CN104031268B - 聚乙烯亚胺三嵌段共聚物及其在基因载体中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚乙烯亚胺三嵌段共聚物及其在基因载体中的用途；所述共聚物PEI‑PLA‑PEG的结构式如下所示：其中，PEG的分子量为2000～10000g/mol中的任意一个整数，PLA的分子量为3000～10000g/mol，PEI的分子量为1800～10000g/mol。该嵌段共聚物可以自组装成纳米胶束作为基因载体应用于基因药物输送体系，在负载基因药物的同时还可以包裹疏水小分子药物，从而成为基因/疏水药物的双重载体。
Description
技术领域
本发明属于化学合成、生物化学、药剂学领域，具体涉及一种聚乙烯亚胺三嵌段共聚物及其在基因载体中的用途。
背景技术
基因治疗是指将外源的目的基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。基因治疗作为新兴的治疗手段，是药学领域研究的热点之一，有着巨大的应用前景。基因药物输送体系以研究制备合适的基因载体负载基因药物为目标，使基因药物能够跨越体内环境中各种屏障，将其输递至靶细胞，实现该药物的高效表达，它是基因治疗研究的重要内容。嵌段共聚物自组装纳米体系作为基因载体具有低毒、低免疫反应、靶向性、易于控制释放等优点，已经成为当今基因治疗领域里一个新的研究热点和重要的研究方向。
基于聚合物自组装纳米体系在基因药物输送体系中的良好应用前景，近年来，科研工作者为靶向基因药物输送体系的研究做出了大量的努力，这一方面取得了长足的发展，然而达到理想效果的靶向输送体系却非常少，理想的靶向输送体系需要安全稳定穿越各种屏障从而把基因药物输送至靶细胞，在细胞内实现控制。还原敏感性载体有着远大的应用前景，因为细胞内环境的谷胱甘肽(GSH)浓度(2-10mM)远远超过细胞外环境的浓度(2-20μM)，设计对谷胱甘肽还原作用敏感的含二硫键基因输送载体，其在体外及体液环境中都可以稳定的负载和输送基因药物，待进入靶向细胞后在还原条件的刺激作用下有效的释放基因治疗药物。
聚乙二醇(PEG)和聚乳酸(PLA)是被美国食品和药物管理局(FDA)批准的具有良好的生物相容性的药物辅料，广泛应用于生物医学领域。PEG表面化的纳米颗粒可以阻止纳米颗粒被网状内皮系统所识别以防止蛋白质吸附，屏蔽人体内皮网状系统(RES)的捕获和清除作用，延长血液循环时间。聚乳酸由于其价格低廉、降解缓慢以及较低的生物毒性使得其在生物医学领域中也得到了广泛的应用。
聚乙烯亚胺(PEI)是一种具有较高转染效率的阳离子聚合物，它具有的“质子海绵效应”使它在多种细胞和组织中都具有良好的基因转染效果。这种效应是由于它具有很强的质子缓冲能力，通过细胞内吞作用进入溶酶体后改变溶酶体的离子渗透压，引起溶酶体破裂并释放所携带的基因药物。
本发明以PLA为疏水片段，PEG为亲水片段，低分子量的PEI为阳离子片段，通过特定的双重二硫键链接单元——分子胶(201110023046.1；201110418589.3；201210311659.X；201210545392.0；201210442360.8；201210563824.0；201310317966.3；PCT/CN2013/088478)使其有机地链接在一起形成两亲性三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG，嵌段共聚物PEI-PLA-PEG可以自组装成纳米胶束作为基因载体应用于基因药物输送体系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚乙烯亚胺三嵌段共聚物及其在基因载体中的用途。本发明设计合成一种通过双重二硫键为链接单元的两亲性三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG，该嵌段共聚物可以自组装成纳米胶束作为基因载体应用于基因药物输送体系，同时也可以作为疏水小分子药物的载体应用于化疗药物的输送。本发明以PLA为疏水片段，PEG为亲水片段，低分子量的PEI为阳离子片段，通过特定的双二硫键链接单元-分子胶，使其链接在一起形成两亲性阳离子嵌段共聚物PEI-PLA-PEG，其中引入的双二硫键赋予了嵌段共聚物的还原敏感性特征，其自组装纳米负载的基因药物在细胞内GSH的调控作用下可以控制药物释放。制备过程中的合成原料试剂易得，条件温和，合成过程均为常规化学反应，并适合较大规模生产。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG，其结构式如式(I)所示：
其中，PEG的分子量为2000～10000g/mol中的任意一个整数，PLA的分子量为3000～10000g/mol，PEI的分子量为1800～10000g/mol。该两亲性三嵌段共聚物涉及通过氢键序列选择性控制的双二硫键的形成。
第二方面，本发明还涉及一种上述的聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG的制备方法，以二氯甲烷为溶剂，在I2存在的条件下，亲水片段化合物PEG-A4PEI-A4和疏水片段化合物Z1-PLA-Z1进行氧化反应，即得所述PEI-PLA-PEG。
具体反应步骤如下：
分别取亲水片段和疏水片段的二氯甲烷溶液，混合均匀旋除DCM，残留物用I2的二氯甲烷溶液溶解，常温反应，TLC跟踪至反应完全。
反应结束后，将反应液冷却到0℃，加入Na2S2O3直至I2的颜色消失，再用DCM萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋去溶剂，薄层层析得淡黄色片状固体产品。
优选的，所述PEG-A4、PEI-A4、Z1-PLA-Z1和I2的摩尔比为2∶2∶1.5∶48。
优选的，所述亲水片段化合物PEG-A4是通过包括如下步骤的方法制备而得：在NMM(N-甲基吗啉)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)存在的条件下，以DMF(N，N-二甲基甲酰胺)为溶剂，化合物A4与PEG-NH2 在冰浴条件下进行酰胺化反应得所述PEG-A4；所述A4、NMM、HATU和PEG-NH2的摩尔比为1∶(1.0～2.0)∶(1.5～3)∶(1.0～2)。
具体反应步骤如下：
以DMF为溶剂，冰水浴下加入A4，NMM(N-甲基吗啉)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)活化，TLC监测活化反应完全后，加入PEG-NH2冰浴下继续搅拌反应1h，然后升温至室温反应，TLC监测反应结束。反应结束后，加入适量水，用DCM(二氯甲烷)萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋去溶剂，柱层析得淡黄色固体产品。
优选的，所述亲水片段化合物PEI-A4是通过包括如下步骤的方法制备而得：在NMM(N-甲基吗啉)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N一四甲基脲六氟磷酸酯)存在的条件下，以DMF为溶剂，化合物A4与PEI-NH2 在冰浴条件下进行酰胺化反应得所述PEI-A4；所述A4、NMM、HATU和PEI-NH2的摩尔比为1∶(1.0～2.0)∶(1.5～2.0)∶1。
具体反应步骤如下：
以DMF为溶剂，冰水浴下加入A4，NMM(N-甲基吗啉)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)活化，TLC监测活化反应完全后，加入PEI-NH2冰浴下继续搅拌反应1h，然后升温至室温反应，TLC监测反应结束。反应结束后，反应液倒入适量乙醚中析出沉淀，离心后以乙醚洗涤三次干燥得淡黄色粘稠物产品。
优选的，所述疏水片段化合物Z1-PLA-Z1是通过包括如下步骤的方法制备而得：
A、以CH2Cl2为溶剂，在DMAP(4-二甲氨基吡啶)存在的条件下，PLA与丁二酸酐在冰浴条件下反应得端羧基PLA所述PLA、DMAP、丁二酸酐的摩尔比为1∶2∶3。
B、以DMF为溶剂，在NMM(N-甲基吗啉)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)存在的条件下，端羧基PLA与化合物Z1在冰浴条件下进行酰胺化反应得所述Z1-PLA-Z1；所述PLA、NMM、HATU和Z1的摩尔比为1∶4∶4∶(2.5～3.0)。
具体反应步骤如下：
以CH2Cl2为溶剂，PLA溶解入CH2Cl2后，加入DMAP，冰水浴下加入丁二酸酐，搅拌反应1h，然后升温至室温反应，TLC监测反应结束。反应结束后，加入适量水，用DCM萃取，有机相分别用饱和NaHCO3水溶液、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋去溶剂即得改性为端羧基的PLA。
以DMF为溶剂，冰水浴下加入端羧基PLA，NMM(N-甲基吗啉)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)活化，TLC监测活化反应完全后，加入Z1冰浴下继续搅拌反应1h，然后升温至室温反应，TLC监测反应结束。反应结束后，加入适量水，用DCM萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋去溶剂，柱层析得白色固体产品。
第三方面，本发明还涉及一种两亲性嵌段共聚物自组装胶束的制备方法，将前述的聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG溶于极性溶剂，缓慢滴加入搅拌的水相中使其形成微乳球，装入透析袋透出所述极性溶剂即得自组装胶束。
本发明涉及的胶束表征方法有：最低聚集浓度(CMC值)的测定，粒径大小测定，胶束表面电位的测定(Zeta电位)，胶束形貌测定TEM(透射电镜)。
优选的，所述极性溶剂为DMSO(二甲基亚砜)或DMF，透析袋分子量为0.2KD，水相为PBS(磷酸缓冲液)缓冲液。
第四方面，本发明涉及一种前述的聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG在制备基因载体中的用途，所述聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG溶于极性溶剂，缓慢滴加入搅拌的水相中使形成微乳球，装入透析袋透出所述极性溶剂得自组装胶束；所述自组装胶束用作基因载体。本发明提供的是ABC型嵌段共聚物，其中采用了表面有正电荷含氮的聚合物PEI，只有这样才能吸附带负电荷的RNA/DNA等基因药物；此外，基因药物是很不稳定的，如果不用纳米胶束包裹，在体内很快就会被降解。因此，如果是PEG-PLA-PEG型的胶束，则无论如何都不能包裹RNA/DNA等基因药物。
本发明涉及了嵌段共聚物胶束作为基因载体的应用，应用包括：空白胶束的细胞毒性测试，胶束的RNA负载作用，负载RNA胶束的控制释放及细胞转染。
优选的，所述自组装胶束可负载RNA。
优选的，所述负载RNA胶束能进入癌细胞并且在谷胱甘肽作用下释放出RNA药物作用于癌细胞。
本发明涉及制备的嵌段共聚物胶束稳定性良好，空白胶束对正常细胞无毒害作用，负载RNA胶束在还原性谷胱甘肽(GSH)的作用下释放负载的RNA，负载RNA胶束能进入癌细胞并且在谷胱甘肽作用下释放出RNA药物作用于癌细胞。其中，所述正常细胞为大鼠胚胎成纤维细胞系(NIH3T3)细胞，癌细胞为人胃癌细胞系(SGC7901)；所述RNA为siRNA或miRNA。
第五方面，本发明涉及一种前述的聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG在制备疏水小分子药物载体中的用途，所述聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG与水难溶性药物溶于极性溶剂得混合液，所述混合液缓慢滴加入搅拌的水相中使形成微乳球，装入透析袋透出所述极性溶剂得自组装胶束；所述自组装胶束用作疏水小分子药物载体应用于疏水药物输送体系。
第六方面，本发明涉及一种前述的聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG在制备负载基因药物和疏水药物的载体中的用途，所述三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG在包裹疏水药物后形成的载药胶束表面带有正电荷，此载药胶束可以进一步吸附基因药物，使得嵌段共聚物同时具有负载基因和疏水药物的双重作用。也就是说，本发明结构的嵌段共聚物能够生成包裹了基因药物和抗癌药物的胶束，产生了意想不到的治疗效果。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明首次设计合成一种通过双重二硫键为链接单元的两亲性三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG，其可以自组装成纳米胶束作为基因载体应用于基因药物输送体系。该类化合物合成原料简单易得，合成过程均为常规反应，适合较大规模生产。
2、本发明制备的嵌段共聚物胶束稳定性良好，空白胶束对正常细胞(NIH3T3细胞)无毒害作用，载药胶束在还原剂二硫苏糖醇或还原性谷胱甘肽等还原剂作用下能够有效释放所吸附的RNA，负载RNA胶束能有效进入癌细胞并且在癌细胞中释放出RNA与癌细胞作用抑制癌细胞生长。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为亲水片段PEG-A4的合成示意图；
图2为亲水片段PEI-A4的合成示意图；
图3为疏水片段Z1-PLA-Z1的合成示意图；
图4为两亲性三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG的合成示意图；
图5为PEI-PLA-PEG合成中的各聚合物的1H-NMR对比图；
图6为PEI-PLA-PEG合成中的各聚合物的FT-Z1对比图；
图7为PEG1800-PLA5000-PEG2000胶束浓度对吸光度A的关系图；
图8(a)为PEI1800-PLA5000-PEG2000空白胶束的粒径分布图，图8(b)为PEI1800-PLA5000-PEG2000空白胶束的透射电镜图；
图9(a)为PEI1800-PLA5000-PEG2000载药胶束的粒径分布图，图9(b)为PEI1800-PLA5000-PEG2000载药胶束的透射电镜图；
图10为空白胶束吸附RNA胶束在不同N/P比条件的凝胶成像图；
图11为载药胶束吸附RNA胶束在不同N/P比条件的凝胶成像图；
图12为空白胶束与胶束RNA复合物的Zeta电位示意图；
图13为不同N/P比条件吸附RNA胶束对DTT刺激响应的凝胶成像图；
图14为空白胶束对NIH3T3细胞的毒性实验示意图；
图15为胶束RNA复合物不同时间条件下对SGC7901癌细胞的转染示意图；
图16为流式细胞术测胶束RNA复合物不同时间条件下对SGC7901癌细胞转染细胞数的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明所用的原料、试剂均为市售AR、CP级。
本发明所得中间产物及最终产物均采用1H-NMR，IR，GPC等进行表征。
实施例1、两亲性三嵌段共聚物PEI-PM-PEG的合成
一、亲水片段PEG-A4的合成
(1)当PEG的n＝44时，Mn＝2000；其合成路线如图1所示：在碱性条件下，取化合物A4与末端为氨基的PEG2000进行酰胺化反应，得化合物PEG2000-A4；
所述步骤具体为：称取A4(0.841g，1mmol)溶于15ml DMF于25ml的单口烧瓶中，冰水浴搅拌下加入NMM(N-甲基吗啉)(167μL，1.5mmol)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)(0.76g，2.0mmol)活化30min后，加入PEG2000(3.0g，1.5mmol)搅拌1h后升温至室温反应18h，停止反应，加入适量二氯甲烷萃取，水洗两次，饱和NaCl溶液洗涤两次，有机相减压蒸馏得淡黄色固体2.4g，产率85.01％。
1H-NMR(CD3OD，400MHz)δ7.93(m，2H，ArH)，7.65(s，1H，ArH)，7.12-7.35(m，30H，ArH)，3.76(m，4H，-OCH2CH2O-)，3.54-3.58(m，200H，-OCH2CH2O-)，3.51(m，4H，-OCH2CH2O-)，3.33(s，3H，CH3O-)，2.32(m，4H，-SCH2-)，2.20(m，4H，-CH2-)，1.70(m，4H，-COCH2-)。GPC：Mn＝2783，Mw＝2903，D＝1.04。IR(KBr)2869，1757，1684，1602，1550，1447，1351，1295，1249，1189，1106，949，847，747，702，621，556。
(2)当PEG的n＝112时，Mn＝5000；其合成路线如图1所示：在碱性条件下，取化合物A4与末端为氨基的PEG5000进行酰胺化反应，得化合物PEG5000-A4；
所述步骤具体为：亲水片段化合物PEG-A4的合成示意图如图1所示；称取A4(0.841g，1mmol)溶于15ml DMF于25ml的单口烧瓶中，冰水浴搅拌下加入NMM(N-甲基吗啉)(223μL，2.0mmol)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)(1.14g，3mmol)活化30min后，加入PEG5000(10.0g，2mmol)搅拌1h后升温至室温反应24h，停止反应，加入适量二氯甲烷萃取，水洗两次，饱和NaCl溶液洗涤两次，有机相减压蒸馏得淡黄色固体4.4g，产率75.81％。
1H-NMR(CD3OD，400MHz)δ7.93(m，2H，ArH)，7.65(s，1H，ArH)，7.12-7.35(m，30H，ArH)，3.76(m，4H，-OCH2CH2O-)，3.54-3.58(m，477H，-OCH2CH2O-)，3.51(m，4H，-OCH2CH2O-)，3.33(s，3H，CH3O-)，2.32(m，4H，-SCH2-)，2.20(m，4H，-CH2-)，1.70(m，4H，-COCH2-)。GPC：Mn＝5678，Mw＝6212，D＝1.09。IR(KBr)2882，1755，1664，1601，1553，1466，1350，1302，1280，1082，955，843，747，702，621，580。
(3)当PEG的n＝225时，Mn＝10000；其合成路线如图1所示：在碱性条件下，取化合物A4与末端为氨基的PEG10000进行酰胺化反应，得化合物PEG10000-A4；
所述步骤具体为：亲水片段化合物PEG-A4的合成示意图如图1所示；称取A4(0.0841g，0.1mmol)溶于15ml DMF于25ml的单口烧瓶中，冰水浴搅拌下加入NMM(N-甲基吗啉)(16.7μL，0.15mmol)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)(0.057g，0.15mmol)活化30min后，加入PEG10000(2.0g，0.2mmol)搅拌1h后升温至室温反应18h，停止反应，加入适量二氯甲烷萃取，水洗两次，饱和NaCl溶液洗涤两次，有机相减压蒸馏得淡黄色固体0.87g，产率81％。
1H-NMR(CD30D，400MHz)δ7.72(m，2H，ArH)，7.41(s，1H，ArH)，7.21-7.30(m，30H，ArH)，3.82(m，4H，-OCH2CH2O-)，3.57-3.72(m，1138H，-OCH2CH2O-)，3.48(m，4H，-OCH2CH2O-)，3.38(s，3H，CH3O-)，2.37-2.41(m，4H，-SCH2-)，2.24-2.28(m，4H，-CH2-)，1.75-1.81(m，4H，-COCH2-)。GPC：Mn＝9158，Mw＝9853，D＝1.07。IR(KBr)2882，1759，1665，1601，1553，1465，1355，1302，1280，1082，958，846，747，702，621。
二、亲水片段PEI-A4的合成
(1)当PEI的t＝1时，Mn＝1800；其合成路线如图2所示：在碱性条件下，取化合物A4与末端为氨基的PEG1800进行酰胺化反应，得化合物PEI1800-A4；
所述步骤具体为：称取A4(0.841g，1mmol)溶于15ml DMF于25ml的单口烧瓶中，冰水浴搅拌下加入NMM(N-甲基吗啉)(167μL，1.5mmol)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)(0.76g，2.0mmol)活化30min后，加PEI1800(1.8g，1.0mmol)搅拌1h后升温至室温反应24h，停止反应，反应液滴入乙醚离心的黄色粘稠物2.5g，产率98％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.46(s，1H，ArH)，8.16-8.09(m，2H，-NH(C＝O)-)，7.97(s，2H，ArH)，7.44-7.13(m，30H，ArH)，3.05-2.41(m，162H，PEI，2H per repeating unit，-CH2CH2-)，2.39-2.29(m，4H，-CH2S-)，2.28-2.18(m，4H，-CH2CO-)，1.84-1.66(m，4H，-CH2CH2CH2-).GPC：Mn＝2885，Mw＝2903，D＝1.05。IR(KBr)3480，2942，2829，1659，1595，1447，1385，1123，843，747，702，621，556。
(2)当PEI的t＝12时，Mn＝7000；其合成路线如图2所示：在碱性条件下，取化合物A4与末端为氨基的PEG7000进行酰胺化反应，得化合物PEI7000-A4；
所述步骤具体为：称取A4(0.841g，1mmol)溶于15ml DMF于25ml的单口烧瓶中，冰水浴搅拌下加入NMM(N-甲基吗啉)(167μL，1.5mmol)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)(0.76g，2.0mmol)活化30min后，加PEI7000(7.0g，1.0mmol)搅拌1h后升温至室温反应24h，停止反应，反应液滴入乙醚离心的黄色粘稠物6.93g，产率96％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.45(s，1H，ArH)，8.14-8.09(m，2H，-NH(C＝O)-)，7.98(s，2H，ArH)，7.42-7.13(m，30H，ArH)，3.05-2.42(m，162H，PEI，2H per repeating unit，-CH2CH2-)，2.36-2.29(m，4H，-CH2S-)，2.28-2.16(m，4H，-CH2CO-)，1.83-1.63(m，4H，-CH2CH2CH2-).GPC：Mn＝7987，Mw＝8705，D＝1.09。IR(KBr)3483，2946，2827，1663，1595，1446，1385，1124，843，745，702，621，557。
(3)当PEI的t＝18时，Mn＝10000；其合成路线如图2所示：在碱性条件下，取化合物A4与末端为氨基的PEG10000进行酰胺化反应，得化合物PEI10000-A4；
所述步骤具体为：称取A4(0.841g，1mmol)溶于15ml DMF于25ml的单口烧瓶中，冰水浴搅拌下加入NMM(N-甲基吗啉)(167μL，1.5mmol)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)(0.76g，2.0mmol)活化30min后，加PEI10000(1.8g，1.0mmol)搅拌1h后升温至室温反应24h，停止反应，反应液滴入乙醚离心的黄色粘稠物10.03g，产率93％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.46(s，1H，ArH)，8.17-8.08(m，2H，-NH(C＝O)-)，7.99(s，2H，ArH)，7.46-7.14(m，30H，ArH)，3.06-2.45(m，162H，PEI，2H perrepeating unit，-CH2CH2-)，2.39-2.31(m，4H，-CH2S-)，2.29-2.17(m，4H，-CH2CO-)，1.82-1.65(m，4H，-CH2CH2CH2-).GPC：Mn＝10983，Mw＝12303，D＝1.12。IR(KBr)3480，2945，2830，1659，1596，1445，1387，1123，843，745，706，620，557。
三、疏水片段Z1-PLA-Z1的合成
(1)当PLA的m＝38时，Mn＝3000；其合成路线如图3所示：改性PLA3000得到端羧基PLA，在酰胺化反应条件下，取化合物Z1与改性的PLA3000进行酰胺化反应，得化合物Z1-PLA3000-Z1；
所述步骤具体为：称取PLA3000(3.0g，1mmol)溶于20ml CH2Cl2中，冰水浴下加入一次加入DMAP(0.244g，2mmol)，丁二酸酐(0.3g，3mmol)搅拌1h后室温搅拌15h，反应结束后，加入适量水，用DCM萃取，有机相分别用饱和NaHCO3水溶液、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂即得改性为端羧基的PLA。
称取以上改性后的端羧基PLA3000(0.31g，0.1mmol)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)(0.152g，0.4mmol)，Z1(0.235，0.3mmol)于25ml的干燥的单口烧瓶中，冰水浴下氮气保护下加入NMM(N-甲基吗啉)(44.8μL，0.4mmol)，干燥的DMF15ml搅拌30min后升温至35℃反应12h，停止反应，加入适量二氯甲烷萃取，水洗两次，饱和NaCl溶液洗涤两次，有机相减压蒸馏得淡黄色固体0.42g，柱层析的产品0.35g，产率75％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.23-7.94(m，4H，ArH)，7.76(m，2H，ArH)，7.42-7.18(m，60H，ArH)，6.48(brs，4H，NH)，5.25-5.01(m，35H，PLA-CH-)，3.28-3.25(m，8H，-NCH2-)，2.80(m，4H，-CH2CH2-)，2.52-2.49(s，8H，-SCH2-)，1.71(m，3H，CH3CH2-)，1.68-1.45(s，102H，PLA-CH3-).GPC：Mn＝4002，Mw＝4205，D＝1.05。IR(KBr)3303，3058，2992，2927，1755，1657，1596，1557，1538，1489，1445，1379，1362，1268，1187，1131，1092，1046，892，742，701，621，505。
(2)当PLA的m＝66时，Mn＝5000；其合成路线如图3所示：改性PLA5000得到端羧基PLA，在酰胺化反应条件下，取化合物Z1与改性的PLA5000进行酰胺化反应，得化合物Z1-PLA5000-Z1。
所述步骤具体为：称取PLA5000(5.0g，1mmol)溶于20ml CH2Cl2中，冰水浴下加入一次加入DMAP(0.244g，20mmol)，丁二酸酐(0.3g，30mmol)搅拌1h后室温搅拌22h，反应结束后，加入适量水，用DCM萃取，有机相分别用饱和NaHCO3水溶液、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂即得改性为端羧基的PLA。
称取以上改性后的端羧基PLA5000(0.51g，0.1mmol)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)(0.152g，0.4mmol)，Z1(0.195，0.25mmol)于25ml的干燥的单口烧瓶中，冰水浴下氮气保护下加入NMM(N-甲基吗啉)(44.8μL，0.4mmol)，干燥的DMF15ml搅拌30min后升温至35℃反应18h，停止反应，加入适量二氯甲烷萃取，水洗两次，饱和NaCl溶液洗涤两次，有机相减压蒸馏得淡黄色固体0.65g，柱层析的产品0.53g，产率80％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.20-7.94(m，4H，ArH)，7.75(m，2H，ArH)，7.42-7.16(m，60H，ArH)，6.48(brs，4H，NH)，5.25-5.01(m，64H，PLA-CH-)，3.28-3.23(m，8H，-NCH2-)，2.78(m，4H，-CH2CH2-)，2.52-2.49(m，8H，-SCH2-)，1.66-1.46(m，192H，PLA-CH3-).GPC：Mn＝6738，Mw＝8018，D＝1.19。IR(KBr)3417，2993，2943，1755，1650，1597，1533，1449，1381，1268，1187，1131，1090，865，739，702，639，506。
(3)当PLA的m＝135时，Mn＝10000；其合成路线如图3所示：改性PLA10000得到端羧基PLA，在酰胺化反应条件下，取化合物Z1与改性的PLA10000进行酰胺化反应，得化合物Z1-PLA10000-Z1。
所述步骤具体为：称取PLA10000(10.0g，1mmol)溶于20ml CH2Cl2中，冰水浴下加入一次加入DMAP(0.244g，2mmol)，丁二酸酐(0.3g，3mmo1)搅拌1h后室温搅拌22h，反应结束后，加入适量水，用DCM萃取，有机相分别用饱和NaHCO3水溶液、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂即得改性为端羧基的PLA。
称取以上改性后的端羧基PLA10000(1.01g，0.1mmol)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)(0.152g，0.4mmol)，Z1(0.235g，0.3mmol)于25ml的干燥的单口烧瓶中，冰水浴下氮气保护下加入NMM(N-甲基吗啉)(44.8μL，0.4mmol)，干燥的DMF15ml搅拌30min后升温至35℃反应36h，停止反应，加入适量二氯甲烷萃取，水洗两次，饱和NaCl溶液洗涤两次，有机相减压蒸馏得淡黄色固体1.168g，柱层析的产品0.73g，产率63％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.17-7.93(m，4H，ArH)，7.76(m，2H，ArH)，7.42-7.17(m，60H，ArH)，6.43(brs，4H，NH)，5.25-5.01(m，133H，PLA-CH-)，3.28-3.24(m，8H，-NCH2-)，2.78(m，4H，-CH2CH2-)，2.52-2.48(m，8H，-SCH2-)，1.66-1.46(m，399H，PLA-CH3-)。GPC：Mn＝10946，Mw＝13463，D＝1.23。IR(KBr)3316，3057，2931，1755，1660，1696，1538，1445，13
四、嵌段共聚物PEI-PLA-PEG的合成
(1)PEI1800-PLA3000-PEG2000的合成
当PEI的t＝3时，Mn＝1800；当PEG的n＝44时，Mn＝2000；当PLA的m＝38时，Mn＝2000；其合成路线如图4所示：在氧化反应条件下，取化合物PEI1800-A4，PEG2000-A4与Z1-PLA3000-Z1进行氧化反应，得嵌段共聚物PEI1800-PLA3000-PEG2000。
所述步骤具体为：分别称取PEI1800-A4(26mg，0.01mmol)，PEG2000-A4(28mg，0.01mmol)和Z1-PLA3000-Z1(46mg，0.01mmol)溶入20ml二氯甲烷于250ml单口瓶中，搅拌溶解混合均匀后减压蒸馏干，残留物加入60ml二氯甲烷I2溶液(其中I2为6.0mM)溶解，常温搅拌1h后将反应液冷却到0℃，加入Na2S2O3(3.0mM)直至I2的颜色消失。旋蒸干有机层，固体物质以(乙醚：丙酮50∶15)溶液超声分散离心后的白色固体产品51mg产率：56％.
1H NMR(400MHz，DMSO)δ9.35-6.81(m，ArH)，5.54-4.93(m，PLA(-CH-))，3.46-3.26(m，PEG(-CH2CH2-))，3.24-2.55(m，PEI(-CH2CH2-))，1.72-1.33(m，PLA(CH3-)).GPC：Mn＝7670，Mw＝8744，D＝1.14。IR(KBr)3459，2880，1757，1655，1545，1452，1353，1191，1093，1033，1012，953，844，754，706，634，601，532.
(2)PEI1800-PLA5000-PEG2000的合成
当PEI的t＝3时，Mn＝1800；当PEG的n＝44时，Mn＝2000；当PLA的m＝66时，Mn＝5000；，其合成路线如图4所示：在氧化反应条件下，取化合物PEI1800-A4，PEG2000-A4与Z1-PLA5000-Z1进行氧化反应，得嵌段共聚物PEI1800-PLA5000-PEG2000。
所述步骤具体为：分别称取PEI1800-A4(26mg，0.01mmol)，PEG2000-A4(28mg，0.01mmol)和Z1-PLA5000-Z1(65mg，0.01mmol)溶入20ml二氯甲烷于250ml单口瓶中，搅拌溶解混合均匀后减压蒸馏干，残留物加入60ml二氯甲烷I2溶液(其中I2为6.0mM)溶解，常温搅拌1h后将反应液冷却到0℃，加入Na2S2O3(3.0mM)直至I2的颜色消失。旋蒸干有机层，固体物质以(乙醚：丙酮50∶15)溶液超声分散离心后的白色固体产品40mg产率：40％.
1H NMR(400MHz，DMSO)δ9.34-6.82(m，ArH)，5.53-4.94(m，PLA(-CH-))，3.45-3.26(m，PEG(-CH2CH2-))，3.24-2.57(m，PEI(-CH2CH2-))，1.72-1.32(m，PLA(CH3-)).GPC：Mn＝10936，Mw＝12685，D＝1.16。IR(KBr)3458，2875，1758，1653，1548，1452，1356，1191，1092，1036，1012，950，844，753，706，634，601，531。
(3)PEI7000-PLA10000-PEG5000的合成
当PEI的t＝12时，Mn＝7000；当PEG的n＝112时，Mn＝5000；当PLA的m＝135时，Mn＝10000，其合成路线如图4所示：在氧化反应条件下，取化合物PEI7000-A4，PEG5000-A4与Z1-PLA10000-Z1进行氧化反应得嵌段共聚物PEI7000-PLA10000-PEG5000。
所述步骤具体为：分别称取PEI7000-A4(78mg，0.01mmol)，PEG5000-A4(58mg，0.01mmol)和Z1-PLA10000-Z1(120mg，0.01mmol)溶入20ml二氯甲烷于250ml单口瓶中，搅拌溶解混合均匀后减压蒸馏干，残留物加入60ml二氯甲烷I2溶液(其中I2为6.0mM)溶解，常温搅拌1h后将反应液冷却到0℃，加入Na2S2O3(3.0mM)直至I2的颜色消失。旋蒸干有机层，固体物质以(乙醚：丙酮50∶15)溶液超声分散离心后的白色固体产品85mg产率：36％.
1H NMR(400MHz，DMSO)δ9.35-6.83(m，ArH)，5.53-4.93(m，PLA(-CH-))，3.44-3.26(m，PEG(-CH2CH2-))，3.24-2.54(m，PEI(-CH2CH2-))，1.75-1.33(m，PLA(CH3-)).GPC：Mn＝22223，Mw＝26223，D＝1.18。IR(KBr)3478，2883，1753，1658，1545，1455，1355，1194，1093，1038，1016，953，846，754，708，636，603，531。
(4)PEI10000-PLA10000-PEG10000的合成
当PEI的t＝18时，Mn＝10000；当PEG的n＝135时，Mn＝10000；当PLA的m＝135时，Mn＝10000，其合成路线如图4所示：在氧化反应条件下，取化合物PEI10000-A4，PEG10000-A4与Z1-PLA10000-Z1进行氧化反应，得嵌段共聚物PEI10000-PLA10000-PEG10000。
所述步骤具体为：分别称取PEI10000-A4(110mg，0.01mmol)，PEG10000-A4(110mg，0.01mmol)和Z1-PLA10000-Z1(120mg，0.01mmol)溶入20ml二氯甲烷于250ml单口瓶中，搅拌溶解混合均匀后减压蒸馏干，残留物加入60ml二氯甲烷I2溶液(其中I2为6.0mM)溶解，常温搅拌1h后将反应液冷却到0℃，加入Na2S2O3(3.0mM)直至I2的颜色消失。旋蒸干有机层，固体物质以(乙醚：丙酮50∶15)溶液超声分散离心后的白色固体产品121mg产率：38％.
1H NMR(400MHz，DMSO)δ9.38-6.83(m，ArH)，5.54-4.93(m，PLA(-CH-))，3.46-3.28(m，PEG(-CH2CH2-))，3.28-2.54(m，PEI(-CH2CH2-))，1.76-1.34(m，PLA(CH3-)).GPC：Mn＝29354，Mw＝35518，D＝1.21。IR(KBr)3476，2885，1755，1655，1543，1458，1358，1194，1098，1038，1016，957，846，754，708，638，605，531。
聚合物的核磁对比图如图5，红外对比图如图6，比较三组聚合物的核磁图中互相重叠的区域可以发现，PEI-PLA-PEG包含有PEI-A4化学位移δ＝3.28-2.54的PEI的-CH2CH2-重复单元，同时也含有化学位移δ＝5.54-4.93，1.76-1.34，两处PLA的-CH-，-CH3重复单元，PEG-A4化学位移δ＝3.46-3.28的-CH2CH2-重复单元，苯环区的氢数目减少说明脱掉三苯甲基形成了二硫键。比较三组聚合物的红外光谱图中互相重叠的区域可以发现，PEI-PLA-PEG含有PEI-A4中因O-H和N-H氢键作用引起的3200～3500cm叫处的吸收峰，而2885cm-1、1458cm-1、1194cm-1、1098cm-1处出现PEG-A4，Z1-PLA-Z1中饱和脂肪长链的甲基和次甲基的吸收峰，在1755cm-1处出现的强吸收峰，是PLA中C＝O吸收峰及酰化的C＝O吸收峰，1647cm-1，1602cm-1，1553cm-1处的吸收峰表现为连接单元处的苯环吸收峰，综合以上分析，可以证明PEI，PLA，PEG三者通过分子胶连接成了嵌段共聚物PEI-PLA-PEG。
实施例2、嵌段共聚物分子量的测定
采用GPC法测定实施例1中制得的聚合物的分子量；仪器：Agilent1260型凝胶渗透色谱仪，GPC柱：7.5×300mm、10μm的凝胶色谱柱，溶剂：四氢呋喃，流速：1.0mL/min，柱温：35℃，标样：聚苯乙烯。各聚合物的GPC测定的分子量：数均分子量Mn，重均分子量Mw，分散度PDI(Mw/Mn)，如下表1所示。
表1各聚合物的分子量及分子量分布范围
| Polymer | Mn | Mw | PDI |
| PEG2000-A4 | 2783 | 2903 | 1.04 |
| PEG5000-A4 | 5678 | 6212 | 1.09 |
| PEG10000-A4 | 9158 | 9853 | 1.07 |
| PEI1800-A4 | 2885 | 3029 | 1.05 |
| PE17000-A4 | 7987 | 8705 | 1.09 |
| PEI10000-A4 | 10983 | 12303 | 1.12 |
| Z1-PLA3000-Z1 | 4002 | 4205 | 1.05 |
| Z1-PLA5000-Z1 | 6738 | 8018 | 1.19 |
| Z1-PLA10000-Z1 | 10946 | 13463 | 1.23 |
| PEI1800--PLA3000--PEG2000 | 7670， | 8744， | 1.14 |
| PEI1800--PLA5000--PEG2000 | 10936 | 12685 | 1.16 |
| PEI7000--PLA10000--PEG5000 | 22223 | 26223 | 1.18 |
| PEI10000--PLA10000--PEG10000 | 29354 | 35518 | 1.21 |
实施例3、胶束的制备与表征(以PEI18000-PLA5000-PEG2000为例)
1、空白胶束的制备
准确称取10mg所合成的嵌段共聚物，溶于2mL DMF(也可为DMSO或THF(四氢呋喃))，把嵌段共聚物DMF溶液缓慢滴入10ml搅拌的PBS缓冲溶液(也可为纯净水或生理盐水)中(10min/ml)，搅拌30min后转入透析袋中，用PBS缓冲液透析48小时，4h换水一次，透析出DMF，即得自组装胶束。
2、载药胶束的制备
准确称取10mg嵌段共聚物PEI-PLA-PEG和1mg DOX.HCI于2mL DMF(也可为DMSO或THF)溶解，加入20μl三乙胺搅拌30min后把含有药物(可以是阿奇霉素、紫杉醇、榄香烯或喜树碱；本实施例中采用的是阿奇霉素)的所合成的嵌段共聚物DMF溶液缓慢滴入10ml搅拌的PBS缓冲溶液(也可为纯净水或生理盐水)当中(10min/ml)，搅拌30min使其形成微乳球，转入透析袋中，用PBS缓冲液透析48小时，4h换水一次，透析出DMF，即得自组装载药胶束。
3、最低聚集浓度CMC的测定
以1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)为紫外分子探针(最大吸收波长为313nm)测定CMC值，取10支10ml的EP管，每支管中加入20μl1mM的DPH丙酮溶液，待丙酮挥发干后，每支管中分别加入不同浓度(浓度范围：0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.1mg/mL，0.05mg/mL，0.025mg/mL，5×10-3mg/mL，1×10-3mg/mL，0.25×10-3mg/mL，0.05×10-3mg/mL，0×10-3mg/mL)的胶束溶液4ml，室温下搅拌4h分别测定吸光度，以胶束浓度为横坐标，吸光度为纵坐标做曲线图，通过吸光度递增的突跃点来确定最低聚集浓度CMC。胶束浓度对吸光度A的关系图如图7所示，胶束PEG1800-PLA5000-PEG2000的CMC值为0.023mg/mL。
4、胶束粒径分布的测定及胶束形貌的测定
粒径测定：取1mL胶束，置入激光粒度仪测量粒径，使用仪器是MalvernZetasizerNanao ZS90仪器，测定温度：25℃平衡时间3min，激光光源：He-Ne激光，波长为633nm，胶束的浓度为1.0mg/mL，测定前以0.45μm的滤膜过滤。空白胶束的粒径分布图如图8(a)所示，载药胶束的粒径分布图如图9(a)所示。
形貌测定：将铜网放在覆有滤纸的表面皿中，取约20μL胶束溶液滴于铜网上，当铜网上的溶剂基本挥发完以后，于室温下自然挥干，胶束固定在网格后，用透射电子显微镜观测其形貌。空白胶束电镜照片如图8(b)所示，载药胶束电镜照片如图9(b)所示，透射电镜测得的胶束粒径大小及分布与粒度仪测得结果相符合。
实施例4、胶束对RNA的负载实验(以PEI18000-PLA5000-PEG2000为例)
1、琼脂糖凝胶电泳实验检验空白胶束及载药胶束颗粒结合RNA的能力
分别取20pmolmiRNA至不含RNase的6个EP管中，分别与空白胶束溶液配成N/P为8，16，32，64，96，载药胶束配制成N/P为12，24，48，96，192并用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的水将各组补足到12μL。配制2％琼脂糖凝胶。将各EP管中的溶液充分混合后室温静置20分钟，然后加入5×loading bμffer混匀后上样，在1*TBE bμffer中以120V电压电泳15分钟后用凝胶成像仪观察实验结果，如图10所示。由图10可见空白胶束在N/P＝32时，RNA可以完全被纳米颗粒吸附上，故以下空白胶束实施实验以N/P＝32的比例进一步实施。由图11可见载药胶束在N/P＝48时，RNA可以完全被纳米颗粒吸附上，这说明聚合物在包裹DOX形成载药胶束后表面具有的正电荷完全有能力吸附RNA，所以嵌段共聚物PEI-PLA-PEG具有包裹药物和负载RNA的双重功能。
2、负载RNA胶束的Zeta电位的测定
采用动态光散射来测量嵌段共聚物胶束的Zeta电位。使用仪器是MalvernZetasizerNanao ZS90仪器，光源为He-Ne激光(633nm)。测量温度设定为25℃。所有待测样品的浓度为0.1mg/mL，测量前用0.45μm的滤膜过滤。空白胶束机负载RNA后胶束的Zeta电位数据如图12。从图12中可知空白胶束的Zeta电位为+12.9，含有的正电位对负电荷的RNA具有吸附作用，在N/P＝32时，RNA被完全吸附上胶束后的zeta电位为+6.86，说明吸附RNA的胶束能够保持稳定，胶束颗粒确实可以通过电荷相互作用与RNA结合形成复合物。
3、琼脂糖凝胶电泳实验检验吸附RNA胶束对GSH的应激作用
分别取20pmolmiRNA至不含RNase的6个EP管中，分别与纳米颗粒胶束溶液配成N/P为8，16，32，64，96，并用含10mM GSH的DEPC处理过的水溶液将各组补足到12μL。配制2％琼脂糖凝胶。将各EP管中的溶液充分混合后室温静置20分钟，然后加入5×loading buffer混匀后上样，在1*TBE buffer中以120V电压电泳15分钟后用凝胶成像仪观察实验结果，如图13所示，与图10对比发现在10mM GSH还原条件的刺激下胶束对RNA无吸附作用，因为在GSH条件下胶束中的二硫键断裂，胶束解体成聚合物释放出吸附的RNA。
实施例5、胶束的细胞实验(以胶束PEI1800-PLA5000-PEG2000为例)
一、空白胶束的细胞毒性实验
1、CCK-8实验法
CCK-8实验。将大鼠胚胎成纤维细胞系(NIH3T3)细胞置于含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液中，37℃、5％CO2培养。取对数生长期细胞以5000/孔接种于96孔培养板，培养过夜后，吸去培养基，细胞用pH＝7.4的PBS洗2次备用。将新鲜配制的纳米颗粒和PEI2k按照以下浓度稀释备用：0.05mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml、0.002mg/ml。将稀释好的纳米材料按照100μL/孔加至备用的96孔培养板，37℃、5％CO2培养4h，吸去纳米复合物，细胞用pH＝7.4的PBS洗3次。按照100μL/孔更换含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液，继续培养48h。取出培养板，按照10μl/孔加入CCK-8试剂，37℃、5％CO2继续培养4h。结束后，取出培养板，酶标仪测定各孔在450nm处的0D值。未接种细胞的孔为空白孔，未经纳米复合物处理的细胞孔为对照孔，其细胞存活率设为100％。利用GraPhpad5.0软件绘制细胞IC50曲线。
细胞存活率cell viability＝(test-background)/(control-background)*100％control(阴性对照)，background(背景)，test compound(实验给药组)；实验结果如图14所示，由图14可见随着纳米颗粒的浓度升高，细胞活性下降，但PEI-PLA-PEG的下降幅度较PEI2k明显减少，因而证实PLA-PEG的修饰可明显降低PEI的细胞活性，其细胞存活率在80％以上，说明合成的PEI-PLA-PEG对细胞无毒性作用，具有良好的生物相容性。
二、胶束RNA复合物的细胞实验
1、细胞转染实验
将制备的同时携载cy3-miR-409-3p的胶束纳米颗粒与SGC7901细胞在37℃分别培养0.5h，1h，2h，4h，然后弃掉培养基，用PBS清洗两次细胞。用4％多聚甲醛溶液室温下固定细胞10分钟后用PBS清洗细胞两次，然后用Triton破膜后用DAPI对细胞核染色，用荧光显微镜观察胶束纳米颗粒和cy3-miR-409-3p在细胞内的分布情况。由图15可见，将裸Cy3-miR-409-3p与细胞培养4h后，在细胞中只能检测到很弱的荧光，说明RNA本身很难进入细胞。与之相比，用NP作为载体，显著增加细胞内的Cy3-409-3p荧光强度，并且，细胞内的荧光强度随着培养时间的增加而增强。以上结果表明NP能够高效地将RNA输送到细胞内，且随着培养时间的延长，输送到细胞内的RNA的量目应增力。
2、流式细胞术测转染细胞数
具体步骤如下：
1)将SGC7901细胞接种到6孔板中，每孔中接种3*105个细胞，然后在37℃培养箱中过夜培养；
2)将胶束纳米颗粒与cy3-miR-409-3p按照N/P比为32结合形成复合物，每种结合条件下miRNA剂量为100，200，3()()nM；
3)将复合物加入到接种有SGC7901细胞的6孔板中；
4)将SGC7901细胞放入37℃培养箱中培养2小时后，消化收集细胞，并用流式细胞仪检测细胞内cy3的荧光信号；
5)统计其各组的转染效率。
从图16可见转染效率与荧光照片数据一致，进一步证实纳米颗粒可以将RNA转入细胞内，并随时间增加转染效率增加。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (11)
1.一种聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG，其结构式如式(Ⅰ)所示：
其中，PEG的分子量为2000～10000g/mol中的任意一个整数，PLA的分子量为3000～10000g/mol，PEI的分子量为1800～10000g/mol。
2.一种如权利要求1所述的聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG的制备方法，其特征在于，以二氯甲烷为溶剂，在I2存在的条件下，亲水片段化合物PEG-A4
PEI-A4和疏水片段化合物Z1-PLA-Z1进行氧化反应，即得所述PEI-PLA-PEG。
3.如权利要求2所述的聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG的制备方法，其特征在于，所述PEG-A4、PEI-A4、Z1-PLA-Z1和I2的摩尔比为2:2:1.5:48。
4.如权利要求2所述的聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG的制备方法，其特征在于，所述亲水片段化合物PEI-A4是通过包括如下步骤的方法制备而得：在4-甲基吗啉，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯HATU存在的条件下，以DMF为溶剂，化合物A4与PEI-NH2 在冰浴条件下进行酰胺化反应得所述PEI-A4；所述A4、4-甲基吗啉，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和PEI-NH2的摩尔比为1:(1.0～2.0):(1.5～2.0):1。
5.一种两亲性嵌段共聚物自组装胶束的制备方法，其特征在于，将如权利要求1所述的聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG溶于极性溶剂，缓慢滴加入搅拌的水相中使其形成微乳球，装入透析袋透出所述极性溶剂即得自组装胶束。
6.如权利要求5所述的两亲性嵌段共聚物自组装胶束的制备方法，其特征在于，所述极性溶剂为DMSO或DMF，透析袋分子量为0.2KD，水相为PBS缓冲液。
7.一种如权利要求1所述的聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG在制备基因载体中的用途，其特征在于，所述聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG溶于极性溶剂，缓慢滴加入搅拌的水相中使形成微乳球，装入透析袋透出所述极性溶剂得自组装胶束；所述自组装胶束用作基因载体应用于基因药物输送体系。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述自组装胶束可负载RNA。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述负载RNA胶束能进入癌细胞并且在谷胱甘肽作用下释放出RNA药物作用于癌细胞。
10.一种如权利要求1所述的聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG在制备疏水小分子药物载体中的用途，其特征在于，所述聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG与水难溶性药物溶于极性溶剂得混合液，所述混合液缓慢滴加入搅拌的水相中使形成微乳球，装入透析袋透出所述极性溶剂得自组装胶束；所述自组装胶束用作疏水小分子药物载体应用于疏水药物输送体系。
11.一种如权利要求1所述的聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG在制备负载基因药物和疏水药物的载体中的用途，其特征在于，所述聚乙烯亚胺三嵌段共聚物PEI-PLA-PEG在包裹疏水药物后形成的载药胶束，进一步吸附基因药物，即可形成所述负载基因药物和疏水药物的载体。
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