JP2010184022A - 抗微生物ペプチドを固定化した素材 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】X1−Lue−X2−Leu−X3−Ile−X4−Arg−Arg−NH2(式中、X1はArgまたはAlaであり、X2はTyr、ArgまたはLeuであり、X3はArgまたはAlaであり、X4はGlyまたはArgである。)を含むポリペプチドを基材に固定化することにより、抗菌活性を有する医療器具、医療素材を得ることができる。
【選択図】なし
Description
X1−Lue−X2−Leu−X3−Ile−X4−Arg−Arg−NH2
(式中、X1はArgまたはAlaであり、X2はTyr、ArgまたはLeuであり、X3はArgまたはAlaであり、X4はGlyまたはArgである。)
好ましくは、上記ポリペプチドはArg−Leu−Tyr−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−NH2、Arg−Leu−Arg−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−NH2、Ala−Leu−Tyr−Leu−Ala−Ile−Arg−Arg−Arg−NH2またはArg−Leu−Leu−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−NH2から成る群より選択される。
(1)下記式で表されるアミノ酸配列:
X1−Lue−X2−Leu−X3−Ile−X4−Arg−Arg−NH2
(式中、X1はArgまたはAlaであり、X2はTyr、ArgまたはLeuであり、X3はArgまたはAlaであり、X4はGlyまたはArgである。)を含むポリペプチドを固定化した素材。
(2)前記ポリペプチドがArg−Leu−Tyr−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−NH2、Arg−Leu−Arg−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−NH2、Ala−Leu−Tyr−Leu−Ala−Ile−Arg−Arg−Arg−NH2またはArg−Leu−Leu−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−NH2である(1)に記載の素材。
(3)前記ポリペプチドがスペーサーを介してC末端側で基材と結合していることを特徴とする(1)または(2)に記載の素材。
(4)基材が高分子または金属である(1)乃至(3)のいずれかに記載の素材。
(5)基材がセルロースである(4)に記載の素材。
(6)基材にエピハロヒドリンを反応させて表面をハロゲン化した後、1,3−ジアミノプロパンまたはジエチレングリコールビス(3−アミノプロピル)エーテルを加えてアミノ修飾し、当該アミノ基に保護アミノ酸を順次結合させ、最後に保護基を脱離させることを特徴とする(1)乃至(5)のいずれかに記載の素材の製造方法。
(7)(1)乃至(5)のいずれかに記載の素材から成る抗微生物または抗ガン活性を有する成型品。
(8)創傷被覆材、縫合糸、人工血管、カテーテル、透析膜、衣服およびステントからなる群より選択される(7)に記載の成型品。
(9)液体を(1)乃至(5)のいずれかに記載の素材と接触させることを特徴とする液体の殺菌方法。
(10)液体が血液または血漿である(9)に記載の殺菌方法。
Arg−Leu−Tyr−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−NH2(配列番号1)、
Arg−Leu−Arg−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−NH2(配列番号2)、
Ala−Leu−Tyr−Leu−Ala−Ile−Arg−Arg−Arg−NH2(配列番号3)、または
Arg−Leu−Leu−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−NH2(配列番号4)を含むポリペプチドを挙げることができる。
スペーサー付きのペプチドを共有結合により固定化するために、すでに基材中に固定化に利用できる適当な官能基を有しているか、あるいは官能基を容易に導入できる素材を使用することが好ましい。
具体的には、セルロース、ナイロン、ポリスチレンなどの高分子の使用が好ましく、特にセルロースは、官能基として水酸基を持っており、その水酸基に他の官能基を導入することも容易である。また、金はそれ自体がチオール基と容易に反応し、また様々な素材を金に蒸着させることが容易であることから特に好ましい。
固相とスペーサーは共有結合に限らず、イオン結合や疎水結合、抗原抗体反応など固相とスペーサーを固定し得るものであれば、結合の種類に限られず、どのような結合であっもよい。
また、どちらにどの官能部位を入れるかは限定されず、反応する2つの官能部位をどちらか一方ずつに導入すればよい。
カブトムシディフェンシン由来改変ペプチドのスペーサーを介したC末端での固定化
1)綿布にエピブロモヒドリンを反応させ表面をブロモ化した後、1,3−ジアミノプロパンを加え、アミノ修飾綿布を合成した。これらのアミノ基に9−フルオレニルメトキシ基(Fmoc基)で保護したD型アミノ酸を結合させ、ピペリジンで保護基を脱離させた後に、新たにFmocで保護したアミノ酸を結合させた。このようにD型アミノ酸を順次結合させて、RLLLRIGRR(配列番号4)のD型ペプチドをC末端で固定化した綿白布を合成した。但し、第1段階のアミノ酸の反応効率が他のアミノ酸に比較して低いために、最初にグリシンを結合させた後に、上記アミノ酸を順次結合させた。単位面積当たりのペプチド結合量は0.25 μg/cm2であった(ペプチド固定綿布1)。
カブトムシディフェンシン由来改変ペプチドの結合部位を制御しない固定化
綿布にエピブロモヒドリンを反応させて、布の表面をブロモ化した。当該綿布にペプチドを反応させ、分子中のいずれかのアミノ基と綿布のブロモ基とを結合させた。配列番号1、2、3および4のペプチドを固定化させた綿布をA、B、CおよびDとした。
カブトムシディフェンシン由来改変ペプチド固定化綿布の抗微生物活性
i)スペーサーを介してペプチドをC末端で固定化した綿布の抗微生物活性試験
実施例1においてペプチドを間接的に固定化した綿布について、抗微生物活性試験を行った。ペプチド固定化綿布を培養液中に入れ、18時間培養した後に生菌は認められなかった(実験1)。実験1で用いた布を超純粋で手振り洗浄(振幅30cm×30回振とう×3回)およびオートクレーブによる滅菌操作を4回繰り返し行った後も抗菌活性が維持されていることが認められた(実験2−5)。また、実験5の後、当該ペプチド固定綿布を家庭用洗濯機を用いて界面活性剤を使用せずに洗濯し(洗い→すすぎ→脱水)、再度上記条件で手振り洗浄を行った後にオートクレーブ処理し、実験6に使用した。
本実験により、スペーサーを介してC末端でペプチドを固定化することにより、抗菌活性が安定的に維持されることが示めされた。
実施例2において作製した、ペプチドの結合部位を制御せず固定化した綿布A、B、CおよびDについて、JIS規格に基づく抗菌試験法を用いて黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に対する抗菌活性を測定した。ペプチド固定化綿布を培養液中に入れ、18時間培養した後に生菌は認められなかった(実験1)。実験1で用いた綿布を前記条件で手振り洗浄し、オートクレーブによる滅菌操作を行った後に再度抗菌試験を行った。当該洗浄及び抗菌試験を繰返し実施した結果、2回以上洗浄を繰り返すことにより全てのペプチド固定化綿布において生菌が認められた(実験2−5)。
カブトムシディフェンシン由来改変ペプチド固定化綿布の抗ガン活性
カブトムシディフェンシン由来改変ペプチド固定化綿布のマウス骨髄腫細胞P3−X63−Ag8.653およびヒト白血病細胞Jurkatに対する活性を測定した。
ペプチド固定化綿布を培地中に入れた場合、ガン細胞の生存率はいずれも大幅に減少した。ペプチド固定化綿布の洗浄、滅菌を行い、再び試験を行った結果も同様に繰返しの実験で抗ガン活性は維持された。
Claims (10)
- 下記式で表されるアミノ酸配列:
X1−Lue−X2−Leu−X3−Ile−X4−Arg−Arg−NH2
(式中、X1はArgまたはAlaであり、X2はTyr、ArgまたはLeuであり、X3はArgまたはAlaであり、X4はGlyまたはArgである。)を含むポリペプチドを固定化した素材。 - 前記ポリペプチドがArg−Leu−Tyr−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−NH2、Arg−Leu−Arg−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−NH2、Ala−Leu−Tyr−Leu−Ala−Ile−Arg−Arg−Arg−NH2またはArg−Leu−Leu−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−NH2である請求項1に記載の素材。
- 前記ポリペプチドがスペーサーを介してC末端側で基材と結合していることを特徴とする請求項1または2に記載の素材。
- 基材が高分子または金属である請求項1乃至3のいずれかに記載の素材。
- 基材がセルロースである請求項4に記載の素材。
- 基材にエピハロヒドリンを反応させて表面をハロゲン化した後、1,3−ジアミノプロパンまたはジエチレングリコールビス(3−アミノプロピル)エーテルを加えてアミノ修飾し、当該アミノ基に保護アミノ酸を順次結合させ、最後に保護基を脱離させることを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載の素材の製造方法。
- 請求項1乃至5のいずれかに記載の素材から成る抗微生物または抗ガン活性を有する成型品。
- 創傷被覆材、縫合糸、人工血管、カテーテル、透析膜、衣服およびステントからなる群より選択される請求項7に記載の成型品。
- 液体を請求項1乃至5のいずれかに記載の素材と接触させることを特徴とする液体の殺菌方法。
- 液体が血液または血漿である請求項9に記載の殺菌方法。
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