CN107846881A - 功能化表面 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用分子进行功能化的氮化金属表面，每个分子包含至少一个结合基团和抗微生物部分。仅通过所述分子的结合基团与氮化金属表面内的氮原子之间的共价相互作用将分子固定在所述表面上。包含功能化的氮化表面的物品可用于抑制或降低经常碰触的表面上的微生物生长。用于制备功能化的氮化表面的方法包括使氮化金属表面与分子接触以在所述分子的结合基团与所述表面中的氮原子之间形成共价键，从而将分子固定在所述金属表面上。

Description

功能化表面
本发明涉及功能化表面，特别是具有仅通过共价相互作用固定在其上的分子(包括肽)的金属表面。
在任何给定的时间，当在NHS医院时每十一名患者中就有大约一名患者获得医院感染。这使得NHS每年花费数亿英镑。随后，减少医院感染的传播对于NHS是关键的优先事项。
微生物已被证明污染了大量的表面，包括但不限于门把手、电话、键盘、水龙头、塑料制品和织物，诸如手术服(scrub)和围裙。此外，已经显示与患有耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的患者直接接触的护士中的65％具有被污染的衣物。额外的42％的工作人员没有与感染病人直接接触，但是与医院中的表面接触，他们也具有被污染的衣物。这表明不仅人与人之间的传播可使感染能够传播，无生命的物体也可使感染能够传播。
在表面的定殖(colonisation)之后，许多微生物已经显示出存活相当长的时间。已经发现一些MRSA菌株在干燥后存活多达9周，并且已经显示副流感病毒在非吸收性表面上持续10小时且在吸收性表面上持续4小时。这些相对长的存活率通过增加可以感染其它患者的时间段来提高所讨论的微生物的传播能力。
尽管英国医院中实施了洗手方案，但是感染仍然能够传播。这可能是由方案本身的不同顺应性或方案中的不切实际之处引起的，因为工作人员在其能够达到水槽并洗手之前与许多表面接触。这允许表面被工作人员和病人二者污染，使得在再次感染之前洗手的那些人仅在短时间内免受污染。另外，衣物也能够被污染，这为微生物的传播提供了备选途径。
尽管已经显示清洁表面减少了感染的传播，但是它不能阻止再次定殖。而且，最初的清洁过程不能消除所有微生物。例如，已知MRSA在清洁后仍然存在。另外，可见的清洁度并不一定与微生物污染的水平相关，这使得难以在没有进行进一步的微生物测试的情况下评价表面是否已经被正确地清洁。没有达成可接受的表面微生物负载的标准并且患者和研究之间的感染剂量变化很大，这使得难以评价必须进行多少清洁和什么时候必须进行清洁。
明显的是，表面在感染物在个体之间的传代中起着重要的作用。目前的清洁工艺是暂时且效率低下的；需要改善的长期抗微生物控制。感染物的传播不仅在医疗环境中是重要的，而且在许多其它环境中也是重要的，包括公共建筑、经营场所、家庭住宅、公共交通、农场和与食物制备有关的区域。
显然需要一种改善的机制，用于环境的抗微生物控制，特别是表面的抗微生物控制。
考虑到这些问题而设计了本发明。
根据本发明的第一方面，提供了用分子进行功能化的氮化金属表面，每个分子包含至少一个结合基团和抗微生物部分，其中仅通过分子的结合基团与氮化金属表面内的氮原子之间的共价相互作用将所有分子固定在所述表面上。
使用共价相互作用将分子固定在金属表面上是有利的，因为共价相互作用强烈地将分子结合到表面，从而防止或减少它们的释放。
将理解的是，结合基团将包括能够与金属表面内的氮原子形成共价键的官能团或者由其组成。所述官能团可以是，但不一定限于，羧基，胺，亚胺，硫代酰胺或烯胺。在一些实施方案中，结合基团包括羧基或由羧基组成。将理解的是，在这种实施方案中，共价相互作用是在每个分子的羧基和金属表面的氮原子之间形成的酰胺键。
因此，使用氮化金属表面使得分子能够直接结合到金属表面，而不需要连接体或金属表面的额外官能化。氮化金属表面可以用多个分子进行功能化。
虽然研究人员先前已经能够使用共价相互作用将分子结合到金属表面，但是这依赖于用聚合物或树脂涂覆金属，然后将分子附着于涂层。然而，用聚合物涂覆金属的表面将非常不同的材料性质给予金属，并且还呈现了在表面上更不耐用的材料。
除了能够通过共价键与分子直接结合外，使用氮化金属表面是有利的，因为表面中存在的氮增加了金属的耐磨性。
在诸如检测(例如污染检测或环境监测)的领域中，分子附着于表面以赋予功能性也是所希望的。
所述分子可以是具有抗微生物活性的任何分子。分子或其抗微生物部分可以具有抗细菌、抗病毒和/或抗真菌活性。在一些实施方案中，分子或其抗微生物部分是抗生素。分子或其抗微生物部分可以对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或二者具有抑菌或杀菌作用。在一些实施方案中，分子或其抗微生物部分对人或动物病原体诸如大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)是有效的。
与金属表面形成共价键的结合基团可以形成抗微生物部分的一部分，或者其可以与抗微生物部分分开。在其中形成共价键的结合基团是抗微生物部分的一部分的实施方案中，将理解的是抗微生物部分直接结合到金属表面。换言之，金属表面与抗微生物部分之间不存在间隔物。
在一些实施方案中，所述分子中的一些或全部由抗微生物部分组成。
在一些实施方案中，每个分子包含第一抗微生物部分和第二部分。第二部分可以是非抗微生物的。
将理解的是，第二部分可以具有任何所需的功能。例如，第二部分可以包含例如在流体系统中用于检测污染物的一个或多个催化基团。
在一些实施方案中，第二部分用作金属表面与第一抗微生物部分之间的间隔物。当分子结合到表面时，间隔物可以有利地允许第一抗微生物部分运动自由并减少空间位阻。间隔物可以具有任何所需的大小或长度，例如1至100个原子、2至50个原子或5至20个原子。
在一些实施方案中，分子或其抗微生物部分是肽。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用肽进行功能化的氮化金属表面，其中仅通过肽的结合基团与金属表面内的氮位点之间的共价相互作用将所有肽固定在所述表面上。在一些实施方案中，仅通过肽的C-末端羧基与金属表面内的氮位点之间的共价相互作用将肽固定在所述表面上。
在一些实施方案中，每个肽包含第一抗微生物部分和第二部分。第二部分可以是非抗微生物的。
在一些实施方案中，第二部分形成肽的C-末端，使得第二部分用作金属表面与第一抗微生物部分之间的间隔物。间隔物可以具有任何所需的长度，例如1至50个、2至20个或5至10个氨基酸。当肽结合到表面时，间隔物可以有利地允许第一部分运动自由并减少空间位阻。
在一些实施方案中，分子、肽或其抗微生物部分包含可检测标记或用可检测标记进行标记。可以使用任何合适的可检测标记。可检测标记可以是例如荧光标记或UV可见标记。合适的荧光标记包括FITC和罗丹明。便利的UV可见标记是色氨酸，其能够被并入肽链中。链中存在的色氨酸残基越多，读数越强。用于并入可检测标记的其它手段对于本领域技术人员是已知的。可检测标记提供了一种便利的手段，通过该手段可以检测到在表面上分子或肽的存在。这可以用于质量控制，例如以证实在制备过程期间分子已经成功固定在表面上。另外，可以在包含表面的物品的寿命期间检查固定的分子的存在，以指示表面是否保持其抗微生物活性。
在一些实施方案中，分子、肽或其抗微生物部分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和/或绿脓假单胞菌具有不大于10mg/ml、不大于5mg/ml、不大于2.5mg/ml、不大于1.25mg/ml、不大于1.0mg/ml或不大于0.5mg/ml的最小抑制浓度。
在一些实施方案中，肽(或其抗微生物部分)来源于防卫素(defensin)。
防卫素是由上皮细胞和免疫细胞表达的小肽，并且对许多革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌、真菌和病毒展现出抗微生物活性。防卫素可以是α、β或γ防卫素。通过“来源于”，将理解的是，肽或其抗微生物部分可以含有防卫素的一部分氨基酸序列或全部氨基酸序列。因此，在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含以下或由以下组成：防卫素肽序列，或其功能性变体或片段。
防卫素肽序列的术语“变体”将被理解为意指肽或其抗微生物部分包含以下序列或由以下序列组成：所述序列与防卫素肽的氨基酸序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的同一性。
术语“片段”将被理解为意指肽或其抗微生物部分包含防卫素肽的一部分或由防卫素肽的一部分组成。片段可以是整个防卫素肽的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。片段可以包括防卫素肽的C-末端或N-末端，或者其可以不包括这两个末端。
通过“功能性”，将理解的是，变体或片段保持了其来源的防卫素序列的至少一些抗微生物活性。将理解的是，可能去除、添加或置换防卫素肽序列的一个或多个氨基酸以提供仍然展现抗微生物活性的变体或片段。实际上，与其亲本序列相比，变体或片段可以具有改善的抗微生物活性。熟练的技术人员将知道如何使用标准技术生产已知的防卫素序列的片段和变体并测试它们的抗微生物性质。熟练的技术人员还将知道如何使用公知的序列比对工具诸如ClustalW(Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research,22,4673-4680；Thompson等人,1997,Nucleic Acids Research,24,4876-4882)来计算氨基酸序列之间的百分比同一性。
肽或其抗微生物部分的长度可以是5至40个氨基酸。在一些实施方案中，肽(或其抗微生物部分)具有至少6个、至少8个或至少10个氨基酸(残基)。在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分具有不多于30个、不多于20个、不多于15个或不多于12个氨基酸。
抗微生物分子(包括肽)是本领域中已知的。技术人员可以利用任何已知的抗微生物分子(或其抗微生物部分)作为本发明的分子。然而，本发明人已经发现并入一种或多种以下特性的肽是有用的。
肽或其抗微生物部分可以包含具有带正电荷的侧链的至少3个、至少4个或至少5个氨基酸。具有带正电荷的侧链的氨基酸可以是精氨酸(R)，组氨酸(H)，赖氨酸(K)或其任何组合。带正电荷的氨基酸可以连续地排列，或者它们可以被一个或多个残基彼此间隔地分开。不希望受理论束缚，认为正电荷与细菌细胞膜的结合可以迫使孔形成并诱导细胞死亡。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含至少3个或至少4个精氨酸残基。精氨酸残基可以连续地排列，或者它们可以被一个或多个残基彼此间隔地分开。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含至少一段5个以上连续精氨酸残基的序列。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包括一个或多个疏水性和中性氨基酸残基。据信，包含疏水性和中性残基赋予了广谱活性。肽或其抗微生物部分可以包括1至20个、2至10个或3至6个疏水性氨基酸。通过“疏水性和中性氨基酸”，我们意指丙氨酸(A)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，苯丙氨酸(F)，色氨酸(W)，酪氨酸(Y)，甘氨酸(G)，脯氨酸(P)或缬氨酸(V)。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含一个或多个亲水性氨基酸残基。肽或其抗微生物部分可以包括1至20个、2至10个或3至6个亲水性氨基酸。通过“亲水性氨基酸残基”，我们意指丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)，天冬氨酸(D)，半胱氨酸(C)或谷氨酸(E)。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含至少3个带正电荷的氨基酸和至少一个疏水性氨基酸，并且任选地包含至少一个亲水性氨基酸。在一些另外的实施方案中，至少两个带正电荷的氨基酸被一个或多个疏水性和/或亲水性残基彼此分开。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含具有下式的序列或由其组成：
A(x)B(y)A(x)B(y)，其中：
A是带正电荷的氨基酸；
B是疏水性氨基酸或亲水性氨基酸；
x是1至10的数字；且
y是1至10的数字。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含具有下式的序列：
式A(x)Z(w)B(y)Z(w)A(x)Z(w)B(y)Z(w)A(x)或式A(x)B(y)Z(w)B(y)A(x)B(y)Z(w)B(y)A(x)，其中：
A是带正电荷的氨基酸；
B是疏水性氨基酸；
C是亲水性氨基酸；
x是1至6的数字；
y是1至6的数字；且
z是1至6的数字。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含序列RRYIGRGYIRR(SEQ ID No.1)或由其组成。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含序列RLYLRIGRR(SEQ ID No.2)或由其组成。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含序列CRVRGGRCA(SEQ ID No.3)或由其组成。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含序列RRRRRR(SEQ ID No.4)或由其组成。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含序列RRRRRRGALAGRRRRRRGALAG(SEQID No.5)或由其组成。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含序列GRRRRRRGALAGRRRRRRGALAG(SEQ ID No.6)或由其组成。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含序列KKKKKKGALAGKKKKKKGALAG(SEQID No.7)或由其组成。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分的序列包含末端半胱氨酸残基.在另外的实施方案中，肽或其抗微生物部分的序列在每个末端具有半胱氨酸残基。例如，序列RLYLRIGRR(SEQ ID No.2)可以通过包含末端半胱氨酸残基被修饰以得到序列CRLYLRIGRRC(SEQ ID No.8)。计算机模拟研究已经表明，包含半胱氨酸残基可以使得抗微生物部分能够依赖于环境通过形成二硫桥可逆地进行环化。不希望受理论束缚，本发明人推测肽或其抗微生物部分的三级结构也可以影响其抗微生物活性。在抗微生物部分中组合三维结构和正电荷可以有助于增加分子(诸如肽)的效力。
因此，在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含具有式C A(x)B(y)A(x)B(y)C的序列或由其组成，其中：
A是带正电荷的氨基酸；
B是疏水性氨基酸或亲水性氨基酸；
x是1至10的数字；
y是1至10的数字；且
C是半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，肽或其抗微生物部分包含以下序列或由以下序列组成：CRLYLRIGRRC(SEQ ID No.8)，CRRRRRRGALAGRRRRRRGALAGC(SEQ ID No.9)，CGRRRRRRGALAGRRRRRRGALAGC(SEQ ID No.10)，CRVRGGRCAC(SEQ ID No.11)，CRRRRRRC(SEQID No.12)，CKKKKKKGALAGKKKKKKGALAGC(SEQ ID No.13)或CRRYIGRGYIRRC(SEQ IDNo.14)。
这些序列可以被认为是“合成的防卫素”，因为它们在结构和功能上与天然存在的防卫素类似。
如本文所使用的，“氮化金属表面”将被理解为意指已经通过将氮扩散到金属表面中的方法进行处理的金属表面。所述方法可以包括氮化，氮碳共渗(包括铁氮碳共渗(ferretic nitrocarburising))，碳氮共渗和/或氧氮碳共渗(包括铁氧氮碳共渗(ferretic oxynitrocarburising))。这些技术对于本领域技术人员将是熟悉的。这些方法典型地用于产生表面硬化的表面。
在一些实施方案中，金属表面中的氮的深度是至少0.05、0.10、0.15、0.20或0.25mm。在一些实施方案中，深度不超过0.30mm。在其它实施方案中，深度不超过0.25mm。在另一个实施方案中，深度不超过0.20mm。技术人员将知晓测量氮的深度的技术。
将理解的是，技术人员将能够在视觉上区分未氮化金属表面和氮化金属表面。备选地或另外地，技术人员可以利用任何已知的技术来确定表面是否已经被氮化。例如，可以通过使用诸如但不限于维氏硬度(Vickershardness)测试、努氏硬度(Knoop hardness)测试或里氏回弹硬度(LeebRebound hardness)测试的测试对金属的硬度进行测试来确认氮化金属表面。备选地或另外地，技术人员可以通过使用EDX和X射线衍射技术、电化学极化方法和电化学阻抗谱中的至少一种来确认金属表面被氮化。
氮化金属表面可以由任何金属形成。将理解的是，可以根据表面的预期用途来选择金属。
在一些实施方案中，金属是铁、钢(例如不锈钢)、钛、铝、铬、铜、银或钼，或其合金。在一些特定实施方案中，金属是钛或不锈钢。在一些实施方案中，金属是铜或银。由于已知铜和银具有抗微生物性质，因此使用这些金属与抗微生物分子组合以提供抗微生物表面可以是特别有益的。
在一些实施方案中，金属是钢。
氮化金属表面可以是任何得益于具有抗微生物活性的表面。例如，氮化金属表面可以包括操作台、椅子、门、把手或栏杆或者与人或动物定期接触的任何其它物体的表面的至少一部分。特别地，金属表面可以包括用于医疗保健或食物制备的工具或设备件的外部的至少一部分。具有固定在其上的抗微生物分子(例如抗微生物肽)的金属表面特别是在医学中使用，尤其在医疗器械中使用。
在一些实施方案中，氮化金属表面是生物相容的。通过“生物相容的”，将理解的是，金属表面能够在人体或动物体内存在，而不对人或动物产生毒性或其它有害作用。特别优选的是金属表面不引起免疫应答。合适的生物相容的材料包括钛或其合金，不锈钢，以及铝或其合金。
氮化金属表面可以用单一类型的分子进行功能化。换言之，固定在表面上的所有分子可以是相同的。备选地，表面可以用两种或更多种不同的分子进行功能化。在一些实施方案中，用具有不同抗微生物部分的两种或更多种不同的分子对表面进行功能化。例如，用两种或更多种不同的分子对表面进行官能化可以是有利的，所述不同的分子包含对不同的微生物有效的抗微生物部分或者由其组成。
氮化金属表面可以用单一类型的肽进行功能化。换言之，固定在表面上的所有肽可以是相同的。备选地，表面可以用两种或更多种不同的肽进行功能化。在一些实施方案中，用具有不同抗微生物部分的两种或更多种不同的抗微生物肽对表面进行功能化。例如，用两种或更多种不同的肽对表面进行官能化可以是有利的，所述不同的肽包含对不同的微生物有效的抗微生物部分或者由其组成。
氮化金属表面可以用分子进行部分功能化，即仅一部分金属表面可以被功能化。因此，在一些实施方案中，金属表面的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％具有固定在其上的分子。在一些实施方案中，基本上整个金属表面具有固定在其上的分子。
氮化金属表面可以用肽进行部分功能化，即仅一部分金属表面可以被功能化。因此，在一些实施方案中，金属表面的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％具有固定在其上的肽。在一些实施方案中，基本上整个金属表面具有固定在其上的肽。
金属的分子百分比表面覆盖率可以通过使用荧光分子和显微镜来确定。
金属的肽百分比表面覆盖率可以通过使用荧光肽和显微镜来确定。
金属表面上的分子密度可以是每cm2表面至少50、至少60、至少70、至少80或至少90微摩尔。
金属表面上的肽密度可以是每cm2表面至少50、至少60、至少70、至少80或至少90微摩尔。
技术人员可以在表面上使用任何数量的分子的组合，所有分子均通过其结合基团与金属表面内的氮之间的共价附着(例如酰胺键)而结合。
在一些实施方案中，提供了用至少一种、至少两种、至少三种或至少五种分子进行功能化的表面，其中每种分子彼此不同。在一些实施方案中，每种分子在化学结构上彼此不同。在一些实施方案中，每种分子在活性谱上彼此不同。在一些实施方案中，每种分子在作用机制上彼此不同。在一些实施方案中，每种分子在类别上彼此不同。技术人员将知晓不同类别的抗微生物剂。
在一些实施方案中，提供了用至少一种、至少两种、至少三种或至少五种肽进行功能化的表面，其中每种分子彼此相差至少一个氨基酸。
肽可以通过固相肽合成(SPPS)形成。关于SPPS的进一步细节对本领域技术人员将是已知的并且可以在普通教科书中找到(例如，Stryer,Biochemistry,W.H.Freeman andCo Ltd,2002)。
功能化的金属表面可以是持久的。通过“持久的”，将理解的是分子或肽中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％可以在表面上固定至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少10周或至少15周。
功能化的金属表面可以是耐磨的。在一些实施方案中，在机械和/或化学处理之后，分子或肽保持固定在表面上。机械处理可以包括与人和/或动物的定期接触。通过“定期接触”，将理解的是每天至少一次、每周至少一次、每月至少一次、每3个月至少一次或每6个月至少一次接触表面，并且每次接触持续至少一秒。化学处理可以包括用醇(例如乙醇)、 胰蛋白酶、洗涤剂或肥皂或者其任何组合进行处理。表面可以每天至少一次、每周至少一次、每月至少一次、每3个月至少一次或每6个月至少一次与化学处理接触，并且每次接触持续至少一秒。
为了避免引发疑虑，将理解的是，金属表面并未用任何通过静电相互作用固定的分子(包括肽)进行功能化。
根据本发明的第二方面，提供了包含本发明第一方面的金属表面的物品。
金属表面可以构成物品表面的一部分或全部。在一些实施方案中，整个物品由金属制成。备选地，所述物品可以包含核心以及根据本发明的第一方面的金属表面。
所述物品可以是以下物品或者可以形成以下物品的一部分：操作台，椅子，写字台或桌子，门，把手或栏杆(其可以在例如公共建筑、经营场所、家庭住宅、农场或公共交通中发现)，小键盘(例如在自动取款机或安全面板上)，管道(例如水龙头、管道系统)，餐饮设备(包括平底锅、器皿、服务容器等)，装置或设备件(诸如制造或农业中使用的设备或机器)或医疗装置。用抗微生物分子(诸如肽)进行功能化的氮化金属表面可以有利地用于抑制或降低经常碰触的表面(例如门把手)上的微生物生长。
医疗装置可以是植入物(例如牙科植入物、起搏器、耳蜗植入物或矫形外科植入物)，假体(例如假体髋或膝盖，或其组件)，分析设备或手术器械。
根据本发明的第三方面，提供了用于制备根据本发明的第一方面的氮化金属表面的方法，所述方法包括使氮化金属表面与包含至少一个结合基团和抗微生物部分的分子接触以在分子的结合基团与表面中的氮原子之间形成共价键，从而将分子固定在金属表面上。
在一些实施方案中，所述方法包括在催化剂的存在下使氮化金属表面与分子接触。将理解的是，必须根据结合基团的性质来选择催化剂的类型。技术人员将知晓用于将不同的结合基团偶联到金属表面中的氮原子的合适的催化剂。在其中分子是肽或包含肽的实施方案中，合适的催化剂是HBTU((2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐))和DIEA(N,N-二异丙基乙胺)。
氮化金属表面可以通过任何合适的手段与分子接触。例如，表面可以浸涂或浸入含有分子和任选的催化剂的溶液。
氮化金属表面可以与分子接触一段时间，该时间适于使得分子的结合基团与表面中的氮原子之间能够形成共价键，从而在表面上实现所需的分子密度。在一些实施方案中，使表面与分子接触(例如浸泡或浸入含有所述分子的溶液)1至24小时的时间，例如大约12小时。
在一些实施方案中，所述方法在10至30℃的温度进行，例如在室温进行。
在一些实施方案中，分子或其抗微生物部分包含肽或由肽组成。因此，在一些实施方案中，所述方法包括使氮化金属表面与肽接触以在肽的结合基团(例如C-末端羧基)和金属表面内的氮位点之间形成共价键。
在一些实施方案中，所述方法还包括制备氮化金属表面。“氮化金属表面”将被理解为意指已经通过将氮扩散到金属表面中的方法进行处理的金属表面。所述方法可以包括氮化，氮碳共渗(包括铁氮碳共渗)，碳氮共渗和/或氧氮碳共渗(包括铁氧氮碳共渗)。氮化将被理解为其中氮扩散到金属表面中的处理工艺；氮碳共渗将被理解为其中氮和碳扩散到金属表面中的处理工艺；碳氮共渗将被理解为其中氮和碳扩散到金属表面中的处理工艺，并且氧氮碳共渗将被理解为其中碳、氮和氧扩散到金属表面中的处理工艺。铁工艺将被理解为意指在含铁金属上的处理工艺。
使金属表面氮化存在三种主要方法：气体氮化，其中使用富氮气体(通常为氨)来供给氮；盐浴氮化，其中供氮介质是含氮盐，诸如氰化物盐；以及等离子体氮化，其中强电场被用来在待氮化的金属表面周围产生电离的气体分子(通常是纯氮)。这些氮化方法对于本领域技术人员将是已知的。
现在将参照附图以举例的方式描述本发明的实施方案，其中：
图1是这样的图，其显示了不同类型的钢上的肽荧光的水平；
图2是这样的图，其显示了在不同的环境处理之后，氮化钢上的肽荧光的水平；
图3是这样的图，其显示了在不同的环境处理之后，氮化钢上的肽荧光的水平；
图4是这样的图，其显示了在不同的处理之后，α1-3钢上的肽荧光的水平；
图5是这样的图，其显示了在不同的处理之后，β1-3钢上的肽荧光的水平；
图6是这样的图，其显示了在不同的处理之后，p1或p2钢上的肽荧光的水平；
图7是这样的图，其显示了取自放置在不同表面上的对照氮化钢片和肽涂覆的氮化钢片的集落形成单位。
图8是这样的图，其显示了在一段时间内Metaltech氮化钛上的肽荧光的水平；
图9是这样的图，其显示了在不同的处理之后，Metaltech氮化钛上的肽荧光的水平；
图10是这样的图，其显示了在Metaltech氮化钛的表面上的肽活性。
图11显示了这样的图，所述图显示在三个月期间医院环境中使用的肽涂覆的氮化钢表面的抗微生物效果。(A)来自表面的绝对细菌计数。误差棒显示平均值的标准误差。(B)与对照表面相比，涂覆表面的百分比有效性，其随着实验时间而分为几组。在所有时间点都观察到99％或更高的效力；
图12显示了这样的图，所述图显示在三个月期间城市医院环境中使用的肽涂覆的氮化钢表面的抗微生物效果。(A)来自表面的绝对细菌计数。误差棒显示平均值的标准误差；虚线表示当前推荐的医院表面上的细菌负载。(B)与对照表面相比，涂覆表面的百分比有效性，其随着实验时间而分为几组。在所有时间点都观察到99％或更高的效力；
图13是这样的图，其显示了肽涂覆的氮化表面的有效性的长期研究。数据显示了医学院中经处理和未经处理的表面上的细菌生长计数(观察一年以上的)；和
图14是这样的图，其显示了已经用细菌处理的肽涂覆的氮化金属表面上结晶紫的吸光度。染色量与细菌的数量直接相关。
实施例
实施例1
肽的合成和纯化
使用标准Fmoc固相合成技术在Liberty blue肽合成仪上合成肽。肽通过高效液相色谱(HPLC)进行纯化。简言之，将水和乙腈添加到含有固体肽的管中。将溶液涡旋直至肽已经完全溶解。使用2μm注射器过滤器过滤样品并使用含有C18柱的HPLC机器进行分析。纯化后，使用0至100％乙腈梯度，在40分钟的时段中使用水和乙腈(二者均具有0.05％三氟乙酸)的溶剂。随后进行20分钟的洗涤周期，其由使用100％乙腈进行10分钟和使用100％水进行10分钟组成。
金属表面的制备
金属的氮化
在等离子体氮化物单元中使用标准等离子体氮化工艺由Metaltech,Consett,Co.Durham制备金属表面。所述工艺的变量在表1中显示。
表1
金属的具有后氧化的等离子体铁氮碳共渗
使用标准工艺由Metaltech对金属表面进行等离子体铁氮碳共渗。不同类型的金属在表2中显示。
表2
钢类型 Oil blackodised？
P1(PlasOx-1) 弹簧钢 否
P2(PlasOx-2) 弹簧钢 是
使用的所有钢片用P400粒度砂纸和丙酮进行清洁。
将肽固定在氮化金属表面
在旋转混合器中，氮化金属表面在溶液中在室温温育过夜，所述溶液包含分别为9:0.5:0.5比率的二甲基甲酰胺(DMF)、DIPIA和HBTU以及0.5μg/ml的标记有荧光标记的肽RRRRRRGALAGRRRRRRGALAG。温育后，用DMF(每5分钟补充一次)洗涤表面50分钟，然后还用盐水(每5分钟补充一次)洗涤表面50分钟，之后使其风干。
肽附着的分析
金属的肽百分比表面覆盖率通过使用荧光肽和显微镜进行评价。通过荧光显微镜在1.55s的曝光下使用10x物镜查看肽涂覆的金属。对于每1cm2钢片获得九张图像。使用ImageJ软件(NIH,MD,USA)分析图像。对从未经肽处理的氮化金属获得的对照图像的阈值进行调整，直到所有像素被去除，留下没有染色的图像。其作为对照基线。然后将来自相应实验样品的图像调整到该阈值，然后将剩余像素计数记录为肽附着的量度。
结果
来看图1，其成功地证明了肽可以附着于八种钢型，因为所有的平均像素计数均大于0。请注意，x轴标签A1-3代表α1-3钢，B1-3代表β1-3钢，并且P1-P2代表p1-p2钢。肽附着水平与钢型之间的差异是显著的(P＝0.006，具有Bonferroni校正的Kruskal-Wallis单向方差分析)，这表明肽优先结合某些钢型。从图中可以看出，肽RRRRRRGALAGRRRRRRGALAG对α钢型具有最高的结合亲和力。
实施例2
由Metaltech使用标准工艺对软钢进行氮化，在440℃进行19小时。如实施例1中所述，将标记有荧光标记的肽RRRRRRGALAGRRRRRRGALAG固定在氮化钢的表面上。在室温将肽涂覆的钢在适当的环境处理中温育合适的时间，这取决于所使用的处理。处理后用盐水洗涤样品，并如实施例1中详述的通过显微镜分析肽附着。
图2显示氮化钢的肽覆盖率在各种环境处理之前和之后保持在相似的水平。
由Metaltech使用标准工艺对软钢进行氮化。如实施例1中所述，将标记有荧光标记的肽RRRRRRGALAGRRRRRRGALAG固定在氮化钢的表面上。在室温将肽涂覆的钢在适当的环境处理中温育合适的时间，这取决于所使用的处理。处理后用盐水洗涤样品，并如实施例1中详述的通过显微镜分析肽附着。
图3显示氮化钢的肽覆盖率在环境处理也保持不限。这表明肽在氮化表面上的耐用且持久的固定适用于不同的钢和金属。
实施例3
如实施例1所述对钢进行氮化或等离子体铁氮碳共渗，然后如实施例1所述将标记有荧光标记的肽RRRRRRGALAGRRRRRRGALAG固定在氮化表面上。
将肽涂覆的α钢样品在室温下在各种标准清洁或涂覆处理中温育合适的时间(这取决于所使用的处理)，以确定这些处理中的任何一个是否影响肽与钢的附着。图4显示了对于每个氮化的肽涂覆表面，在特定处理后高于阈值的像素(指示肽覆盖的程度)。对于α1钢(H＝19.4p＝0.004)和α3钢(H＝12.8,p＝0.047)，处理之间的像素计数中发现统计学上显著的差异。由于钢片重复地暴露于光，所以这种下降可能部分由3周时间的荧光损失造成。然而，在α2钢的各种环境处理后的像素计数之间没有观察到显著差异(H＝12.4,p＝0.053)。
图5显示了对于每个氮化的肽涂覆的β钢，高于阈值的像素。统计分析表明，环境处理不影响β1和β3钢的肽覆盖率，因为在处理(分别为(H＝10.6,p＝0.103)和(H＝10.9,p＝0.09))之间没有观察到显着的差异。对于β2钢组，不同处理之间观察到显著差异(H＝13.7,p＝0.033)。
图6显示了对于肽涂覆的PlasOx钢，在环境处理后高于阈值的像素。在大多数情况下，发现PlasOx 2钢的像素数量高于PlasOx 1钢的像素数量。对于这两种金属，处理之间的像素数量上的差异是显著的(PlasOx 1钢,H＝15.4 p＝0.017，以及PlasOx 2钢,H＝12.7 p＝0.048)。
实施例4
使用标准氮化工艺制备α2钢，并使用如实施例1中所述的方法用1μg/ml的未标记的肽RRRRRRGALAGRRRRRRGALAG进行涂覆。然后将肽涂覆的钢样品或对照的未涂覆钢样品附接于预测存在高集落形成单位(CFU)计数的区域(例如马桶座圈、厨房水龙头等)。在第1、2、7、8和9天，使用浸泡在盐水中的脱脂棉签来擦拭表面。将棉签置于立体管中并用于接种血琼脂平板，随后在获取CFU计数之前将平板在37℃温育48小时。
图7显示了在附着于特定表面之后，肽涂覆的氮化α2钢表面对比对照的氮化α2钢表面的平均CFU计数。结果表明对于所有测试区域，与肽涂覆的钢片相比，对照的金属片上的平均CFU计数始终是更高的。
实施例5
在已经确定了固定的肽在钢表面上的耐久性和效力的情况下，对固定在钛表面上的肽的效力进行评价。氮化钛由Metaltech制备。如先前所述，将标记有荧光标记的RRRRRRGALAGRRRRRRGALAG固定在氮化钛的表面上。将肽涂覆的样品在室温下在PBS溶液中温育1至4周，然后如先前所述通过荧光显微镜评价荧光，以及所得的高于阈值的像素数量。
图8显示了在PBS溶液中1、2、3或4周之后氮化钛表面上的高于阈值的平均像素数量。在溶液中1周之后观察到最高的平均像素数量。尽管像素数量在1至2周显著减少，但是在2周后像素数量保持相对恒定。在溶液中1、2、3和4周后观察到高于阈值的像素，这表明肽和氮化钛表面之间的相互作用是持久的。
实施例6
如图9所示，在不同的环境处理后评价固定的肽在氮化钛表面上的耐久性。在室温将RRRRRRGALAGRRRRRRGALAG涂覆的钛在对照PBS溶液、胰蛋白酶、中温育合适的时间或用砂纸处理合适的时间，所述时间取决于所使用的处理。然后通过荧光显微镜评价高于阈值的平均像素数量。重要的是，在任何环境处理之后肽荧光得以保持，这指示肽和金属之间强烈且持久的相互作用。无论用对照溶液、胰蛋白酶或处理，肽荧光仍保持相似。此外，在使用砂纸进行机械搅拌之后，肽荧光得以保持，尽管其处于较低水平，这表明肽和表面之间的共价相互作用能够经受住机械或化学处理。
实施例7
氮化钛由Metaltech制备，并且如先前所述用RRRRRRGALAGRRRRRRGALAG涂覆，除了其中氮化钛用非抗微生物肽涂覆的对照(肽)组和其中氮化钛保持未涂覆的对照(钛)组之外。还使用了由未涂覆的组织培养塑料制品组成的阳性对照组。将表面洗涤并用作细菌的生长平板。将一组抗微生物肽涂覆的钛表面直接用作细菌的生长平板(处理(直接))。另一个抗微生物肽涂覆的钛组(处理(环境))用PBS处理，然后用胰蛋白酶/EDTA处理，然后用地特尔处理，然后用砂纸处理，然后将表面用作细菌的生长平板。吸光度与温育后在表面上生长的细菌数量有关(图10)。低值表示没有细菌生长，而高值表示高数量的细菌。图10显示了与观察到高吸光度值的对照相比，抗微生物肽涂覆的钛的吸光度值非常低。
实施例8
氮化钢表面用肽RRRRRRGALAGRRRRRRGALAG涂覆。将表面在肽(3μl的10mg/ml肽/cm2的金属)和将肽粘附到表面的催化剂(HBTU/DIEA混合物)的混合物中浸涂。在室温下进行涂覆12小时。
将涂覆和未涂覆的钢表面安装在医院单位中，在事故和急诊室、手术室、病房1和相关的浴室中。对照表面和涂覆的表面位于相同的位置，并测试了超过三个月。在使用后，将收集的样品和数据送至伯明翰大学进行分析。
获得的数据在图11中呈现。涂覆的表面显示出细菌生长的完全抑制。除了一个平板以外，在任何已经用肽涂覆的表面上没有看到集落形成单位(cfu)。其在第二个月显示了一个cfu。据信这是由擦拭或电镀工艺期间的污染造成的。对照平板显示细菌和真菌二者的生长。
涂层没有降低表面的耐磨性、促进生锈或导致任何其它操作问题。
实施例9
进一步的研究在城市医院的门诊区进行。这是医院非常繁忙的区域，并且看到高容量的病人和人员流动。使用的肽是RRRRRRGALAGRRRRRRGALAG，并且如实施例8中所述制备涂覆的钢表面。
将对照和涂覆的表面置于门诊区中的门把手上。对照表面显示了医院中的细菌水平显著高于医院表面的推荐性标准(5cfu)。有趣的是，只看到细菌生长，而未看到真菌生长。肽涂覆的表面将细菌的水平显著降低至1cfu，观察到有效性大于99％(图12)。我们从表面上看到1个菌落生长，这被认为是由表面的使用频率造成的。在观察期间平均每2分钟触摸一次表面，并且在很多情况下，在进行擦拭之前立即触摸表面。观察到这种显著降低的事实表明，表面是有效的并且能够防止细菌在表面的定殖，但是表面可能花费超过30秒的时间来杀死细菌细胞。
实施例10
将实施例8和9中描述的肽涂覆的表面安装在医学院。将表面置于厕所中的水龙头上，并擦拭了一年多的时间。数据(图13)显示在12个月后，在经处理的表面上仍然观察到细菌生长的抑制。
实施例8-10表明用抗微生物肽进行功能化的氮化金属表面能够抑制细菌生长并在临床环境中在很长一段时间内维持相同的效力水平。
实施例11
在具有DMF中的HBTU/DIEA催化剂的情况下，将氮化钢与具有序列RRIYGRGYIRR的抗微生物肽的溶液(25μl,10mg/ml/cm2)在室温下温育1小时以产生涂覆的表面。
用1x 106个细菌细胞(表皮葡萄球菌(S.epidermidis))接种涂覆的表面并在37℃温育过夜。然后用PBS洗涤表面，并在室温下用结晶紫(核染色剂)染色15分钟。将表面洗涤三次以去除任何残留的染色剂，并将染色在70％乙醇中提升。在560nm读取结晶紫的吸光度以定量染色水平(图14)。染色量与细菌的数量直接相关。这表明表面上的肽涂层可以显著降低粘附到表面的细菌的数量。
因此，本发明提供了功能化表面，特别是具有仅通过共价相互作用固定在其上的分子(包括肽)的金属表面。本发明人已经发现使用共价相互作用将肽固定在氮化金属表面上，通过降低微生物数量并在很长一段时间保持功能化，是有效的抗微生物机制。此外，已经证明即使在暴露于高CFU的区域中，肽涂覆的表面对微生物也是有效的，这表明其对于难以清洁的区域、未定期清洁的区域或暴露于高数量的病原体的区域是有效的。

Claims (18)

1.用分子进行功能化的氮化金属表面，每个分子包含至少一个结合基团和抗微生物部分，其中仅通过所述分子的结合基团与所述氮化金属表面内的氮原子之间的共价相互作用将所有所述分子固定在所述表面上。
2.根据权利要求1所述的氮化金属表面，其中所述结合基团是羧基。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的氮化金属表面，其中所述分子中的至少一些由抗微生物部分组成。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的氮化金属表面，其中每个分子包含第一抗微生物部分和第二部分。
5.根据权利要求4所述的氮化金属表面，其中所述第二部分用作所述金属表面与所述第一抗微生物部分之间的间隔物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的氮化金属表面，其中所述抗微生物部分是抗细菌的。
7.根据任一项前述权利要求所述的氮化金属表面，其中所述分子或其抗微生物部分是肽。
8.根据权利要求7所述的氮化金属表面，其中所述肽或其抗微生物部分来源于防卫素。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的氮化金属表面，其中所述肽或其抗微生物部分包含以下或由以下组成：防卫素肽序列或其片段或变体。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的氮化金属表面，其中所述肽具有至少6个氨基酸。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的氮化金属表面，其中所述肽包含选自精氨酸(R)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)或其任何组合的至少3个氨基酸。
12.根据权利要求7-11中任一项所述的氮化金属表面，其中所述肽包含以下序列中的任一种或者由以下序列中的任一种组成：RRYIGRGYIRR，RLYLRIGRR，CRVRGGRCA，RRRRRR，RRRRRRGALAGRRRRRRGALAG，GRRRRRRGALAGRRRRRRGALAG或KKKKKKGALAGKKKKKKGALAG。
13.根据任一项前述权利要求所述的氮化金属表面，其中所述金属是铁、钢、钛、铝、铬或钼，或其合金。
14.根据任一项前述权利要求所述的氮化金属表面，其中用具有不同抗微生物部分的两种以上不同的分子对所述表面进行功能化。
15.包含根据权利要求1至14中任一项所述的氮化金属表面的物品。
16.根据权利要求15所述的物品，其中所述氮化金属表面构成所述物品的表面的一部分或全部。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的物品，其中所述物品是以下物品或者形成以下物品的一部分：操作台、椅子、写字台或桌子、门、把手、栏杆、小键盘或医疗装置。
18.用于制备根据权利要求1至14中任一项所述的氮化金属表面的方法，所述方法包括使氮化金属表面与分子接触以在所述分子的结合基团与所述表面中的氮原子之间形成共价键，从而将所述分子固定在所述金属表面上。
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