CN104918492A - 抗微生物涂覆组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于涂覆制品的抗微生物涂覆组合物,包含:抗微生物肽和结合至所述抗微生物肽的纳米颗粒,其中,所述组合物适于结合至所述制品的表面。所述组合物可以用作医疗器械和实验室表面的涂覆组合物。
Description
技术领域
本公开的主题涉及用于涂覆制品的抗微生物涂覆组合物(coatingcomposition),包含:抗微生物肽;结合至所述抗微生物肽的纳米颗粒,其中,组合物适于结合至制品的表面。所述组合物可以用作医疗器械和实验室表面的涂覆组合物。
背景技术
由于金属纳米颗粒的独特表面等离子体共振(SPR)性能、稳定性、生物相容性、容易合成、以及表面功能化,因此已经对它们用于生物传感器、药物递送、抗微生物材料、以及其他生物医学应用进行了广泛研究1。在关于具有较宽抗微生物谱的抗微生物金属纳米颗粒制备的文献中可得到数个报导2,3。这些方法包括包含合成纳米颗粒、表面功能化和封端抗微生物材料的多个步骤,或合成具有抗微生物性能的纳米颗粒的一锅法(onepot method)3。然而,由于这些纳米材料分布广泛并且不加选择暴露一段时间,因此存在细菌可以采取针对它们的耐受性的可能性,这引起了全世界公众健康关注。大量研究已经记录了通过多种机制,针对纳米银和纳米氧化铝的细菌不同菌株的耐受性4。事实上,这种耐受性还可以影响细菌针对其他种类抗微生物剂的耐受性4。此外,这些纳米颗粒对人类细胞的毒性取决于尺寸、形状、功能性、以及剂量,并且没有详细研究由这些颗粒诱导的代谢反应和免疫反应5。
对于开发具有不会触发细菌耐受性和人类细胞毒性的性能的抗微生物纳米颗粒,存在迫切需要。随后描述的抗微生物肽(AMP)是满足这些标准的一类具有前景的分子,这是因为它们的作用方式以及它们代表新一代的抗生素。近来,已经将自组装AMP纳米颗粒、负载在碳水化合物纳米颗粒上的AMP、以及与银纳米颗粒结合的AMP用作有效的抗微生物剂6。通过蛋白水解降解可以减弱AMP的抗微生物活性,并且因此,已经合成了具有不同链长的各种AMP类似物,以防止降解7。另一方面,纳米颗粒表面上的肽封端是可替代的方法,以阻止它们蛋白水解降解4f,8。已经将具有不同生物学性能的肽用于在合成步骤过程中结合金纳米颗粒,用于它们潜在的生物学应用9。此外,使用用于合成金属纳米颗粒的选择技术如噬菌体、细胞表面、以及酵母展示,已经合成了工程化肽10。这些肽不仅特异性并且强烈地结合至一定范围的不同金属、半导体、氧化物、以及生物矿物表面,而且精确地控制从原子开始矿物化的无机纳米颗粒的形状和尺寸10。然而,关于肽如何控制纳米颗粒的形态和尺寸的机理,出现了多个问题。如果将更好地理解合成机理,生物学上重要的肽可以用于合成用在生物催化、成像、健康、以及治疗中的数个应用的先进材料。就我们所知,尚未对使用AMP合成抗微生物的以及生物相容的金纳米颗粒作出努力。
此外,植入物和生物医疗器械相关感染在患者中非常常见,这对医疗和卫生保健行业造成严峻的挑战。经常实践利用新植入物除去和替换植入物,这确实是膨胀过程(expansive procedure)。形成在植入物表面上的生物膜保护微生物免受常规施用抗生素和来自人体的免疫反应。除此之外,抗生素暴露较长时间可以促进抗生素抗性表型的发展,这导致在不存在有效医学治疗下对于控制感染的破坏性影响。使用抗生素(Rai,A.;Prabhune,A.;Perry,C.C.J.Mater.Chem.2010,20,6789.b)Shukla,A.;Avadhany,S.N.;Fang,J.C.Hammond,P.T.Small 2010,21,2392.c)Hanna,H.;Benjamin,R.;Chatzinikolaou,I.;Alakech,B.;Richardson,D.;Masfield,P.;Dvorak,T.;Munsell,M.F.;Darouiche,R.;Kantarjian,H.;Raad,I.J.Clin.Oncol.2004,22,3263.d)Aumsuwan,N.;McConnell,M.S.Urban,M.W.Biomacromol.2009,10,623)、季铵盐(Lee,S.B.;Koepsel,R.R.;Morley,S.W.;Matyjaszewski,K.;Sun,Y.;Russell.A.J.Biomacromol.2004,5,877.b)Murata,H.;Koepsel.R.R.;Matyjaszewski,K.;Russell,A.J.Biomater.2007,28,4870)、苯酚衍生物(Chung,D.;Papadakis,S.E.;Yam,K.L.Int.J.FoodSci.Technol.2003,38,165)、氧化钛(Fu,G.;Vary,P.S.;Lin,C-T.J.Phys.Chem.B 2005,109,8889.b)Matsunaga,T.;Tomoda,R.;Nakajima,T.;Nakamura,N.;Komine,T.Appl.Environ.Microbiol.1988,54.1330)、以及重金属如银(Silver,S.Ferns Microbiol.Rev.2003,27,341.b)Atiyeh,B.S.;Costagliola,M.;Hayek,S.N.;Dibo,S.A.Burns 2007,33,139.c)Dowling,D.P.;Donnelly,K;McConnell,M.L;Eloy,R..;Arnaud,M.N.Thin Solid Films2001,398,602)、以及锡衍生物(Omae,I.Appl.Organomet.Chem.2003,17,81)已经开发了各种共价涂层和非共价涂层,以对抗微生物感染,然而,利用这些涂层以达到具有较小细胞毒性作用的有效抗微生物表面,存在有限的成功。这些技术的另一个缺点在于:在频繁使用之后,微生物可能将发展对抗这些涂层的耐受性(Page,K;Wilson,M.;Parkin,I.P.J.Mater.Chem.2009,19,3819)。因此,对于开发具有宽谱抗微生物活性(其不仅杀死微生物和阻止生物膜生长而且还对细菌对抗涂层耐受性的发展具有较小影响)用于生物医学植入物的强劲涂层(robust coating),存在日益增长的兴趣。
如之前所述,抗微生物肽(AMP)、非经典药物可替代其他抗微生物药物,这是因为它们的宽谱抗微生物活性和调节免疫反应的能力以及对宿主细胞无毒性((a)Onaizi,S.A.;Leong,S.S.J.Biotechnol.Adv.2011,29,67.b)Costa,F.Carvalho,I.F.Montelaro,R.C.Gomes,P.;Martins,C.L.ActaBiomaterialia 2011,7,1431.c)Andreu,D.;Rivas,L.Biopolym.1998,47,4and Hilpert,K;Elliott,M.;Jenssen,H.;Kindrachuk,J.;Fjell,C.D.;Korner,J.;Winkler,D.F.H.;Weaver,L.L;Henklein,P.;Ulrich,A.S.;Chiang,S.H.Y.;Farmer,S.W.;Pante,N.;Volkmer,R.;Hancock,R.E.W.Chem.Biol.2009,16,58)Reddy,K.V.;Yedery,R.D.;Aranha,C.Int.J.Antimicrob.Agents 2004,24,536.)。AMP较短(15-50个氨基酸),在性质上是净正电荷具有较大变化的高度阳离子性,并且具有采用两亲结构的趋向((a)Onaizi,S.A.;Leong,S.S.J.Biotechnol.Adv.2011,29,67.b)Costa,F.Carvalho,I.F.Montelaro,R.C.Gomes,P.;Martins,C.L.Acta Biomaterialia 2011,7,1431.c)Andreu,D.;Rivas,L.Biopolym.1998,47,4and Hilpert,K;Elliott,M.;Jenssen,H.;Kindrachuk,J.;Fjell,C.D.;Korner,J.;Winkler,D.F.H.;Weaver,L.L;Henklein,P.;Ulrich,A.S.;Chiang,S.H.Y.;Farmer,S.W.;Pante,N.;Volkmer,R.;Hancock,R.E.W.Chem.Biol.2009,16,58and Reddy,K.V;Yedery,R.D.;Aranha,C.Int.J.Antimicrob.Agents 2004,24,536;以及a)Perron,G.G.;Zasloff,M.;Bell,G.Proc.Biol.Sci.2006,273,251.b)Van't Hof,W.;Veerman,E.C;Helmerhost,E.J.;Amerongen,A.V.Biol.Chem.2001,382,597)。近年来,在不同表面上AMP涂层(同时维持它们的活性)的文献中已经报导了许多策略如物理(一层一层地组装(layer by layer assembly))((a)Etienne,O.;Gasnier,C;Taddei,C;Voegel,J-C;Aunis,D.;Schaaf,P.Metz-Boutigue,M-H.;Bolcato-Bellemin,A-L;Egles,C.Biomater.2005,26,6704.b)Etienne,O.;Picart,C;Taddei,C;Haikel,Y.;Dimarcq,J.L;Schaaf,P.;Voegel,J.C;Ogier,J.A.;Egles,C.Antimicrob.Agents Chemother.2004,48,3662)和共价固定方法((a)Bagheri,M.;Beyermann,M.;Dathe,M.A.Antimicrob.Agents Chemotherap.2009,53,1132.b)Haynie,S.L.;Crum,G.A.;Doele,B.A.Antimicrob.Agents Chemotherap.1995,39,301.c)Ferreira,L;Zumbuehl,A J.Mater.Chem.2009,19,7796)。已经研究了包括间隔物类型、长度和柔性、以及AMP的取向和浓度的不同参数对于固定肽活性的影响,以开发高效、安全、以及持久的抗微生物植入物和设备((a)Onaizi,S.A.;Leong,S.S.J.Biotechnol.Adv.2011,29,67.b)Costa,F.Carvalho,I.F.Montelaro,R.C.Gomes,P.;Martins,C.L.Acta Biomaterialia 2011,7,1431.c)Andreu,D.;Rivas,L.Biopolym.1998,47,4and Hilpert,K;Elliott,M.;Jenssen,H.;Kindrachuk,J.;Fjell,C.D.;Korner,J.;Winkler,D.F.H.;Weaver,L.L;Henklein,P.;Ulrich,A.S.;Chiang,S.H.Y.;Farmer,S.W.;Pante,N.;Volkmer,R.;Hancock,R.E.W.Chem.Biol.2009,16,58and Reddy,K.V;Yedery,R.D.;Aranha,C.Int.J.Antimicrob.Agents 2004,24,536.,and a)Perron,G.G.;Zasloff,M.;Bell,G.Proc.Biol.Sci.2006,273,251.b)Van't Hof,W.;Veerman,E.C;Helmerhost,E.J.;Amerongen,A.V.Biol.Chem.2001,382,597and a)Bagheri,M.;Beyermann,M.;Dathe,M.A.Antimicrob.AgentsChemotherap.2009,53,1132.b)Haynie,S.L.;Crum,G.A.;Doele,B.A.Antimicrob.Agents Chemotherap.1995,39,301.c)Ferreira,L;Zumbuehl,A J.Mater.Chem.2009,19,7796and a)Humblot,V;Yala,J-F.;Thebault,P.;Boukerma,K;Hequet,A.;Berjeaud,J-M.;Pradier,C-M.Biomater.2009,30,3503.b)Gao,G.;Yu,K;Kindrachuk,J.;Brooks,D.E.;Hancock,R.E.W.;Kizhakkedathu,J.N.Biomacromol.2011,12,3715.c)Gabriel,M.;Nazmi,K.;Veerman,E.C;Amerongen,A.V.N.;Zentner,A.Bioconj.Chem.2006,17,548.d)Hilpert,K.;Elliott,M.;Jenssen,H.;Kindrachuk,J.;Fjell,C.D.;Korner,J.;Winkler,D.F.H.;Weaver,L.L;Henklein,P.;Ulrich,A.S.;Chiang,S.H.Y.;Farmer,S.W.;Pante,N.;Volkmer,R.;Hancock,R.E.W.Chem.Biol.2009,16,58.e)Steven,H.D.;Hotchkiss,J.H.J.Appl.Polym.Sci.2008,110,2665.f)Appendini,P.;Hotchkiss,J.H.J.Appl.Polym.Sci.2001,81,609.g)Cho,W.M.;Joshi,B.P.;Cho,H.;Lee,K.H.Bioorg.Med.Chem.Lett.2007,17,5772)。就我们所知,除了其中在钛表面上与聚合物刷(polymer brush)结合的AMP示出了优异的体内抗微生物活性的一个研究,尚未进行多个研究用来证明在人类血清存在下固定AMP的抗微生物活性(Gao,G.;Lange,D.;Hilpert,K;Kindrachuk,J.;Zou,Y.;Cheng,J.T.J.;Kazemzadeh-Narbat,M.;Yu,K;Wang,R.;Straus,S.K;Brooks,D.E.;Chew,B.H.;Hancock,R.E.W.;Kizhakkedathu,J.N.Biomater.2011,32,3899)。
本发明的实施方式之一是开发在存在人类血清下,在具有抗微生物活性下在各种表面上抗微生物肽(AMP)强劲涂层(robust coating)的技术。杀菌肽-蜂毒素(Cecropin-mellitin)(CM)是存在的抗微生物肽,其中,选择C端的半胱氨酸以固定在金纳米颗粒涂覆的玻璃表面和钛表面上。CM肽是具有15个氨基酸长度、包含来自杀菌肽-A和蜂毒素抗微生物肽的序列的杂合抗微生物肽。胱胺和硫醇-PEG-胺用于使表面功能化,以研究两种分子的链长和柔性(flexibility)对系连CM肽的抗微生物活性的影响。与其他报导方法((b)Gao,G.;Yu,K;Kindrachuk,J.;Brooks,D.E.;Hancock,R.E.W.;Kizhakkedathu,J.N.Biomacromol.2011,12,3715.c)Gabriel,M.;Nazmi,K;Veerman,E.C;Amerongen,A.V.N.;Zentner,A.Bioconj.Chem.2006,17,548and Gao,G.;Lange,D.;Hilpert,K;Kindrachuk,J.;Zou,Y.;Cheng,J.T.J.;Kazemzadeh-Narbat,M.;Yu,K;Wang,R.;Straus,S.K;Brooks,D.E.;Chew,B.H.;Hancock,R.E.W.;Kizhakkedathu,J.N.Biomater.2011,32,3899and Kazemzadeh-Narbat,M.;Kindrachuk,J.;Duan,K.;Jenssen,H.;Hancock,R.E.W.;Wang,R.Biomater.2010,31,9519)相比,将每平方厘米大量CM肽(1.02mg/cm2)固定在硫醇-PEG-胺功能化的表面上。系连在胱胺功能化表面上的小量CM肽起抑菌作用,而系连在胱胺或硫醇-PEG-胺功能化表面上的大量起杀菌作用,这由AFM分析支持。系连在金纳米颗粒涂覆的钛表面上的CM肽在人类血清存在下维持了抗微生物活性,具有优异的可复用性,持续了五个循环。
发明内容
所公开的主题涉及用于涂覆制品的抗微生物涂覆组合物,包含:抗微生物肽;结合至所述抗微生物肽的纳米颗粒,其中,组合物适于结合至制品的表面。所述组合物可以用作医疗器械和实验室表面的涂覆组合物。
本发明主题的一种实施方式涉及用于涂覆制品的抗微生物涂覆组合物,包含:抗微生物肽和结合至所述抗微生物肽的纳米颗粒,其中,组合物适于结合至制品的表面。
在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中,纳米颗粒可以是金属纳米颗粒或由金属层覆盖的纳米颗粒,优选地,所述纳米颗粒具有10-100nm,优选地,15-50nm,更优选地,20-30nm之间的尺寸。
在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中,抗微生物肽可以在C端具有半胱氨酸,优选地,抗微生物肽模拟物、AMP的小分子模拟物。
在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中,抗微生物肽可以选自下组:杀菌肽-蜂毒素(cecropin-mellitin)、爪蟾抗菌肽(magainin)、皮抑菌肽(dermaseptin)、导管素(cathelicidin)、防卫素(defensin)、蛋白整合素(protegrin)、本领域技术人员将意识到的其他物质。
在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中,组合物可以进一步包含粘合剂,优选地,分子,更优选地,聚合物,甚至更优选地,可以是聚阳离子或聚阴离子。在一种优选的实施方式中,所述聚合物可以是聚多巴胺。
在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中,粘合剂可以通过加热结合至制品的表面。
在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中,通过使用抗微生物肽作为模板可以获得纳米颗粒。
在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中,组合物可以进一步包含缓冲剂,优选地选自下组:TAPS、Bicine、Tris、Tricine、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、甲次砷酸盐(Cacodylate)、SSC、MES。
在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中,组合物可以进一步包含防污剂作为间隔物,优选PEG。
在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中,抗微生物肽浓度可以在0.5mM至1mM之间,优选地,在0.20mM至0.10mM之间。
在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中,金属纳米颗粒可以是金、钛、银、或它们的混合物。
在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中,其可以用于医药,优选利用描述的抗微生物组合物涂覆制品。更优选地,所述制品是医疗器械,甚至更优选地,所述医疗器械是植入物、压舌器、医学温度计、血糖仪、医用机器人、微晶片植入物、手术工具、或神经假体(neuroprosthesis)。
另一个方面涉及利用描述的抗微生物涂覆组合物来涂覆制品的方法,包括以下步骤:
■加热包含氯金酸的水溶液;
■添加柠檬酸钠,并且加热混合物;
■清洗制品;
■将制品浸渍在包含抗微生物肽的溶液中用于使制品功能化;
■使功能化制品沉浸在所述加热的混合物中。
附图说明
落在权利要求范围下的附图体现了本公开主题的实施方式,所有其他是参考图。
图1:在CMC肽存在下在HH(A)、HW(B)、和WH(C)、以及WW(D)条件下合成的金纳米颗粒的时间依赖紫外-可见光谱。
图2:在CMC肽存在下使用200HEPES(A)以及在CM肽存在下使用100mM HEPES(B)合成的金纳米颗粒的时间依赖紫外-可见光谱。(C)在不存在肽下(曲线1)、在0.25mM半胱氨酸存在下(曲线2)、以及在0.25mM半胱氨酸和CM肽存在下(曲线3),使用100HEPES合成的金纳米颗粒的紫外可见光谱。(D)在pH 5(曲线1)、pH 6(曲线2)、以及pH 7.5(曲线3)下,使用100mM HEPES在CMC肽存在下合成的金纳米颗粒的紫外-可见光谱。
图3:在CMC肽存在下,在HH(A)、HW(B)、WH(C)条件下使用100mM HEPES以及(D)在HH条件下使用200mM HEPES合成的金纳米颗粒的代表性TEM图。(E)在不存在肽下使用100mM HEPES合成的金纳米颗粒的TEM图。(F)在存在CM肽下使用100mM HEPES缓冲液合成的金纳米颗粒的TEM图。
图4:在半胱氨酸(A)以及半胱氨酸和CM肽(B)存在下,使用100mM HEPES缓冲液合成的金纳米颗粒的代表性TEM图。在CMC肽存在下,在pH 5(C)和pH 6(D)下使用100mM HEPES合成的金纳米颗粒。
图5:(A)在不存在CMC肽(曲线1)下,以及在存在CMC肽在WH(曲线2)、HW(曲线3)、以及HH(曲线4)条件下合成的金纳米颗粒的TGA分析。(B)CMC肽(曲线1)和在HH(曲线2)、HW(曲线3)、WH(曲线4)下合成的金纳米颗粒的FTIR分析。图5B曲线5相应于在不存在CMC肽下使用HEPES缓冲液合成的金纳米颗粒的FTIR光谱。Au NPs针对大肠杆菌(C)和金黄色葡萄球菌(D)合成的CMC肽的不同量的抗微生物活性。
图6:(A)在利用10%的人类血清(曲线2)和1mg/mL的胰蛋白酶(曲线3)温育之后,HH-Au NPs(曲线1)的紫外-可见光谱。图A的插入图示出了硫醇-PEG功能化柠檬酸还原的Au NPs(曲线1)和在用10%的人类血清(曲线2)温育之后的紫外-可见光谱。(B)用人类血清和胰蛋白酶处理的HH-Au NPs以及用针对大肠杆菌的胰蛋白酶处理的CMC肽的抗微生物活性测试。
图7:在HH(A)、HW(B)、以及WH(C)条件下使用100mM HEPES(pH 7.5),以及使用200mM HEPES(pH 7.5)(D),在CMC肽存在下合成的金纳米颗粒的粒径分析。在CM肽(E)、半胱氨酸(F)、以及半胱氨酸和CM肽(G)存在下合成的金纳米颗粒的粒径分析。在pH 5(H)和pH 6(I)下,使用100mM HEPES在CMC肽存在下合成的金纳米颗粒的粒径分析。
图8:在pH 5下在CMC肽存在下合成的金纳米颗粒的代表性低放大TEM图像(A)和高放大TEM图像(B)。
图9:不同浓度CMC肽针对大肠杆菌的抗微生物活性测试。
图10:针对大肠杆菌储存不同时期的HH-Au NPs的抗微生物活性以及可复用性的研究。
图11-(A)金纳米颗粒溶液的紫外-可见光谱,(B)使用柠檬酸盐方法合成的金纳米颗粒的TEM图像,(C)金纳米颗粒涂覆的玻璃表面的AFM图像。
图12-(A)在不同的温育时间下,在胱胺和硫醇-PEG-胺涂覆的表面上胺基的定量,(B)在金纳米颗粒涂覆的表面(曲线1),胱胺(曲线2)、硫醇-PEG-胺(曲线3)、胱胺-磺基GMBS(曲线4)、以及硫醇-PEG-胺-磺基GMBS(曲线5)功能化的金涂覆的表面上固定的CM肽的评价。
图13-针对大肠杆菌(A和B)和金黄色葡萄球菌(C和D),涂覆在CS表面和NS表面上的CM肽的抗微生物活性。
图14-用CM肽固定的NS(A)表面、CS(B)表面和对照(大肠杆菌已经在溶液中生长)处理的大肠杆菌的代表性高度模式(height mode)AFM图像。相模式(phase mode)图像(D-F)和相应高度模式图像(A-C)的横截面分析(cross sectional analyse)(G-I)。
图15-(A)在Au NP涂覆的表面上随机附着的CM肽的抗微生物活性。(B)附着在不同比率的硫醇-PEG-胺和硫醇-PEG-酸修饰的Au NP表面上的CM肽的抗微生物活性。(C)附着在N:C 1:1修饰的Au NP涂覆的Ti表面上的CM肽的抗微生物活性。(D)附着在N:C 1:1修饰的Au NP涂覆的Ti表面上的CM肽的可复用性研究。
图16-可溶的CM肽对人真皮成纤维细胞(NDHF)(7A)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(7B)细胞毒性的影响。*p<0.05。
具体实施方式
本发明涉及用于涂覆制品的抗微生物涂覆组合物,包括抗微生物肽;结合至所述抗微生物肽的纳米颗粒;其中,所述组合物适于结合至制品的表面。
更优选地:纳米颗粒适合于通过加热结合至制品的表面,或组合物进一步包括用于粘合组合物至制品表面的粘合剂。
在本发明的主题中,使用实验和分子模型方法在环境条件下研究抗微生物肽(例如:杀菌肽蜂毒素)和缓冲液(例如:HEPES-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))浓度,缓冲液pH和肽链对于金纳米颗粒形成过程的影响。在C-末端处具有和不具有半胱氨酸的杀菌肽蜂毒素(CM)肽用于金纳米颗粒的合成。发现半胱氨酸残基的巯基在经由消化成熟(digestive ripening)和表面反应方法控制金纳米颗粒的大小和形态中起关键作用。在人血清存在下,在100μg/mL的MIC范围内,CM肽封端的金纳米颗粒具有杀死革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的优异性能,连同对于蛋白酶降解的抗性以及与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和正常人真皮成纤维细胞(NDHF)(最高达100μg/mL的浓度)的生物相容性。
此外,细菌克隆和随后的感染被认为是生物医学植入物失败的一个主要原因。有几种涂覆方法,其使用抗生素、季铵盐、聚阳离子和光敏剂抗微生物材料,但是由于较小的抗微生物活性和更多的细胞毒性作用,它们中没有一个成功。在本发明中,描述了使用杀菌肽-蜂毒素(CM)肽在金纳米颗粒涂覆的玻璃和钛表面上的牢固(robust)涂覆步骤。使用双接头(bilinker)磺基-GMBS,将CM肽共价接枝在胱胺和硫醇-PEG-胺官能化的表面上,同时维持其较强的抗微生物活性。在胱胺-磺基GMBS官能化的表面上少量的系连CM肽起抑菌作用,而在两种表面上大量系连的CM肽起杀菌作用。在20%的人血清存在下,在硫醇-PEG-胺和硫醇-PEG-酸的二元自组装单层上系连的CM肽具有较强的抗微生物活性,同时具有优异的可再用性(最高达5个循环)。
纳米颗粒制备和表征
材料
原样使用HAuC14.3H2O、NaH2PO4、Na2HPO4(优选地,Sigma-Aldrich)和HEPES(优选地,Anal Chem)。具有半胱氨酸(KWKLFKKIGAVLKVLC)和不具有半胱氨酸(KWKLFKKIGAVLKVL)的杀菌肽蜂毒素肽,优选地来自于Caslo实验室,丹麦。人血清AB,优选地,来自于Invitrogen。
方法
0.5mM的CMC肽(具有半胱氨酸的杀菌肽蜂毒素肽)和CM(不具有半胱氨酸的杀菌肽蜂毒素)肽最初溶解在50μL的DMF中,跟着添加950μL的HEPES(100mM,pH 7.5)或milli-Q水。在肽溶液(0.25μM)中添加金离子以获得0.5μM的最终金浓度(在25℃下在用于合成金纳米颗粒的不同条件下)(表SI 1):
表SI1:在CMC肽存在下用于合成金纳米颗粒的不同条件。
优选地,使用BioTek synergy MX酶标仪记录时间依赖的UV-vis光谱以监测金离子的还原。金纳米颗粒还可以使用具有相似浓度的金离子不具有肽的HEPES合成。为了理解硫醇基团的作用,在HH条件下,将溶解在HEPES中的0.25mM半胱氨酸添加在含有金离子(0.5mM)和HEPES(100mM)或金离子、HEPES和CM肽(0.25mM)的还原溶液中。在Jeol上进行金纳米颗粒样品的透射电子显微镜(TEM)测量,使用Image J软件测量最少(minimum)100个纳米颗粒用于粒子粒径分析。
所合成的金纳米颗粒溶液在14000rpm下离心,接着利用mill-Q水洗涤以除去未反应的肽和HEPES。离心得到的金纳米颗粒冷冻并在冰箱内在223K下干燥(使用…)。在N2气体存在下,以10℃/min的加热速率使用30-600℃的温度范围进行肽封端金纳米颗粒和不使用肽合成的金纳米颗粒的热重分析(TGA)。优选地使用JASCO分光光度计(4cm-1分辨率和64次扫描)通过FTIR光谱分析以ATR模式分析在金纳米颗粒表面上的肽结合。优选地,在室温下使用Brukerheaven仪器测量在离心和再分散在HEPES中之后合成的金纳米颗粒的Zeta(ζ)电位。
抗微生物活性测试:
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在37℃培养并维持在LB平板(优选地,具有1.5%琼脂的Luria-Bertani肉汤)上。细菌还生长于LB培养基中在37℃下过夜并且通过OD600测量定量细胞计数。在10%的人血清存在下,将不同量的肽封端的金纳米颗粒、肽(5-10μg/mL)和HEPES还原的金纳米颗粒(10μg/ml)添加至细菌悬浮液(105细菌/mL)并且在37℃下培养4小时。每隔2小时从相应悬浮液中取出100μL等分部分并在PBS缓冲液中稀释以获得103细菌/mL,铺在LB琼脂平板上,随后在37℃下培养。24小时温育后计数菌落。在另一个实验中,利用1mg/mL的mPEG-硫醇(5kD)官能化柠檬酸还原的金纳米颗粒。如前所述(11)使用柠檬酸合成金纳米颗粒。PEG和CMC肽涂敷的金纳米颗粒与10%的人血清在4℃下温育2小时,接着在14000rpm下离心以除掉游离的人血清。类似地,为了研究蛋白酶降解,CMC涂敷的金纳米颗粒和裸露CMC肽利用1mg/mL胰蛋白酶(磷酸盐缓冲液pH8)在37℃处理2小时。在反应2小时后,纳米颗粒溶液进行离心以除去胰蛋白酶。针对大肠杆菌,利用人血清和胰蛋白酶处理的肽封端的金纳米颗粒进行抗微生物试验。
结果:
在25℃下使用HEPES缓冲液(100mM和pH7.5)和杀菌肽蜂毒素(CMC)肽(0.25mM)在不同条件下(HH,HW,WH和WW)下合成的金纳米颗粒的生长动力学,紧接着UV-Vis光谱。图1示出了作为反应时间函数合成的金纳米颗粒溶液的UV-Vis光谱。UV-Vis谱图清楚地显示了对于所有条件在反应7天后在530nm处的较强的表面等离子体共振(SPR)带(图1A-C)。在530nm处的SPR带表示在所有条件下合成具有介于9-14nm的尺寸的球形金纳米颗粒(图3A-C)。与HW和WH条件相比(其中在第9天达到饱和),在HH条件中金离子还原速度是更快的,其中在7天达到饱和(图1A-C)。通过过量的HEPES还原金离子,导致在所有条件下在2天后溶液的外观从浅黄色到粉红色。在反应的初始阶段,通过静电和/或配位相互作用CM肽的硫醇基与Au(0)原子形成复合物,导致核形成和随后纳米颗粒生长的延迟9a,9c。这种现象可以通过表面反应的抑制来解释,其作为生长限制步骤,其中,CMC肽-Au(0)复合物延缓了与金离子形成核的表面反应9c,12。这里值得注意的是,扩散限制机制与我们的情况(如通过使用HEPES和肽形成单分散的金纳米颗粒的其他方式所支持的)不相关9a,b,12。如果存在这种机制,由于与100mM HEPES的情况相比,大量的N-中心阳离子基团的存在,较高浓度的HEPES将以更快的速率合成金纳米颗粒。有趣的是,利用200mM HEPES没有观察到金离子还原速率(7天)与SPR带位置(530nm)的改变,这解释了核的表面反应性控制生长速率(图2A)。反应溶液中游离的Au(0)、肽和肽-Au(0)复合物的临界浓度在控制纳米颗粒生长和尺寸中是关键决定因素。例如,当在HH条件中利用恒定浓度的金离子(0.5mM)分别在0.25mM以上(如0.5和1mM)或以下(如0.20和0.10mM)改变肽浓度时,在反应溶液中没有发现合成和聚结。此外,通过肽的巯基催化的尺寸聚焦(size focusing)和消化成熟(digestive ripening)方法对于颗粒尺寸的降低和长反应时间(7天)13的多分散性具有显著的贡献(如随着时间推移由宽至窄的SPR带转化所反映的)(图1A-C)。对于这个观察的支持性证据是通过在不同条件(具有100mM的HEPES的HH,HW和WH)下合成的纳米颗粒的TEM分析获得。TEM和颗粒尺寸分析显示,对于所有的条件,球形金纳米颗粒的尺寸大约是9-14纳米,尽管也观察到了较大纳米颗粒(20-25nm)的小集合(图3A-C和7A-C)。类似地,使用200mM的HEPES合成平均尺寸13nm的球形金纳米颗粒(图3D)。相反,单独的肽(在WW条件中不具有HEPES)不能还原金离子(图1D)甚至在反应的9天后,说明HEPES和肽分别充当还原剂和封端剂(9a-c)。在没有肽的情况下,通过HEPES在30min内快速还原金离子并且SPR带中心在740nm,还如其他人员观察到的(曲线1,图2C)14。以前已经详细研究了HEPES分子的氧化还原机制,其中,在通过金离子氧化HEPES的N取代的哌嗪环后,形成N中心的阳离子游离基团(free radical)。
为了理解在纳米颗粒形成过程中肽链的作用,不具有硫醇基团的相同序列的肽(CM肽)用于金纳米颗粒的合成。在HH条件中金纳米颗粒的合成是相对快的,还原在2天内饱和,尽管在反应12hr后开始出现红色溶液(图2B)。UV-Vis光谱显示出在530nm处的SPR带类似于使用CMC肽合成的金纳米颗粒(图1和2B)。TEM图像和粒度分析显示多分散的球形金纳米颗粒尺寸范围从8至35nm(图3F和7E)。对于CMC和CM肽,金纳米离子的尺寸的不同的分散性是分别与它们与Au(0)的不同的界面结合强度和消化成熟过程的存在和不存在相一致。由于CM肽通过金-胺相互作用适度钝化Au(0),表面反应的延迟是温和的并且它仅稍稍减慢生长速率,但是没有螯合足够量的Au(0)以形成肽-Au(0)复合物以显著地改变核形成速率。HEPES分子迅速地将金离子转变为Au(0),所以在反应溶液中Au(0)的初始浓度是较高的。多分散的金纳米颗粒的生长经由多步生长机制发生。在肽存在下,小的纳米颗粒首先形成在溶液中,这限制生长至低于12nm并且产生这种群体的窄尺寸分布。较大的金纳米颗粒可以通过较小的纳米颗粒聚结(如通过其它文献建议的(15))形成。可替代地,大多数肽在较小的纳米颗粒表面上吸附;根据通过较少的肽在它们上施加的时间和尺寸,较大的纳米颗粒(30nm)可以生长,具有较小的限制。此外,由于在CM肽中硫醇基团的缺乏,多分散性是不发生消化成熟过程的表示。
实际上,当半胱氨酸(0.25mM)添加至含有HEPES和金离子不具有肽的溶液中,观察到金纳米颗粒的合成是迅速的(30min),类似于不具有半胱氨酸的反应(曲线1和2,图2C)。然而,SPR带位置显著蓝移至530nm并且相比于不使用半胱氨酸形成的多分支的金纳米颗粒,合成平均尺寸13nm的球形金纳米颗粒(图3E和4A)。在另一种情况下,当类似摩尔浓度的半胱氨酸添加至含有0.25mM CM肽的反应溶液中时,HEPES分子的还原能力几乎是延迟的;在反应9天后,当合成平均尺寸17nm的球形金纳米颗粒后观察到较弱的且较宽的SPR带(曲线3、图2C和图4B)。这些数据表明硫醇基团优先结合至在溶液中形成的金核的表面,紧接着结合肽而不是过量的HEPES。硫醇基团不影响通过HEPES的金离子还原,但是硫醇和肽的组合作用在控制纳米颗粒的生长速率、尺寸和形状中发挥重要的作用,其与使用CMC肽的前面的结论相符(图3和4)。
HEPES缓冲液的pH也影响了纳米颗粒的还原速率和尺寸。反应溶液变化的pH改变CMC肽的电荷和金离子的物种形成,其显著影响肽对Au(0)的亲和力,导致在反应溶液中肽-Au(0)复合物与游离的Au(0)的临界浓度的不成比例的比率。随着HEPES缓冲液pH降低,分别对于PH 6和5,金离子的还原时间显著改变至24hr并且最后至1小时(图2D)。另一方面,在1hr的反应内在高于PH 7.5时(pH8和9)观察到金纳米颗粒的聚结(数据未显示)。相比于pH 7.5,对于pH 5和6,UV-vis光谱显示出金纳米颗粒的SPR带红移至540nm(图2D)。在SPR带中的红移是金纳米颗粒尺寸增加的表征。这个结果与TEM的分析结果是一致的,其显示出,分别对于pH 5和6平均尺寸17nm和35nm的纳米颗粒的合成(图4C、D和7H、I)。TEM图像清楚地显示由于在25℃下在限制的反应时间(分别1和24hr)中消化成熟过程的缺乏,在pH 5和6下大群体的多种形状的(multi-shaped)(三角形、六边形和随机的)金纳米颗粒的形成(图4C、D和8)。在90min内在沸腾条件下使用烷硫醇,消化成熟过程用于将多分散的和棱柱形(prismatic)纳米颗粒转化成窄尺寸分布的球形纳米颗粒(16)。在比较获得数据与来自于以前文章的结果(9a-c,17)之后,HEPES/肽的浓度和使用不同的肽合成金纳米颗粒的反应溶液的pH方面不存在实验基线。
执行在不同的条件中合成的金纳米颗粒的热重分析(TGA)以获得肽含量的定量信息。在30-240℃的温度区域中最初的2至8%重量损失是由于水分子从样品中解吸附作用(图5A)。在多个不同的步骤中对于HEPES还原的金纳米颗粒发现26%的重量损失直到480℃(最初逐步的随后在更高温度下快速损失)。在肽封端的金纳米颗粒样品的情况下,存在快速的重量损失直到400℃(对于分别在HH,HW和WH条件中合成的金纳米颗粒55、43和38%的质量降低)(图5A)。重量损失中的变化是由于这样的事实,即相比于其它条件,在HH条件下合成的大量金纳米颗粒消耗大量的肽,导致改变纳米颗粒表面上肽的密度(表1)。纳米颗粒的数量使用通过Haiss等人提出的等式计算(18)。结合至每个纳米颗粒的肽的数量是使用如前所述的热重分析测定(9d,19)。在所有条件下合成的金纳米颗粒的表面电荷是正电荷(+28±2mV),类似天然肽(+23±1mV),证实在纳米颗粒的表面上的CMC肽的存在和纳米颗粒溶液的胶体稳定性(表1):
条件 | 纳米颗粒数 | 肽/纳米颗粒 | 肽/nm2 | ζ电势(mV) |
HH | 5.8×1015 | 556 | 1.24 | +28±2 |
HW | 1.1×1015 | 466 | 1.03 | +27.5±2.2 |
WH | 0.98×1015 | 453 | 1.01 | +26.1±1.6 |
表1:在不同条件下合成的金纳米颗粒的数量和表面电荷和肽密度的估算。
为了顺应TGA分析,进行FTIR光谱以分析在金纳米颗粒表面上肽的结合。曲线1,图5B示出了在1623和1650cm-1处特有的胺-I带,对应于CMC肽主要β-折叠和α-螺旋二级结构。CMC肽具有β-折叠和α-螺旋结构的不同比率,取决于氨基酸组成7a,b,20。然而,在金纳米颗粒表面上封端的CMC肽显示出随机螺旋(coil)结构(在1646cm-1处的胺-1带),如在水溶液中AMP定向在随机螺旋结构中(曲线2-4,图5B)7a,20-21。在CMC肽不存在时,对于HEPES合成的纳米颗粒没有发现肽信号(曲线5、图5B),其伴随着纳米颗粒的表面电荷(-33.5mV)。
在膜或促螺旋有机溶剂(helix promoting organic solvent)存在时,CMC肽采用α-螺旋结构,其触使它们用作有效的抗微生物剂20,22。为了验证在HH条件(HH-Au NP)下合成的金纳米颗粒的抗微生物活性,在10%人血清存在下对于不同的孵育时间针对革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性(大肠杆菌)细菌测试HH-Au NP(以模仿体外组织培养条件)。由于肽的高加载,选择在HH条件中合成的金纳米颗粒。用于抗微生物测试的HH-Au NP的量在如以前报道的CMC肽(5μg/mL)的最小抑制浓度(MIC)范围中取得(图9)。当孵育时间增加时,两种细菌的菌落形成单元(CFU)随着HH-Au NP量的增加而降低(图5C和D)。图5C和D示出了在孵育2hr后对于10μg/mL的HH-Au NP溶液未观察到细菌克隆。5μg/mL的HH-Au NP的杀菌活性稍慢一些并且在孵育4hr后发现100%的抗微生物活性。因此,对于两种细菌,HH-Au NP的MIC是10μg/mL。另一方面,甚至在孵育4hr后,10μg/mL的HEPES还原的金纳米颗粒(AuNP)不杀死细菌(图5C和D)。众所周知,PEG修饰的表面防止蛋白质的吸附。PEG层可以提供界面层以防止蛋白质吸附在下面的纳米颗粒的表面上。PEG的这种独特的性质取决于PEG分子的分子量,链长度和界面链密度。HH-Au NP以与PEG涂敷的金纳米颗粒相似的方式起作用以阻止人血清吸附在金纳米颗粒的表面上并且维持抗微生物活性23。为了验证这一假设,HH-Au NP和PEG涂敷的金纳米颗粒(PEG-Au NP)孵育在10%人血清中2小时。相比于未处理的HH-Au NP和PEG-Au NP,对于两种金纳米颗粒,观察到尖的SPR带连同带位置无移位,这表示蛋白质单层没有在纳米颗粒表面上形成(曲线1和2,图6A和图6A的插图)。蛋白亚单层在金纳米颗粒的表面上形成是可能的,利用UV-vis光谱23b未检测到它。在孵育的2hr中,人血清处理的HH-Au NP(10μg/mL)杀死99%的细菌(大肠杆菌)与我们以前的实验一致(图5C、D和6B)。相比于HH-AuNP,甚至使用10μg/mL(其是CMC肽的MIC的两倍)在孵育4hr后在人血清存在下观察到CMC肽降低的活性(图5C和D)。CMC是非常有效的肽以在人血清不存在下在孵育的60min中杀死细菌,表明人血清大大降低了肽的活性(图9)。
高阳离子CMC肽经由静电相互作用首先与细菌膜结合随后肽在与膜接触以后转化成α-螺旋结构,跨越通过脂质双层7e,21-22。在插入时长链肽伸展膜表面以产生孔21,22b。它表明用于形成孔/离子通道的肽和用于产生孔洞的金纳米颗粒的结合动作完全破坏(rapture)细菌膜,其导致细胞内容的泄漏并且最终细胞死亡。与上面动作协同,插入的金纳米颗粒可以结合至细菌的细胞内含物(DNA)并且阻止转录和翻译过程以修复损伤2a,4a。
在生物系统(living system)中发现的裂解蛋白酶,胰蛋白酶会降低AMP从而限制它们成为下一代的抗生素的可能。存在几份报告,其中采用昂贵和繁琐的方法以合成CM肽的不同类似物以防止被胰蛋白酶降解7e,21,24。相反,HH-Au NP对抗1mg/mL胰蛋白酶并且没有迹象表明在孵育2hr后聚结,这可以归因于来自于蛋白酶的肽的纳米颗粒相关保护(曲线3,图6A)4f,8。针对大肠杆菌,没有发现HH-Au NP抗微生物活性的降低,而普通CMC肽被降解并且在胰蛋白酶处理后没有表现出任何抗微生物活性(图6B)。封端至金纳米颗粒的CMC肽的附加益处是它们优异的稳定性和在冷藏条件下维持生物活性6个月(图10)。应当注意,CMC肽单独需要在-20℃贮存以保持其生物活性。除了储存性能,在重复使用5个循环后,HH-Au NP显示出生物活性的轻度降低(图10)。
金纳米颗粒的合成与在载玻片上的涂层
材料
所有化学品(胱胺二盐酸盐、柠檬酸钠、磷酸一钠、磷酸氢二钠、氯化金(III)三水合物、BCA试剂盒),优选地来自于Sigma Aldrich。CM肽,纯度98%,优选地来自于Caslo实验室(Lyngby,丹麦)。硫醇-PEG-胺(1kDa)和硫醇-PEG-酸(1kDa),优选地来自于Creative PEG works(WinstonSalem,北卡罗来纳,美国)。人血清,优选地来自于Invitrogen。用于细菌培养基的所有培养基组分优选地来自于Frilabo,葡萄牙。所有玻璃器皿均用皂溶液清洗,再用王水(1mL的HNO3(15.9M):3mL HCL(12M))清洗并且利用Milli-Q水冲洗。玻璃盖玻片,优选地来自于VWR和Menzel和钛圆盘(titanium disks)。大肠杆菌(E.coli)(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)(ATCC 6538)用于抗微生物研究。
方法
金纳米颗粒(Au NP)使用Turkevich的方法(Turkevich,J.;Stevenson,P.L.;Hillier,J.;Discuss Faraday Soc.1951,11,55)合成。通常,将Erlenmyer烧瓶中90mL的10-4M HAuCl4溶液沸腾,紧接着添加10mL的0.2mg的柠檬酸钠。将溶液沸腾直到溶液的颜色从淡黄色改变至深红色(ruby-red)。圆形玻璃载玻片在使用前通过浸泡在piranha溶液(30%H2O2+70%H2SO4)1小时而严格清洗。随后利用大量的Milli-Q水清洗它们。将清洗的玻璃载片浸泡于处于乙醇中的1%的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)中30分钟,随后利用乙醇清洗。APTMS功能化的玻璃载玻片浸入金纳米颗粒溶液24小时以沉积金膜。所沉积的金纳米颗粒涂覆的表面利用Milli-Q水洗两次并且利用N2气温和地干燥。为了在钛(Ti)表面上涂敷金纳米颗粒,利用H2SO4溶液清洗Ti圆盘30分钟。按上面所描述的进行其它步骤。
CM肽的固定
金纳米颗粒涂覆的表面利用20mM胱胺和1mg/mL硫醇-PEG胺(1kDa)功能化24小时,紧接着利用水冲洗以除去未结合的胺分子。使用如之前所描述的苦味酸酯(盐)测试定量在Au NP涂敷的玻璃表面上存在的胺官能团的量(Lee,C.C.Y.;Loudon,G.M.Anal.Biochem.1978,94,60)。对于胺分子的浓度的估计,胺的消光系数被认为是134700(Lee,C.C.Y.;Loudon,G.M.Anal.Biochem.1978,94,60)。将新制备的处于磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中的1mg/mL磺基-GMBS与胺-官能化的表面孵育2小时以修饰胺基团。再次进行苦味酸盐(酯)测试以定量在表面上的游离胺基团。应该注意的是,为了简单地解释结果,在整篇文章中,磺基-GMBS修饰的胱胺和硫醇-PEG-胺表面将分别称为CS和NS表面。将在磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中溶解的不同浓度的CM肽(1-3mg/mL)与CS和NS表面在4℃下孵育24小时用于共价固定。通过利用磷酸盐缓冲液温和地洗涤两次去除未结合的肽。在固定和洗涤后在剩余的肽溶液中肽的量使用按照生产商的说明书的BCA方法进行定量(优选地,Sigma Aldrich)。计算在不同表面上每单位表面积共价固定的CM肽(mg/cm2)。
傅立叶变换红外(FITR)研究
在Jasco分光光度计中使用金色栅极衰减全反射(golden Gateattenuated total reflection)(ATR)附件表征涂敷过程的不同阶段。在FTIR测量前完全干燥所有样品。在4cm-1分辨率下记录光谱,将128次扫描平均,随后通过邻近11点平均(11 points adjacent averaging)进行平滑。
接触角测量
通过在使用的表面上获取5μL水滴的图像进行接触角测量。水滴的图像立即拍摄(take after)以避免与液滴干燥相关的问题。每个样品的三个图像取自表面不同的区域,并且在液滴表面界面处进行切线测量并计算接触角。官能团和水接触角之间的关系使用Wenzel方程评估,其中表面上液体的表观接触角取决于表面的粗糙度和化学组成(Wenzel,R.N.Ind.Eng.Chem.1936,28,988)。
X-射线光电子放射光谱(XPS)测量
抗微生物活性
在37℃下,将革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性(大肠杆菌)在Luria肉汤(LB)培养基中生长24小时。将100μL的细菌悬浮液转移至含有5mL的LB培养基的无菌小瓶中并在37℃孵育2小时以获得细菌中期对数阶段生长随后进一步使用LB培养基稀释以达到105CFU/mL细菌。在磷酸盐缓冲盐水(pH 7.2,PBS)中孵育CM系连的表面4小时以沥滤出任何未结合和物理吸附的CM肽。为了测试系连的CM肽的抗微生物活性,在37℃下具有CM肽的不同表面孵育在105CFU/mL的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬浮液中4小时。以30分钟的间隔从相应的细菌溶液中取等分部分(100μL)并且在PBS中稀释至105CFU/mL,随后铺板在LB琼脂平板上,紧接着在37℃下孵育。计算在板上生长的菌落。所有抗菌活性试验进行三次并且在不同的时间进行以证明数据的再现性。针对大肠杆菌还测试了沥滤的溶液并且没有观察到杀死细菌。为了测试CM肽涂敷的玻璃表面的可再用性,该表面在大肠杆菌中孵育4小时,然后利用PBS洗涤并空气干燥。
为了测试在人血清(HS)存在下系连的CM肽的抗微生物活性,使用硫醇-PEG-胺的上面的官能化步骤稍加改变。在用1mg/mL的硫醇-PEG-胺官能化Au NP涂敷的玻璃表面后,这些表面利用不同量的硫醇-PEG-酸溶液进一步孵育12小时以获得胺和酸的不同摩尔比(胺与酸的不同摩尔比在原稿中表示为N:C 1:1、2:1、3:1、4:1和5:1)。在12小时后,官能化表面利用乙醇洗涤以除去未结合的分子。将CM肽固定在这些表面上的其它步骤,类似如上所述使用3mg/mL CM肽。CM系连的N:C表面利用20%的人血清孵育2小时,紧接着利用无菌PBS洗涤。在PBS中稀释人血清(HS)以获得20%的浓度。针对大肠杆菌,测试HS处理的N:C表面。类似地,使用N:C 1:1表面化学利用3mg/mL的CM肽固化Au纳米颗粒涂敷的钛表面。CM固定的Au纳米颗粒涂敷的Ti表面利用20%的人血清处理2小时,紧接着进行针对大肠杆菌的抗微生物活性测试。
细胞培养
两种人类细胞类型(如作为血管化组织模型的人内皮脐静脉细胞(HUVEC)和正常真皮人类成纤维细胞(NDHF)(存在于人结缔组织中的一种最常见的细胞类型))用于评价通过CM肽固定的表面诱导的细胞毒性。在进一步使用之前,使用内皮生长因子-2培养基(EGM-2),bullet试剂盒培养基(优选地,Lonza,目录编号CC-3156)培养HUVEC(优选地,Lonza,目录编号CC-2517,Walkersville,马里兰州,美国)至少24小时。对于所有实验使用传代低于6次。
NDHF细胞(优选地,Lonza,目录编号CC-2511)利用补充有10%(v/v)的胎牛血清(优选地,Gibco,EU批准的来源,目录编号10270-106,Grand Island,纽约,美国)和1%(v/v)青霉素/链霉素(优选地,Lonza,目录编号DE17-602E)的dulbecco改进的eagle培养基(DMEM)(优选地,Sigma,目录编号D5796)培养。使用传代数低于十次的NDHF细胞以在进行测定的时间期间维持原代细胞状态(primary cell state)。
在具有75cm2表面的组织培养瓶(BD,Falcon)中在它们各自培养基中培养HUVEC和NDHF细胞。在接种于适当的组织培养板中进行细胞毒性研究之前,将细胞用胰蛋白酶消化,离心并计数用于细胞数的恰当评估。
可溶的CM肽与细胞的相互作用
如前所述培养HUVEC和NDHF细胞并且以4.2×103细胞/cm2的密度铺板在24孔板中。在进行任何实验之前,允许细胞生长24小时。使用MTT细胞代谢活性测定,将不同浓度的CM肽溶液(50、30、20、10、5、2.5和1μg/mL)与两种细胞孵育24小时以评价CM肽的细胞毒性效果。
MTT测定
最初用温热的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞。在37℃在具有5%的空气和95%的CO2的CO2培养箱中用噻唑蓝溴化四唑鎓盐(MTT)溶液的工作液(将10mL培养基加入至1mL四唑鎓盐的母液,5mg/mL的PBS)孵育,用不同浓度CM肽处理24小时后的细胞持续3小时。孵育3小时后,通过温和搅动定轨振荡器上(orbital shaker)的测试板通过二甲基亚砜(DMSO)溶解所形成的紫色甲臜(formazan)晶体。在UV-可见光分光光度计中(SynergyMx,来自Biotek Instruments,Winooski,VT,美国)参照670nm在540nm下测定吸光度(我不理解参考(I don’t understandby reference))。
在直接接触测试的情况下(稍后详细解释),在加入MTT工作液之前,将样品转移到新的平板以避免细胞活性的错误计算。使用这种策略,只考虑与测试的表面接触的细胞。对于TCPS的条件,将获得的值针对与修饰的样品相同的表面积标准化以对于所有的条件具有相同的表面积。
提取测试
进行提取测试以评估是否任何由培养基表面沥出的CM肽对两种细胞的代谢活性具有影响。制备提取物之前,将Au NP涂覆的,N:C(1:1)涂覆的和固定于N:C(1.)的CM肽涂覆的Au NP表面在层流通风橱中使用UV光源灭菌20分钟。根据国际标准ISO10993-5制备提取物和在无菌条件下在培养箱中在37℃下两种培养基都接触前面提到3cm2面积的表面24小时并柔和地搅拌。由表面处理回收的培养基用作提取物。在将提取物加入到孔之前,将细胞以4.2x103个细胞/cm2密度接种并使其生长24小时。在每一次试验中,样品的表面积与培养基的比例保持恒定为3cm2/mL。使提取物与接种细胞保持接触24小时,紧接着使用MTT测定法评估细胞毒性。
直接接触测定
使用前面提到的在UV光下不同的表面消毒用于直接接触测定。将两种细胞以4x104个细胞/cm2的密度接种在顶部不同的表面上,并且在使用MTT测定法评估细胞毒性前,使其生长24小时。
将样品转移到新板中,以避免测得的细胞活性错误计算,并且仅考虑与测试表面接触的细胞。对于TCPS条件,将获得的值针对与修饰的样品相同的表面积标准化以对于所有的条件具有相同的表面积(我不理解(Idid not understand))。
扫描电子显微镜(SEM)
使用不同类型的改性玻璃表面用于这些分析:用金纳米颗粒涂覆的玻璃盖玻片作为对照和用金和杀菌肽(cecropin)-蜂毒素(mellitin)抗微生物杂合肽涂覆的玻璃盖玻片作为AMP测试样品。
使用不同表面用于与HUVEC和NDHF细胞的直接接触测试。此外,由于对照的原因,也观察了没有任何细胞培养物的金和AMP涂覆表面的样品。
使用FEG ESEM/EDS/EBSD FEI Quanta 400 FEG ESEM/EDAXGenesis X4M(仅需要写入型号名称)进行扫描电子显微镜成像。
出于定量的目的,每种条件进行总共三次重复的不同样本的不同场(field)的10次成像(对于NDHF细胞,仅成像了2次重复)。计算每个表面区域中存在的细胞数并且绘制成图形以便更好地理解每种表面类型中存在的细胞总数。使用200x放大捕捉用于该目的的图像。此外,使用例如5000x、40000x、100000x或200000x的更高的放大率下捕获的图像详细地分析细胞形态。
使用能量分散光谱(Energy Dispersive Spectrum)(EDS)更准确地说明这些样品中存在的细胞和颗粒,该能量分散光谱获得特定的区域点并且允许适当地区分有机材料和金材料。
基于乳酸脱氢酶(LDH)释放的测试
在用于直接接触测量的相似的条件下,对于用不同的表面处理的细胞进行LDH释放测试。每种条件使用三次重复,以获得统计学显著的数据。乳酸脱氢酶测试是简单且准确的方法并且该测试是基于通过LDH将NAD还原成NADH。它允许将膜完整性测定为释放到培养基中的胞浆LDH的量的函数。
根据生产商的规程(优选为Sigma,目录号TOX7)测定LDH释放和相应总的LDH测量。对于总LDH定量,在回收样品用于测试前,使用LDH测试裂解缓冲液。对于所有的样品,将一定体积的LDH测试混合物(等于有待测试的培养基体积的两倍)加入具有来自用不同表面处理的细胞的培养基的不透明板。用铝箔保护板避光并且培养20至30分钟。使用分光光度计(优选地,SynergyMx,Biotek Instruments)在490nm波长和690nm背景下测定吸光度。将后面的值减去原来波长获得的读数(490nm)。
膜电势评估
将细胞接种于8孔无菌Labtek室中并且培养至少24小时。随后,用处于磷酸盐缓冲盐水中的0.5%的牛血清白蛋白溶液清洗后,将粘附的细胞染色。使碘化丙锭和3,3'-二戊基氧碳菁碘化物(dipentyloxacarbocyanine)(DiOC5)(1mg/mL)的混合物在37℃与细胞反应10分钟。然后用PBS清洗处理的细胞并使用荧光显微镜进行成像(Zeiss,德国)。捕捉每种条件的至少三幅图像用于定量目的。使用Image J 1.45S软件分析图片(National Institutes of Health,美国)并且分别检查两个通道。在计数前,使用上述软件转化对应于标记死细胞的碘化丙锭染料的通道的图像。此外,如获得的使用对应于DiOC 5的通道的图像,并且使用细胞计数器插件(cell counter pluggin)用于对表达感兴趣的分子的细胞的总数手动定量(不清楚)。从而将所有数据进行绘图。
统计学分析
对于所有的实验分析至少三次重复。分析数据,使用Prism Software forMacintosh(4.0b版本,GraphPad Software Inc.,2004)分析数据并且绘制成图形格式。使用95%的置信区间进行统计学t-学生检验以比较不同的组。
结果
金纳米颗粒(Au NP)是使用熟知的Turkevich方法合成的(Wenzel,R.N.Ind.Eng.Chem.1936,28,988)。柠檬酸盐稳定的金纳米颗粒使用UV-Vis光谱和TEM分析进行表征。图1A示出了在520nm具有表面等离子体共振(SPR)带的金纳米颗粒的UV-vis光谱,表示球形金纳米颗粒的合成。通过该溶液的TEM分析得到了这一观察的支持性证据(图11)。TEM图像示出了具有20纳米尺寸的球形金纳米颗粒的合成(图1B)。使用合成的金纳米颗粒用于制造玻璃载玻片上的金薄膜。AFM图像表明金纳米颗粒在硅烷官能化的玻璃载玻片上的均匀分布(图1C)。因为已知含胺聚合物通过物理吸附于玻璃表面上而强烈地相互作用,通常使用胺分子来官能化表面以提供与生物分子的相容性(Song,J.;Chen,J.;Klapperich,C.M.;Eng,V.;Bertozzi,C.R.J.Mater.Chem.2004,14,2643)。3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-amino propyltrymethoxysilane)的硅烷基团与玻璃表面通过silaxone连接发生反应,同时胺基团可以与金纳米颗粒通过静电作用发生相互作用(Karakouz,T.;Maoz,B.M.;Lando,G.;Vaskevich,A.;Rubinstein,I.ACS Appl.Mater.Interfaces 2011,3,978)。
为了将CM肽固定在Au NP涂覆的表面上,选择胱胺和硫醇-PEG-胺作为间隔物(spacer)以使表面官能化(方案1)。胱氨与金反应(切割硫-硫二硫键),以及硫醇-PEG胺通过硫醇基团反应,导致与在硫醇-PEG-胺涂覆的表面上每分子一个胺基团相比,在胱胺涂覆的表面上每分子两个胺基团可供使用(Rai,A.;Perry,C.C.Langmuir 2010,26,4152)。然而,在24小时孵育之后,苦味酸盐试验表现出与硫醇-PEG-胺涂覆的表面相比在胱胺上1.5倍更高的胺基,这与XPS分析很好地吻合(图3和表2和表3):
表2-Au NP涂覆的表面上所制备薄膜的胺密度和接触角测量
表3:在不同的涂覆阶段测得的表面的原子组成(At%)
孵育1小时后,在两种表面上存在很小的胺基数量增加;然而,关键是孵育24小时以获得表面上的有组织的单层(图3)((a)Wang,H.;Chen,S.F.;Li,L.Y.;Jiang,S.Y.Langmuir 2005,21,2633.b)Dietrich,P.M.;Graf,N.;Gross,T.;Lippitz,A.;Krakert,S.;Schupbach,B.;Terfort,A.;Unger,W.E.S.Surf.Interface Anal.2010,42,1184)。
磺基-GMBS是异双功能交联剂,其包含NHS酯和马来酰亚胺(meleimide)基团。用磺基-GMBS修饰后,由于与磺基-GMBS的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基团的共价反应,1630cm-1处的胺带消失并且出现新条带。相似地,在针对磺基-GMBS改性表面的XPS分析中观察到氮(N)%氧(%O)数量增加(表3)。使用苦味酸盐测试没有检测到胺基团,表明用磺基-GMBS修饰胺基(表2)。在C-末端具有巯基(-SH基)的CM肽与在Au NP涂覆的表面上游离可用的磺基-GMBS的马来酰亚胺基团共价反应。图中的曲线示出了特征性的酰胺-1(C=0伸展模式)和酰胺-II(分别在1640和1560cm-1N-H弯曲模式。XPS分析表明硫元素仅存于CM肽涂覆的表面,而不是其他表面,表明共价连接的CM肽存在于NS和CS两者表面上(表3)。
虽然在胱胺官能化的表面上胺基的量较高,在NS表面上共价固定的CM肽的量估计为高于CS表面上的量。XPS分析表明%C,N和O在NS表面是较高的(表3)。这可能是由于与刚性CS表面相比,NS表面上的柔性的和长链的硫醇-PEG-胺通过CM肽的界面重排(interfacialrearrangement)促进了更多的固定,侧向扩散(lateral diffusion)和致密充填(dense packing)的事实,其中,CM肽之间的位阻主要抑制进一步吸附(a)Hylton,D.M.;Klee,D.;Fabry,M.;Hocker,J.Colloid Interface Sci.1999,220,198.b)Kleijn,M.;Norde,W.Heterog.Chem.Rev.1995,2,157)。此外,在玻璃表面上的金纳米颗粒涂层产生较高的粗糙度,这进而导致与其他报道的步骤相比((b)Gao,G.;Yu,K.;Kindrachuk,J.;Brooks,D.E.;Hancock,R.E.W.;Kizhakkedathu,J.N.Biomacromol.2011,12,3715.c)Gabriel,M.;Nazmi,K.;Veerman,E.C;Amerongen,A.V.N.;Zentner,A.Bioconj.Chem.2006,17,548and Gao,G.;Lange,D.;Hilpert,K.;Kindrachuk,J.;Zou,Y.;Cheng,J.T.J.;Kazemzadeh-Narbat,M.;Yu,K.;Wang,R.;Straus,S.K.;Brooks,D.E.;Chew,B.H.;Hancock,R.E.W.;Kizhakkedathu,J.N.Biomater.2011,32,3899and Kazemzadeh-Narbat,M.;Kindrachuk,J.;Duan,K.;Jenssen,H.;Hancock,R.E.W.;Wang,R.Biomater.2010,31,9519),大量的每cm2表面积的肽的固定。图3B显示具有增加量的大量CM肽固定在两种表面上,然而由于非特异性物理相互作用,在未用磺基-GMBS修饰的金,胱胺和硫醇-PEG-胺涂覆的表面上发现很少吸附。在涂覆过程的每个阶段改变膜的化学组成,导致接触角的变化(表2)。接触角增加的趋势反映了两种表面上存在的不同官能团的改变的可润湿性,这与XPS分析是一致的(表2和表3)。Au NP和胺改性的表面是亲水性的,而由于存在较大百分比的疏水氨基酸,CM肽涂覆的表面是疏水性的,这导致肽涂覆的表面产生疏水行为(表2)。
CM肽本质上是高度阳离子性的,并且当与溶液中的细菌膜相互作用时采用良好限定的结构并且这些结构改变涉及它们潜在的抗微生物活性((a)Zasloff,M.Nature 2002,415,389.b)Brogden,K.A.Nat.Rev.Microbiol.2005,3,238.c)Bastos,M.;Bai,G.;Gomes,P.;Andreu,D.;Goormaghtigh,E.;Prieto,M.Biophys J.2008,94,2128.d)Melo,M.N.;Ferre,R.;Castanho,M.A.Nat.Rev.Microbiol.2009,7,245)。在表面上的系连CM肽的情况下,由于在与局部正电荷表面静电作用时,干扰细菌膜的表面静电特性或肽穿透进入细菌膜内,可以触发自溶和细菌死亡((d)Hilpert,K.;Elliott,M.;Jenssen,H.;Kindrachuk,J.;Fjell,C.D.;Korner,J.;Winkler,D.F.H.;Weaver,L.L;Henklein,P.;Ulrich,A.S.;Chiang,S.H.Y.;Farmer,S.W.;Pante,N.;Volkmer,R.;Hancock,R.E.W.Chem.Biol.2009,16,58andJelokhani-Niaraki,M.;Prenner,E.J.;Kay,C.M.;McElhaney,R.N.;Hodges,R.S.J.Pept.Res.2002,60,23)。因此,与肽的量、间隔物的柔性和长度相关的表面上较高的电荷密度可以导致CM肽系连表面的抗微生物活性。为了证实CM肽系连表面的活性,针对革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性(大肠杆菌)细菌测试了不同量的CM肽固定的表面。随着培养时间的增加,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的CFU随着NS和CS表面上CM肽的量的增加而减小。示出了CM肽系连表面的抗菌活性有效性的证据(图4)。在CM肽系连的CS表面的情况下,孵育4小时后,98%细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)被杀死,虽然,孵育2小时后,具有少量固定CM肽(0.29mg/cm2)的表面不能杀死细菌(图4A和C)。通常,也如其他人员观察到的,具有少量肽的CS表面用作抑菌物而具有大量肽的CS表面用作杀菌物(Humblot,V.;Yala,J-F.;Thebault,P.;Boukerma,K.;Hequet,A.;Berjeaud,J-M.;Pradier,C-M.Biomater.2009,30,3503)。与CS表面相比,系连于NS表面上的不同量的CM肽用作抑菌物,在分别孵育2小时和4小时后,被具有0.89和0.38mg/cm2肽的表面杀灭了98%细菌(图4B和图D)。感兴趣的是,孵育1.30小时后,含有1.02mg/cm2的肽的NS表面杀灭了100%的细菌,这使得该表面理想地用于进一步的研究(图4B和图D)。
对照表面,例如胱胺和硫醇-PEG胺涂覆的金表面没有显示任何抗微生物活性(数据未示出)。NS表面上CM肽的增强的抗微生物活性是由于大量肽,硫醇-PEG-胺分子的柔性和长链的结合作用。在缓冲液存在下硫醇-PEG-胺的长链和膨胀(由于其水溶胀特性),进一步从表面移动CM肽从而降低了肽和表面之间的相互作用并保持CM肽活性((a)Banerjee,I.;Pangule,R.C;Kane,R.S.Adv.Mater.2011,23,690.b)Liu,Z.;Wang,L;Bao,C;Li,X.;Cao,L.Dai,K.;Zhu,L.Biomacromol.2011,12,2389)。此外,硫醇-PEG-胺分子的柔性为肽提供了侧向移动性并且表面上大量的肽限制了CM肽的构象自由度,导致与细菌膜更好的相互作用从而增强杀菌活性(Onaizi,S.A.;Leong,S.S.J.Biotechnol.Adv.2011,29,67.b)Costa,F.Carvalho,I.F.Montelaro,R.C.Gomes,P.;Martins,C.L.Acta Biomaterialia2011,7,1431 and a)Humblot,V.;Yala,J-F.;Thebault,P.;Boukerma,K.;Hequet,A.;Berjeaud,J-M.;Pradier,C-M.Biomater.2009,30,3503.b)Gao,G.;Yu,K.;Kindrachuk,J.;Brooks,D.E.;Hancock,R.E.W.;Kizhakkedathu,J.N.Biomacromol.2011,12,3715.c)Gabriel,M.;Nazmi,K.;Veerman,E.C;Amerongen,A.V.N.;Zentner,A.Bioconj.Chem.2006,17,548.d)Hilpert,K.;Elliott,M.;Jenssen,H.;Kindrachuk,J.;Fjell,C.D.;Korner,J.;Winkler,D.F.H.;Weaver,L.L.;Henklein,P.;Ulrich,A.S.;Chiang,S.H.Y.;Farmer,S.W.;Pante,N.;Volkmer,R.;Hancock,R.E.W.Chem.Biol.2009,16,58.e)Steven,H.D.;Hotchkiss,J.H.J.Appl.Polym.Sci.2008,110,2665.f)Appendini,P.;Hotchkiss,J.H.J.Appl.Polym.Sci.2001,81,609.g)Cho,W.M.;Joshi,B.P.;Cho,H.;Lee,K.H.Bioorg.Med.Chem.Lett.2007,17,5772.)。这些结果表明少量的肽连同短间隔物链长度可能通过干扰低水平的细菌膜静电特性促进抑菌性。而大量的肽和较短或较长的间隔物链长度引发了杀菌活性、与肽穿透进入膜中和干扰膜静电特性相结合(图4)。
由AFM分析支持了抗微生物活性机制。高度模式AFM图像示出用CM肽系连的NS表面处理的大肠杆菌的的严重损坏和穿孔的膜,而在对照实验中观察到大肠杆菌的平滑的细胞壁,其中,细菌在Au NP涂覆的表面孵育(图5A和图C)。可能的是,通过NS表面上系连的肽的静电干扰在细菌细胞壁中产生孔,然后肽穿过以形成“孔洞(hole)”,这导致细胞内容物的泄漏和细菌的死亡(图5A和图D)。在扫描期间(4a)通过AFM尖端,与完整的膜相比,由于损伤膜的自由移动,观察到AFM图像中的“孔洞”。在相位模式图像中,可以清楚可见的是,在暴露于CM肽系连的NS表面后,外部细胞壁层是完整的(图5D)。由于较小的干扰膜的静电特性,用CM肽系连的CS表面处理的大肠杆菌(0.29mg/cm2)具有粗糙的细胞壁,而没有任何“孔洞”,(图5B和E),这通过观察到的表面的抑菌特性得以证实(图4A)。横截面分析揭示了与大肠杆菌(针对CM肽系连的CS表面)的较低粗糙度细胞壁相比,由于大肠杆菌细胞壁塌陷(针对CM肽系连NS表面)随着高度降低粗糙度增加(图5G-I)。因此,我们的结果强烈表明合适的表面化学和系连在表面上的抗微生物肽的量是获得强抗微生物活性的关键。
固定在表面上的CM肽的取向是获得其最大活性的一个重要标准。图6A示出了随机固定在硫醇-PEG-酸修饰表面上的CM肽的抗微生物活性。孵育4小时后,发现大肠杆菌相对低的杀伤(48%),这有可能与大多数碱性氨基酸可能不能接近细菌膜的事实相关(图6A)。另一方面,C-末端结合负责CM肽的适当取向连同游离的碱性氨基酸存在于N-末端并且促进与带负电的细菌膜更好的相互作用,这可以解释系连的CM肽(98%活性)的不良的作用(图4)。其他研究人员也观察到类似的趋势,尽管在文献中不清楚取向对于抗微生物肽活性的影响(Haynie,S.L.;Crum,G.A.;Doele,B.A.Antimicrob.Agents Chemotherap.1995,39,301 and b)Gao,G.;Yu,K.;Kindrachuk,J.;Brooks,D.E.;Hancock,R.E.W.;Kizhakkedathu,J.N.Biomacromol.2011,12,3715.c)Gabriel,M.;Nazmi,K.;Veerman,E.C;Amerongen,A.V.N.;Zentner,A.Bioconj.Chem.2006,17,548.)
就我们所知,还没有在人血清存在下系连肽的抗微生物活性相关的可用的研究文献。在表面在20%人血清中孵育2小时后,CM肽系连的NS表面没有显示出任何抗微生物活性。可能的是,人血清在CM肽系连表面顶部吸附并抑制了CM肽的活性。因此,通过引入不同摩尔比的硫醇-PEG-胺与硫醇-PEG-酸分子,对涂覆步骤稍加改进。使用混合PEG分子后面说明的基本原理是为了生成两性离子类型表面以及表面上的高密度的PEG分子以防止人血清的吸附((a)Banerjee,I.;Pangule,R.C;Kane,R.S.Adv.Mater.2011,23,690.,and a)Holmlin,R.E.;Chen,X.;Chapman,R.G.;Takayama,S.;Whitesides,G.M.Langmuir 2001,17,2841.b)Vaisocherova,H.;Yang,W.;Zhang,Z.;Cao,Z.;Cheng,G.;Pillarik,M.;Homola,J.;Jiang,S.Anal.Chem.2008,80,7894.c)Chapman,R.G.;Ostuni,E.;Yan,L;Whitesides,G.M.Langmuir 2000,16,6927)。图6B表明与其它摩尔比表面相比,孵育4小时后1:1比率的N:C表面能够杀灭大肠杆菌85%菌落。接触角测量表明与其它摩尔比表面相比,1:1比率表面更亲水,这使得该表面抗血清吸附,从而保护系连的CM肽的抗微生物活性(表2)。根据以上步骤,系连于Au NP涂覆的钛表面上的CM肽在人血清存在下孵育4小时显示出可比较的相似的抗微生物活性(图6C)。该结果表明该步骤可以在整形外科和牙科植入物上用来涂覆抗微生物肽用于它们的生物医学应用。在Au NP涂覆的Ti表面上的CM肽的涂层是十分牢固的,在重复使用5个循环后仍保持抗微生物活性(图6D)。这五个循环在10天内完成,其中频率为每个循环2天。在每个循环使用后抗微生物活性稍稍降低,但是,相对于用对照Ti表面培养的细菌,甚至五个循环之后有效地杀灭细菌(90%)(图6D)。
细胞毒性分析
杀菌肽-蜂毒素(CM)是使用了许多年的抗微生物肽。
使不同浓度的可溶性杀菌肽-蜂毒素肽与NDHF和HUVEC细胞(在TCPS 24-孔板中预先培养24小时)接触。目的是为了证明CM肽不影响细胞同时具有杀灭细菌细胞的活性。
在这些实验中,检测到,在细胞和可溶性肽之间直接接触24h后,高水平的可溶性CM肽在NDHF细胞代谢活性中有统计学显著的不利作用。发现在10到2.5μg/mL之间的CM浓度特别有效地降低细胞代谢活性(通过细胞将MTT盐转化为甲臜晶体的能力间接测量的)。对于使用HUVEC的试验获得了类似的结果。对于这种细胞类型,对于1μg mL的浓度,也检测到了可溶性CM肽的负面影响,这证实了内皮细胞是不如成纤维细胞牢固(robust)的细胞系统,或这是由对于2.5μg/mLCM可溶性肽条件测得的较高标准差值支持的。
为此,还使用在37℃在温和的搅拌下(150转/分)与不同表面接触24小时的培养基进行提取试验。在此,主要目的是为了评估是否存在从表面沥滤出的一些颗粒并且因此影响培养中的细胞的行为。
据检测,在HUVEC细胞培养物的情况下,来自AMP修饰表面的提取物会显著影响细胞并且它们的代谢活性降低。
将阴性对照加入到该组条件以便破坏细胞并且对于这种影响具有负值,在这种情况下过氧化氢,这对于此目的是有效的。
在以下示出HUVEC细胞与改性表面直接接触。结果表明,用AMP肽修饰的样品和仅用PEG-胺(PEG-NH2)和PEG-COOH(NC化学样品)修饰的那些之间存在差异。该实验的对照包括接种在组织培养物处理的塑料(TCPS)和未经修饰的玻璃盖玻片(之前在乙醇中清洗并用氮气干燥以及如所有其它表面一样消毒)中的细胞。
发现了在AMP修饰的表面和未修饰的,或者金处理的和金处理的加上NC化学处理之间的显著差异。因此,看起来可能肽的存在影响与这些特定表面接触的细胞行为。
还用正常人真皮成纤维细胞(NDHF)进行进一步的实验以确认是否将获得相同的结果。本文获得的结果表明与AMP修饰的表面直接接触的成纤维细胞具有下降的代谢活性。因此,对于两种细胞类型获得了相似的结果。
成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞在维持成人组织中特定细胞群中将具有不同作用,并为此在这里进行研究。在这种特定的试验中,尽管已知内皮细胞要比成纤维细胞更敏感,它们表现相同。
当然本发明不以任何方式局限于所描述的实施例,本领域的技术人员将预见其多种可能的修改而不背离如所附权利要求限定的本发明的基本思想。
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本发明不以任何方式,局限于本文描述的实施方式,并且本领域技术人员可以提供许多可能的修改而不背离如权利要求中所限定的本发明的总体思想。所附权利要求给出本发明的具体实施方式。
Claims (25)
1.一种用于涂覆制品的抗微生物涂覆组合物,包含:
■抗微生物肽;
■结合至所述抗微生物肽的纳米颗粒;
其中,所述组合物适于结合至所述制品的表面。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述纳米颗粒是金属纳米颗粒或由金属层覆盖的纳米颗粒。
3.根据前述权利要求所述的组合物,其中,所述纳米颗粒具有10-100nm,优选地,15-50nm,更优选地,20-30nm之间的尺寸。
4.根据前述权利要求所述的组合物,其中,所述抗微生物肽在C端具有半胱氨酸。
5.根据前述权利要求所述的组合物,其中,所述抗微生物肽是抗微生物肽模拟物,抗微生物肽的小分子模拟物。
6.根据前述权利要求所述的组合物,其中,所述抗微生物肽选自下组:杀菌肽-蜂毒素、爪蟾抗菌肽、皮抑菌肽、导管素、防卫素、蛋白整合素。
7.根据前述权利要求所述的组合物,进一步包含粘合剂。
8.根据前述的组合物,其中,所述粘合剂是分子。
9.根据前一权利要求所述的组合物,其中,所述分子是聚合物。
10.根据前一权利要求所述的组合物,其中,所述聚合物是聚阳离子或聚阴离子。
11.根据权利要求9-10所述的组合物,其中,所述聚合物是聚多巴胺。
12.根据前述权利要求所述的组合物,其中,通过加热,将所述组合物结合至所述制品的表面。
13.根据前述权利要求所述的组合物,其中,使用抗微生物肽作为模板能得到所述纳米颗粒。
14.根据前述权利要求所述的组合物,进一步包含缓冲剂。
15.根据前一权利要求所述的组合物,其中,所述缓冲剂选自下组:TAPS、Bicine、Tris、Tricine、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、甲次砷酸盐、SSC、MES。
16.根据前述权利要求所述的组合物,进一步包含防污剂作为间隔物。
17.根据前一权利要求所述的组合物,其中,所述防污剂是PEG。
18.根据前述权利要求所述的组合物,其中,所述抗微生物肽浓度在0.5mM至1mM之间,优选地,在0.20mM至0.10mM之间。
19.根据权利要求2-18所述的组合物,其中,所述金属是金、钛、银、或它们的混合物。
20.根据前述权利要求所述的组合物,用于医药。
21.根据前述权利要求所述的组合物,用于治疗和/或预防微生物感染。
22.一种涂覆有权利要求1-21中描述的抗微生物涂覆组合物的制品。
23.根据前一权利要求所述的制品,其中,所述制品是医疗器械。
24.根据前一权利要求所述的制品,其中,所述医疗器械是植入物、压舌器、医学温度计、血糖仪、医用机器人、微晶片植入物、手术工具、或神经假体。
25.一种利用前述权利要求所述的抗微生物涂覆组合物涂覆制品的方法,包括以下步骤:
■加热包含氯金酸的水溶液;
■添加柠檬酸钠,并且加热混合物;
■清洗所述制品;
■将所述制品浸渍在包含抗微生物肽的溶液中用于使所述制品功能化;
■使功能化制品沉浸在所述加热的混合物中。
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