CN105030795B - 一种纳米载药系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种纳米载药系统及其制备方法和应用，所述纳米载药系统包含载药纳米胶束内核和聚多巴胺外壳以及聚多巴胺外壳上连接的硼替佐米，所述载药纳米胶束为聚乙二醇‑二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺包载化学抗癌药物形成的纳米胶束。本发明纳米载药系统的制备方法包括载药纳米胶束的形成；在载药纳米胶束外形成聚多巴胺外壳；在聚多巴胺外壳上连接硼替佐米。本发明的纳米载药系统粒径小于50nm，稳定性高，具有肿瘤富集作用，实现了硼替佐米与其他化学抗癌药物的同时递送，聚多巴胺具有光热效应，可以辅助化疗药物治疗，具有化疗与热疗联合治疗的协同效果，具有广泛的医药学应用前景。

Description

一种纳米载药系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米生物医药领域，涉及一种纳米载药系统及其制备方法和应用。

背景技术

乳腺癌是严重影响广大妇女身体健康的恶性肿瘤，主要是由乳腺导管上皮细胞发生的恶性细胞增殖。其病因并不十分明确，目前认为可能与遗传、内分泌、病毒感染、基因及细胞因子等改变有关。手术、放疗、化疗或者内分泌治疗是乳腺癌的主要治疗手段，然而，这些治疗方法的效果欠佳，毒副作用大，患者顺应性差。研究显示，光热治疗是一种创伤性低的方法，可提高化疗的敏感性，有望协同化疗提高抗肿瘤效果。

美国国立卫生研究生发现的硼替佐米作为第一个蛋白酶体抑制剂药物，对多种肿瘤细胞有很强的抑制作用，其与其他的抗癌药物联合使用(如阿霉素)可以有效的促进肿瘤细胞凋亡，增强化疗敏感性，克服化疗耐药性。然而，硼替佐米的临床使用和疗效被水溶性差、稳定性差、生物利用度低、对正常组织毒性大、产生耐药性等一系列问题所限制。此外，硼替佐米如何与其他化疗药物有效地共同递送也是亟待解决的问题。

为了避免重复繁琐给药，提高患者顺应性，临床实践中需要单一的给药系统拥有多种化疗药物同时递送和光热治疗的功能。此外，近期的研究表明小尺寸的抗癌纳米药物，尤其是50纳米或更小尺寸的药物，体内表现更强，组织渗透更大和肿瘤抑制性更好。然而，目前的双药递送系统和光热治疗试剂的尺寸往往都比较大，很难控制在100nm以内，而且，常用的光热治疗试剂往往是金纳米棒、纳米笼，碳材料，生物相容性差、毒副作用大。

因此，在本领域期望开发一种既可以将硼替佐米与其他化学抗癌药物联合应用，又可以实现化疗与热疗联合治疗的小尺寸纳米药物递送系统。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米载药系统及其制备方法和应用。本发明的纳米载药系统可以实现硼替佐米与其他化学抗癌药物的同时递送，又具有光热治疗效果，可以达到化疗与热疗联合治疗的效果。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种纳米载药系统，所述纳米载药系统包含载药纳米胶束内核和聚多巴胺外壳以及聚多巴胺外壳上连接的硼替佐米，所述载药纳米胶束为聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺包载化学抗癌药物形成的纳米胶束。

本发明的纳米载药系统，通过聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺包载化学抗癌药物形成胶束，以及在聚多巴胺外壳上连接硼替佐米，实现了硼替佐米与化学抗癌药物的同时递送，并且由于聚多巴胺外壳具有光热效应，因此可以实现将化学药物治疗与光热治疗相结合。

本发明的纳米载药系统中，通过形成硼酸邻苯二酚酯键而在聚多巴胺外壳上连接硼替佐米。

本发明的纳米载药系统中，所述聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚中乙二醇链段中聚乙二醇链段的重均分子量为1000～15000，例如1000、1200、1400、1500、2000、2300、2500、2800、3000、3500、4000、4500、5000、5200、5400、5800、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000或15000，优选为1500～5500。

优选地，本发明所述化学抗癌药物为疏水性和/或亲水性化学抗癌药物，优选为阿霉素、紫杉醇、顺铂、环磷酰胺、羟基喜树碱或所述药物的药学上可接受的盐中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为盐酸阿霉素。在药物联合应用时，应注意药物之间的相互作用，例如环磷酰胺与阿霉素同用时，可增加心脏毒性，因此在药物联合应用时，避免药物相互作用而对人体产生毒性。本发明所述药物组合可以为但不限于羟基喜树碱和顺铂的组合、羟基喜树碱和阿霉素的组合、顺铂和盐酸阿霉素的组合、羟基喜树碱与顺铂和阿霉素的组合、顺铂与环磷酰胺和羟基喜树碱的组合。此外，由于本发明的纳米药物载体系统中含有硼替佐米，因此也要注意硼替佐米与上述药物联用时的药物相互作用，以不产生毒副作用为用药原则。

本发明的纳米载药系统中，所述载药纳米胶束内核的粒径为≤30nm。

本发明的纳米载药系统中，所述聚多巴胺外壳的厚度为1～15nm，例如1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm或15nm，优选为3～10nm，进一步优选为4～8nm。

本发明中载药纳米胶束内核的粒径≤30nm，加上聚多巴胺壳层的厚度(1～15nm)，总体药物载体颗粒的粒径在50nm以下，该粒径范围的纳米颗粒可以在体循环中稳定存在，并且可以显示出较大的组织穿透力和更强的癌症部位富集作用，使得该药物载体可以实现携带药物在肿瘤部位富集，以达到靶向递送抗癌药物，提高对肿瘤的抑制能力。

另一方面，本发明提供了如第一方面所述的纳米载药系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)载药纳米胶束的形成；

(2)在所述载药纳米胶束外形成聚多巴胺外壳；

(3)在聚多巴胺外壳上连接硼替佐米。

在本发明所述纳米载药系统的制备方法中，步骤(1)所述载药纳米胶束形成的方法为：将聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和化学抗癌药物分散在pH值为8.0-9.0的缓冲溶液中，获得载药纳米胶束溶液。

优选地，步骤(2)所述在载药纳米胶束外形成聚多巴胺外壳的方法为：向载药纳米胶束溶液中加入多巴胺盐酸盐，反应4～48小时，在所述载药胶束外形成聚多巴胺外壳，得到具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液。

优选地，步骤(3)所述在聚多巴胺外壳上连接硼替佐米的方法为：使具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液与溶有硼替佐米的有机相混合，反应1～24h，使硼替佐米连接在聚多巴胺外壳上。

在本发明中，步骤(1)的实现可以采用两种方案，第一种是将PEG-DSPE和化学抗癌药物形成载药纳米胶束后再分散到缓冲溶液中；第二种是直接在缓冲溶液中形成载药纳米胶束溶液。根据所应用的具体药物的溶解性选择合适的方案。具体地，第一种方案可以将PEG-DSPE和化学抗癌药物加入有机溶剂(如甲醇和/或二氯甲烷)中，溶解(通过超声或搅拌)，而后除去有机溶剂(通过旋转蒸发或减压蒸馏等)，PEG-DSPE会在烧瓶内形成一层膜，加水分散，再加缓冲溶液调整pH值，或者直接加入8.0-9.0(优选pH 8.5)的缓冲溶液进行分散，得到载药纳米胶束溶液。第一种方案更适合于包载疏水性药物。第二种方案是将PEG-DSPE直接加入到水或者pH 8.0-9.0(优选pH 8.5)的缓冲溶液中，经过超声和/或搅拌，PEG-DSPE会在水体系中自组装形成胶束，然后再加入化学抗癌药物(如盐酸阿霉素)，需要注意的是，如果用水进行分散，后续仍需要加缓冲溶液调整pH值。第二种方案更利于PEG-DSPE包载带正电荷的亲水性药物分子。在本发明中，两种方案均可以形成30nm以下的载药纳米胶束。

在本发明的步骤(1)中将PEG-DSPE和化学抗癌药物分散在pH值为8.0-9.0的缓冲溶液中得到载药纳米胶束溶液，因此，本发明所述的载药纳米胶束溶液为载药纳米胶束的缓冲溶液体系，pH值为8.0-9.0。

在本发明步骤(2)中利用在pH值为8.0-9.0的载药纳米胶束的缓冲溶液体系中使多巴胺盐酸盐发生自聚合作用生成聚多巴胺，而包覆于载药纳米胶束上。

在本发明步骤(3)中聚多巴胺与硼替佐米发生反应，形成硼酸邻苯二酚酯键，从而将硼替佐米连接在聚多巴胺外壳上。

在本发明所述纳米载药系统的制备方法中，步骤(1)所述聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺与化学抗癌药物的质量比为4～20:1，例如4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1，优选为4～10:1。

优选地，步骤(1)所述缓冲溶液为tris-HCl缓冲溶液。

优选地，步骤(1)所述缓冲溶液的pH值可以为8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0，优选为8.5。

优选地，步骤(1)所述载药纳米胶束的浓度为2～15mg/mL，例如2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL或15mg/mL。

优选地，步骤(2)所述聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺与多巴胺盐酸盐的质量比为1:0.2～1.5，例如1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，优选为1:0.5～0.8。

在本发明所述纳米载药系统的制备方法中，步骤(2)所述反应时间为4～48小时，例如4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、14小时、15小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、33小时、35小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时或48小时，优选地，步骤(2)所述反应时间为6～24小时。

优选地，步骤(2)所述反应在有氧气的环境中进行。

优选地，步骤(2)所述反应在搅拌下进行。

优选地，步骤(2)还包括在反应结束后进行离心分离、干燥，去除未反应的多巴胺以及缓冲溶液的步骤；将未反应的多巴胺除去的目的是防止其对后续反应造成影响，而缓冲溶液的去除是因为在后续反应中并不需要pH值为8.0-9.0的环境。

优选地，步骤(3)所述硼替佐米与步骤(1)所述化学抗癌药物的质量比为0.5～1.2:1，例如0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1或1.2:1，优选为0.7～1:1。

优选地，步骤(3)所述溶有硼替佐米的有机相中有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)和/或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。

优选地，步骤(3)所述具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液与溶有硼替佐米的有机相的体积比≥5:1，例如可以为5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1或20:1等，更优选地，步骤(3)所述具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液与溶有硼替佐米的有机相的体积比≥10:1。

在本发明所述纳米载药系统的制备方法中，步骤(3)所述反应的时间为1～24h，例如1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、21h、22h、23h或24h，优选地，步骤(3)所述反应的时间为2～6h。

优选地，步骤(3)所述反应的温度为4-30℃，例如4℃、6℃、8℃、10℃、15℃、20℃、22℃、24℃、25℃、27℃、29℃或30℃。

优选地，步骤(3)所述反应在碱性或中性环境下进行。

步骤(3)所述使具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液与溶有硼替佐米的有机相混合可以采用两种方式完成，一种是向步骤(2)得到的具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液中加入溶有硼替佐米的有机相，进行混合，此时由于步骤(2)得到的载药纳米胶束溶液是碱性溶液，步骤(3)的反应可在碱性条件下进行，在反应过程中，载药纳米胶束可以保持完整的胶束形式，其外壳与硼替佐米可以充分接触，从而将硼替佐米连接至聚多巴胺外壳上；第二种方式是可将步骤(2)得到的具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液，离心分离和干燥，除未反应的多巴胺以及缓冲溶液，而后将干燥的产品分散在水或中性PBS缓冲溶液中，而后向其中加入溶有硼替佐米的有机相，或者可以将干燥的产品直接加入溶有硼替佐米的有机溶剂和水的混合液中，进行混合，此时步骤(3)的反应可以在中性条件下进行，从而将硼替佐米连接至聚多巴胺外壳上。

作为本发明的优选技术方案，本发明所述纳米载药系统的制备方法包括以下步骤：

(1)将质量比为4～20:1的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和化学抗癌药物分散在pH值为8.0-9.0的缓冲溶液中，获得浓度为2～15mg/mL的载药纳米胶束溶液；

(2)向步骤(1)得到的载药纳米胶束溶液中加入多巴胺盐酸盐，使得聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺与多巴胺盐酸盐的质量比为1:0.2～1.5，在有氧气的环境中搅拌反应4～48h，在所述载药纳米胶束外形成聚多巴胺外壳，得到具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液，离心分离、干燥，去除未反应的多巴胺以及缓冲溶液；

(3)使步骤(2)得到的具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液与溶有硼替佐米的有机相混合，在4-30℃，反应1～24h，使硼替佐米连接在聚多巴胺外壳上，得到所述纳米载药系统。

作为本发明进一步优选的技术方案，本发明所述纳米载药系统的制备方法包括以下步骤：

(1)将质量比为4～10:1的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和化学抗癌药物分散在pH值为8.5的缓冲溶液中，获得浓度为2～15mg/mL的载药纳米胶束溶液；

(2)向步骤(1)得到的载药纳米胶束溶液中加入多巴胺盐酸盐，使得聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺与多巴胺盐酸盐的质量比为1:0.5～0.8，在有氧气的环境中搅拌反应6～24h，在所述载药纳米胶束外形成聚多巴胺外壳，得到具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束；

(3)使步骤(2)得到的具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液与溶有硼替佐米的有机相混合，在4-30℃，反应2～6h，使硼替佐米连接在聚多巴胺外壳上，得到所述纳米载药系统。

另一方面，本发明提供了如第一方面所述的纳米载药系统在制备用于抗癌治疗的药物中的应用。

本发明所述纳米载药系统可以实现硼替佐米与其他化学抗癌药物的同时递送，能够作用纳米载药系统用于癌症的治疗，并且聚多巴胺层具有光热效应，实现了化学药物治疗与光热治疗相结合，达到更好的癌症治疗效果，具有广泛的应用前景。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明的纳米载药系统以载药纳米胶束为内核，聚多巴胺为外壳，并在聚多巴胺外壳上连接硼替佐米。本发明的纳米载药系统粒径小于50nm，稳定性高，在体内运输时可以稳定存在，并且具有肿瘤富集作用，可以靶向地将药物运送至肿瘤部位，实现靶向治疗，提高了药物的生物利用度。本发明的纳米载药系统通过形成硼酸邻苯二酚酯键将硼替佐米连接至聚多巴胺外壳上，不仅实现了硼替佐米与其他化学抗癌药物的同时递送，而且硼酸邻苯二酚酯键具有pH敏感性，使得在肿瘤部位酸性环境下释放硼替佐米，提高了硼替佐米的生物利用度。此外，聚多巴胺具有光热效应，可以辅助硼替佐米和其他化疗药物的治疗，提高化疗药物的敏感性，取得了化疗与热疗联合治疗的协同效果，具有广泛的医药学应用前景。此外，本发明纳米载药系统的制备方法简单，原料易得。

附图说明

图1为实施例1制备的纳米载药系统的透射电镜图；

图2为实施例9中对本发明实施例2制备的纳米载药系统中阿霉素的释放情况的测定结果图；

图3为实施例9中对对本发明实施例2制备的纳米载药系统中硼替佐米的释放情况的测定结果图；

图4为实施例10中测定的不同质量比例的阿霉素和硼替佐米对MCF-7乳腺癌细胞的细胞活力影响结果图；

图5为实施例11中测定的本发明的载药系统与其他对照组对肿瘤细胞抑制作用的结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

在本实施例中，通过以下方法制备纳米载药系统，具体包括以下步骤：

(1)将100mg PEG₂₀₀₀-DSPE分散到5mL甲醇中，搅拌溶解，加入溶有10mg阿霉素的二氯甲烷溶液(PEG-DSPE与阿霉素的质量比为10:1)，用旋转蒸发仪除去有机溶剂形成脂膜。向上述脂膜中加入pH 8.5的tris-HCl缓冲溶液，形成载药纳米胶束溶液，其中，载药PEG-DSPE纳米胶束溶液的浓度为2mg/mL；

(2)向步骤(1)得到的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液中加入20mg多巴胺盐酸盐，反应容器开口搅拌反应24h，获得核壳结构的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液，60000rmp离心，去除未反应的多巴胺以及缓冲溶液，冻干备用；

(3)将冻干的载药PEG-DSPE纳米胶束分散在水中，向其中加入到溶有5mg硼替佐米的DMSO溶液(PEG-DSPE纳米胶束水溶液和DMSO的体积比为10:1)中，25℃反应6h，60000rmp离心，获得纳米载药系统。

利用透射电镜(美国FEI,Tecnai G220S-TWIN，200kV)表征实施例1制备的载药PEG-DSPE纳米胶束以及最终产物纳米载药系统的粒径和形态，如图1所示，从电镜图上可以看出，纳米载药系统的尺寸在20～30nm左右，近似球形。利用动态光散射仪(ZetasizerNanoZS)对载药PEG-DSPE纳米胶束和最终产物纳米载药系统的粒径分布进行测定，结果表明载药PEG-DSPE纳米胶束的粒径分布为10-30nm，最终产物纳米载药系统的尺寸为15-40nm，该结果与电镜结果相一致。这也表明形成了聚多巴胺的外壳，使得原来胶束的尺寸有所增大。

实施例2

(1)将100mg PEG₂₀₀₀-DSPE分散在6mL水溶液中，超声，搅拌，加入5mg盐酸阿霉素(PEG-DSPE与盐酸阿霉素的质量比为20:1)，缓慢搅拌2h，再加入tris-HCl缓冲溶液，调整pH值至8.5，tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mmol/L，形成载药纳米胶束溶液，并使得PEG-DSPE纳米胶束的浓度为15mg/mL；

(2)向步骤(1)得到的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液中加入150mg多巴胺盐酸盐，反应容器开口与外界空气对流的情况下搅拌反应14h，获得核壳结构的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液；

(3)向步骤(2)得到的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液中加入溶有5mg硼替佐米的DMSO溶液(载药PEG-DSPE纳米胶束溶液和DMSO的体积比为10:1)中，25℃反应2h，60000rmp离心，获得纳米载药系统。

利用透射电镜和动态光散射表征，结果显示，得到载药PEG-DSPE纳米胶束的粒径尺寸为10-30nm，最终产物纳米载药系统的粒径尺寸为20-45nm。

实施例3

(1)将100mg PEG₅₀₀₀-DSPE分散在10mL浓度为10mmol/L的tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)中，形成PEG-DSPE纳米胶束溶液，再加入20mg盐酸阿霉素，搅拌获得载药纳米胶束溶液(载药纳米胶束的浓度为10mg/mL)；

(2)向步骤(1)得到的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液中加入10mL溶有100mg多巴胺盐酸盐的tris-HCl缓冲溶液(10mmol/L，pH值8.0)，反应容器开口与外界空气对流的情况下搅拌反应48h，获得核壳结构的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液，60000rmp离心，去除未反应的多巴胺以及缓冲溶液，冻干备用；

(3)将冻干的载药PEG-DSPE纳米胶束加入到溶有14mg硼替佐米的DMSO/水混合溶液(水和DMSO的体积比为8:1)中，25℃反应6h，60000rmp离心，获得纳米载药系统。

利用透射电镜和动态光散射表征，结果显示，得到载药PEG-DSPE纳米胶束的粒径尺寸为15-30nm，最终产物纳米载药系统的粒径尺寸为20-40nm。

实施例4

(1)将100mg PEG₁₀₀₀₀-DSPE分散在10mL浓度为20mmol/L的tris-HCl缓冲溶液中，形成PEG-DSPE纳米胶束溶液，再加入5mg盐酸阿霉素，搅拌获得载药纳米胶束溶液(载药纳米胶束的浓度为10mg/mL)。

(2)向步骤(1)得到的载药纳米胶束溶液中加入10mL溶有80mg多巴胺盐酸盐的水溶液，反应容器开口与外界空气对流的情况下搅拌反应6h，获得核壳结构的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液，60000rmp离心，去除未反应的多巴胺以及缓冲溶液，冻干备用；

(3)将冻干的载药PEG-DSPE纳米胶束加入到溶有5mg硼替佐米的DMSO/水混合溶液(水和DMSO的体积比为5:1)中，30℃反应6h，60000rmp离心，获得所述多功能纳米载药系统。

利用透射电镜和动态光散射表征，结果显示，得到载药PEG-DSPE纳米胶束的粒径尺寸为5-25nm，最终产物纳米载药系统的粒径尺寸为10-40nm。

实施例5

在本实施例中，通过以下方法制备纳米载药系统，具体包括以下步骤：

(1)将100mg PEG₁₀₀₀₀-DSPE分散到5mL甲醇中，搅拌溶解，加入溶有25mg紫杉醇的二氯甲烷溶液(PEG-DSPE与紫杉醇的质量比为4:1)，用旋转蒸发仪除去有机溶剂形成脂膜。向上述脂膜中加入pH 8.5的tris-HCl缓冲溶液，形成载药纳米胶束溶液，其中，载药PEG-DSPE纳米胶束溶液的浓度为8mg/mL；

(2)向步骤(1)得到的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液中加入20mg多巴胺盐酸盐，反应容器开口搅拌反应4h，获得核壳结构的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液，60000rmp离心，去除未反应的多巴胺以及缓冲溶液，冻干备用；

(3)将冻干的载药PEG-DSPE纳米胶束加入到溶有25mg硼替佐米的DMSO/水混合溶液(水和DMSO的体积比为15:1)中，20℃反应1h，60000rmp离心，获得纳米载药系统。

利用透射电镜和动态光散射表征，结果显示，得到载药PEG-DSPE纳米胶束的粒径尺寸为12-30nm，最终产物纳米载药系统的粒径尺寸为15-40nm。

实施例6

在本实施例中，通过以下方法制备纳米载药系统，具体包括以下步骤：

(1)将100mg PEG₁₅₀₀₀-DSPE分散到5mL甲醇中，搅拌溶解，加入溶有10mg羟基喜树碱的二氯甲烷溶液(PEG-DSPE与紫杉醇的质量比为10:1)，用旋转蒸发仪除去有机溶剂形成脂膜。向上述脂膜中加入pH 9.0的tris-HCl缓冲溶液，形成载药纳米胶束溶液，其中，载药PEG-DSPE纳米胶束溶液的浓度为5mg/mL；

(2)向步骤(1)得到的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液中加入50mg多巴胺盐酸盐，反应容器开口搅拌反应18h，获得核壳结构的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液；

(3)向步骤(2)得到的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液中加入溶有10mg硼替佐米的DMF溶液(载药PEG-DSPE纳米胶束溶液和DMF的体积比为5:1)，混合，4℃反应10h，60000rmp离心，获得纳米载药系统。

利用透射电镜和动态光散射表征，结果显示，得到载药PEG-DSPE纳米胶束的粒径尺寸为12-30nm，最终产物纳米载药系统的粒径尺寸为16-40nm。

实施例7

在本实施例中，通过以下方法制备纳米载药系统，具体包括以下步骤：

(1)将100mg PEG₅₀₀₀-DSPE分散到5mL甲醇中，搅拌溶解，加入溶有10mg顺铂与环磷酰胺(二者各5mg)的二氯甲烷溶液(PEG-DSPE与化学抗癌药物(顺铂与环磷酰胺的组合)的质量比为10:1)，用旋转蒸发仪除去有机溶剂形成脂膜。向上述脂膜中加入pH 8.5的tris-HCl缓冲溶液，形成载药纳米胶束溶液，其中，载药PEG-DSPE纳米胶束溶液的浓度为2mg/mL；

(2)向步骤(1)得到的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液中加入20mg多巴胺盐酸盐，反应容器开口搅拌反应40h，获得核壳结构的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液；

(3)向步骤(2)得到的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液中加入溶有5mg硼替佐米的DMSO溶液(载药PEG-DSPE纳米胶束溶液和DMSO的体积比为7:1)，混合，10℃反应24h，60000rmp离心，获得纳米载药系统。

利用透射电镜和动态光散射表征，结果显示，得到载药PEG-DSPE纳米胶束的粒径尺寸为15-30nm，最终产物纳米载药系统的粒径尺寸为16-45nm。

实施例8

在本实施例中，通过以下方法制备纳米载药系统，具体包括以下步骤：

(1)将100mg PEG₅₀₀₀-DSPE分散到5mL甲醇中，搅拌溶解，加入溶有10mg羟基喜树碱与顺铂和阿霉素(三者各4mg)的二氯甲烷溶液(PEG-DSPE与化学抗癌药物(羟基喜树碱与顺铂和阿霉素的组合)的质量比为8.3:1)，用旋转蒸发仪除去有机溶剂形成脂膜。向上述脂膜中加入pH 8.5的tris-HCl缓冲溶液，形成载药纳米胶束溶液，其中，载药PEG-DSPE纳米胶束溶液的浓度为8mg/mL；

(2)向步骤(1)得到的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液中加入20mg多巴胺盐酸盐，反应容器开口搅拌反应30h，获得核壳结构的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液；

(3)向步骤(2)得到的载药PEG-DSPE纳米胶束溶液中加入溶有12mg硼替佐米的DMSO溶液(载药PEG-DSPE纳米胶束溶液和DMSO的体积比为6:1)，混合，25℃反应12h，60000rmp离心，获得纳米载药系统。

利用透射电镜和动态光散射表征，结果显示，得到载药PEG-DSPE纳米胶束的粒径尺寸为10-30nm，最终产物纳米载药系统的粒径尺寸为15-45nm。

实施例9

本实施例目的在于考察纳米载药系统的药物释放情况，对实施例2获得的纳米载药系统调节为pH值为7.4和pH值为5.0的PBS缓冲体系，在两个pH值下分别设置6个平行样品，检测25小时内药物释放情况，结果在图2和图3中示出，由图2可以看出，在pH值为7.4时阿霉素在25小时内释放率小于10％，而当pH值为7.4时加上808nm的激光照射，会使得药物的释放有所增加，但是在25小时内的释放率最多也只有10％；当pH值为5.0时，阿霉素在25小时内释放率可以达到将近40％，加上808nm的激光照射后阿霉素率进一步提高至50％左右。由图3可以看出，在pH值为7.4时硼替佐米在12小时内释放率小于30％，而当pH值为7.4时加上808nm的激光照射，会使得药物的释放有所增加，但是在12小时内的释放率最多也只有35％；当pH值为5.0时，硼替佐米在12小时内释放率可以达到将近80％，加上808nm的激光照射后硼替佐米释放率进一步提高。这说明在体内运输过程中，该纳米载药系统比较稳定，不会产生药物的大量释放，在pH值为5.0的酸性环境下药物的释放率增大，由于肿瘤细胞溶酶体环境的pH值为5.0，所以该纳米载药系统对于肿瘤抑制具有一定的应用潜力。

实施例10

本实施例的目的在于测定不同的硼替佐米与阿霉素的质量比对于肿瘤细胞生长抑制作用的影响。

本实施例采用与实施例2相同的方法和反应条件，区别仅在于，将硼替佐米与阿霉素的质量比定为：0:1、0.1:1、0.3:1、0.7:1、1:1、1.5:1、3:1、5:1、10:1和1:0，分别在所述质量比下制备得到纳米载药系统。

通过CCK法对该实施例得到的纳米载药系统对肿瘤细胞的生长抑制作用进行测定，方法如下：将MCF-7细胞在35mm内径的培养皿内以10³个的密度分别接种于含有2mL的DMEM培养基(含10体积％的胎牛血清)的培养皿中，在37℃和5体积％的CO₂浓度下培养24小时后，吸出培养基，将2mL溶有纳米载药系统的培养基加入培养皿中，每个样品平行三个孔，继续在37℃和5％的CO₂浓度下孵育12小时后，按照文献(Mingbin Zheng，等，ACS nano，2013，7：2056-67)中所述的光热治疗方法对上述培养皿中的细胞进行激光照射后在37℃和5％的CO₂浓度下孵育12小时。按照文献(Qinghua Miao，等，生物材料(Biomaterials)，2010，31(28)：7364-75)中所述的CCK-8法检测细胞凋亡水平。

结果如图4所示，从图4中可以看出，当硼替佐米与阿霉素的质量比为0.7～1：1时，其细胞杀伤力最强。因此，将这两种药组装在多功能纳米载药系统中时，优选霉素与硼替佐米的质量比为0.7～1:1的比例范围。

实施例11

在本实施例中，对实施例3制备的纳米载药系统对肿瘤细胞的生长抑制作用进行考察。

通过CCK法进行考察，将MCF-7细胞在35mm内径的培养皿内以10³个的密度分别接种于含有2mL的DMEM培养基(含10体积％的胎牛血清)的培养皿中，在37℃和5体积％的CO₂浓度下培养24小时后，吸出培养基，将2mL溶有纳米载药系统的培养基(药物浓度：阿霉素为6μg/mL，硼替佐米为4μg/mL)加入培养皿中，继续在37℃和5％的CO₂浓度下孵育12小时后，按照文献(Mingbin Zheng，等，ACS nano，2013，7：2056-67)中所述的光热治疗方法对上述2只培养皿中的细胞进行激光照射后在37℃和5％的CO₂浓度下孵育12小时。按照文献(Qinghua Miao，等，生物材料(Biomaterials)，2010，31(28)：7364-75)中所述的CCK-8法检测细胞凋亡水平。同时采用一系列对照，对照组设置为载药纳米胶束(DSPE-PEG包载阿霉素形成的纳米胶束)、修饰硼替佐米的药物载体(DSPE-PEG包覆PDA外壳后化学连接硼替佐米)、包载阿霉素的药物载体(DSPE-PEG包载阿霉素后，包覆PDA外壳形成的纳米胶束，PDA外壳上不连接硼替佐米)+光照(808nm激光照射)、修饰硼替佐米的药物载体(DSPE-PEG修饰PDA后化学连接硼替佐米，未包载阿霉素)+光照(808nm激光照射)。需要说明的是，上述对照组的药物总浓度均为10μg/mL。

结果在图5中示出，从图5中可以看出，使用本发明的纳米载药系统+光照，可以使肿瘤细胞存活率不到5％；本发明的纳米载药系统在不加光照的情况下，对肿瘤细胞的抑制作用也明显优于其他对照组，使用对照药物的培养皿中，肿瘤细胞存活率均大于20％。上述结果说明本发明的纳米载药系统对MCF-7细胞具有更强的促凋亡效果。并且可以具有化学药物治疗与光热治疗的协同效果，对肿瘤细胞具有更大的杀伤作用。此外，由于本发明的纳米载药系统的药物载体只包含PEG-DSPE和聚多巴胺，毒副作用小，光热效果好，相对于常用的金属、碳光热材料，其成本更低、安全性更高、尺寸更小、制备方法更便捷，还可同时以不同比例载药，在生物医药领域具有一定的应用潜力。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的纳米载药系统及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (28)

1.一种纳米载药系统，其特征在于，所述纳米载药系统包含载药纳米胶束内核和聚多巴胺外壳以及聚多巴胺外壳上连接的硼替佐米，所述载药纳米胶束为聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺包载化学抗癌药物形成的纳米胶束；

通过形成硼酸邻苯二酚酯键而在聚多巴胺外壳上连接硼替佐米；所述化学抗癌药物为疏水性和/或亲水性化学抗癌药物；

所述纳米载药系统由以下制备方法制备得到：

(1)载药纳米胶束的形成；

(2)在所述载药纳米胶束外形成聚多巴胺外壳；

(3)在聚多巴胺外壳上连接硼替佐米；

步骤(1)所述载药纳米胶束形成的方法为：将聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和化学抗癌药物分散在pH值为8.0-9.0的缓冲溶液中，获得载药纳米胶束溶液；

步骤(2)所述在载药纳米胶束外形成聚多巴胺外壳的方法为：向载药纳米胶束溶液中加入多巴胺盐酸盐，反应4～48h，在所述载药胶束外形成聚多巴胺外壳，得到具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液；

步骤(3)所述在聚多巴胺外壳上连接硼替佐米的方法为：使具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液与溶有硼替佐米的有机相混合，反应1～24h，使硼替佐米连接在聚多巴胺外壳上；

步骤(1)所述聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺与化学抗癌药物的质量比为4～20:1；步骤(2)所述聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺与多巴胺盐酸盐的质量比为1:0.2～1.5；步骤(3)所述硼替佐米与步骤(1)所述化学抗癌药物的质量比为0.5～1.2:1。

2.根据权利要求1所述的纳米载药系统，其特征在于，所述聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇链段的重均分子量为1000～15000。

3.根据权利要求2所述的纳米载药系统，其特征在于，所述聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇链段的重均分子量为1500～5500。

4.根据权利要求1所述的纳米载药系统，其特征在于，所述化学抗癌药物为除硼替佐米之外的其他化学抗癌药物。

5.根据权利要求4所述的纳米载药系统，其特征在于，所述化学抗癌药物为阿霉素、紫杉醇、顺铂、环磷酰胺、羟基喜树碱或所述药物的药学上可接受的盐中的任意一种或至少两种的组合。

6.根据权利要求5所述的纳米载药系统，其特征在于，所述化学抗癌药物为盐酸阿霉素。

7.根据权利要求1所述的纳米载药系统，其特征在于，所述载药纳米胶束内核的粒径为≤30nm。

8.根据权利要求1所述的纳米载药系统，其特征在于，所述聚多巴胺外壳的厚度为1～15nm。

9.根据权利要求8所述的纳米载药系统，其特征在于，所述聚多巴胺外壳的厚度为3～10nm。

10.根据权利要求9所述的纳米载药系统，其特征在于，所述聚多巴胺外壳的厚度为4～8nm。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的纳米载药系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)载药纳米胶束的形成；

(2)在所述载药纳米胶束外形成聚多巴胺外壳；

(3)在聚多巴胺外壳上连接硼替佐米；

步骤(1)所述载药纳米胶束形成的方法为：将聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和化学抗癌药物分散在pH值为8.0-9.0的缓冲溶液中，获得载药纳米胶束溶液；

步骤(2)所述在载药纳米胶束外形成聚多巴胺外壳的方法为：向载药纳米胶束溶液中加入多巴胺盐酸盐，反应4～48h，在所述载药胶束外形成聚多巴胺外壳，得到具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液；

步骤(3)所述在聚多巴胺外壳上连接硼替佐米的方法为：使具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液与溶有硼替佐米的有机相混合，反应1～24h，使硼替佐米连接在聚多巴胺外壳上；

步骤(1)所述聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺与化学抗癌药物的质量比为4～20:1，步骤(2)所述聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺与多巴胺盐酸盐的质量比为1:0.2～1.5；步骤(3)所述硼替佐米与步骤(1)所述化学抗癌药物的质量比为0.5～1.2:1。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺与化学抗癌药物的质量比为4～10:1。

13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述缓冲溶液为tris-HCl缓冲溶液。

14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述缓冲溶液的pH值为8.5。

15.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述载药纳米胶束的浓度为2～15mg/mL。

16.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺与多巴胺盐酸盐的质量比为1:0.5～0.8。

17.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述反应时间为6～24h。

18.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述反应在有氧气的环境中进行。

19.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述反应在搅拌下进行。

20.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)还包括在反应结束后进行离心分离和干燥，去除未反应的多巴胺以及缓冲溶液的步骤。

21.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述硼替佐米与步骤(1)所述化学抗癌药物的质量比为0.7～1:1。

22.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述溶有硼替佐米的有机相中有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N-二甲基甲酰胺。

23.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述具有聚多巴胺外壳的载药纳米胶束溶液与溶有硼替佐米的有机相的体积比≥5:1。

24.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述体积比≥10:1。

25.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述反应的时间为2～6h。

26.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述反应的温度为4-30℃。

27.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述反应在碱性或中性环境下进行。

28.根据权利要求所述1-10中任一项的纳米载药系统在制备用于抗癌治疗的药物中的应用。