烯亚胺PEI-SS-C1，PEI-SS-C2，PEI-SS-C3和PEI-SS-C4的毒性明显低于25kDa PEI。
表1不同聚合物的半数抑制浓度IC50
实施例20聚合物/DNA复合物在无血清存在时的体外转染效率
将实施例10-18中制得的含双硫键改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物分别溶于NaCl溶液(150mM，pH7.4)，过滤灭菌，制备成相应浓度的溶液，在1.5mL无菌离心管中加入50μL含1.0μg质粒DNA(pcDNA3-Luc是荧光素酶的报告基因)溶液，按照N/P比为10-50加入相应量的50μL阳离子聚合物溶液，与DNA复合，震荡5s，该复合物在37℃静置半小时后用于细胞转染实验。用25kDa的PEI和1.8kDa的PEI作为对照，比较了复合物对293T和HeLa细胞的体外转染效率(加入复合物和无血清DMEM培养基后在37℃转染4h，培养基换成1mL完全DMEM培养基后在37℃继续培养48h)。图3展示了PEI-SS-C1和PEI-SS-C3在不同的氮磷比(N/P)时荧光素酶的转染表达效率。图4A展示了PEI-SS-HP2在不同的氮磷比(N/P)时荧光素酶的转染表达效率。这些图说明改性聚乙烯亚胺衍生物PEI-SS-C1，PEI-SS-C2和PEI-SS-HP2的复合物的基因转染效率大大高于原料1.8kDa PEI的复合物(2-3个数量级)，也高于常用高分子基因载体参照聚合物25kDa PEI的复合物的基因转染效率。结果表明：这类还原敏感性改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物复合物对293T和HeLa细胞具有很高的转染效率。
实施例21聚合物/DNA复合物在有血清存在时的体外转染效率
步骤同实施例20，区别在于加入复合物和有10％血清DMEM培养基后在37℃转染4h，培养基换成1mL完全DMEM培养基后在37℃继续培养48h)。图4B和图5展示了有血清存在时不同的氮磷比(N/P)改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物复合物对293T细胞荧光素酶的转染表达效率。结果表明：在有血清存在时，这类还原敏感性改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物对293T细胞或者HeLa细胞的转染效率也较高。
实施例22聚合物/DNA复合物体外绿色荧光蛋白基因转染效率
使用实施例10，实施例12，实施例15和实施例16中制得的含双硫键改性聚乙烯亚胺阳离子聚合物PEI-SS-C1，PEI-SS-C3，PEI-SS-HP1和PEI-SS-HP2分别复合质粒DNA pEGFP(绿色荧光蛋白基因)体外转染293T细胞，转染48小时后，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。结果表明，均能有效转导该细胞，其转染效果均优于对照聚合物PEI 25kDa和1.8kDa。
Claims (10)
1.一种含双硫键改性的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于其化学组成具有下列通式：
式中PEI为重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺；n＝0-30；m＝0-30；n和m不同时为零；所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物重均分子量为5千-8万。
2.根据权利要求1所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于：所述n＝2-25；m＝0；所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物重均分子量在5千-6万之间。
3.根据权利要求1所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于：所述n＝0；m＝2-25；所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物重均分子量在5千-6万之间。
4.根据权利要求2或3所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于PEI为重均分子量在800-2500之间的聚乙烯亚胺。
5.一种制备权利要求2所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的方法，包括如下步骤：
a)化合物2的制备方法：将化合物1和胱胺按摩尔比1-4∶1加入有机溶剂中，在20-60℃下搅拌反应2-48小时，纯化得到化合物2；其中化合物2的结构式为
化合物1的结构式为
b)叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(N3)X的制备方法：
将化合物3和重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺PEI按摩尔比1-5∶1溶于有机溶剂中，在25-80℃下搅拌反应2-48小时，减压除去溶剂，得到产物4含咪唑小分子的叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(N3)X，其中的每个聚乙烯亚胺含叠氮端基的数量X取值范围为2-5；
所述化合物3的结构式为：
所述PEI-(N3)X的结构示意图为：
c)还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备方法：
将上述产物4和化合物2按叠氮端基与炔基的摩尔比0.5-3∶1溶于有机溶剂或者水中或者水和有机溶剂的混合物中，在20-80℃下进行反应1-48小时得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物产物5，其结构示意图为：
6.一种制备权利要求3所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的方法，包括如下步骤：
a)化合物7的制备方法：将化合物1和胱胺按摩尔比0.5-1.5∶1加入有机溶剂中，在20-60℃下搅拌反应2-48小时，纯化得到化合物6；再将化合物6与1，1′-羰基二咪唑按摩尔比0.4-0.75∶1加入有机溶剂中，在20-70℃下搅拌反应2-48小时，纯化得到化合物7；其中化合物7的结构式为
化合物1的结构式为
化合物6的结构式为
b)叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺的制备方法：
将化合物3和重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺PEI按摩尔比0.9-1.1∶1溶于有机溶剂中，在25-60℃下搅拌反应2-24小时，减压除去溶剂，得到含咪唑小分子的叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺，其中的每个聚乙烯亚胺含叠氮端基的数量为0.9-1.1；其中化合物3的结构式为
c)炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(Cyst-CI)Y的制备方法：
将化合物7和重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺按摩尔比2-25∶1溶于有机溶剂中，在25-80℃下搅拌反应2-48小时，减压除去溶剂，得到产物8含咪唑小分子的炔端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(Cyst-CI)Y，其中的每个聚乙烯亚胺含炔端基的数量取值Y为2-25；产物8的结构示意图为：
d)还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备方法：
将上述b)中制得的叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺和产物8按叠氮端基与炔基的摩尔比0.6-2∶1溶于有机溶剂或者水中或者水和有机溶剂的混合物中，在20-80℃下进行反应1-48小时得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其结构示意图为：
式中2≤m≤Y。
7.一种制备权利要求3所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的方法，包括以下步骤：
a)化合物7的制备方法：
将化合物1和胱胺按摩尔比0.5-1.5∶1加入有机溶剂中，在20-60℃下搅拌反应2-48小时，纯化得到化合物6；再将化合物6与1，1′-羰基二咪唑按摩尔比0.4-0.75∶1加入有机溶剂中，在20-70℃下搅拌反应2-48小时，纯化得到化合物7；其中化合物7的结构式为
化合物1的结构式为
化合物6的结构式为
b)叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(N3)X的制备方法：
将化合物3和重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺PEI按摩尔比2-25∶1溶于有机溶剂中，在25-80℃下搅拌反应2-48小时，减压除去溶剂，得到含咪唑小分子的叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺，其中的每个叠氮端基功能化的聚乙烯亚胺PEI-(N3)X含叠氮端基的数量X取值范围为2-25；其中化合物3的结构式为
c)炔端基功能化的聚乙烯亚胺的制备方法：
将化合物7和重均分子量在600-5000之间的聚乙烯亚胺按摩尔比0.9-1.1∶1溶于有机溶剂中，在20-60℃下搅拌反应2-48小时，减压除去溶剂，得到含咪唑小分子的炔端基功能化的聚乙烯亚胺，其中的每个聚乙烯亚胺含炔端基的数量取值范围为0.9-1.1；
d)还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备方法：
将上述c)中制得的炔端基功能化的聚乙烯亚胺和PEI-(N3)X按炔基端基与叠氮端基的摩尔比0.6-2∶1溶于有机溶剂或者水中或者水和有机溶剂的混合物中，在20-80℃下进行反应1-48小时得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物产物，其结构示意图为：
式中2≤m≤X。
8.权利要求1所述的含双硫键改性的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物作为基因载体的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述基因载体为用于人体或者动植物细胞基因传导的载体。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：对含双硫键改性的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，引入靶向基团和/或引入可以交联的组分。
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