CN116549609A - 一种il2制剂、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种IL2制剂、其制备方法及应用。所述的制剂为水溶剂,其中包含:(1)浓度大于1mg/ml的IL2蛋白;(2)二硬脂酸磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇(PEG‑DSPE);(3)必要的pH调节/缓冲剂。所述的IL2/PP制剂用于制备通过皮下注射的方式给药的药物或制剂。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体的,涉及一种IL2制剂、其制备方法及应用。
背景技术
白细胞介素2(IL2)又称为T细胞生长因子,发现于1976年,在体外实验中刺激T细胞克隆扩增[1]。IL2为四个α螺旋的糖蛋白,分子量为15.5kD[2],主要由活化的CD4T细胞分泌,其它细胞如活化的CD8细胞、NK细胞、NKT细胞以及ILCs细胞也能产生少量的IL2[3,4]。IL2以自分泌和旁分泌途径结合于受体细胞上发挥功能,对T、NK细胞具有重要的调节作用。IL2的受体由IL2Rα(CD25),IL2Rβ(CD122)和IL2Rγc(也称为共同的细胞因子受体γ链,γc或CD132)三个亚基构成,IL2与三种亚基之间的亲和力存在差异[5,6]。IL2与α亚基之间低亲和力结合(Kd~10-8M),与βγ二聚体中等亲和力结合(Kd~10-9M),与αβγ三聚体高亲和力结合(Kd~10-11M)[7,8,13]。此外,IL2Rγc(CD132)同时也是IL4、IL7、IL9、IL15、IL21的受体单元。
不同亲和力受体在不同细胞上的表达水平存在差异:βγ受体主要表达在静息状态的T细胞、CD8T记忆细胞和NK细胞上;α受体在细胞活化后表达上调,活化后的T细胞表达高亲和力的αβγ受体。Treg细胞持续高表达α受体,Treg细胞对IL2分子具有很高的亲和力[9]。由于受体表达的差异性,低剂量的IL2优先活化表达高亲和力受体的Treg细胞,高剂量的IL2才能有效活化CD8+T细胞和NK细胞[10],而临床上使用高剂量的IL2会导致更大的毒副作用而限制了IL2的使用。
为了克服这一问题,尝试通过不同的手段对IL2分子进行改造,使其降低对Treg的 结合而提高对效应T细胞和NK细胞的结合来增强其在肿瘤治疗中的效果,同时避免高剂量 使用而导致的毒性。现有技术中,对IL2的改造主要包括以下几种方法:
(1)PEG化的IL2
IL2的分子量为15.5kD,在体内血清中的半衰期为10-85min,为了达到治疗效果需要多次重复给药。PEG化的IL2提高了IL2的总体分子量延长了IL2的半衰期,同时通过PEG化修饰位点的不同可以使IL2偏向于结合或者IL2-Rb[11]。
(2)IL2与抗IL2抗体复合物
IL2与抗IL2抗体复合物的结合一方面可以延长IL2的半衰期,另一方面由于抗IL2抗体可以与IL2分子不同部位的结合,使IL2与抗IL2抗体复合物表现出与受体CD25或者CD122结合的不同倾向性。
(3)IL2突变改造
通过对IL2上面不同受体结合位点的点突变改造,也可以改变IL2与不同受体亚基的亲和力。通过对IL2分子L80F、R81D、L85V、I86V和I92F五个碱基的点突变,使IL2发生构象改变,增加与CD122的结合同时使下游信号的转导不依赖于CD25分子。突变的IL2偏向于扩增CD8+T细胞和NK细胞,具有更低的毒副作用并且在小鼠的肿瘤模型中表现出更好的肿瘤治疗效果[12]。
可见,如何进一步比较和分析瘤内Treg细胞和效应T细胞上CD25以及CD122受体表 达的差异性来进一步提高IL2治疗效果仍是一个关键的问题。
但是,上述现有技术中,对IL2的改造,往往需要引入较为复杂的生物/化学合成工艺,极大的增加了药物开发的难度和不确定性。基于此,提出本发明。
[参考文献]
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[13]Spolski R,et al.Nat Rev Immunol.2018.PMID:30089912Review.
发明内容
本发明首先涉及一种IL2/PP制剂,所述的制剂为水溶剂,其中包含:
(1)浓度大于40ug/ml的IL2蛋白,优选的,浓度大于0.1mg/ml的IL2蛋白;更优选的,浓度大于1mg/ml的IL2蛋白;
(2)二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(PEG-DSPE);
(3)必要的pH调节/缓冲剂;
所述的PEG-DSPE与IL2蛋白的摩尔比为8~100:1;优选的,所述的PEG-DSPE与IL2蛋白的摩尔比为10~80:1;更优选的,所述的PEG-DSPE与IL2蛋白的摩尔比为15~50:1;最优选的,所述的PEG-DSPE与IL2蛋白的摩尔比为20~30:1;
所述的IL2蛋白又称为T细胞生长因子,其结构包含四个α螺旋的糖蛋白,分子量为15.5kD;优选的,所述的IL2蛋白包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列;最优选的,所述的IL2蛋白由大肠杆菌系统表达并纯化,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述的PEG-DSPE的纯度≥95%,其中的PEG链的分散度≤1.1;
优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为1000~5000Da;更优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为1500~2500Da;最优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为2000Da(PEG2000-DSPE);
优选的,所述的IL2蛋白的浓度为40~20000ug/ml;更优选的,所述的IL2蛋白的浓度为0.1~20mg/ml;最优选的,所述的IL2蛋白的浓度为1~10mg/ml。
优选的,使用所述的pH调节剂将所述的IL2/PP制剂的pH调节至5.5~6.0;
所述的pH调节/缓冲剂包括但不限于,盐酸、醋酸、氢氧化钠/钾、碳酸氢钠、碳酸二氢钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、氨基酸类pH调节/缓冲剂如甘氨酸、组氨酸。
可选的,所述的IL2/PP制剂可以进一步进行冻干,制备成IL2/PP冻干制剂。
所述的IL2/PP冻干制剂中还包括冻干保护剂,所述的冻干保护剂包括但不限于:甘油、甘氨酸、蔗糖、乳糖、白蛋白、组氨酸、甘露醇或其组合物。
本发明还涉及所述的IL2/PP制剂的制备方法,其包括如下步骤,
(1)制备含有pH为3.0~3.5的水溶液;优选的,用去离子水将冰醋酸稀释至浓度为10mM,调节pH为3.0~3.5;
(2)称取一定量的IL2蛋白干粉,加入上述pH为3.0~3.5的水溶液,充分混匀得到IL2悬浊液;
(3)根据上一步中IL2蛋白的用量称取相应量的PEG-DSPE干粉,加入上述IL2悬浊液中,充分混匀;
(4)40℃~60℃水浴加热10~30分钟;
(5)将步骤(4)制得的溶液静置平衡至室温,将pH调至5.5~6.0,继续静置10~60分钟;
以及可选的,
(6)用同样缓冲体系的溶剂将步骤(5)制得的溶液中的IL2蛋白稀释至合适的浓度,或超滤浓缩步骤(5)制得的溶液将IL2蛋白浓缩至合适的浓度;
(7)过滤除菌。
所述制备方法制得的IL2/PP制剂中的IL2蛋白的回收率≥90%;回收率指IL2/PP制剂中的蛋白含量与蛋白投料量的比值;
所述的PEG-DSPE的纯度≥95%,其中的PEG链的分散度≤1.1;
优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为1000~5000Da;更优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为1500~2500Da;最优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为2000Da(PEG2000-DSPE);
本发明还涉及所述的IL2/PP制剂的如下应用:
(1)制备抗肿瘤药物;
(2)制备激活细胞免疫反应的制剂;
(3)制备抗肿瘤联用制剂,优选的,所述的联用制剂中还包括:抗体或抗体构建体、细胞毒性药物、免疫或细胞治疗制剂;
所述的药物或制剂相比与DLS制剂形式的IL2制剂,具有更低的毒性和/或副作用;
所述的激活细胞免疫反应指,在体内或体外:
(1)上调CD8+T细胞的增殖,和/或
(2)诱导T细胞向CD8+T细胞分化,和/或
(3)抑制T细胞向Treg细胞分化;和/或
(4)提高CD8+T细胞/Treg细胞的比例;
优选的,所述的激活细胞免疫反应指:
所述的IL2/PP制剂,相比与DLS制剂形式的IL2制剂(阳性参比制剂)或游离的蛋白溶液形式的制剂,能够在体内或体外:
(1)更多的上调CD8+T细胞的增殖,和/或
(2)更多的诱导T细胞向CD8+T细胞分化,和/或
(3)更多的抑制T细胞向Treg细胞分化;
(4)提高CD8+T细胞/Treg细胞的比例;
优选的,所述的药物或制剂是通过皮下注射的方式给药的药物或制剂。
本发明还涉及二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(PEG-DSPE)在制备改变目的蛋白与其受体亲和力的制剂中的应用,所述的目的蛋白中包含至少一个α螺旋结构;优选的,所述的蛋白包含四至六个α螺旋结构;更优选的,所述的目的蛋白为IL2、IL4、IL7、IL9、IL15、IL21、G-CSF、GM-CSF;
所述的改变目的蛋白与其受体亲和力指,降低蛋白与低亲和力受体的结合能力;优选的,所述的低亲和力受体指,与蛋白的亲和力(Kd值)≥10-6M;更优选的,所述的低亲和力受体指,与蛋白的亲和力(Kd值)≥10-7M;最优选的,所述的低亲和力受体指,与蛋白的亲和力(Kd值)≥10-8M;
所述的制剂中,所述PEG-DSPE的分子与所述目的蛋白的比例为:
(1)所述PEG-DSPE的分子数与所述目的蛋白的α螺旋结构数的比为2~25:1;优选的,所述PEG-DSPE的分子数与所述目的蛋白的α螺旋结构数的比为3~20:1;更优选的,所述PEG-DSPE的分子数与所述目的蛋白的α螺旋结构数的比为4~15:1;
或(2)所述的PEG-DSPE与所述目的蛋白的摩尔比为8~100:1;优选的,所述的PEG-DSPE与所述目的蛋白的摩尔比为10~80:1;更优选的,所述的PEG-DSPE与所述目的蛋白的摩尔比为15~50:1;最优选的,所述的PEG-DSPE与所述目的蛋白的摩尔比为20~30:1。
所述的PEG-DSPE的纯度≥95%,其中的PEG链的分散度≤1.1;
优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为1000~5000Da;更优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为1500~2500Da;最优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为2000Da(PEG2000-DSPE)。
附图说明
图1、IL-2与低亲和力、中等亲和力和高亲和力IL-2受体结合的示意图[13]。
图2、IL2/PP制剂成品的照片。
图3、CTLL-2/MTT实验考察IL2/PP制剂与阳性参照品DLS的生物活性。
图4、微量热滴定(ITC)考察IL-2与PEG2000-DSPE和SDS之间的相互作用强弱。
4A.IL-2与SDS的滴定结果,实验温度25℃;
4B.IL-2与PEG2000-DSPE的滴定结果,实验温度25℃;
4C.IL-2与PEG2000-DSPE的滴定结果,实验温度50℃。
图5、在CT26-Balb/C小鼠荷瘤模型上考察并比较IL2/PP制剂与阳性参照品DLS抑制肿瘤发展的功能(腹腔+皮下)
5A.整个考察阶段内,各组小鼠的肿瘤体积变化情况(平均值+SEM);
5B.从开始给药到结束给药后一周内,各组小鼠的体重变化情况(平均值+SEM)。
图6、在CT26-Balb/C小鼠荷瘤模型上考察并比较IL2/PP制剂与阳性参照品DLS抑制肿瘤发展的功能(尾静脉&皮下)
6A.整个考察阶段内,各组小鼠的肿瘤体积变化情况(平均值+SEM);
6B.整个考察阶段内,各组小鼠的体重变化情况(平均值+SEM);
6C.各组小鼠的生存期差异(除正常死亡外,当肿瘤体积>2000mm3时即判定小鼠死亡)。
图7、在CT26-Balb/C小鼠荷瘤模型上比较IL2/PP制剂与阳性参照品DLS连续给药后引起的毒副反应(尾静脉&皮下)
7A.阳性参照品DLS经过连续皮下给药后,会在注射位置出现明显的表皮破溃现象并在创口处结痂(针口大小的破溃结痂);
7B.IL2/PP制剂经过连续皮下给药后,不会出现任何明显的不良反应,注射位置完全正常;
7C.阳性参照品DLS经过连续尾静脉给药后,会导致小鼠整个尾部出现非常严重的破溃、淤血、肿胀等情况,该现象不仅使得注射操作难以完成,且在停止给药后恢复十分缓慢;
7D.IL2/PP制剂经过连续尾静脉给药后,不会出现任何明显的不良反应,整个尾部完全正常,可以完成连续注射的操作;
7E.阳性参照品DLS尾静脉给药组中毒副作用较严重的一只小鼠,其尾部在破溃血肿后逐渐坏死,最终断裂脱落。
图8、在B16F10-C57BL/6小鼠荷瘤模型上考察并比较IL2/PP制剂与阳性参照品DLS抑制肿瘤发展的功能(尾静脉&皮下)
8A.整个考察阶段内,采用皮下注射给药的4组小鼠的肿瘤体积变化情况(平均值
+SEM);
8B.整个考察阶段内,采用尾静脉注射给药的2组小鼠的肿瘤体积变化情况(平均值
+SEM);
8C.整个考察阶段内,使用DLS制剂给药治疗的3组小鼠的肿瘤体积变化情况(平均值
+SEM);
8D.整个考察阶段内,使用IL2/PP制剂给药治疗的3组小鼠的肿瘤体积变化情况(平均值+SEM);
8E.整个考察阶段内,各组小鼠的体重变化情况(平均值+SEM);
8F.各组小鼠的生存期差异(除正常死亡外,当肿瘤体积>2000mm3时即判定小鼠死亡)。
图9、在B16F10-C57NL/6小鼠荷瘤模型上比较IL2/PP制剂与阳性参照品DLS连续给药后引起的毒副反应(尾静脉&皮下)
9A.阳性参照品DLS经过连续皮下给药后,会在注射位置出现明显的表皮破溃现象并在创口处结痂,停止给药后4~6天伤口会逐渐愈合;
9B.IL2/PP制剂经过连续皮下给药后,不会出现任何明显的不良反应,注射位置完全正常;
9C.阳性参照品DLS经过连续尾静脉给药后,会导致小鼠整个尾部出现比较严重的淤血、肿胀及进针位置破溃的情况,该现象使得注射操作难以完成,在停止给药后一周左右逐渐恢复;
9D.IL2/PP制剂经过连续尾静脉给药后,不会出现任何明显的不良反应,整个尾部完全正常;
9E.阳性参照品DLS皮下给药组中毒副作用较严重的一只小鼠,其破溃结痂的位置在停止给药后2周仍未完全愈合;
9F.阳性参照品DLS尾静脉给药组中毒副作用较严重的一只小鼠,其尾部破溃的部位在停止给药后2周仍未恢复。
图10、在CT26-Balb/C小鼠荷瘤模型中考察并比较IL2/PP制剂与阳性参照品DLS对不同T细胞亚群的选择性作用
10A.经过连续腹腔给药后,IL2/PP制剂和阳性参照品DLS引起荷瘤小鼠脾脏中免疫抑制性Treg细胞(CD45+CD4+Foxp3+)和CD8+效应T细胞(CD45+CD3+CD8+)活化的比例以及二者的比值(平均值+SEM);
10B.经过连续腹腔给药后,IL2/PP制剂和阳性参照品DLS引起荷瘤小鼠肿瘤组织中免疫抑制性Treg细胞(CD45+CD4+Foxp3+)和CD8+效应T细胞(CD45+CD3+CD8+)活化的比例以及二者的比值(平均值+SEM)。
具体实施方式
材料和方法
IL-2蛋白由大肠杆菌系统表达并纯化,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示:
SEQ ID NO.1:
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
PEG2000-DSPE(二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)购自Lipoid公司。
阳性参比制剂
使用DLS制剂作为阳性参比制剂,其为含有SDS(十二烷基硫酸钠)作为助溶剂的IL2蛋白制剂,其成份和制备为本领域技术人员所熟知的现有技术,可参考例如:EP1688146B1等。
细胞株:
CTLL-2:ATCC Number TIB-214,来源于C57BL/6品系小鼠的细胞毒性T淋巴细胞,其正常生长和增殖依赖一定浓度的IL-2作用,常作为报告细胞用于评价IL-2及其类似物的生物学活性。
CT26小鼠结肠癌细胞:ATCC Number CRL-2638,来源于Balb/c品系小鼠,是被N-亚硝基-N-甲基脲烷(NNMU)诱导得到的未分化的小鼠结肠癌细胞,成纤维样贴壁生长,常用于测试免疫治疗程序的模型或用于研究宿主的免疫反应。
B16F10小鼠皮肤黑色素瘤细胞:ATCC Number CRL-6475,来源于C57BL/6J品系黑色素瘤荷瘤小鼠的皮肤,是B16F0的亚系,成纤维样贴壁生长,常用于构建小鼠的黑色素皮肤瘤动物模型。
细胞株培养方法:
小鼠IL-2依赖型细胞毒性T淋巴细胞CTLL-2的培养:使用RPMI-1640培养基,加入10%胎牛血清、400~800IU/ml rhIL-2、50uMβ-巯基乙醇。将冻存的细胞从液氮保存罐中取出后立即放入37℃水浴中快速溶化,然后将细胞悬液移入含10ml培养基的离心管中,1500×g离心5分钟后去除上清,用新鲜培养基重悬后将细胞转移到含10~15ml培养基的细胞培养瓶中,置于37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养。每天或隔天观察细胞状态,及时更换新鲜培养基并进行传代。
小鼠结肠癌模型CT26细胞系的培养:使用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清),将冻存的细胞从液氮保存罐中取出后立即放入37℃水浴中快速溶化,然后将细胞悬液移入含10ml培养基的离心管中,700×g离心5分钟后去除上清,用新鲜培养基重悬后将细胞转移到含10~15ml培养基的细胞培养瓶中,置于37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养。每天或隔天观察细胞状态,及时更换新鲜培养基并进行传代。
小鼠黑色素瘤B16F10细胞系的培养:使用DMEM培养基(含10%胎牛血清),将冻存的细胞从液氮保存罐中取出后立即放入37℃水浴中快速溶化,然后将细胞悬液移入含10ml培养基的离心管中,700×g离心5分钟后去除上清,用新鲜培养基重悬后将细胞转移到含10~15ml培养基的细胞培养瓶中,置于37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养。每天或隔天观察细胞状态,及时更换新鲜培养基并进行传代。
实验动物:
BALB/c:为SPF级,6~8周龄,雌性,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,符合北京市实验动物质量标准。
C57BL/6N:为SPF级,6~8周龄,雌性,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,符合北京市实验动物质量标准。
实施例1、IL2/PP制剂的制备
(1)用去离子水将冰醋酸稀释至浓度为10mM,pH=3.0~3.5,经0.22um滤膜过滤后作为溶剂使用。
(2)称取一定质量的IL2蛋白冻干粉,加入上述10mM稀醋酸溶液,充分混匀得到IL2悬浊液。
(3)根据上一步中IL2的用量称取相应质量的PEG2000-DSPE粉末,使得二者的摩尔比达到PEG2000-DSPE:IL2=15~30:1,加入上述IL2悬浊液中,充分混匀。
(4)40℃~60℃水浴加热10~30分钟。
(5)将样品静置平衡至室温。
(6)向样品中加入1M NaOH溶液,将pH调至5.5~6.0,继续静置10~60分钟。
(7)用盐浓度和酸碱度一致的溶剂将所得样品稀释至合适的浓度。
(8)用0.22um滤膜过滤样品,即得IL2/PP制剂。
用BCA法检测过滤后产物的蛋白浓度后,将产物于4℃密封保存。制备得到的IL2/PP制剂的外观如图2所示,为无色澄清透明溶液,无任何可见不溶物。
实施例2、CTLL-2/MTT细胞增殖实验考察IL2/PP制剂的生物活性
试剂:
(1)基础培养基:RPMI 1640+10%FBS+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素。
(2)完全培养基:在基础培养基中加入IL2至终浓度达到400~800IU/ml。
(3)PBS:每1L中含有NaCl 8g、KCl 0.20g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO4 0.24g,121℃高压灭菌15min。
(4)噻唑蓝溶液(MTT):浓度5mg/ml,经0.22um滤膜过滤除菌,4℃避光保存。
(5)裂解液:15%十二烷基硫酸钠溶液(SDS)。
实验步骤:
(1)制备样品:以生物活性已知的阳性参照品DLS作为标准品,以实施例1中制备的IL2/PP制剂作为供试品,分别用基础培养基稀释至合适的浓度,例如400~800IU/ml。
(2)制备CTLL-2细胞悬液:取复苏后用完全培养基培养、生长旺盛的CTLL-2细胞,用不含其他成分的1640培养液将细胞洗3次后,再用基础培养基重悬,配成合适浓度的细胞悬液,例如2~6×105/ml。
(3)加入样品:准备平底96孔板,将供试品和标准品用基础培养基进行梯度稀释,至少得到8个浓度、彼此相差2倍或以上,每个浓度做2~3个孔,每孔中加入50ul样品。
(4)接种细胞:向各孔加入50ul细胞悬液,混匀后置于5%CO2的37℃细胞培养箱中18~24小时。
(5)每孔加入20ul MTT溶液,于培养箱中继续孵育4~6小时。
(6)每孔加入150ul 15%SDS溶液,充分混匀,于培养箱中继续孵育18~24小时。
(7)使用酶标仪测定570nm波长处的吸光度,并根据以下方法计算供试品的IL-2活性。
比活性计算:供试品的生物学活性(IU/ml)=Pr×(Ds×Es)/(Dr×Er),其中,
Pr:标准品的生物学活性,IU/ml
Ds:供试品的预稀释倍数
Dr:标准品的预稀释倍数
Es:供试品相当于标准品半效量的稀释倍数
Er:标准品半效量的稀释倍数
实验结果(图3)表明,
(1)IL2/PP制剂中的IL-2蛋白分子的生物活性与阳性参照品DLS中的蛋白分子的生物活性基本一致,甚至略高于DLS;
(2)IL2/PP的半数有效浓度EC50值约为0.00723mM,明显低于DLS的EC50值0.01147nM。
实施例3、考察IL2与PEG2000-DSPE和SDS之间相互作用的亲和力差异
(1)样品准备:
A.PEG2000-DSPE溶液:溶于10mM醋酸钠盐缓冲液(pH=5.5),浓度0.5mM;
B.SDS溶液:溶于7.69mM磷酸钠盐缓冲液(pH=7.6),浓度1.73mM;
C.IL-2溶液:溶于10mM醋酸钠盐缓冲液(pH=5.5),浓度0.005mM;
D.IL-2溶液:溶于7.69mM磷酸钠盐缓冲液(pH=7.0),浓度0.0164mM。
(2)参数设定及实验条件:
使用Malvern Panalytical公司的MicroCal ITC 200等温滴定量热仪及其配套的操作软件,具体参数设定参照下表:
(3)考察PEG2000-PE与IL-2之间的相互作用时,向注射器中加入40ul样品A,向样品池中加入250ul样品C;考察SDS与IL-2之间的相互作用时,向注射器中加入40ul样品B,向样品池中加入250ul样品D。在软件中设置相应样品的浓度和反应温度后开始滴定。反应结束后,对检测到的热量变化进行积分处理并拟合反应曲线(图4),计算出两种样品相互作用的各项参数。其中,ITC滴定过程测出的K值是结合常数,单位是M-1,它的倒数是两种物质的解离常数Kd,单位M,Kd值越小,表明两种物质相互间亲和力越强。
(4)结果显示,IL-2蛋白与SDS之间的相互作用力很弱(计算出平衡解离常数Kd约为3.73×10-5M);与之相对,IL-2与PEG2000-DSPE在该条件下能够自发地发生非常强的相互作用(Kd约为1.17×10-7M),二者的亲和力相比于SDS高出约2个数量级;且随着反应温度的升高(从25℃提高至50℃),IL-2与PEG2000-DSPE的亲和力也明显增大(Kd约为1.28×10-8M)。说明在实施例一中所描述的制备条件下,IL-2蛋白与PEG2000-DSPE之间的相互作用远远强于阳性参照品中使用的SDS。
实施例4、在CT26-Balb/C小鼠荷瘤模型中考察IL2/PP制剂的功能活性
实验方案(一)腹腔给药&皮下给药
(1)使用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)培养从液氮中复苏后的CT26细胞,连续培养5~7天、传代3次以上并确保细胞状态正常后方可使用。实验当天,细胞应贴壁生长至达到80%~90%汇合度且状态良好,用0.05%胰酶消化后再用10倍体积新鲜培养基中和,700×g离心弃上清后加入适当体积的无菌PBS重悬并计数,用无菌PBS将细胞悬液的密度调整为5×106/ml,置冰上保存待用。
(2)使用1ml无菌注射器在周龄6~8周的雌性野生型Balb/C小鼠的右侧背部皮下接种CT26细胞悬液,每只小鼠注射0.1ml,即接种5×105个CT26细胞。
(3)在接种后的第10天,小鼠在接种位置已长成明显的肿瘤,体积为120±10mm3。选取肿瘤大小和形状合适的小鼠进行分组,使各组体积的分布和平均值基本一致。共设置5个实验组,每组8只小鼠:
A.空白对照组(Blank CTR)
B.阳性参照品DLS腹腔给药组(DLS i.p.)
C.阳性参照品DLS皮下给药组(DLS s.c.)
D.IL2/PP制剂腹腔给药组(IL2/PP i.p.)
E.IL2/PP制剂皮下给药组(IL2/PP s.c.)
(4)从接种后的第11天开始进行给药,按照所属分组的给药方式,每只小鼠每次注射0.1ml对应制剂(每次注射的IL-2实际用量为10ug),每天给药2次,持续给药8天,共给药16次(空白对照组不做任何处理)。
(5)IL2/PP制剂的制备按照实施例一中所描述的方法进行,阳性参照品DLS使用注射用水复溶冻干粉制备注射液,二者均用BCA法进行蛋白定量并调整至所需浓度。
(6)从完成分组开始持续观察各组小鼠的状态,每周3次测量荷瘤小鼠的肿瘤体积和体重变化,并记录死亡情况。
(7)实验结果(图5)显示:在该给药方案的治疗下,
①采用腹腔注射给药时,IL2/PP制剂和DLS制剂相比于空白对照组均能够显著抑制肿瘤的生长、将瘤体积控制在很小的范围内,但两组之间并没有明显差异。
②采用皮下注射给药时,IL2/PP制剂和DLS制剂相比于空白对照组均能够显著抑制肿瘤的生长,两组之间也有明显差异,IL2/PP制剂组的抑制效果要明显优于DLS制剂组,并达到与腹腔给药组抑制的水平,这说明IL2/PP制剂比阳性参照品DLS具有更加优异的活 性和效果。
③体重的变化情况显示,腹腔给药组的小鼠在开始给药后会出现体重快速大幅度下降的情况,同时伴随小鼠活力和体温下降、生存状态较差等现象,在结束给药后才逐渐恢复。而皮下给药组的体重则持续上升,小鼠状态也保持稳定。这说明腹腔给药虽然吸收快、效果好,但毒副作用同样较强、会严重影响小鼠的生存状态,而皮下给药则相对安全很多。
综上,IL2/PP制剂在采用皮下给药方案时能够兼顾治疗效果和安全性,整体上优 于现有阳性参照品DLS。
实验方案(二)尾静脉给药&皮下给药
(1)使用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)培养从液氮中复苏后的CT26细胞,连续培养5~7天、传代3次以上并确保细胞状态正常后方可使用。实验当天,细胞应贴壁生长至达到80%~90%汇合度且状态良好,用0.05%胰酶消化后再用10倍体积新鲜培养基中和,700×g离心弃上清后加入适当体积的无菌PBS重悬并计数,再用无菌PBS将细胞悬液的密度调整为5×106/ml,置冰上保存待用。
(2)使用1ml无菌注射器在周龄6~8周的雌性野生型Balb/C小鼠的右侧背部皮下接种CT26细胞悬液,每只小鼠注射0.1ml,即接种5×105个CT26细胞(注意每次吸取细胞悬液前将其混合均匀)。
(3)在接种后的第8天,小鼠在接种位置已长成明显的肿瘤,体积为150±10mm3。选取肿瘤大小和形状合适的小鼠进行分组,使各组体积的分布和平均值基本一致。共设置5个实验组,每组5只小鼠:
A.空白对照组(Blank CTR)
B.阳性参照品DLS尾静脉给药组(DLS i.v.)
C.阳性参照品DLS皮下给药组(DLS s.c.)
D.IL2/PP制剂尾静脉给药组(IL2/PP i.v.)
E.IL2/PP制剂皮下给药组(IL2/PP s.c.)
(4)从接种后的第9天开始进行给药,按照所属分组的给药方式,每只小鼠每次注射0.1ml对应制剂(IL-2实际用量为16ug),每天给药1次,持续给药8天(空白对照组不做任何处理)。
(5)IL2/PP制剂的制备按照实施例1中所描述的方法进行,阳性参照品DLS使用注射用水复溶冻干粉制备注射液,二者均用BCA法进行蛋白定量并调整至所需浓度。
(6)从完成分组开始持续观察小鼠的状态,每周3次测量荷瘤小鼠的肿瘤体积和体重变化,记录死亡情况,并观察给药过程中各组小鼠出现的毒副反应。
(7)实验结果(图6、图7)显示:在该给药方案的治疗下,
①采用皮下注射给药时,相比于空白对照组,IL2/PP制剂组能够显著抑制肿瘤的 生长和发展并延长荷瘤小鼠的生存期,而DLS制剂组的效果则弱得多,只能轻微改善肿瘤体积的生长。
②采用尾静脉注射给药时,IL2/PP和DLS两种制剂的抑瘤效果相比于空白对照组 都不明显。
③使用IL2/PP制剂治疗时,相同剂量下皮下给药的效果要明显优于尾静脉给药,二者存在显著性差异。
④使用DLS制剂治疗时,相同剂量下皮下给药和尾静脉给药的效果基本一致,且都不明显。
⑤无论是皮下注射还是尾静脉注射,IL2/PP制剂在连续使用时的安全性都要远远 优于DLS制剂,基本不会产生任何不良反应。与之相对,DLS制剂在连续给药后会出现非常明显且严重的毒副作用。
综上,IL2/PP制剂在采用皮下注射进行给药时,在加强抗肿瘤效果、延长生存期、提高安全性等多方面都显著优于现有阳性参照品DLS。
实施例5、在B16F10-C57BL/6小鼠荷瘤模型中考察IL2/PP制剂的功能活性(尾静脉&皮下给药)
(1)使用DMEM培养基(含10%胎牛血清)培养从液氮中复苏后的B16F10细胞,连续培养5~7天、传代3次以上并确保细胞状态正常后方可使用。实验当天,细胞应贴壁生长至达到80%~90%汇合度且状态良好,用0.05%胰酶消化后再用10倍体积新鲜培养基中和,700×g离心弃上清后加入适当体积的无菌PBS重悬并计数,用无菌PBS将细胞悬液的密度调整为2×106/ml,置冰上保存待用。
(2)使用1ml无菌注射器在周龄6~8周的雌性野生型C57BL/6小鼠的右侧背部皮下接种B16F10细胞悬液,每只小鼠注射0.1ml,即接种2×105个CT26细胞(注意每次吸取细胞悬液前将其混合均匀)。
(3)在接种后的第10天,小鼠在接种位置已长成明显的肿瘤,体积为40±3mm3。选取肿瘤大小和形状合适的小鼠进行分组,使各组体积的分布和平均值基本一致。共设置8个实验组,每组5只小鼠:
A.空白对照组(Blank CTR)
B.阳性参照品DLS尾静脉给药组(DLS i.v.16ug)
C.IL2/PP制剂尾静脉给药组(IL2/PP i.v.16ug)
D.阳性参照品DLS皮下给药高剂量组(DLS s.c.16ug)
E.阳性参照品DLS皮下给药低剂量组(DLS s.c.8ug)
F.IL2/PP制剂皮下给药高剂量组(IL2/PP s.c.8ug)
G.IL2/PP制剂皮下给药低剂量组(IL2/PP s.c.4ug)
(4)从接种后的第8天开始进行给药,按照所属分组的给药方式和剂量,每只小鼠每次注射0.1ml对应浓度的不同制剂(IL-2实际用量为4、8、16ug不等,具体用量参考上述各组说明),每天给药1次,其中皮下给药组持续给药8天、尾静脉给药组持续给药4天(空白对照组不做任何处理)。
(5)IL2/PP制剂的制备按照实施例一中所描述的方法进行,阳性参照品DLS使用注射用水复溶冻干粉制备注射液,二者均用BCA法进行蛋白定量并用无菌PBS调整至所需浓度。
(6)从完成分组开始持续观察小鼠的状态,每周3次记录荷瘤小鼠的肿瘤体积和体重变化以及死亡情况,并观察给药过程中各组小鼠出现的毒副反应。
(7)实验结果(图8、9)显示:在该给药方案的治疗下,
①采用皮下注射给药时,相比于空白对照组,IL2/PP制剂和DLS制剂均能比较明显地抑制肿瘤的生长,且均呈现出明显的剂量依赖性,剂量越高治疗效果越好。其中IL2/PP制剂组的抑瘤效果要明显优于DLS制剂组,且实现相同的治疗效果所需的剂量要小得多,仅需 DLS制剂1/4的剂量即可达到更好的疗效。
②采用尾静脉注射给药时,IL2/PP制剂组的抑瘤效果要明显优于DLS制剂组,而后者相比于空白对照组效果并不明显。
③使用IL2/PP制剂治疗时,皮下给药的效果要明显优于尾静脉给药,且所需剂量更小,二者存在显著性差异。
④使用DLS制剂治疗时,皮下给药的效果同样优于尾静脉给药。
⑤IL2/PP制剂相比于空白对照组能够略微延长荷瘤小鼠的生存期,但2组IL2/PP皮下给药组各有一只小鼠实现了肿瘤完全消除,其他组均无此现象。
⑥无论是皮下注射还是尾静脉注射,IL2/PP制剂在连续使用时的安全性都要优于 DLS制剂,基本不会产生任何不良反应。与之相对,DLS制剂在连续给药后会出现比较明显且严重的毒副作用。
综上,IL2/PP制剂在采用皮下注射以及尾静脉注射进行给药时,在加强抗肿瘤效果、提高安全性等方面都明显优于现有阳性参照品DLS。尤其是皮下给药,IL2/PP制剂能够以小得多的剂量实现与DLS制剂相同的治疗效果。
实施例6、在CT26-Balb/C小鼠荷瘤模型中验证IL2/PP制剂对不同受体细胞的选择性作用
(1)使用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)培养从液氮中复苏后的CT26细胞,连续培养5~7天、传代3次以上并确保细胞状态正常后方可使用。实验当天,细胞应贴壁生长至达到80%~90%汇合度且状态良好,用0.05%胰酶消化后再用10倍体积新鲜培养基中和,700×g离心弃上清后加入适当体积的无菌PBS重悬并计数,用无菌PBS将细胞悬液的密度调整为5×106/ml,置冰上保存待用。
(2)使用1ml无菌注射器在周龄6~8周的雌性野生型Balb/C小鼠的右侧背部皮下接种CT26细胞悬液,每只小鼠注射0.1ml,即接种5×105个CT26细胞。
(3)在接种后的第8天,小鼠在接种位置已长成明显的肿瘤,体积为80±15mm3。选取肿瘤大小和形状合适的小鼠进行分组,使各组体积的分布和平均值基本一致。共设置2个实验组,每组3只小鼠:
A.阳性参照品DLS腹腔给药组
B.IL2/PP制剂腹腔给药组
(4)从接种后的第8天开始进行给药,按照所属分组,每只小鼠每次腹腔注射0.1ml对应制剂(IL-2实际用量为10ug),每天给药1次,持续给药10天。
(5)IL2/PP制剂的制备按照实施例1中所描述的方法进行,阳性参照品DLS使用注射用水复溶冻干粉制备注射液,二者均用BCA法进行蛋白定量并调整至所需浓度。
(6)接种后的第19天,断颈处死小鼠并剥离小鼠的脾脏和肿瘤组织,分别提取淋巴细胞用于检测。
对于脾脏:将样品在70um滤网上碾碎并充分研磨,并将过滤后的悬液500×g离心5分钟;用ACK试剂重悬离心沉淀同时裂解红细胞,之后再次用滤网过滤并离心;用FACSbuffer重悬细胞并计数,稀释至合适的浓度后用于荧光抗体染色。
对于肿瘤组织:将样品剪碎后加入2mg/ml胶原酶IV溶液,于37℃恒温摇床中消化1~2小时;将消化后的组织样品在70um滤网上进行研磨过滤,并将过滤后的悬液500×g离心5分钟;用ACK试剂重悬离心沉淀同时裂解红细胞,之后再次用滤网过滤并离心;用FACSbuffer重悬细胞并计数,稀释至合适的浓度后用于荧光抗体染色。
(7)细胞染色:每个样品使用2×106个细胞,抗体染色方案为:
调节性Treg细胞:anti-mouse CD45-BV605,anti-mouse CD4-BV421,anti-Foxp3-PE CD8+效应T细胞:anti-mouse CD45-BV605,anti-mouse CD3-FITC,anti-mouse CD8-PE-Cy7
其中Foxp3为包内抗原,需要在完成其他表面抗原染色后固定细胞,再进行透膜染色。染色完成后,用FACS buffer洗涤并重悬细胞,使用流式细胞仪BD LSR Fortessa进行检测,使用FlowJo X软件进行数据分析。
(8)实验结果(图10)显示:在该给药方案的作用下,
①IL2/PP制剂和DLS制剂活化不同受体细胞亚群的能力存在显著差异,IL2/PP制剂相比于阳性参照品DLS制剂,能够活化更高比例的CD8+效应T细胞,同时降低对免疫抑制性Treg细胞的活化比例。
②对于DLS制剂,主要活化的细胞亚群是表达IL2高亲和力受体、具有免疫抑制性的Treg细胞,而对只表达IL2中等亲和力受体、行使功能的CD8+效应T细胞的活化水平较低。
③对于IL2/PP制剂,Treg细胞的活化显著减少,而CD8+效应T细胞的活化比例显著增大,且这一趋势在脾脏和肿瘤组织中都十分明显。
④在脾脏和肿瘤组织两种不同的样品中,虽然Treg细胞和CD8+T细胞的比例以及二者的比值在数值上有所不同,但两种制剂之间的差异和趋势则保持一致,说明在不同的免疫环境中两种制剂对靶细胞的选择和作用基本相同。
综上,IL2/PP制剂相比于阳性参照品(DLS制剂)在活化IL2靶细胞时具有明显的选择性作用,不再优先活化Treg细胞亚群,而是更多地活化的CD8+效应T细胞。这说明IL2/PP制剂对于IL2蛋白本身的结构产生了改变,更多的倾向于直接活化具有肿瘤治疗作用的效应T细胞。这对于改善IL2蛋白在临床使用中的各种局限具有重大意义。
最后需要说明的是,以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质,不用于限定本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京良远生物医药研究有限公司
<120> 一种IL2制剂、其制备方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
Claims (11)
1.一种IL2/PP制剂,所述的制剂为水溶剂,其中包含:
(1)浓度大于40ug/ml的IL2蛋白,优选的,浓度大于0.1mg/ml的IL2蛋白;更优选的,浓度大于1mg/ml的IL2蛋白;
(2)二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(PEG-DSPE);
(3)必要的pH调节/缓冲剂;
所述的PEG-DSPE与IL2蛋白的摩尔比为8~100∶1;优选的,所述的PEG-DSPE与IL2蛋白的摩尔比为10~80∶1;更优选的,所述的PEG-DSPE与IL2蛋白的摩尔比为15~50∶1;最优选的,所述的PEG-DSPE与IL2蛋白的摩尔比为20~30∶1;
所述的IL2蛋白又称为T细胞生长因子,其结构包含四个α螺旋的糖蛋白,分子量为15.5kD;优选的,所述的IL2蛋白包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列;最优选的,所述的IL2蛋白由大肠杆菌系统表达并纯化,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述的PEG-DSPE的纯度≥95%,其中的PEG链的分散度≤1.1;
优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为1000~5000Da;更优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为1500~2500Da;最优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为2000Da(PEG2000-DSPE)。
2.根据权利要求1所述的IL2/PP制剂,其特征在于,
所述的IL2蛋白的浓度为40~20000ug/ml;
优选的,所述的IL2蛋白的浓度为0.1~20mg/ml;
更优选的,所述的IL2蛋白的浓度为1~10mg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的IL2/PP制剂,其特征在于,
使用所述的pH调节剂将所述的IL2/PP制剂的pH调节至5.5~6.0;
所述的pH调节/缓冲剂包括但不限于,盐酸、醋酸、氢氧化钠/钾、碳酸氢钠、碳酸二氢钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、氨基酸类pH调节/缓冲剂如甘氨酸、组氨酸。
4.根据权利要求1-3任一所述的IL2/PP制剂,其特征在于,
将所述的IL2/PP制剂冻干制备成IL2/PP冻干制剂;所述的IL2/PP冻干制剂中还包括冻干保护剂,所述的冻干保护剂包括但不限于:甘油、甘氨酸、蔗糖、乳糖、白蛋白、组氨酸、甘露醇或其组合物。
5.权利要求1-4任一所述的IL2/PP制剂的制备方法,其包括如下步骤,
(1)制备含有pH为3.0~3.5的水溶液;优选的,用去离子水将冰醋酸稀释至浓度为10mM,调节pH为3.0~3.5;
(2)称取目标量的IL2蛋白干粉,加入上述pH为3.0~3.5的水溶液,充分混匀得到IL2悬浊液;
(3)根据上一步中IL2蛋白的用量称取相应量的PEG-DSPE干粉,加入上述IL2悬浊液中,充分混匀;
(4)40℃~60℃水浴加热10~30分钟;
(5)将步骤(4)制得的溶液静置平衡至室温,将pH调至5.5~6.0,继续静置10~60分钟。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,还包括如下步骤,
(6)用同样缓冲体系的溶剂将步骤(5)制得的溶液中的IL2蛋白稀释至合适的浓度,或超滤浓缩步骤(5)制得的溶液将IL2蛋白浓缩至合适的浓度;
(7)过滤除菌。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其特征在于,
所述的IL2/PP制剂中的IL2蛋白的回收率≥90%;
所述的PEG-DSPE的纯度≥95%,其中的PEG链的分散度≤1.1;
优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为1000~5000Da;更优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为1500~2500Da;最优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为2000Da(PEG2000-DSPE)。
8.权利要求1-4任一所述的IL2/PP制剂的如下应用:
(1)制备抗肿瘤药物;
(2)制备激活细胞免疫反应的制剂;
(3)制备抗肿瘤联用制剂,优选的,所述的联用制剂中还包括:抗体或抗体构建体、细胞毒性药物、免疫或细胞治疗制剂;
所述的激活细胞免疫反应指,在体内或体外:
(1)上调CD8+T细胞的增殖,和/或
(2)诱导T细胞向CD8+T细胞分化,和/或
(3)抑制T细胞向Treg细胞分化;和/或
(4)提高CD8+T细胞/Treg细胞的比例;
优选的,所述的药物或制剂是通过皮下注射的方式给药的药物或制剂。
9.二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(PEG-DSPE)在制备改变目的蛋白与其配体亲和力的制剂中的应用,其特征在于,
所述的目的蛋白中包含至少一个α螺旋结构;优选的,所述的蛋白包含四至六个紧密堆叠的α螺旋结构;更优选的,所述的蛋白为IL2、IL4、IL7、IL9、IL15、IL21、G-CSF、GM-CSF;
所述的改变目的蛋白与其配体亲和力指:
降低蛋白与低亲和力配体的结合能力;优选的,所述的低亲和力配体指与蛋白的亲和力(Kd值)≥10-6M的配体;更优选的,所述的低亲和力配体指与蛋白的亲和力(Kd值)≥10-7M的配体;最优选的,所述的低亲和力配体指与蛋白的亲和力(Kd值)≥10-8M的配体。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,
所述的PEG-DSPE的纯度≥95%,其中的PEG链的分散度≤1.1;
优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为1000~5000Da;更优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为1500~2500Da;最优选的,所述的PEG-DSPE分子中的PEG链长为2000Da(PEG2000-DSPE)。
11.根据权利要求9或10所述的应用,其特征在于,所述的制剂中,所述PEG-DSPE的分子与所述目的蛋白的比例为:
(1)所述PEG-DSPE的分子数与所述目的蛋白的α螺旋结构数的比为2~25∶1;优选的,所述PEG-DSPE的分子数与所述目的蛋白的α螺旋结构数的比为3~20∶1;更优选的,所述PEG-DSPE的分子数与所述目的蛋白的α螺旋结构数的比为4~10∶1;或
(2)所述的PEG-DSPE与所述目的蛋白的摩尔比为5~100∶1;优选的,所述的PEG-DSPE与所述目的蛋白的摩尔比为10~80∶1;更优选的,所述的PEG-DSPE与所述目的蛋白的摩尔比为15~50∶1;最优选的,所述的PEG-DSPE与所述目的蛋白的摩尔比为20~30∶1。
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