CN103710383A - 一种非病毒转基因载体、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种非病毒转基因载体及其制备方法，所述非病毒转基因载体为精氨酸短肽改性的壳聚糖，所述精氨酸短肽的一端通过酰胺键与所述壳聚糖相连。所述非病毒转基因载体的制备方法包括如下步骤：取精氨酸短肽；将所述精氨酸短肽与壳聚糖发生酰胺化反应，获得所述精氨酸短肽改性的壳聚糖即非病毒转基因载体。本发明还提供了所述非病毒转基因载体在基因转染中的应用。所述非病毒转基因载体含有具有穿膜效果的精氨酸短肽单元，能够和细胞膜作用而促进其所携带药物或载体进入细胞，发挥后续功能，同时表现出良好的生物相容性和较高的转染效率，是一种低毒有效的非病毒基因载体，具有广阔的应用前景。

Description

一种非病毒转基因载体、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种非病毒转基因载体及其制备方法和应用。

背景技术

基因治疗通过将目的基因导入到靶细胞核内以修复或置换导致疾病的缺陷基因，为先天和后天的基因缺陷疾病提供了新的治疗方法，寻求合适的转基因载体将目的基因导入到靶细胞内无疑成为基因治疗成功与否的关键所在。

目前，转基因载体主要有非病毒载体，非病毒载体主要包括壳聚糖、脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)和树枝状高聚物(Dendrimer)等，这些非病毒载体通过静电作用与DNA复合形成纳米微球进行基因转染。其中，壳聚糖(Chitosan)作为唯一的天然阳离子多糖，具有良好的生物相容性、低细胞毒性和可降解性等优点，因而广泛地应用于非病毒转基因载体。但壳聚糖作为非病毒转基因载体时转染效率较低，成为制约其在实际临床应用中的瓶颈，因此，如何提高非病毒转基因载体的转染效率成为研究重点。

发明内容

为解决上述问题，本发明第一方面旨在提供一种非病毒转基因载体，该非病毒转基因载体转染效率良好；本发明第二方面旨在提供一种非病毒转基因载体的制备方法，该制备方法简单，制备的非病毒转基因载体转染效率良好；本发明第三方面旨在提供一种用于基因治疗的纳米复合物，该纳米复合物的转染效率良好；本发明第四方面旨在提供一种用于基因治疗的纳米复合物的制备方法，该纳米复合物的制备方法简单，制备得到的用于基因治疗的纳米复合物细胞转染效率良好。

第一方面本发明提供了一种非病毒转基因载体，所述非病毒转基因载体为精氨酸短肽改性的壳聚糖，所述精氨酸短肽的一端通过酰胺键与所述壳聚糖相连。

优选地，所述精氨酸短肽为2～19个精氨酸脱水缩合得到。

优选地，所述壳聚糖的分子量为5kDa～100kDa。

现有技术中，精氨酸短肽是一种穿膜肽，在生理条件下精氨酸短肽带有大量的正电荷，能够快速与带负电荷的细胞膜上的磷脂分子作用，启动细胞膜外物质的跨膜传输，从而将细胞膜外物质导入细胞内，且不损伤细胞膜的结构和功能，具有较强的细胞膜穿透能力，转运效率高。因此被广泛用于传递各种蛋白、大分子和纳米粒子进入细胞。

本发明提供了一种非病毒转基因载体，所述非病毒转基因载体为精氨酸短肽改性的壳聚糖，所述非病毒转基因载体上的精氨酸短肽单元可以与细胞膜上的磷脂分子相互作用，而促进所述非病毒转基因载体进入细胞质，转染效率高。

第二方面本发明提供了一种非病毒转基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）提供精氨酸短肽；将所述精氨酸短肽和活化剂溶解于缓冲液中得到精氨酸短肽溶液；

（2）将壳聚糖溶解后得到壳聚糖溶液，将所述壳聚糖溶液滴加到所述精氨酸短肽溶液中，得到混合溶液，搅拌反应1～6天，所述混合溶液中的氨酸短肽和壳聚糖发生酰胺化反应，得到产物，将所述产物分离纯化后进行冷冻干燥，得到所述非病毒转基因载体；所述非病毒转基因载体为精氨酸短肽改性的壳聚糖，所述精氨酸短肽的一端通过酰胺键与所述壳聚糖相连。

优选地，步骤（1）中所述精氨酸短肽为2～19个精氨酸脱水缩合得到。

优选地，步骤（1）中所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐中的至少一种。

优选地，步骤（2）中所述壳聚糖的分子量为5kDa～100kDa。

优选地，所述精氨酸短肽和所述壳聚糖的摩尔比为1:1～1:20。

所述壳聚糖和精氨酸短肽通过酰胺化反应一步合成所述非病毒转基因载体，制备方法简单，原料廉价易得，制得的非病毒转基因载体中的精氨酸短肽单元能与细胞膜上的磷脂分子相互作用，而促进所述非病毒转基因载体进入细胞内，转染效率高。

第三方面，本发明提供了一种用于基因治疗的纳米复合物，所述纳米复合物为质粒DNA和上述所述的非病毒转基因载体通过静电作用形成的纳米微球。

所述精氨酸短肽和壳聚糖发生酰胺化反应，将具有穿膜作用的精氨酸短肽连接到壳聚糖上，得到具有穿膜效果的非病毒转基因载体，所述非病毒转基因载体能够有效复合DNA形成纳米复合物，所述纳米复合物上的精氨酸短肽单元能与细胞膜上的磷脂分子相互作用，促进纳米复合物进入细胞内，实现了目的基因的投递，有利于目的基因后续的表达。

第四方面，本发明提供了一种用于基因治疗的纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

将质粒DNA和上述所述的非病毒转基因载体溶解于灭菌纯水后，得到混合液，然后室温静置，所述混合液中的非病毒转基因载体和质粒DNA通过静电作用形成纳米微球，得到所述纳米复合物。

所述精氨酸短肽和壳聚糖发生酰胺化反应，将具有穿膜作用的精氨酸短肽连接到壳聚糖上，得到具有穿膜效果的非病毒转基因载体，所述非病毒转基因载体能够有效复合DNA形成纳米复合物，所述纳米复合物上的精氨酸短肽单元能与细胞膜上的磷脂分子相互作用，促进所述纳米复合物进入细胞质，实现了目的基因的投递，有利于目的基因后续的表达。该制备方法简单，条件温和，具有广阔的应用前景。

综上，本发明有益效果包括以下几个方面：

（1）本发明提供的非病毒转基因载体转染效率高；

（2）本发明提供的非病毒转基因载体制备方法简单，原料廉价易得；

（3）本发明提供的纳米复合物转染效率高，有利于纳米复合物中目的基因的表达，所述纳米复合物的制备方法简单。

附图说明

图1是本发明实施例1和实施例2制备的非病毒转基因载体的核磁谱图；

图2是本发明实施例1和实施例2制备的非病毒转基因载体的细胞存活率柱状图；

图3是本发明实施例1和实施例2制备的非病毒转基因载体的转染效率柱状图。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

第一方面本发明提供了一种非病毒转基因载体，所述非病毒转基因载体为精氨酸短肽改性的壳聚糖，所述精氨酸短肽的一端通过酰胺键与所述壳聚糖相连。

优选地，所述精氨酸短肽为2～19个精氨酸脱水缩合得到。

所述精氨酸短肽的氨基需要保护，优选地，所述精氨酸短肽的氨基端通过乙酰基保护。

更优选地，所述氨基端为乙酰基保护的精氨酸短肽的分子量为372Da～3062Da。

进一步优选地，所述精氨酸短肽为8个精氨酸脱水缩合得到。

所述精氨酸短肽通过现有技术制备或购买得到。优选地，氨基保护的精氨酸短肽可通过Fmoc固相法聚合或其他方法制备。

优选地，所述壳聚糖的分子量为5kDa～100kDa。

优选地，所述壳聚糖的脱乙酰度大于90%。

例如：用氨基端通过乙酰基保护的精氨酸短肽改性壳聚糖，得到的非病毒转基因载体的化学结构式如式Ⅰ所示。

式Ⅰ

其中，M表示壳聚糖的聚合度，D表示D个精氨酸脱水缩合得到精氨酸短肽。

现有技术中，精氨酸短肽是一种穿膜肽，具有较强的细胞膜穿透能力，能够将药物或给药载体导入细胞内并保持药物或给药载体的活性，且不损伤细胞膜的结构和功能，转运效率高。所述精氨酸短肽在生理条件下带有大量的正电荷，能够快速与带负电荷的细胞膜上的磷脂分子作用，启动细胞膜外物质的跨膜传输，将细胞膜外物质导入细胞内，因此被广泛用于传递各种蛋白、大分子和纳米粒子进入细胞。进一步的研究发现，8个精氨酸脱水缩合得到的精氨酸短肽的进入细胞的能力最强。

本发明提供了一种非病毒转基因载体，所述非病毒转基因载体为精氨酸短肽改性的壳聚糖，所述非病毒转基因载体上的精氨酸短肽单元可以与细胞膜上的磷脂分子相互作用，而促进所述非病毒转基因载体进入细胞质，转染效率高。

另外，所述精氨酸短肽生物相容性好，将所述精氨酸短肽通过酰胺键连接到所述壳聚糖上，不会影响壳聚糖的生物相容性，制得的非病毒转基因载体细胞毒性低，生物相容性好，可以更好地应用于基因治疗领域。

第二方面本发明提供了一种非病毒转基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）提供精氨酸短肽；将所述精氨酸短肽和活化剂溶解于缓冲液中得到精氨酸短肽溶液；

（2）将壳聚糖溶解后得到壳聚糖溶液，将所述壳聚糖溶液滴加到所述精氨酸短肽溶液中，得到混合溶液，搅拌反应1～6天，所述混合溶液中的氨酸短肽和壳聚糖发生酰胺化反应，得到产物，将所述产物分离纯化后进行冷冻干燥，得到所述非病毒转基因载体；所述非病毒转基因载体为精氨酸短肽改性的壳聚糖，所述精氨酸短肽的一端通过酰胺键与所述壳聚糖相连。

优选地，所述精氨酸短肽为2～19个精氨酸脱水缩合得到。

所述精氨酸短肽的氨基需要保护，优选地，所述精氨酸短肽的氨基通过乙酰基保护。

更优选地，所述氨基为乙酰基保护的精氨酸短肽的分子量为372Da～3062Da。

进一步优选地，所述精氨酸短肽为8个精氨酸脱水缩合得到。

所述精氨酸短肽通过现有技术制备或购买得到。优选地，氨基保护的精氨酸短肽可通过Fmoc固相法聚合或其他方法制备。

优选地，步骤（1）中所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐中的至少一种。

更优选地，步骤（1）中所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS），所述精氨酸短肽、EDC和NHS的摩尔比为1:5:2。

优选地，步骤（1）中所述缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲液或磷酸盐（PBS）缓冲液。

优选地，步骤（1）中将所述精氨酸短肽和活化剂溶解于缓冲液中得到精氨酸短肽溶液后，常温下搅拌所述精氨酸短肽溶液10h以活化所述精氨酸短肽的羧基。

优选地，步骤（2）中所述壳聚糖的分子量为5kDa～100kDa。

优选地，所述壳聚糖的脱乙酰度大于90%。

优选地，步骤（2）中将所述壳聚糖溶解到醋酸缓冲液得到壳聚糖溶液。

优选地，步骤（2）中所述搅拌反应后，在所述混合溶液中加入10mmol/L的羟胺终止反应，并用NaOH将所述混合溶液pH调至8.0。

优选地，步骤（2）中所述精氨酸短肽和所述壳聚糖的摩尔比为1:1～1:20。

优选地，步骤（2）中所述分离纯化为将所述产物加入到透析袋中透析4天。

利用精氨酸短肽上的羧基和壳聚糖上的氨基缩合反应，得到酰胺键，所述精氨酸短肽通过酰胺键连接到所述壳聚糖上。

例如：所述壳聚糖的化学式为

所述氨基端用乙酰基保护的精氨酸短肽的化学式为所述精氨酸短肽和壳聚糖发生酰胺化反应得到所述非病毒转基因载体，反应式如式Ⅱ所示：

其中，M表示壳聚糖的聚合度，D表示D个精氨酸脱水缩合得到精氨酸短肽。

所述壳聚糖和精氨酸通过酰胺化反应一步合成所述非病毒转基因载体，制备方法简单，原料廉价易得，制得的非病毒转基因载体中的精氨酸短肽单元能与细胞膜上的磷脂分子相互作用，而促进所述非病毒转基因载体进入细胞内，转染效率高。

第三方面，本发明提供了一种用于基因治疗的纳米复合物，所述纳米复合物为质粒DNA和第一方面所述的非病毒转基因载体通过静电作用形成的纳米微球。

所述精氨酸短肽的羧基和壳聚糖的氨基发生酰胺化反应，将具有穿膜作用的精氨酸短肽连接到壳聚糖上，得到具有穿膜效果的非病毒转基因载体，所述非病毒转基因载体能够有效复合DNA形成纳米复合物，非病毒转基因载体上的精氨酸短肽单元能与细胞膜上的磷脂分子相互作用，而促进纳米复合物进入细胞质，实现了目的基因的投递，有利于目的基因后续的表达。

优选地，所述纳米复合物的粒径为50nm～200nm。

优选地，所述非病毒转基因载体包裹所述质粒DNA得到所述纳米复合物。

第四方面，本发明提供了一种用于基因治疗的纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

将质粒DNA和第一方面所述的非病毒转基因载体溶解于灭菌纯水后，得到混合液，然后室温静置，所述混合液中的非病毒转基因载体和质粒DNA通过静电作用形成纳米微球，得到所述纳米复合物。

优选地，所述非病毒转基因载体在所述混合液中的浓度为5μg/mL～2mg/mL。

优选地，所述非病毒转基因载体和质粒DNA的质量比为15:1～25:1。

优选地，所述纳米微球的粒径为50nm～200nm。

优选地，所述非病毒转基因载体包裹所述质粒DNA得到所述纳米复合物。

所述精氨酸短肽和壳聚糖发生酰胺化反应，将具有穿膜作用的精氨酸短肽连接到壳聚糖上，得到具有穿膜效果的非病毒转基因载体，所述非病毒转基因载体能够有效复合DNA形成纳米复合物，非病毒转基因载体上的精氨酸短肽单元能与细胞膜上的磷脂分子相互作用，而促进纳米复合物进入细胞内，实现了目的基因的投递，有利于目的基因后续的表达。该制备方法简单，条件温和，具有广阔的应用前景。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

实施例1：

一种非病毒转基因载体的制备方法，步骤如下：

（1）提供8个精氨酸脱水缩合得到的精氨酸短肽，该精氨酸短肽的氨基端由乙酰基保护，将该精氨酸短肽溶解于MES缓冲液中(MES缓冲液的浓度为0.1mol/L,pH=6.0)，然后将EDC和NHS加入缓冲溶液中活化精氨酸短肽的羧基端，得到精氨酸短肽溶液，常温下搅拌精氨酸短肽溶液10h，精氨酸短肽、EDC和NHS的摩尔比为1:5:2；

（2）将分子量为50kDa、脱乙酰度为92%的壳聚糖溶于50mmol/L醋酸缓冲溶液中得到壳聚糖溶液，将该壳聚糖溶液滴加到精氨酸短肽溶液中，得到混合溶液，搅拌反应24h后，混合溶液中的氨酸短肽和壳聚糖发生酰胺化反应得到产物，在混合溶液中加入终浓度为10mmol/L的羟胺，并用NaOH调整混合溶液pH值至8.0来终止反应，壳聚糖和精氨酸短肽的摩尔比为8:1。将产物用截留分子量为12000的透析袋在去离子水中透析4天后，冷冻干燥得到白色固体，即非病毒转基因载体。

一种用于基因治疗的纳米复合物的制备方法，步骤如下：

将实施例1制备的非病毒转基因载体溶于灭菌纯水后用0.22μm滤膜过滤除菌得到非病毒转基因载体溶液，将非病毒转基因载体溶液和pGL-3control质粒DNA溶液混合得到混合液，非病毒转基因载体在混合液中的浓度为5μg/mL，非病毒转基因载体和质粒DNA的质量比为15:1，培育30分钟后得到纳米复合物。

实施例2：

一种非病毒转基因载体的制备方法，步骤如下：

（1）提供8个精氨酸脱水缩合得到的精氨酸短肽，该精氨酸短肽的氨基端由乙酰基保护，将该精氨酸短肽溶解于MES缓冲液中(MES缓冲液的浓度为0.1mol/L,pH=6.0)，然后将EDC和NHS加入缓冲溶液中活化精氨酸短肽的羧基端，得到精氨酸短肽溶液，常温下搅拌精氨酸短肽溶液10h，精氨酸短肽、EDC和NHS的摩尔比为1:5:2；

（2）将分子量为100kDa、脱乙酰度为92%的壳聚糖溶于50mmol/L醋酸缓冲溶液中得到壳聚糖溶液，将该壳聚糖溶液滴加到精氨酸短肽溶液中，得到混合溶液，搅拌反应24h后，混合溶液中的氨酸短肽和壳聚糖发生酰胺化反应得到产物，在混合溶液中加入终浓度为10mmol/L的羟胺，并用NaOH调整混合溶液pH值至8.0来终止反应，壳聚糖和精氨酸短肽的摩尔比为4:1。将产物用截留分子量为12000的透析袋在去离子水中透析4天后，冷冻干燥得到白色固体，即非病毒转基因载体。

一种用于基因治疗的纳米复合物的制备方法，步骤如下：

将实施例2制备的非病毒转基因载体溶于灭菌纯水后用0.22μm滤膜过滤除菌得到非病毒转基因载体溶液，将非病毒转基因载体溶液和pGL-3control质粒DNA溶液混合得到混合液，非病毒转基因载体在混合液中的浓度为2mg/mL，非病毒转基因载体和质粒DNA的质量比为25:1，培育30分钟后得到纳米复合物。

实施例3：

一种非病毒转基因载体的制备方法，步骤如下：

（1）提供2个精氨酸脱水缩合得到的精氨酸短肽，该精氨酸短肽的氨基端由乙酰基保护，将该精氨酸短肽溶解于MES缓冲液中(MES缓冲液的浓度为0.1mol/L,pH=6.0)，然后将EDC和NHS加入缓冲溶液中活化精氨酸短肽的羧基端，得到精氨酸短肽溶液，常温下搅拌精氨酸短肽溶液10h，精氨酸短肽、EDC和NHS的摩尔比为1:5:2；

（2）将分子量为50KDa、脱乙酰度为92%的壳聚糖溶于50mmol/L醋酸缓冲溶液中得到壳聚糖溶液，将该壳聚糖溶液滴加到精氨酸短肽溶液中，得到混合溶液，搅拌反应3天后，混合溶液中的氨酸短肽和壳聚糖发生酰胺化反应得到产物，在混合溶液中加入终浓度为10mmol/L的羟胺，并用NaOH调整混合溶液pH值至8.0来终止反应，壳聚糖和精氨酸短肽的摩尔比为1:1。将产物用截留分子量为12000的透析袋在去离子水中透析4天后，冷冻干燥得到白色固体，即非病毒转基因载体。

一种用于基因治疗的纳米复合物的制备方法，步骤如下：

将实施例3制备的非病毒转基因载体溶于灭菌纯水后用0.22μm滤膜过滤除菌得到非病毒转基因载体溶液，将非病毒转基因载体溶液和pGL-3control质粒DNA溶液混合得到混合液，非病毒转基因载体在混合液中的浓度为1mg/mL，非病毒转基因载体和质粒DNA的质量比为20:1，培育30分钟后得到纳米复合物。

实施例4：

一种非病毒转基因载体的制备方法，步骤如下：

（1）提供19个精氨酸脱水缩合得到的精氨酸短肽，该精氨酸短肽的氨基端由乙酰基保护，将该精氨酸短肽溶解于MES缓冲液中(MES缓冲液的浓度为0.1mol/L,pH=6.0)，然后将EDC和NHS加入缓冲溶液中活化精氨酸短肽的羧基端，得到精氨酸短肽溶液，常温下搅拌精氨酸短肽溶液10h，精氨酸短肽、EDC和NHS的摩尔比为1:5:2；

（2）将分子量为5KDa、脱乙酰度为92%的壳聚糖溶于50mmol/L醋酸缓冲溶液中得到壳聚糖溶液，将该壳聚糖溶液滴加到精氨酸短肽溶液中，得到混合溶液，搅拌反应6天后，混合溶液中的氨酸短肽和壳聚糖发生酰胺化反应得到产物，在混合溶液中加入终浓度为10mmol/L的羟胺，并用NaOH调整混合溶液pH值至8.0来终止反应，壳聚糖和精氨酸短肽的摩尔比为20:1。将产物用截留分子量为12000的透析袋在去离子水中透析4天后，冷冻干燥得到白色固体，即非病毒转基因载体。

一种用于基因治疗的纳米复合物的制备方法，步骤如下：

将实施例4制备的非病毒转基因载体溶于灭菌纯水后用0.22μm滤膜过滤除菌得到非病毒转基因载体溶液，将非病毒转基因载体溶液和pGL-3control质粒DNA溶液混合得到混合液，非病毒转基因载体在混合液中的浓度为1mg/mL，非病毒转基因载体和质粒DNA的质量比为20:1，培育30分钟后得到纳米复合物。

效果实施例

1、非病毒转基因载体的结构表征。

将实施例1和2制备的非病毒转基因载体溶于氘代水和氘代醋酸(氘代水和氘代醋酸的体积比为95:5)形成的混合溶液中，在400MHz Bruker ARX400的核磁共振光谱仪上扫描氢谱，结构参见图1。与壳聚糖的核磁谱图相比，非病毒转基因载体的氢谱出现的δ1.5(CONH–CHCH₂CH₂–),δ1.7(CONH–CHCH₂–),δ3.3(–CH–CN₃H₄)和δ4.2(CONH–CH–)特征峰表明精氨酸短肽已经被接枝到壳聚糖的主链上。同时通过计算壳聚糖2号位上的氢的特征峰(δ3.0，图1中虚线圈位置)和精氨酸上短肽上4号位的氢的特征峰(δ1.50，图1中五角星位置)的积分面积的比值(0.5×I_1.5/I_3.0×100%)，可得出实施案例1得到的非病毒转基因载体中精氨酸短肽单元的摩尔组分为12%，而通过实施案例2得到的非病毒转基因载体中精氨酸短肽单元的摩尔组分为23%。

2、非病毒转基因载体的细胞毒性

将COS-1细胞(1×10⁴/孔)接种于96孔培养板，过夜培养至细胞贴壁。用PBS洗涤后，加入含不同量（壳聚糖、实施例1和实施例2制备的非病毒转基因载体的浓度分别为6ug/ml、12ug/ml、18ug/ml、30ug/ml、50ug/ml、75ug/ml和100ug/ml）的壳聚糖、实施例1和实施例2制备的非病毒转基因载体的100μL/孔培养基，以不含任何载体的培养基作为对照。培养24小时后换成新鲜培养基再培养48小时。用PBS洗涤，加入新鲜培养基100μL和10μL MTT噻唑蓝)(5mg/mL)溶液，继续培养4h后，去除培养基，加入100μL/孔的DMSO（二甲基亚砜），震荡10分钟后，用酶标仪上测570nm和690nm的吸光值，按以下公式计算细胞存活率。

图2是本发明实施例1和实施例2制备的非病毒转基因载体的细胞存活率柱状图；结果表明本发明制备的非病毒转基因载体的细胞存活率高于壳聚糖，非病毒转基因载体一直保持80%以上的细胞存活率，表明非病毒转基因载体具有良好的生物相容性，用精氨酸短肽改性壳聚糖不会对壳聚糖的生物相容性产生不利影响。

3、非病毒转基因载体的细胞转染效率的测定

pGL-3control转染细胞：将COS-1细胞（6×10⁴/孔）接种于24孔培养板，过夜培养至细胞融合度为70%～80%时，用PBS洗涤后加入450μL不含抗生素的培养基。将壳聚糖、实施例1和实施例2制备的非病毒转基因载体和脂质体Lipofectamine2000用0.22μm滤膜过滤除菌后，按不同的质量比用灭菌纯水稀释后与pGL-3control质粒DNA溶液混合（壳聚糖、实施例1、实施例2制备的非病毒转基因载体和pGL-3control质粒DNA的质量比分别为3:1、6:1、9:1、15:1、25:1、37:1），培育30分钟后得到复合物。将含不同复合物总体积为50μL的溶液加入到细胞中，每孔的DNA含量为1μg。以脂质体Lipofectamine2000为阳性对照，单纯加质粒DNA（裸DNA）为阴性对照。培养24h后，吸去转染液后，加入完整培养基继续培养48h后测量荧光素酶的表达。吸去培养基用PBS洗涤后，加入150μL的细胞裂解液裂解30分钟后，转移至1.5mL的离心管中，12000rpm高速离心5分钟。取50μL上清液与50μL荧光素梅检测试剂（Promega）反测定相对光单位。另取20μL上清液进行BCA蛋白含量测试。以每毫克蛋白的相对光单位（RLU/mg）作为转染效率的评价指标，结果见图3。从图3中可以看出，本发明制备的非病毒转基因载体的纳米复合物转染效率高于壳聚糖作为载体时的的纳米复合物的转染效率，说明，本发明将壳聚糖和精氨酸短肽通过酰胺化反应得到非病毒转基因载体，该非病毒转基因载体上的精氨酸短肽单元能与细胞膜上的磷脂分子相互作用，而促进所述非病毒转基因载体进入细胞质，转染效率高。

综上所述，本发明的非病毒转基因载体既保留了壳聚糖无毒、生物相容性高的特性，又大大提高了非病毒转基因载体的基因转染效率，用该非病毒转基因载体制备的纳米复合物具有生物相容性高、毒性低、转染效率高等特点。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种非病毒转基因载体，其特征在于，所述非病毒转基因载体为精氨酸短肽改性的壳聚糖，所述精氨酸短肽的一端通过酰胺键与所述壳聚糖相连。

2.如权利要求1所述的非病毒转基因载体，其特征在于，所述精氨酸短肽为2～19个精氨酸脱水缩合得到。

3.如权利要求1所述的非病毒转基因载体，其特征在于，所述壳聚糖的分子量为5kDa～100kDa。

4.一种非病毒转基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提供精氨酸短肽；将所述精氨酸短肽和活化剂溶解于缓冲液中得到精氨酸短肽溶液；

（2）将壳聚糖溶解后得到壳聚糖溶液，将所述壳聚糖溶液滴加到所述精氨酸短肽溶液中，得到混合溶液，搅拌反应1～6天，所述混合溶液中的氨酸短肽和壳聚糖发生酰胺化反应，得到产物，将所述产物分离纯化后进行冷冻干燥，得到所述非病毒转基因载体；所述非病毒转基因载体为精氨酸短肽改性的壳聚糖，所述精氨酸短肽的一端通过酰胺键与所述壳聚糖相连。

5.如权利要求4所述的非病毒转基因载体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述精氨酸短肽为2～19个精氨酸脱水缩合得到。

6.如权利要求4所述的非病毒转基因载体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐中的至少一种。

7.如权利要求4所述的非病毒转基因载体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述壳聚糖的分子量为5kDa～100kDa。

8.如权利要求4所述的非病毒转基因载体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述精氨酸短肽和所述壳聚糖的摩尔比为1:1～1:20。

9.一种用于基因治疗的纳米复合物，其特征在于，所述纳米复合物为质粒DNA和权利要求1所述非病毒转基因载体通过静电作用形成的纳米微球。

10.一种用于基因治疗的纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将质粒DNA和权利要求1所述的非病毒转基因载体溶解于灭菌纯水后，得到混合液，然后室温静置，所述混合液中的非病毒转基因载体和质粒DNA通过静电作用形成纳米微球，得到所述纳米复合物。

Images