CN103627005A - 聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺及其作为抗原蛋白载体的用途 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺及其作为抗原蛋白载体的用途。
背景技术
治疗性疫苗旨在打破机体的免疫耐受,提高机体的免疫应答。其作用机理是通过改善和增强对疫苗靶抗原的摄入、表达、处理、呈递和激活免疫应答,从根本上重新激活机体对靶抗原的免疫应答能力。它能在已患病个体上诱导特异性免疫应答,清除病原体或异常细胞,使疾病得以治愈。作为一种新兴的治疗型疫苗,尤其是在肿瘤治疗方面,有着广阔的发展前景
但目前以蛋白质抗原为基础的肿瘤疫苗的疗效有限,其中一个重要原因是其诱导产生的免疫反应为体液免疫即以抗体反应为主的免疫反应,而能够对肿瘤细胞起到杀伤作用的免疫反应是抗原特异性激活的细胞毒性T淋巴细胞免疫反应。因此,控制抗原在抗原提呈细胞(APCs)内部的处理过程和使其通过MHC-I途径进行抗原提呈是激活细胞毒性T淋巴细胞的关键,而提高抗原交叉提呈反应效率对于提高治疗性抗原效用具有非常重要的意义。
目前,通常作为生物载体材料得到应用的阳离子多聚物包括多聚赖氨酸(Poly-L-lysine,PLL)、多聚精氨酸、多聚组氨酸、组氨酸赖氨酸、壳聚糖(chitosan)、鱼精蛋白、多胺树突状物(polyamidoaminedendrimer)、聚丙烯亚胺树突状物(polypropyleniminedendrimers)、超支化聚合肽、聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)等。其中聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)是由Boussif等在1995年最早发现,其可缩合质粒DNA而不需受体介导,不需溶酶体抑制剂就可转染细胞,之后,PEI相关的生物载体材料也成为了载体领域的研究热点。
聚乙烯亚胺是已经商业化的一种阳离子聚合物,每个单体(-CH2-CH2-NH2-)中含有2个碳原子和1个氮原子,即在PEI的骨架中每三个原子中含一个氨基,根据根据合成路线的不同和反应的温度不同,经过酸催化氮丙啶单体聚合,分别形成线状和链状的聚合物结构。多聚物的分子量范围很宽,其中以分子量为22kDa和25kDa的PEI应用最广。目前的研究表明,PEI在体内和体外均有较高的转染效率,而PEI的高转染效率与它具有强大的缓冲能力有关。
在生理条件下,PEI链上的氨基并不完全质子化,当PEI复合物通过与细胞膜相互作用内吞进入细胞后,形成内涵体,之后内涵体与溶酶体融合,在溶酶体中PH值降低,溶酶体中的PEI氨基质子化程度大大提高,PEI吸收大量质子而改变了溶酶体的内环境,引起溶酶体肿胀破裂,使PEI复合物得以放入胞质。这就是常用的一种“质子海绵”效应假说。但在PEI溶酶体的逃逸机制上仍有一定的争议。
利用抗原蛋白在一定条件下带负电的特点,在先前的研究工作中,陈剑等人设计了一种基于PEI25K的新型抗原载体输送系统,主要是将带负电的抗原蛋白质和带正电的PEI25K以静电作用结合形成纳米粒(Chen,J.,et al.,Improved antigencross-presentation by polyethyleneimine-based nanoparticles.Int JNanomedicine,2011.6:p.77-84.)。研究表明,以PEI为基础制备的纳米粒子可以有效提高抗原交叉提呈反应,具有成为治疗性肿瘤疫苗的纳米载体系统的潜力。
但是单纯的PEI作为载体在体内应用有诸多问题,如PEI-DNA复合物进入血循环时,复合物表面的阳性电荷就成了一道障碍。带阳性电荷的复合物不仅导致红细胞的聚集,也能够和血浆成分如白蛋白、纤维蛋白原和补体C3等作用,导致聚集体的形成,颗粒增大;在循环内最后被肺脏毛细血管床捕获,这给治疗肺脏以外的疾病带来很大困难;载体表面阳性电荷和聚合体形成也是PEI高毒性的一个主要原因;此外,特定细胞或组织的靶向性也很差,这些都成为限制其体内应用的重要因素之一。因此研究者们对如何进一步增强转染效率并减轻其毒性作用需作进一步研究。
PEI的毒性作用于破坏细胞膜的完整性,在体内,细胞膜上的载脂蛋白会吸附PEI/DNA复合物,从而形成结构组成较复杂的多元聚集体,进而破坏膜的完整性。PEG是由乙二醇单体聚合而成的线性高分子材料,属于可溶性的惰性聚合物,由于PEG分子中存在大量乙氧基能够和水形成氢键,因此其可在周围形成一定厚度的水合层,而对环境中的大分子及粒子产生“屏蔽”效应。多年来研究表明,PEG是无毒和抗免疫原性的水溶性大分子,有优良的生物相容性。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足,提供一种新型的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺及其作为蛋白载体生物材料的用途。本发明为了改善PEI的生物性能,采用引入聚乙二醇(PEG)的方法对PEI进行修饰。PEI经PEG修饰后,可形成囊泡状结构屏蔽表面多余的正电荷,有利于体内的长循环给药应用,且可增加阳离子多聚物复合物颗粒的可溶性,而且PEG化的PEI复合物还可以减少颗粒之间的相互聚集及降低复合物与血清蛋白(如补体)、红细胞之间的相互聚集,延长在血液中的循环时间并降低全身毒性。因此用PEG修饰合成的PEG与PEI的聚合物作为基因递释载体有降低毒性、增加复合物稳定性、延长体内循环时间等优点。同样,将PEI进行聚乙二醇修饰能够增强其与蛋白相互作用,同时维持低毒性。因此,本发明提供的新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺在提高抗原交叉提呈效果的同时,显著降低了细胞毒性,有助于提高免疫治疗效果。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
第二方面,本发明涉及一种上述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成方法,所述方法包括如下步骤:
优选地,所述PEI的重均分子量为2000~25000。
优选地,所述单甲基聚乙二醇的重均分子量为400~10000。
第三方面,本发明涉及一种上述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺作为蛋白载体生物材料的用途,所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺可与蛋白质复合形成稳定的纳米粒子。其对应的制备方法为在涡旋条件下,将蛋白质溶液与聚合物溶液按比例混合均匀,即得复合物纳米粒子。
优选地,所述蛋白质为带负电的蛋白质。
优选地,所述蛋白质为肿瘤抗原或病毒抗原。
优选地,所述纳米粒子可作为肿瘤治疗性疫苗的载体。
优选地,所述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的n为10~20中的任一自然数。此时,聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺与蛋白质复合形成的纳米粒子具有的抗原交叉提呈效果最好且毒性更小。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、本发明制备的新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺具有较强的蛋白质结合性能,可以携带抗原蛋白被抗原提呈细胞识别并引起免疫反应;
2、本发明制备的新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺在提高抗原交叉提呈效果的同时,显著降低了细胞毒性,有助于提高免疫治疗效果,是一种优良的治疗性肿瘤疫苗的纳米载体系统。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺合成路线示意图;
图2为实施例1制得的聚合物/OVA纳米粒子的TEM形貌图;其中,A、B分别为不同放大倍数时纳米粒子的形貌图;
图3为实施例1制得的聚合物/OVA的抗原交叉提呈细胞实验效果图(A)和细胞毒性实验效果图(B),以B1代指该实施例所得聚合物;
图4为实施例2制得的聚合物/OVA的抗原交叉提呈细胞实验效果图(A)和细胞毒性实验效果图(B),以B2代指实施例所得聚合物;
图5为实施例3制得的聚合物/OVA的抗原交叉提呈细胞实验效果图(A)和细胞毒性实验效果图(B),以B3代指实施例所得聚合物;
图6为实施例4制得的聚合物/OVA的抗原交叉提呈细胞实验效果图(A)和细胞毒性实验效果图(B),以B4代指实施例所得聚合物;
图7为实施例5制得的聚合物/OVA的抗原交叉提呈细胞实验效果图(A)和细胞毒性实验效果图(B),以B5代指该实施例所得聚合物;
图8为实施例6制得的聚合物/OVA的抗原交叉提呈细胞实验效果图(A)和细胞毒性实验效果图(B),以B6代指实施例所得聚合物;
图9为实施例7制得的聚合物/OVA的抗原交叉提呈细胞实验效果图(A)和细胞毒性实验效果图(B),以B7代指实施例所得聚合物;
图10为实施例8制得的聚合物/OVA的抗原交叉提呈细胞实验效果图(A)和细胞毒性实验效果图(B),以B8代指实施例所得聚合物;
图11为实施例9制得的聚合物/OVA的抗原交叉提呈细胞实验效果图(A)和细胞毒性实验效果图(B),以B9代指该实施例所得聚合物;
图12为实施例10制得的聚合物/OVA的抗原交叉提呈细胞实验效果图(A)和细胞毒性实验效果图(B),以B10代指实施例所得聚合物;
图13为实施例11制得的聚合物/OVA的抗原交叉提呈细胞实验效果图(A)和细胞毒性实验效果图(B),以B11代指实施例所得聚合物;
图14为实施例12制得的聚合物/OVA的抗原交叉提呈细胞实验效果图(A)和细胞毒性实验效果图(B),以B12代指实施例所得聚合物;
图15为实施例13制得的聚合物/OVA的抗原交叉提呈细胞实验效果图(A)和细胞毒性实验效果图(B),以B13代指实施例所得聚合物。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。而这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例的新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成示意图如图1(说明书附图图1)所示,具体步骤如下:
首先用活化的4A型分子筛除去无水乙醚中少量的水,将1.5倍摩尔比的对甲苯磺酰氯溶于除水的无水乙醚中。称取1摩尔比的mPEG400,放入圆底烧瓶中,,再将溶于无水乙醚的对甲苯磺酰氯倒入圆底烧瓶中。称取1.2倍摩尔比的吡啶(作为催化剂使用)后搅拌,反应24h后,将反应混合物倒入无水乙醚中沉淀,该沉淀过滤后干燥即制得mPEG400-OTS(单甲基聚乙二醇对甲苯磺酰酯)。
将第一步制得的mPEG400-OTS与等摩尔比的PEI25000在80℃下搅拌反应12h。将得到的黄棕色粘稠状的液体。透析24h并真空干燥后得到物质的结构式如下:
其中n=1,所表示的最终产物即聚乙二醇修饰的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺mPEG400-PEI25000(以下记做B1)。1H NMR(CDCl3,300MHz),3.35(单峰,-0-CH2CH2-),3.2-2.2(宽峰,N-CH2CH2-N,34H),0.94-0.72(三重峰,末端CH3,6H)。
称取OVA固体以HEPES溶液(pH7.4)溶解制得5mg/ml OVA溶液。称取B1以去离子水溶解配制0.06mg/ml的溶液。在涡旋混合条件下,向0.06mg/ml的B1溶液中加入等体积的5mg/ml OVA溶液,使其混合均匀,以此得到B1/OVA复合纳米粒子。
本实施例的实施效果如下;
(1)Zeta电位和粒径检测:形成的B1/OVA复合物,用10mM HEPES溶液(pH7.4)经复合物稀释10倍在Zetasizer Nano-ZS90粒径分析仪上,测定直径为150.2±12nm,Zeta电位为-31.2±0.5mV。
(2)取聚合物/OVA复合物适量,用等体积的pH为6.6的4%磷钨酸负染5分钟。取适量滴加在铜网上,平放30分钟,用滤纸吸去多余液体,过夜自然干燥后置透射电子显微镜(TEM)下观察复合物的形态;如图2所示。由图2可知:在过夜干燥后的条件下,复合物为大小均匀的实心球体。
(3)聚合物/OVA的抗原交叉提呈效果:
取雄性C57/BL6小鼠骨髓,加含有GM-CSF和IL-4的培养液培养,第六天获得树突状细胞。收集树突状细胞,向96孔板中加入树突状细胞,使细胞浓度为每孔1×105个,然后加入样品,样品的OVA浓度均为0.5mg/ml。混匀,培养过夜48小时后,向各孔内加入1×105个RF33.70细胞,培养48小时。使用Mouse IL-2试剂盒采用酶联免疫吸附法测定IL-2浓度,IL-2浓度越高说明其抗原交叉提呈效果越好。
抗原交叉提呈细胞实验比较了各组纳米粒的抗原交叉提呈效果,每组实验5个平行测试复孔。其中第一组为阴性对照组,是为不加任何纳米粒的树突状细胞,第二组为加入OVA溶液的树突状细胞,第三组为加入PEI25000/OVA的树突状细胞,第四组为加入B1/OVA纳米粒的树突状细胞。抗原交叉提呈细胞实验结果如图3(A)所示,由图3(A)可知B1所制得的复合纳米粒子在细胞实验有抗原交叉提呈作用,且比PEI25000制得的纳米粒显著的增强作用。
(4)聚合物/0VA的细胞毒性:
取雄性C57/BL6小鼠骨髓,加含有GM-CSF和IL-4的培养液培养,第六天获得树突状细胞。收集树突状细胞收集树突状细胞,向96孔板中加入树突状细胞,使细胞浓度为每孔1×105个,然后加入样品,样品的OVA浓度均为0.5mg/ml。,使细胞浓度为每孔1×105个,OVA浓度为0.5mg/ml。混匀,培养过夜12小时后,向各孔内加入CCK8试剂,培养1~4小时。待有明显颜色后酶标仪450nm测定。
细胞毒性实验比较了各组纳米粒的细胞毒性,每组实验5个平行测试复孔。其中阴性对照组为不加任何纳米粒加入等体积1640培养基的树突状细胞,第一实验组为加入OVA溶液的的树突状细胞,第二实验组为加入PEI25000/OVA的树突状细胞,第三实验组为加入B1/OVA纳米粒的树突状细胞细胞毒性实验结果如图3(B)所示,活细胞比例越高,说明纳米粒对细胞的毒性越小。由图3(B)可知:B1所制得的复合纳米粒子在细胞毒性实验有一定的毒性,但比PEI25000制得的纳米粒的毒性显著降低。
实施例2
本实施例涉及的材料同实施例1,新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成过程及纳米粒的复合方法亦同实施例1,所不同之处在于,n=10,且合成时的mPEG为mPEG600,PEI为PEI2000,所制备得到的最终产物即一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺(以下记做B2),如结构式其中n=10。1H NMR(CDCl3,300MHz),3.35(单峰,-0-CH2CH2-),3.2-2.2(宽峰,N-CH2CH2-N,34H),0.94-0.72(三重峰,末端CH3,6H)。
按实施例1同样方法制备聚合物/OVA复合物。测定粒径为211.4±7nm,Zeta电位为—37.2±0.56mV。抗原交叉提呈效果、细胞毒性实验效果分别如图4(A)、(B)所示,由图4(A)、(B)可知:所制得的聚合物/OVA复合纳米粒子在细胞实验中对抗原交叉提呈作用均存在显著的增强作用且降低了细胞毒性。
实施例3
本实施例涉及的材料同实施例1,新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成过程及纳米粒的复合方法亦同实施例1,所不同之处在于,n=15,且合成时的mPEG为mPEG600,PEI为PEI8000,所制备得到的最终产物即一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺,如结构式其中n=15所示。1HNMR(CDCl3,300MHz),3.35(单峰,-0-CH2CH2-),3.2-2.2(宽峰,N-CH2CH2-N,34H),0.94-0.72(三重峰,末端CH3,6H)。
按实施例1同样方法制备聚合物/OVA复合物。测定粒径220.5±11nm,Zeta电位为—41.3±0.37mV。抗原交叉提呈效果、细胞毒性实验效果分别如图5(A)、(B)所示,由图5(A)、(B)可知:所制得的聚合物/OVA复合纳米粒子在细胞实验中对抗原交叉提呈作用均存在显著的增强作用且降低了细胞毒性。
实施例4
本实施例涉及的材料同实施例1,新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成过程及纳米粒的复合方法亦同实施例1,所不同之处在于,n=15,且合成时的mPEG为mPEG600,PEI为PEI8000,所制备得到的最终产物即一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺,如结构式其中n=1所示。1HNMR(CDCl3,300MHz)4.3(宽峰,NH),3.2-2.2(宽峰,N-CH2CH2-N,34H),1.8-1.15(宽峰,脂肪链CH2,12H),0.94-0.72(三重峰,末端CH3,6H)。
按实施例1同样方法制备聚合物/OVA复合物。测定粒径220.5±11nm,Zeta电位为—41.3±0.37mV。抗原交叉提呈效果、细胞毒性实验效果分别如图6(A)、(B)所示,由图6(A)、(B)可知:所制得的聚合物/OVA复合纳米粒子在细胞实验中对抗原交叉提呈作用均存在显著的增强作用且降低了细胞毒性。
实施例5
本实施例涉及的材料同实施例1,新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成过程及纳米粒的复合方法亦同实施例1,所不同之处在于,n=5,且合成时的mPEG为mPEG1000,PEI为PEI20000,所制备得到的最终产物即一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺,如结构式其中n=5,所示。1H NMR(CDCl3,300MHz),3.35(单峰,-0-CH2CH2-),3.2-2.2(宽峰,N-CH2CH2-N,34H),0.94-0.72(三重峰,末端CH3,6H)。
按实施例1同样方法制备聚合物/OVA复合物。测定粒径123.5±10nm,Zeta电位为—28.9±0.39mV。抗原交叉提呈效果、细胞毒性实验效果分别如图7(A)、(B)所示,由图7(A)、(B)可知:所制得的聚合物/OVA复合纳米粒子在细胞实验中对抗原交叉提呈作用均存在显著的增强作用且降低了细胞毒性。
实施例6
本实施例涉及的材料同实施例1,新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成过程及纳米粒的复合方法亦同实施例1,所不同之处在于,n=7,且合成时的mPEG为mPEG2000,PEI为PEI10000,所制备得到的最终产物即一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺,如结构式其中n=7,所示。1H NMR(CDCl3,300MHz),3.35(单峰,-0-CH2CH2-),3.2-2.2(宽峰,N-CH2CH2-N,34H),0.94-0.72(三重峰,末端CH3,6H)。
按实施例1同样方法制备聚合物/OVA复合物。测定粒径131.8±11nm,Zeta电位为—40.2±0.10mV。抗原交叉提呈效果、细胞毒性实验效果分别如图8(A)、(B)所示,由图8(A)、(B)可知:所制得的聚合物/OVA复合纳米粒子在细胞实验中对抗原交叉提呈作用均存在显著的增强作用且降低了细胞毒性。
实施例7
本实施例涉及的材料同实施例5,新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成过程及纳米粒的复合方法亦同实施例1,所不同之处在于,n=5,且合成时的mPEG为mPEG1000,PEI为PEI20000,所制备得到的最终产物即一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺,如结构式其中n=5,所示。1H NMR(CDCl3,300MHz),3.35(单峰,-0-CH2CH2-),3.2-2.2(宽峰,N-CH2CH2-N,34H),0.94-0.72(三重峰,末端CH3,6H)。
按实施例1同样方法制备聚合物/OVA复合物。测定粒径108.5±6nm,Zeta电位为—52.2±0.11mV。抗原交叉提呈效果、细胞毒性实验效果分别如图9(A)、(B)所示,由图9(A)、(B)可知:所制得的聚合物/OVA复合纳米粒子在细胞实验中对抗原交叉提呈作用均存在显著的增强作用且降低了细胞毒性。
实施例8
本实施例涉及的材料同实施例1,新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成过程及纳米粒的复合方法亦同实施例1,所不同之处在于,n=6,且合成时的mPEG为mPEG1000,PEI为PEI15000,所制备得到的最终产物即一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺,如结构式其中n=6,所示。1H NMR(CDCl3,300MHz),3.35(单峰,-0-CH2CH2-),3.2-2.2(宽峰,N-CH2CH2-N,34H),0.94-0.72(三重峰,末端CH3,6H)。
按实施例1同样方法制备聚合物/OVA复合物。测定粒径310.5±13nm,Zeta电位为—50.5±0.82mV。抗原交叉提呈效果、细胞毒性实验效果分别如图10(A)、(B)所示,由图10(A)、(B)可知:所制得的聚合物/OVA复合纳米粒子在细胞实验中对抗原交叉提呈作用均存在显著的增强作用且降低了细胞毒性。
实施例9
本实施例涉及的材料同实施例1,新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成过程及纳米粒的复合方法亦同实施例1,所不同之处在于,n=5,且合成时的mPEG为mPEG5000,PEI为PEI25000,所制备得到的最终产物即一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺,如结构式其中n=5,所示。1H NMR(CDCl3,300MHz),3.35(单峰,-0-CH2CH2-),3.2-2.2(宽峰,N-CH2CH2-N,34H),0.94-0.72(三重峰,末端CH3,6H)。
按实施例1同样方法制备聚合物/OVA复合物。测定粒径110.5±14nm,Zeta电位为—34.2±0.53mV。抗原交叉提呈效果、细胞毒性实验效果分别如图11(A)、(B)所示,由图11(A)、(B)可知:所制得的聚合物/OVA复合纳米粒子在细胞实验中对抗原交叉提呈作用均存在显著的增强作用且降低了细胞毒性。
实施例10
本实施例涉及的材料同实施例1,新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成过程及纳米粒的复合方法亦同实施例1,所不同之处在于,n=4,且合成时的mPEG为mPEG8000,PEI为PEI10000,所制备得到的最终产物即一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺,如结构式其中n=4,所示。1H NMR(CDCl3,300MHz),3.35(单峰,-0-CH2CH2-),3.2-2.2(宽峰,N-CH2CH2-N,34H),0.94-0.72(三重峰,末端CH3,6H)。
按实施例1同样方法制备聚合物/OVA复合物。测定粒径114.5±7nm,Zeta电位为—41.7±0.74mV。抗原交叉提呈效果、细胞毒性实验效果分别如图12(A)、(B)所示,由图12(A)、(B)可知:所制得的聚合物/OVA复合纳米粒子在细胞实验中对抗原交叉提呈作用均存在显著的增强作用且降低了细胞毒性。
实施例11
本实施例涉及的材料同实施例1,新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成过程及纳米粒的复合方法亦同实施例1,所不同之处在于,n=2,且合成时的mPEG为mPEG10000,PEI为PEI25000,所制备得到的最终产物即一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺,如结构式其中n=2,所示。1H NMR(CDCl3,300MHz),3.35(单峰,-0-CH2CH2-),3.2-2.2(宽峰,N-CH2CH2-N,34H),0.94-0.72(三重峰,末端CH3,6H)。
按实施例1同样方法制备聚合物/OVA复合物。测定粒径80.9±3nm,Zeta电位为—35.2±0.45mV。抗原交叉提呈效果、细胞毒性实验效果分别如图13(A)、(B)所示,由图13(A)、(B)可知:所制得的聚合物/OVA复合纳米粒子在细胞实验中对抗原交叉提呈作用均存在显著的增强作用且降低了细胞毒性。
实施例12
本实施例涉及的材料同实施例1,新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成过程及纳米粒的复合方法亦同实施例1,所不同之处在于,n=2,且合成时的mPEG为mPEG6000,PEI为PEI10000,所制备得到的最终产物即一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺,如结构式其中n=18,所示。1H NMR(CDCl3,300MHz),3.35(单峰,-0-CH2CH2-),3.2-2.2(宽峰,N-CH2CH2-N,34H),0.94-0.72(三重峰,末端CH3,6H)。
按实施例1同样方法制备聚合物/OVA复合物。测定粒径170.6±9nm,Zeta电位为—23.2±0.48mV。抗原交叉提呈效果、细胞毒性实验效果分别如图14(A)、(B)所示,由图14(A)、(B)可知:所制得的聚合物/OVA复合纳米粒子在细胞实验中对抗原交叉提呈作用均存在显著的增强作用且降低了细胞毒性。
实施例13
本实施例涉及的材料同实施例1,新型聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成过程及纳米粒的复合方法亦同实施例1,所不同之处在于,n=20,且合成时的mPEG为mPEG800,PEI为PEI12000,所制备得到的最终产物即一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺,如结构式其中n=20,所示。1H NMR(CDCl3,300MHz),3.35(单峰,-0-CH2CH2-),3.2-2.2(宽峰,N-CH2CH2-N,34H),0.94-0.72(三重峰,末端CH3,6H)。
按实施例1同样方法制备聚合物/OVA复合物。测定粒径133.5±10nm,Zeta电位为—27.9±0.39mV。抗原交叉提呈效果、细胞毒性实验效果分别如图15(A)、(B)所示,由图15(A)、(B)可知:所制得的聚合物/OVA复合纳米粒子在细胞实验中对抗原交叉提呈作用均存在显著的增强作用并且降低了细胞毒性。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (9)
3.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成方法,其特征在于,所述PEI的重均分子量为2000~25000。
4.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的合成方法,其特征在于,所述单甲基聚乙二醇的重均分子量为400~10000。
5.一种如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺作为蛋白载体生物材料的用途,其特征在于,所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺可与蛋白质复合形成稳定的纳米粒子。
6.如权利要求5所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺作为蛋白载体生物材料的用途,其特征在于,所述蛋白质为带负电的蛋白质。
7.如权利要求5所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺作为蛋白载体生物材料的用途,其特征在于,所述蛋白质为肿瘤抗原或病毒抗原。
8.如权利要求5所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺作为蛋白载体生物材料的用途,其特征在于,所述纳米粒子可作为肿瘤治疗性疫苗的载体。
9.如权利要求5所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺作为蛋白载体生物材料的用途,其特征在于,所述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺的n为10~20中的任一自然数。
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