CN107997984A - 一种抗菌肽-壳聚糖复合物、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种经过用SEQ ID Nos.1‑4所示的抗菌肽修饰的壳聚糖的抑菌材料及其制备方法。具体地，本发明提供一种抗菌肽‑壳聚糖复合物，其中抗菌肽上的羧基和壳聚糖上的氨基通过酰化反应发生偶联。抗菌肽修饰的壳聚糖材料具有显著的抑菌效果，能显著抑制金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌或大肠杆菌。同时公开了以该材料加载的细胞生长因子制成的纳米粒及其制备方法。以所述纳米粒为原料复合其它辅料所制成的化妆品或护肤品具有抑制痤疮生长及修复痤疮破损皮肤的作用。

Description

一种抗菌肽-壳聚糖复合物、其制备方法及其应用
技术领域
本发明属于化妆品及护肤品领域。本发明公开了一种抗菌肽修饰的壳聚糖复合物，具体涉及一种用SEQ ID Nos.1-4所示的抗菌肽修饰的壳聚糖复合物，同时公开了以该材料加载的细胞生长因子制成的纳米粒及其制备方法。所述纳米粒可以进一步制备成水剂、乳剂、凝胶剂、脂质体等形态。
背景技术
20世纪80年代，由瑞典科学家发现的一类具有抗菌活性的多肽称为“antimicrobial peptides”，意为“抗微生物肽”。抗菌肽是由基因编码在核糖体内合成的多肽，不同种类的抗菌肽通常有共同的特点：短肽(30～60个氨基酸)，强阳离子性(等电点范围为8.9～10.7)，热稳定性好(100℃，15min)，分子质量约为4KD，无药物屏蔽且不影响真核细胞。当今，抗菌肽已经可以由原核生物到人类的大部分有机生物体中成功分离和分类。抗菌肽通常作用于细菌，在真核生物的天然免疫方面发挥着重要作用，被认为是古代进化中哺乳动物体内有效保留的免疫分子。由于全球抗生素药物的滥用，越来越多的细菌可能发展成为对传统抗生素耐药的菌株。人们迫切地寻找能够代替传统抗生素的药物，使得抗菌肽受到广泛的重视。
壳聚糖(chitosan)是现代制药技术常用的载体，因其诸多优点现今在化妆品中也被广泛使用。壳聚糖是来源于甲壳素脱乙酰产物，一种无定形的半透明物质，无毒、无害、易生物降解，不污染环境，并且具有良好的吸附性、成膜性、吸湿性等特性。已有大量的研究证实壳聚糖及其衍生物具有广谱的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌和白色念珠菌等均具有抑制作用。早前的报道主要研究了分子量大小、脱乙酰度因素对于壳聚糖杀菌性的影响。近年来，人们逐渐发现了化学改性对于抗菌能力的正向增强作用。其中，大多数条件下，季铵化操作所获得的季铵化壳聚糖衍生物，其杀菌能力都在不同程度上得到了进一步加强。但其抗菌能力与分子量及pH值相关，其抗菌范围及抗菌效果未达到期望。
发明内容
本发明提供了一种抗菌肽修饰的壳聚糖复合物、其制备方法及其在化妆品中的应用。抗菌肽偶联壳聚糖在不改变其生物学特性的情况下提高了其抗菌活性，特别是在禁止添加抗生素的祛痘化妆品中得到广泛应用。
具体而言，本发明提供一种抗菌肽-壳聚糖复合物，具体涉及一种用SEQ IDNos.1-4所示的抗菌肽修饰的壳聚糖复合物，以及该复合物的制备方法，同时公开了以该复合物加载细胞生长因子制成的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒及其制备方法。将所述抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒进一步制备成水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜等形态，可用于抗痤疮系列产品的开发利用。
在第一方面，本发明提供一种抗菌肽偶联的壳聚糖复合物。其中，抗菌肽上的羧基和壳聚糖上的氨基通过酰化反应偶联。优选地，所述抗菌肽通过其上的羧基与壳聚糖上的氨基发生酰化反应，从而使所述抗菌肽与壳聚糖键合偶联。在下文中，将这种偶联有抗菌肽的壳聚糖复合物称为“抗菌肽-壳聚糖复合物”。
其中，所述的抗菌肽为选自D-peptide A(氨基酸序列为RLYLRIGRR-NH2，SEQ IDNo.1)、D-peptide B(氨基酸序列为RLRLRIGRR-NH2，SEQ ID No.2)、D-peptide C(氨基酸序列为ALYLAIRRR-NH2，SEQ ID No.3)或D-peptide D(氨基酸序列为RLLLRIGRR-NH2，SEQ IDNo.4)中的一种或几种，优选D-peptide A和/或D-peptide B。在所述抗菌肽-壳聚糖复合物中，抗菌肽上的羧基和壳聚糖上的氨基通过酰化反应发生偶联，从而使抗菌肽与壳聚糖偶联。在制备抗菌肽-壳聚糖复合物的方法中，优选地，通过控制酰化反应中抗菌肽与壳聚糖的质量比为2∶1～1∶5，优选为1∶1，可以得到合乎需要的抗菌肽-壳聚糖复合物。并且，优选地，在酰化反应中，分别控制[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]∶[抗菌肽]的质量比和[N-羟基琥珀酰亚胺]∶[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]的质量比为0.8和2.75。
所述抗菌肽可以通过标准的短肽合成技术人工合成，也可以商购得到。
本领域技术人员应该理解，在所述抗菌肽-壳聚糖复合物中的“壳聚糖”是壳聚糖及其衍生物的统称。可以通过商购或化学合成途径获得适用于本发明的壳聚糖及其衍生物。
所述抗菌肽-壳聚糖复合物中的壳聚糖部分可以选自壳聚糖、季铵盐化壳聚糖、磺酸化壳聚糖或磷酸化壳聚糖，并且它们的分子量为3.5～10KD。
所述抗菌肽-壳聚糖复合物能够有效地抑制革兰氏阳性菌(G+)和阴性菌(G-)的生长，例如，但不限于，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白葡萄球菌(Staplylococcus Albus)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、大肠杆菌(E.coli)的生长。
在第二方面，本发明还提供制备所述的抗菌肽-壳聚糖复合物的方法，其包括以下步骤：
(1)称取50～100mg壳聚糖，溶解于10～50mL PBS缓冲液(pH 6～7)，
(2)精密称取50～100mg抗菌肽，溶解于10～30mL PBS缓冲液(pH6～7)，
(3)精密称取40～100mg EDC-HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和50～250mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入至步骤(2)制得的包含抗菌肽的PBS溶液中，4℃避光搅拌十分钟，活化羧基，
(4)将步骤(1)制得的壳聚糖溶液滴加入步骤(3)制得的包含抗菌肽、EDC-HCl和NHS的PBS溶液中，4℃避光搅拌过夜，
(5)转移步骤(4)的溶液至截留分子量为6～8kDa的透析袋中，在4℃避光条件下用超纯水透析24h除去EDC-HCl、NHS和游离的壳聚糖，即得到所述抗菌肽-壳聚糖复合物。
其中，在步骤(4)的偶联反应中，壳聚糖与抗菌肽的用量比(质量比)可以为2∶1～1∶5，优选为1∶1。
优选地，在步骤(3)中，分别控制[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]∶[抗菌肽]的质量比和[N-羟基琥珀酰亚胺]∶[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]的质量比为0.8和2.75。
所述方法还可以包括下述步骤：
(6)将步骤(5)制得的抗菌肽-壳聚糖复合物冻干，-20℃保存待用。
其中所用的抗菌肽为选自D-peptide A(氨基酸序列为RLYLRIGRR-NH2，SEQ IDNo.1)、D-peptide B(氨基酸序列为RLRLRIGRR-NH2，SEQ ID No.2)、D-peptide C(氨基酸序列为ALYLAIRRR-NH2，SEQ ID No.3)或D-peptide D(氨基酸序列为RLLLRIGRR-NH2，SEQ IDNo.4)中的一种或几种，优选D-peptide A(SEQ ID No.1)、D-peptide B(SEQ ID No.2)或二者的组合。
所述抗菌肽-壳聚糖复合物中的壳聚糖部分可以选自壳聚糖、季铵盐化壳聚糖、磺酸化壳聚糖或磷酸化壳聚糖，并且，它们的分子量可以为3.5～10KD。可以通过商购或化学合成途径获得这些适用于本发明的壳聚糖及其衍生物。
在所述抗菌肽-壳聚糖复合物中，抗菌肽上的羧基和壳聚糖上的氨基通过酰化反应发生偶联。
在第三方面，本发明提供了一种以第一方面的抗菌肽-壳聚糖复合物为原料加载细胞生长因子制成的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒。其中所述细胞生长因子被包裹在第一方面的抗菌肽-壳聚糖复合物中。所包裹方式可以是物理或化学的包裹方式。对于所述抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒，抗菌肽的抗菌作用联合细胞生长因子的修复作用，对于痤疮的治疗和痤疮破损皮肤的修复能起到协同作用。
所述细胞生长因子选自成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)或角朊细胞生长因子(KGF)中的一种或几种，优选EGF。这些细胞生长因子可以商购获得。
在所述抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒中，所述细胞生长因子可以通过物理或化学的方式被包裹在纳米粒中。其中，所述抗菌肽-壳聚糖复合物与所述细胞生长因子的摩尔比为10∶1～1∶5，优选为5∶1。
所述抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒的粒径为50～200nm。
所述抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒可以用于制备化妆品，例如，制备用于祛痘的化妆品。优选地，所述化妆品用于预防和/或治疗由座疮丙酸杆菌(P.Acne)引起的痤疮。
在第四方面，本发明提供了制备第三方面所述的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)室温下(25℃)，将第一方面的抗菌肽-壳聚糖用1％醋酸配制成0.5～2mg mL-1的抗菌肽-壳聚糖醋酸溶液，用0.1～1mol L-1NaOH调节pH值至5～6，
(2)向步骤(1)的溶液中加入10～20μg细胞生长因子，恒温磁力搅拌器控制温度25～40℃，转速200～400r min-1，缓慢滴加浓度为0.5～2mg mL-1的多聚磷酸钠(TPP)水溶液，滴加完毕后继续搅拌15min，得到抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒混悬液，
(3)将步骤(2)制得的混悬液以1w～3w r min-14℃离心30～60min，收集沉淀物，分散在注射用水中，-40℃冷冻干燥得到抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒冻干粉，避光储存。
在第五方面，本发明提供了一种包含有效量的本发明所述的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒的化妆品，其以本发明所述的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒为原料添加辅料制备而成。所述化妆品可以为凝胶剂、脂质体、乳液等其它系列剂型，优选地，所述化妆品可以是祛痘化妆品。所述祛痘化妆品能够抑制座疮丙酸杆菌(P.Acne)，进而能够有效地预防和/或治疗痤疮。
优选地，本发明提供一种祛痘化妆品，其包含有效量的本发明第三方面所述的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒。
综上所述，本发明提供下述实施方案：
1.一种抗菌肽-壳聚糖复合物，其中抗菌肽上的羧基和壳聚糖上的氨基通过酰化反应偶联。
2.第1项所述的抗菌肽-壳聚糖复合物，其中所述抗菌肽选自SEQ ID Nos.1-4所示的肽中的一种或几种。
3.第2项所述的抗菌肽-壳聚糖复合物，其中所述抗菌肽为SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2或它们的组合。
4.第1项所述的抗菌肽-壳聚糖复合物，其中所述抗菌肽-壳聚糖复合物中的壳聚糖部分选自壳聚糖、季铵盐化壳聚糖、磺酸化壳聚糖或磷酸化壳聚糖，其中它们的分子量为3.5～10KD。
5.一种制备第1-4项中任一项的抗菌肽-壳聚糖复合物的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)称取50～100mg壳聚糖，溶解于10～50mL pH 6～7的PBS缓冲液，
(2)精密称取50～100mg抗菌肽，溶解于10～30mL pH 6～7的PBS缓冲液，
(3)精密称取40～100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和50～250mg N-羟基琥珀酰亚胺，加入至步骤(2)制得的包含抗菌肽的PBS溶液中，4℃避光搅拌十分钟，活化羧基，
(4)将步骤(1)制得的壳聚糖溶液滴加入步骤(3)制得的包含抗菌肽、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的PBS溶液中，4℃避光搅拌过夜，
(5)转移步骤(4)的溶液至截留分子量为6～8kDa的透析袋中，在4℃避光条件下，用超纯水透析24小时除去1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和游离的壳聚糖，即得到所述抗菌肽-壳聚糖复合物。
6.第5项所述的方法，其中在步骤(4)的偶联反应中，抗菌肽与壳聚糖的质量比为2∶1～1∶5，优选为1∶1。
7.第5项所述的方法，其中在步骤(3)中，分别控制[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]∶[抗菌肽]的质量比和[N-羟基琥珀酰亚胺]∶[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]的质量比为0.8和2.75。
8.根据第5项所述的方法，所述方法还包括下述步骤：
(6)将步骤(5)得到的透析液冻干，-20℃保存。
9.一种抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子的纳米粒，其中所述细胞生长因子被包裹在第1-4项中任一项所述的抗菌肽-壳聚糖复合物中，其中所述抗菌肽-壳聚糖复合物与所述细胞生长因子的摩尔比为10∶1～1∶5，优选为5∶1。
10.第9项所述的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子的纳米粒，其中所述细胞生长因子选自成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、角朊细胞生长因子或它们的任意组合，优选表皮细胞生长因子。
11.第9项所述的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子的纳米粒，其中所述纳米粒的粒径为50～200nm。
12.制备第9项所述的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子的纳米粒的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)室温下(25℃)，将第1-4项中任一项的抗菌肽-壳聚糖用1％醋酸配制成0.5～2mg mL-1的抗菌肽-壳聚糖醋酸溶液，用0.1～1mol L-1NaOH调节pH值至5～6，
(2)向步骤(1)的溶液中加入10～20μg细胞生长因子，恒温磁力搅拌器控制温度25～40℃，转速200～400r min-1，缓慢滴加浓度为0.5～2mg mL-1的多聚磷酸钠(TPP)水溶液，滴加完毕后继续搅拌15min，得到抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒混悬液，
(3)将步骤(2)制得的混悬液以1w～3w r min-14℃离心30～60min，收集沉淀物，分散在注射用水中，-40℃冷冻干燥得到抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒冻干粉，避光储存。
13.一种化妆品，其包含有效量的第9-11项中任一项所述的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子的纳米粒，优选地，所述化妆品为凝胶剂、脂质体或乳液剂型。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1：实施例1的抗菌肽-壳聚糖复合物的红外光谱图。
图2：实施例4制得的抗菌肽-壳聚糖凝胶剂抑制金黄色葡萄球菌MIC实验。1～8分别为阴性对照(不含凝胶剂)、阳性对照(氨苄霉素)、3.125、6.25、12.5、25、50、100mg/mL的凝胶剂。
图3：实施例4制得的抗菌肽-壳聚糖凝胶剂抑制痤疮丙酸杆菌MIC实验。1～6分别为阴性对照(不含实施例4制得的凝胶剂)、浓度为50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL的凝胶剂。
图4：实施例4制得的凝胶使用前后情况对比，(A)为使用前后脸部对比图；(B)为使用前后脸部红色区对比图。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
实施例1抗菌肽-壳聚糖复合物的制备
本实施例以抗菌肽D-peptide A和壳聚糖为例，制备步骤如下：
(1)精密称取100mg壳聚糖(分子量为3.5～10KD，购自浙江金壳药业有限公司)，溶解于10mL PBS缓冲液(pH 6)，
(2)精密称取100mg D-peptide A，溶解于10mL PBS缓冲液(pH 6)，
(3)精密称取80mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)和220mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入至D-peptide A的PBS溶液中，4℃避光搅拌十分钟，活化羧基，
(4)将步骤(1)制得的壳聚糖溶液滴加入D-peptide A的PBS溶液中，4℃避光搅拌过夜，
(5)转移步骤(4)的溶液至截留分子量为7kDa的透析袋中，避光，4℃，超纯水透析24h除去EDC-HCl、NHS和游离的壳聚糖，
(6)冻干，-20℃保存待用。
其中，在步骤(3)中，分别控制[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]∶[抗菌肽]的质量比和[N-羟基琥珀酰亚胺]∶[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]的质量比为0.8和2.75。在步骤(4)的偶联反应中，壳聚糖与D-peptide A的用量比为1∶1(w/w)。
经过上述步骤，制得抗菌肽D-peptide A与壳聚糖的复合物。
实施例2抗菌肽-壳聚糖红外光谱检测
分别取适量实施例1制备的抗菌肽-壳聚糖复合物、壳聚糖和抗菌肽冻干粉混合KBr粉末(1∶10～20，w/w)，研磨混合后放入压模器压成片状，置于烘干机烘干。置入空白KBr片于傅立叶红外光谱仪采集背景，然后更换成抗菌肽-壳聚糖复合物(PT-COS)、壳聚糖(COS)和抗菌肽(PT)样品的KBr片，扫描得到原始图谱后，然后进行后续的基线校正、曲线平滑和水蒸气补偿等。
结果见图1。结果显示：图1中的壳聚糖(COS)，3405cm-1左右的强宽峰是-NH的伸缩振动峰和-OH的伸缩振动峰重叠成的多重吸收峰；2921cm-1的峰是C-H伸缩振动峰；1614～1517cm-1是-NH2的变形振动峰；1382～1307cm-1是C＝H2弯曲或-CH3变形振动峰；1072cm-1的强峰是C-N的伸缩振动峰。壳聚糖的-NH2峰从1614cm-1位移到抗菌肽-壳聚糖复合物(PT-COS)红外的1653cm-1，反映壳聚糖的氮原子上未共用电子对与抗菌肽的-COOH形成了新的酰胺键，反映抗菌肽已偶联到壳聚糖上。
实施例3抗菌肽-磺化壳聚糖-细胞生长因子纳米粒的制备
本实施例以抗菌肽D-peptide A和磺化壳聚糖为例，制备步骤如下：
(1)精密称取100mg磺化壳聚糖(分子量为5.2KD，由广州暨南大学医药生物技术研究开发中心按照标准化学方法制备，合成方法可参见Hong-weiWang，LinYuan，Tie-liangZhao，et al.Altered enzymatic activity of lysozymes bound to variouslysulfated chitosans[J].Chinese Journal of Polymer Science，2012，30(6)：893-899.)，溶解于10mL PBS缓冲液(pH 6)，
(2)精密称取100mg D-peptide A，溶解于10mL PBS缓冲液(pH 6)，
(3)精密称取80mg EDC-HCl和220mg NHS，加入至D-peptide A的PBS溶液中，4℃避光搅拌十分钟，活化羧基，
(4)将步骤(1)制得的磺化壳聚糖溶液滴加入D-peptide A的PBS溶液中，4℃避光搅拌过夜，
(5)转移步骤(4)的溶液至截留分子量为7kDa的透析袋中，避光，4℃，超纯水透析24h除去EDC-HCl、NHS和游离的磺化壳聚糖，
(6)冻干，-20℃保存待用，(7)室温下(25℃)，用1％醋酸配制1mg mL-1D-peptideA-磺化壳聚糖醋酸溶液，1mol L-1NaOH调节pH值至5～6，加入适量表皮细胞生长因子，恒温磁力搅拌器控制温度35℃，转速200r min-1，
(8)缓慢滴加浓度为1mg mL-1的TPP(多聚磷酸钠)水溶液，滴加完毕后继续搅拌15min，得抗菌肽-磺化壳聚糖-细胞生长因子纳米粒混悬液，
(9)将混悬液于30000r min-14℃离心30min，收集沉淀，分散在注射用水中，-40℃冷冻干燥得到纳米粒冻干粉，避光储存。
其中，在步骤(3)中，分别控制[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]∶[抗菌肽]的质量比和[N-羟基琥珀酰亚胺]∶[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]的质量比为0.8和2.75。在步骤(4)的偶联反应中，磺化壳聚糖与抗菌肽的用量比为1∶1(w/w)。
在所述抗菌肽-磺化壳聚糖-细胞生长因子纳米粒中，所述细胞生长因子通过物理或化学的方式被包裹在纳米粒中。所述细胞生长因子为表皮细胞生长因子，其与所述抗菌肽-磺化壳聚糖复合物的摩尔比为1∶5，并且所制得的纳米粒的粒径为50～200nm。
实施例4抗菌肽-磺化壳聚糖-细胞生长因子纳米粒温敏凝胶剂的制备
取80ml注射用水，边搅拌边加入泊洛沙姆20g，在4℃充分溶胀形成溶液，加入甘油5g、乙醇5g和对羟基苯甲酸乙酯0.2g，混合均匀，然后在0.1Mpa，121℃条件下高压灭菌15分钟，冷却至4℃，制成基质部分；称取实施例3制得的抗菌肽-磺化壳聚糖-细胞生长因子纳米粒100mg，加入适量注射用水搅拌均匀后，过滤除菌后加入到灭菌后的凝胶基质中，加入灭菌后注射用水至100g，缓慢搅拌混合均匀，制成抗菌肽-磺化壳聚糖-细胞生长因子纳米粒温敏型凝胶剂。
实施例5抗菌肽-壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌实验
将金黄色葡萄球菌(最初购自CGMCC，由本实验室保种并延续使用)从斜面培养基接种到肉汤培养液中，置于普通的培养箱37℃培养16～18h；用麦氏标准比浊管调整菌液浓度为1.5x 108CFU/ml，然后无菌的生理盐水稀释成1×106CFU/ml备用。用营养肉汤将供试物(实施例4制得)配成含系列供试物浓度的培养液，分别取上述浓度的金黄色葡萄球菌0.1ml分别加到体积为1ml，含系列浓度供试品的试管中于培养箱37℃培养24h后观察有无浑浊。以不出现浑浊的最低浓度为观察最小抑菌浓度(MIC)。结果见图2。图2中1～8分别为阴性对照、阳性对照(氨苄霉素)、3.125、6.25、12.5、25、50、100mg/mL的凝胶剂。结果显示12.5mg/mL的试管培养基出现浑浊，表明实施例4制得的凝胶剂对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为25mg/mL。
实施例6祛痘组合物对座疮丙酸杆菌(P.Acne)的抑菌实验
将座疮丙酸杆菌(P.Acne，购自广东省微生物菌种保藏中心)在37℃厌氧发生罐中进行厌氧培养48h(使用肉汤培养基，购自广州威佳生物有限公司)，用无菌的生理盐水稀释到1×106CFU/ml。用肉汤浸液将供试物(实施例4制得)配成含系列供试物浓度的培养液，取菌液0.1ml加入到体积为1mL的不同浓度的无菌供试物(实施例4制得)的试管中。置厌氧罐中37℃培养48h，用氧气指示剂来指示厌氧罐内的氧气含量(当氧气的浓度大于0.5％时，氧气指示剂由紫色或紫红色变成蓝色)。观察有无浑浊，以不出现浑浊的最低浓度为观察最小抑菌浓度(MIC)。
结果见图3。图3中1～6分别为阴性对照(不含实施例4制得的凝胶剂)、浓度为50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL的凝胶剂。结果显示6.25mg/mL的试管(5号试管)培养基出现浑浊，表明实施例4制得的凝胶剂对座疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为12.5mg/mL。
实施例7抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子凝胶剂祛痘功效评价
受试者32例，年龄为18～45岁，皆为女性；参照国际改良痤疮分级法及Pillsbury分类法属于面部有I-III级寻常型痤疮；受试部位没有经过皮肤治疗、美容或是其它皮肤测试，能严格按照研究方案的要求，并签署知情同意书；近一个月没有用维A酸以及抗生素等祛痘药物；近一月内没有使用激素类药物及免疫抑制剂者；现在或最近三个月受试部位没有参加其他临床实验者。
面部清洁30min后，采用VISIA面部图像分析仪进行面部拍摄，分析面部的皮损状况、红斑区(炎症)面积以及卟啉水平，并于面部左右脸颊、额头以及下巴皮损部位检测皮肤油脂含量以及皮肤pH值的基础值，每个部位重复3次并求其平均值。然后规范受试者或护理者按产品(即，实施例4制得的抗菌肽-磺化壳聚糖-细胞生长因子纳米粒温敏凝胶剂)说明书用量、使用步骤，将试样均匀涂布于面部。于使用产品后第3、7、14、28天回访并进行同样的指标检测。同一个受试者的测试由同一个测量人员完成。
祛痘凝胶使用前后对比，图4A为使用前皮肤情况，图4B为使用4周后皮肤情况。结果表明，使用本发明的抗菌肽-磺化壳聚糖-细胞生长因子纳米粒温敏凝胶剂后脸部痤疮明显减少，红色区痤疮皮损部位显著减轻，祛痘效果明显。
本领域技术人员应该理解，尽管上述实施例以抗菌肽D-peptide A和壳聚糖或磺化壳聚糖为例制备了抗菌肽-(磺化)壳聚糖复合物，并以抗菌肽-磺化壳聚糖复合物和表皮细胞生长因子为例制备了抗菌肽-磺化壳聚糖-表皮细胞生长因子的纳米粒，并检测了上述复合物的抗菌活性或祛痘功效，但是本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明所教导的方法和技术方案，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员能够进行适当的修改或改进，由此所得的其他抗菌肽-壳聚糖复合物和/或抗菌肽-壳聚糖复合物-细胞生长因子的纳米粒都在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种抗菌肽-壳聚糖复合物，其中抗菌肽上的羧基和壳聚糖上的氨基通过酰化反应偶联。
2.权利要求1所述的抗菌肽-壳聚糖复合物，其中所述抗菌肽选自SEQ ID Nos.1-4所示的肽中的一种或几种。
3.权利要求2所述的抗菌肽-壳聚糖复合物，其中所述抗菌肽为SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2或它们的组合。
4.权利要求1所述的抗菌肽-壳聚糖复合物，其中所述抗菌肽-壳聚糖复合物中的壳聚糖部分选自壳聚糖、季铵盐化壳聚糖、磺酸化壳聚糖或磷酸化壳聚糖，其中它们的分子量为3.5～10KD。
5.一种制备权利要求1-4中任一项的抗菌肽-壳聚糖复合物的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)称取50～100mg壳聚糖，溶解于10～50mL pH 6～7的PBS缓冲液，
(2)精密称取50～100mg抗菌肽，溶解于10～30mL pH 6～7的PBS缓冲液，
(3)精密称取40～100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和50～250mgN-羟基琥珀酰亚胺，加入至步骤(2)制得的包含抗菌肽的PBS溶液中，4℃避光搅拌十分钟，活化羧基，
(4)将步骤(1)制得的壳聚糖溶液滴加入步骤(3)制得的包含抗菌肽、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的PBS溶液中，4℃避光搅拌过夜，
(5)转移步骤(4)的溶液至截留分子量为6～8kDa的透析袋中，在4℃避光条件下，用超纯水透析24小时除去1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和游离的壳聚糖，即得到所述抗菌肽-壳聚糖复合物。
6.根据权利要求5所述的方法，所述方法还包括下述步骤：
(6)将步骤(5)得到的透析液冻干，-20℃保存。
7.一种抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子的纳米粒，其中所述细胞生长因子被包裹在权利要求1-4中任一项所述的抗菌肽-壳聚糖复合物中，其中所述抗菌肽-壳聚糖复合物与所述细胞生长因子的摩尔比在10∶1～1∶5的范围内，优选为5∶1。
8.权利要求7所述的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子的纳米粒，其中所述细胞生长因子选自成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、角朊细胞生长因子或它们的任意组合，优选表皮细胞生长因子。
9.制备权利要求7所述的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子的纳米粒的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)室温下(25℃)，将权利要求1-4中任一项的抗菌肽-壳聚糖用1％醋酸配制成0.5～2mg mL-1的抗菌肽-壳聚糖醋酸溶液，用0.1～1mol L-1NaOH调节pH值至5～6，
(2)向步骤(1)的溶液中加入10～20μg细胞生长因子，恒温磁力搅拌器控制温度25～40℃，转速200～400r min-1，缓慢滴加浓度为0.5～2mg mL-1的多聚磷酸钠(TPP)水溶液，滴加完毕后继续搅拌15min，得到抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒混悬液，
(3)将步骤(2)制得的混悬液以1w～3w r min-14℃离心30～60min，收集沉淀物，分散在注射用水中，-40℃冷冻干燥得到抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒冻干粉，避光储存。
10.一种化妆品，其包含有效量的权利要求7或8所述的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子的纳米粒，优选地，所述化妆品为凝胶剂、脂质体或乳液剂型。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109142560A (zh) * 2018-07-06 2019-01-04 浙江工商大学 PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物及其应用和降低凡纳滨对虾中生物胺的方法
CN109172802A (zh) * 2018-09-21 2019-01-11 岭南师范学院 一种罗非鱼鱼鳃抗菌肽壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用
CN109276471A (zh) * 2018-11-07 2019-01-29 上海上水和肌化妆品有限公司 包裹体技术的多肽抗衰老组合物及其制备方法
CN110330656A (zh) * 2019-07-08 2019-10-15 同济大学 含抗菌肽的两亲性接枝共聚物及其制备方法和应用
CN112552425A (zh) * 2020-11-16 2021-03-26 浙江技立新材料股份有限公司 一种用于织物上的蛋清肽整理剂的制备方法
CN112957317A (zh) * 2021-04-28 2021-06-15 吉林大学 一种口腔凝胶材料及其制备方法和应用
CN113201082A (zh) * 2021-04-28 2021-08-03 江南大学 一种壳聚糖-二氢卟吩e6抗菌剂及其制备方法
CN117064811A (zh) * 2023-09-18 2023-11-17 广东省华桑丽皙生物技术有限公司 含有蚕丝抗菌肽的组合物及其在化妆品中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010184022A (ja) * 2009-02-12 2010-08-26 National Institute Of Agrobiological Sciences 抗微生物ペプチドを固定化した素材
CN103710383A (zh) * 2013-12-11 2014-04-09 深圳先进技术研究院 一种非病毒转基因载体、制备方法及其应用
CN106700108A (zh) * 2016-12-05 2017-05-24 深圳职业技术学院 一种可降解抗菌保鲜膜及其制备方法
CN106880512A (zh) * 2017-02-23 2017-06-23 西安艾尔菲生物科技有限公司 Ha修饰的人脐带msc无血清培养液cs纳米粒冻干粉及其制备和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010184022A (ja) * 2009-02-12 2010-08-26 National Institute Of Agrobiological Sciences 抗微生物ペプチドを固定化した素材
CN103710383A (zh) * 2013-12-11 2014-04-09 深圳先进技术研究院 一种非病毒转基因载体、制备方法及其应用
CN106700108A (zh) * 2016-12-05 2017-05-24 深圳职业技术学院 一种可降解抗菌保鲜膜及其制备方法
CN106880512A (zh) * 2017-02-23 2017-06-23 西安艾尔菲生物科技有限公司 Ha修饰的人脐带msc无血清培养液cs纳米粒冻干粉及其制备和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PRIYANKA SAHARIAH等: "Antimicrobial peptide shows enhanced activity and reduced toxicity upon grafting to chitosan polymers", 《CHEMICAL COMMUNICATIONS》 *
吴欢: "壳聚糖及其衍生物接枝多肽的制备及其性能研究", 《万方数据知识服务平台（HTTP://WWW.WANFANGDATA.COM.CN/DETAILS/DETAIL.DO?_TYPE=DEGREE&ID=D794431#）》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109142560A (zh) * 2018-07-06 2019-01-04 浙江工商大学 PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物及其应用和降低凡纳滨对虾中生物胺的方法
CN109142560B (zh) * 2018-07-06 2021-03-02 浙江工商大学 PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物及其应用和降低凡纳滨对虾中生物胺的方法
CN109172802A (zh) * 2018-09-21 2019-01-11 岭南师范学院 一种罗非鱼鱼鳃抗菌肽壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用
CN109276471A (zh) * 2018-11-07 2019-01-29 上海上水和肌化妆品有限公司 包裹体技术的多肽抗衰老组合物及其制备方法
CN110330656A (zh) * 2019-07-08 2019-10-15 同济大学 含抗菌肽的两亲性接枝共聚物及其制备方法和应用
CN112552425A (zh) * 2020-11-16 2021-03-26 浙江技立新材料股份有限公司 一种用于织物上的蛋清肽整理剂的制备方法
CN112957317A (zh) * 2021-04-28 2021-06-15 吉林大学 一种口腔凝胶材料及其制备方法和应用
CN113201082A (zh) * 2021-04-28 2021-08-03 江南大学 一种壳聚糖-二氢卟吩e6抗菌剂及其制备方法
CN117064811A (zh) * 2023-09-18 2023-11-17 广东省华桑丽皙生物技术有限公司 含有蚕丝抗菌肽的组合物及其在化妆品中的应用
CN117064811B (zh) * 2023-09-18 2024-04-12 广东省华桑丽皙生物技术有限公司 含有蚕丝抗菌肽的组合物及其在化妆品中的应用

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