CN106983912B - 一种3d打印的抗菌水凝胶修复支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种3D打印的抗菌水凝胶修复支架及其制备方法。本发明将改性透明质酸钠/改性氧化海藻酸钠水凝胶前体通过光固化3D打印制备复合水凝胶支架，再在其表面修饰抗菌肽LL‑37，得到3D打印的抗菌水凝胶修复支架。本发明提供的制备方法简单，耗时短，容易实现产业化，而且支架的大小及几何形状可以根据受损部位去定制。该支架的压缩强度为0.16～0.29MPa；能有效抑制大肠杆菌和金黄葡萄球菌，且具有良好的细胞相容性。

Description

一种3D打印的抗菌水凝胶修复支架及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，特别涉及一种3D打印的抗菌水凝胶修复支架及其制备方法。
背景技术
某些软组织例如软骨组织、脂肪组织等，因不含有或者很少有血管、淋巴，不具备再生能力。且由于其自身修复能力非常有限，当软组织有损伤或者缺失时，不能自行修复。组织工程支架是一种重要的替代治疗措施，有望最终解决这个问题。由于水凝胶可以在一定条件下保持流动状态而在外部物理或化学刺激下形成具有一定形状和强度的体型材料，因此可以利用这种智能性来制备注射型支架,发挥其在修复形状复杂缺损以及微创治疗等方面的优势，另外，水凝胶支架能够为细胞的增殖与分化提供更接近于天然软骨细胞外基质的微环境，是软组织修复的一种理想材料。
传统的水凝胶支架制作技术无法实现个体化和复杂的几何形状，软组织工程涉及支架、细胞诱导和生成因子刺激以及合适的生物力学环境等多重因素，对力学强度、降解性能、支架几何形状等具有很高的要求。3D打印技术可在很大程度上实现这些特性的可控性，因此可能实现优良软组织工程支架的制备。但是3D打印的材料也需要满足一定的力学性能，才能具有良好的成型性；另外，目前通过3D打印制备所得的修复支架的功能较为单一，不具备抗菌性能，往往导致其在应用中容易受细菌感染而导致一系列炎症及并发症的发生。
因此，有必要研究出一种适合3D打印的水凝胶材料，获得一种3D打印的抗菌水凝胶修复支架。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种3D打印的抗菌水凝胶修复支架的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的3D打印的抗菌水凝胶修复支架。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种3D打印的抗菌水凝胶修复支架的制备方法，包括如下步骤：将改性透明质酸钠/改性氧化海藻酸钠水凝胶前体通过光固化3D打印制备复合水凝胶支架，再在其表面修饰抗菌肽LL-37，得到3D打印的抗菌水凝胶修复支架。
所述的改性透明质酸钠优选为甲基丙烯酰化透明质酸钠。
所述的改性氧化海藻酸钠优选为甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠。
所述的改性透明质酸钠/改性氧化海藻酸钠水凝胶前体优选通过如下步骤制备得到：往水中依次加入光引发剂Irgacure2959、氯化钙、甲基丙烯酰化透明质酸钠，混合均匀，得到甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液；将含光引发剂Irgacure2959的水溶液和甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠混匀，得到甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液；将甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液和甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液混合，得到改性透明质酸钠/改性氧化海藻酸钠水凝胶前体。
所述的甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液和所述的甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液优选按质量比20～80：20～80混合；更优选为按质量比20：20～80混合。
所述的光固化3D打印的条件优选为：紫外光照射时间为10s，紫外光照射强度为10mW/CM2。
所述的表面修饰抗菌肽LL-37的具体步骤优选如下：将复合水凝胶支架浸泡于盐酸多巴胺溶液中，得到聚多巴胺表面修饰处理的复合水凝胶支架；再将聚多巴胺表面修饰处理的复合水凝胶支架浸泡于抗菌肽LL37溶液中，得到3D打印的抗菌水凝胶修复支架。
所述的3D打印的抗菌水凝胶修复支架的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)甲基丙烯酰化透明质酸钠的制备：将透明质酸钠水溶液的pH值调节为8.5；按质量比m透明质酸钠：m甲基丙烯酸酐＝1:7.8加入甲基丙烯酸酐，反应，纯化，冷冻干燥，得到甲基丙烯酰化透明质酸钠；
(2)甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠的制备：将氧化海藻酸钠水溶液的pH值调节为8；按质量比m氧化海藻酸钠：m甲基丙烯酸酐＝1:8加入甲基丙烯酸酐，反应，纯化，冷冻干燥，得到甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠；
(3)复合水凝胶前体溶液的制备：
①甲基丙烯酰化透明质酸钠打印前体的制备：往水中依次加入光引发剂Irgacure2959、氯化钙、步骤(1)制备的甲基丙烯酰化透明质酸钠，每次加入的物质完全溶解后再加入下一种物质，得到甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液；其中，光引发剂Irgacure2959的浓度为0.5wt％、氯化钙的浓度为2wt％，甲基丙烯酰化透明质酸钠的浓度为2wt％；
②甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠打印前体的制备：配制含光引发剂Irgacure2959的水溶液，然后再往其中加入步骤(2)制备的甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠，得到甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液；其中，光引发剂Irgacure2959的浓度为0.5wt％，甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠的浓度为2wt％；
③复合打印前体溶液的制备：将步骤①和步骤②分别所配制而成的甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液和甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液混合，得到复合打印前体溶液；
(4)支架的3D打印：
①将复合打印前体溶液装入37℃预热的微量输出泵，打印喷头37℃预热，接收平台为盛有氯化钙溶液的培养皿；
②设置打印每层支架的紫外光照射时间为10s，紫外光照射强度为10mW/CM2开始打印，打印完成后，将所得的复合水凝胶支架用水冲洗，然后浸泡于磷酸盐缓冲液中；
(5)3D打印的抗菌水凝胶修复支架的制备：
①将盐酸多巴胺溶解于三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲溶液中，配制成浓度为10mg/mL的盐酸多巴胺溶液；然后将经3D打印所制得的复合水凝胶支架浸泡于盐酸多巴胺溶液中，进行反应，用水冲洗，得到聚多巴胺表面修饰处理的复合水凝胶支架；
②抗菌肽LL37溶解于磷酸盐缓冲溶液中，配制成抗菌肽LL37溶液；然后将聚多巴胺表面修饰处理的复合水凝胶支架浸泡于抗菌肽LL37溶液中，静置，然后用水冲洗，得到3D打印的抗菌水凝胶修复支架。
步骤(1)中所述的透明质酸钠优选分子量为1×106～1.2×106kDa的透明质酸钠。
步骤(1)中所述的透明质酸钠水溶液的浓度优选为质量百分比1％。
步骤(1)中所述的pH值优选为通过浓度为5mol/L的NaOH溶液调节。
步骤(1)中所述的反应的条件优选为10℃反应24h。
步骤(1)中所述的纯化的步骤优选为通过截留分子量为14000的透析袋透析3天进行纯化。
步骤(1)中所述的冷冻干燥的条件优选为-80℃。
步骤(2)中所述的氧化海藻酸钠优选为通过高碘酸钾氧化得到的氧化海藻酸钠。
所述的通过高碘酸钾氧化得到的氧化海藻酸钠优选由如下步骤制备得到：按质量比m海藻酸钠：m高碘酸钠＝2:1在海藻酸钠水溶液中加入高碘酸钠，避光搅拌反应，然后加入与高碘酸钠等摩尔量的乙二醇终止反应，再加入无水乙醇使产物析出，抽滤，真空干燥，得到氧化海藻酸钠
所述的海藻酸钠优选为分子量为5×106～8×106kDa的海藻酸钠。
所述的海藻酸钠水溶液的浓度优选为质量百分比2％。
所述的避光搅拌反应的时间优选为24小时。
所述的真空干燥的温度优选为37℃。
步骤(2)中所述的氧化海藻酸钠水溶液的浓度为质量百分比10％。
步骤(2)中所述的pH值优选为通过浓度为5mol/L的NaOH溶液调节。
步骤(2)中所述的反应的条件优选为10℃反应24h。
步骤(2)中所述的纯化的步骤优选为通过截留分子量为14000的透析袋透析3天进行纯化。
步骤(2)中所述的冷冻干燥的条件优选为-80℃。
步骤(3)③中所述的甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液和所述的甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液按质量比20～80：20～80配比混合；优选为按质量比20：20～80配比混合。
步骤(4)中所述的3D打印优选为使用3D systems ProX 800打印机进行打印。
步骤(4)①中所述的氯化钙溶液的浓度为质量百分比2％，温度为4℃。
步骤(4)②中所述的水优选为去离子水。
步骤(4)②中所述的磷酸盐缓冲液优选为4℃、0.1M、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。
步骤(5)①中所述的三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲溶液优选为0.1M、pH为8.5的三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲溶液。
步骤(5)①中所述的盐酸多巴胺溶液的用量为能浸没过聚多巴胺表面修饰处理的复合水凝胶支架为宜。
步骤(5)①中所述的反应的条件优选为于无菌环境中放置3～4小时。
步骤(5)①中所述的水优选为蒸馏水。
步骤(5)②中所述的磷酸盐缓冲液优选为4℃、0.1M、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。
步骤(5)②中所述的抗菌肽LL37溶液的浓度优选为10～50μg/mL。
步骤(5)②中所述的抗菌肽LL37溶液的用量为能浸没过聚多巴胺表面修饰处理的复合水凝胶支架为宜；优选为按如下成分的质量比计算得到：甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液：甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液：抗菌肽LL37＝(20～80)：(20～80)：(0.1～0.5)；更优选为按甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液：甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液：抗菌肽LL37＝20：(20～80)：0.1计算得到。
步骤(5)②中所述的静置的条件优选为于无菌环境中放置12～18小时。
步骤(5)②中所述的水优选为灭菌的去离子水。
一种3D打印的抗菌水凝胶修复支架，通过上述制备方法得到。
所述的3D打印的抗菌水凝胶修复支架的压缩强度为0.16～0.29MPa；能有效抑制大肠杆菌和金黄葡萄球菌，且具有良好的细胞相容性。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
该种水凝胶修复支架具有良好的生物相容性和抗菌性能，且具有良好的力学性能、合适的降解速率和血管化能力。本发明通过光固化3D打印制备水凝胶，再通过表面修饰的方法将生物抗菌肽LL-37固定在支架表面上，整个制备过程耗时短，方法简单，容易实现产业化，而且支架的大小及几何形状可以根据受损部位去定制。
附图说明
图1是力学性能测试结果图。
图2是抗菌性能测试结果图。
图3是细胞相容性测试结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明按如下步骤制备得到3D打印的抗菌水凝胶修复支架：
(1)甲基丙烯酰化透明质酸钠的制备：取一定量的透明质酸钠(1×106～1.2×106kDa)溶解于蒸馏水中配制成质量浓度为1％的透明质酸钠溶液，然后加入浓度为5mol/L的NaOH溶液调节透明质酸钠溶液的pH至8.5；按质量比m透明质酸钠：m甲基丙烯酸酐＝1:7.8加入甲基丙烯酸酐，10℃下反应24h后，加入到透析袋(截留分子量为14000)中流水透析3天，于-80℃进行冷冻干燥，即得甲基丙烯酰化透明质酸钠，置于-20℃冰箱冷藏备用。
(2)甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠的制备：将海藻酸钠溶解于蒸馏水中配制成质量浓度为2％的海藻酸钠(5×106～8×106kDa)溶液，然后按质量比m海藻酸钠：m高碘酸钠＝2:1加入高碘酸钠，避光搅拌24h，然后加入与高碘酸钠等摩尔量的乙二醇终止反应，再加入大量的无水乙醇使产物析出，抽滤，37℃真空干燥，得到氧化海藻酸钠。取一定量的氧化海藻酸钠溶解于蒸馏水中配成质量浓度为10％的氧化海藻酸钠溶液，然后加入浓度为5mol/L的NaOH溶液调节氧化海藻酸钠溶液的pH至8；按质量比m氧化海藻酸钠：m甲基丙烯酸酐＝1:8加入甲基丙烯酸酐，10℃下反应24h后，加入到透析袋(截留分子量为14000)中流水透析3天，于-80℃冷冻干燥，即得甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠，置于-20℃冰箱冷藏备用。
(3)复合水凝胶前体溶液的制备：
①甲基丙烯酰化透明质酸钠打印前体的制备：往水中依次加入光引发剂Irgacure2959、氯化钙、步骤(1)制备的甲基丙烯酰化透明质酸钠，每次加入的物质完全溶解后再加入下一种物质，得到甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液(HA-MA)，备用；其中，光引发剂Irgacure2959的浓度为0.5wt％、氯化钙的浓度为2wt％，甲基丙烯酰化透明质酸钠的浓度为2wt％；
②甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠打印前体的制备：配制含光引发剂Irgacure2959的水溶液，然后再往其中加入步骤(2)制备的甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠，得到甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液(OMA)，备用；其中，光引发剂Irgacure2959的浓度为0.5wt％甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠的浓度为2％；
③复合打印前体的制备：将步骤①和步骤②分别所配制而成的甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液(HA-MA)和甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液(OMA)按质量比m(HA-MA)：m(OMA)＝1:1～4混合，备用；
(4)支架的3D打印：使用3D systems ProX 800打印机进行打印；
①将复合水凝胶前体溶液装入37℃预热的微量输出泵，打印喷头37℃预热，接收平台为一个盛有4℃、质量浓度为2％的氯化钙溶液的培养皿；
②设置打印每层支架的紫外光照射时间为10s，紫外光照射强度为10mW/CM2开始打印，打印完成后，将所得的HA-MA/OMA复合水凝胶支架用去离子水冲洗，然后浸泡于4℃的磷酸盐缓冲液(0.1M、pH＝7.4的PBS，下同)中，备用；
(5)抗菌水凝胶修复支架的制备：
①将盐酸多巴胺溶解于0.1M、pH为8.5的三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲溶液中，配制成浓度为10mg/mL的盐酸多巴胺溶液，然后将经仿生打印所制得的HA-MA/OMA复合水凝胶支架浸泡于盐酸多巴胺溶液中，于无菌超净台中放置3-4小时后，用蒸馏水冲洗，得到聚多巴胺表面修饰处理的HA-MA/OMA复合水凝胶，备用。
②抗菌肽LL37溶解于pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，轻柔搅拌1小时，配制成浓度为10～50μg/mL的抗菌肽LL37溶液，然后将聚多巴胺表面修饰处理的HA-MA/OMA复合水凝胶浸泡于抗菌肽LL37溶液中置于无菌超净台中12-18小时，然后用灭菌的去离子水冲洗，得到抗菌水凝胶修复支架。其中，抗菌肽的用量按m(HA-MA)：m(OMA)：m(抗菌肽LL37)＝20～80：20～80：0.1～0.5计算。
实施例1
本发明按上述方法制备抗菌水凝胶修复支架，其中：所用的透明质酸钠的分子量为1×106kDa；海藻酸钠的的分子量为5×106kDa；复合打印前体的制备步骤中，HA-MA的用量为20质量份，OMA的用量为20质量份；10mg/mL的盐酸多巴胺溶液30体积份；抗菌肽LL37的用量为0.1质量份，其使用时的浓度为10μg/mL；聚多巴胺表面修饰处理的HA-MA/OMA复合水凝胶浸泡于抗菌肽LL37溶液中置于无菌超净台中的时间为12小时。
实施例2
本发明按上述方法制备抗菌水凝胶修复支架，其中：所用的透明质酸钠的分子量为1×106kDa；海藻酸钠的的分子量为5×106kDa；复合打印前体的制备步骤中，HA-MA的用量为20质量份，OMA的用量为40质量份；10mg/mL的盐酸多巴胺溶液30体积份；抗菌肽LL37的用量为0.1质量份，其使用时的浓度为30μg/mL；聚多巴胺表面修饰处理的HA-MA/OMA复合水凝胶浸泡于抗菌肽LL37溶液中置于无菌超净台中的时间为18小时。
实施例3
本发明按上述方法制备抗菌水凝胶修复支架，其中：所用的透明质酸钠的分子量为1×106kDa；海藻酸钠的的分子量为5×106kDa；复合打印前体的制备步骤中，HA-MA的用量为20质量份，OMA的用量为80质量份；10mg/mL的盐酸多巴胺溶液40体积份；抗菌肽LL37的用量为0.1质量份，其使用时的浓度为50μg/mL；聚多巴胺表面修饰处理的HA-MA/OMA复合水凝胶浸泡于抗菌肽LL37溶液中置于无菌超净台中的时间为12小时。
实施例4
对比例：(一种寡聚氨基酸与海藻酸钠复合的杂化抗菌水凝胶(参考申请号为CN201610204907.9实施例1制备得到)。
实验组1～3：为实施例1～3所得的3D打印的抗菌水凝胶修复支架。
(1)力学性能的检测：将上述实施例1～3所制备的3D打印的抗菌水凝胶修复支架与对比例进行力学评价实验，采用Instron 5575力学试验机测试对比例和实验组的压缩性能，压缩速率设置为0.5mm/min，用于测试的样品的直径为6mm，高为4.5mm。测试前仪器按说明书调零，而且之后每次测试采用自动复位功能测试，每组样品设置5个平行样，实验结果如图1示。
可以看到通过本发明所公开的方法所制得的水凝胶修复支架实施1～3的压缩强度明显较对比例要高，实施例3的压缩强度为对比例的4倍，压缩强度达0.29MPa。
(2)抗菌性能的检测：将上述实施例1～3所制备的3D打印的抗菌水凝胶修复支架与对比例进行抗菌能力评价实验(按QB/T 2591-2003进行实验)，对比实施例1～3和对比例对大肠杆菌(ATCC25922)、金黄葡萄球菌(ATCC25923)触24小时和48小时后的抑菌效果。实验结果如图2示。
从结果可见实施例1～3在与大肠杆菌和金黄葡萄球菌接触24小时后抑菌率均能达到90％以上，而对比例均为80％左右，证明实施例1～3均具有强效，作用时间快的广谱抗菌性能，而在与大肠杆菌和金黄葡萄球菌接触48小时后对比例相对应的抑菌率分别降至65％和58％，而实施例1～3对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的抑菌率在48小时后无明显变化，证明实施例1～3均具有长效的抗菌能力。
(3)细胞毒性评价实验
将上述实施例1～3所制备的3D打印的抗菌水凝胶修复支架与对比例进行细胞毒性评价实验(按国标GB/T 16886.5-2003进行实验)，对比实施例1～3和对比例对的实验结果如图3示。
细胞毒性检测结果显示实施例1～3在与骨髓间充质细胞共培养24小时和48小时后其对应的细胞相对增殖率均在90％以上，细胞毒性评级为0级，证明其具有良好的细胞形容性，而对比例与骨髓间充质细胞共培养24小时和48小时后其对应细胞相对增殖率均在70％左右，细胞毒性评级为3级，具有严重的细胞毒性。此外，共培养时间的延长实施例1～3的相对相比增殖率均有明显提高，实施例2和3在48小时后其细胞相对增殖率均较阴性组要高(均高于100％)，证明采用本发明所公开的制备方法所制得的抗菌水凝胶修复支架能促进骨髓间充质细胞的生长，有良好的生物相容性。
(4)血管内皮生长因子(VEGF)的表达检测
将上述实施例1～3所制备的3D打印的抗菌水凝胶修复支架与对比例进行血管内皮生长因子(VEGF)的表达检测(利用实时荧光定量法RT-PCR进行检测)具体步骤如下：
取第一代的血管内皮细胞(BNCC338510，北京北纳生物)制成细胞浓度为2×106个/mL的细胞悬浮液。将分别取100μL的细胞悬浮液接种于实验组和对比例样品(均制成直径5mm，长4mm的圆柱状)中，置于细胞培养箱中3小时，待细胞完全黏附于样品材料上后加含5％牛血清蛋白的EBM-2培养基至覆盖样品材料，然后继续培养；分别于培养1天和3天时，采用实时荧光定量PCR检测实验组和对比例组的细胞的VEGF，上游引物序列为：5'-TCACCGCCTCGGCTTGTCAC-3'，下游引物序列为：3'-GTTCTGTCGTCTTTCAAGTA-5'。采用标准三步法进行反应:预变性温度设置为95℃、时间为10min，1个循环；变性温度为95℃、时间为10s，退火温度为56℃、时间为20s，延伸72℃、15s，40个循环。将循环数结果换算为2-ΔΔCt值，
对比实施例1～3和对比例的实验结果如表1示。VEGF为刺激血管新生作用较为明确的生长因子，可特异性作用于血管内皮细胞，发挥其促分裂、趋化的作用，并可增加血管通透性，诱导血管产生多种基质以生成并降解相关的大分子物质，从表1数据可知实施例1～3的VEGF表达值均较对比例的表达值明显要高，证明采用本发明所公开的制备方法所制得的抗菌水凝胶修复支架具有良好的血管化能力。
表1 实验组和对比例的VEGF的表达值
1天 3天
实施例1 1.31±0.21 2.71±0.15
实施例2 1.64±0.34 2.86±0.27
实施例3 1.75±0.15 3.21±0.31
对比例 1.00±0.07 1.02±0.02
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所）
<120> 一种3D打印的抗菌水凝胶修复支架及其制备方法
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 上游引物
<400> 1
tcaccgcctc ggcttgtcac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 下游引物
<400> 2
gttctgtcgt ctttcaagta 20

Claims (8)

1.一种3D打印的抗菌水凝胶修复支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将改性透明质酸钠/改性氧化海藻酸钠水凝胶前体通过光固化3D打印制备复合水凝胶支架，再在其表面修饰抗菌肽LL-37，得到3D打印的抗菌水凝胶修复支架；
所述的改性透明质酸钠为甲基丙烯酰化透明质酸钠；
所述的改性氧化海藻酸钠为甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠；
所述的改性透明质酸钠/改性氧化海藻酸钠水凝胶前体通过如下步骤制备得到：往水中依次加入光引发剂Irgacure2959、氯化钙、甲基丙烯酰化透明质酸钠，混合均匀，得到甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液；将含光引发剂Irgacure2959的水溶液和甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠混匀，得到甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液；将甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液和甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液混合，得到改性透明质酸钠/改性氧化海藻酸钠水凝胶前体；
所述的表面修饰抗菌肽LL-37的具体步骤如下：将复合水凝胶支架浸泡于盐酸多巴胺溶液中，得到聚多巴胺表面修饰处理的复合水凝胶支架；再将聚多巴胺表面修饰处理的复合水凝胶支架浸泡于抗菌肽LL37溶液中，得到3D打印的抗菌水凝胶修复支架。
2.根据权利要求1所述的3D打印的抗菌水凝胶修复支架的制备方法，其特征在于：
所述的光固化3D打印的条件为：紫外光照射时间为10 s，紫外光照射强度为10 mW/CM2。
3.根据权利要求1或2所述的3D打印的抗菌水凝胶修复支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）甲基丙烯酰化透明质酸钠的制备：将透明质酸钠水溶液的pH值调节为8.5；按质量比m透明质酸钠：m甲基丙烯酸酐 = 1:7.8 加入甲基丙烯酸酐，反应，纯化，冷冻干燥，得到甲基丙烯酰化透明质酸钠；
（2）甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠的制备：将氧化海藻酸钠水溶液的pH值调节为8；按质量比m氧化海藻酸钠：m甲基丙烯酸酐= 1:8 加入甲基丙烯酸酐，反应，纯化，冷冻干燥，得到甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠；
（3）复合水凝胶前体溶液的制备：
①甲基丙烯酰化透明质酸钠打印前体的制备：往水中依次加入光引发剂Irgacure2959、氯化钙、步骤（1）制备的甲基丙烯酰化透明质酸钠，每次加入的物质完全溶解后再加入下一种物质，得到甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液；其中，光引发剂Irgacure2959的浓度为0.5wt%、氯化钙的浓度为2wt%，甲基丙烯酰化透明质酸钠的浓度为2wt %；
②甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠打印前体的制备：配制含光引发剂Irgacure2959的水溶液，然后再往其中加入步骤（2）制备的甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠，得到甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液；其中，光引发剂Irgacure2959的浓度为0.5wt%，甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠的浓度为2 wt %；
③复合打印前体溶液的制备：将步骤①和步骤②分别所配制而成的甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液和甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液混合，得到复合打印前体溶液；
（4）支架的3D打印：
①将复合打印前体溶液装入37℃预热的微量输出泵，打印喷头37℃预热，接收平台为盛有氯化钙溶液的培养皿；
②设置打印每层支架的紫外光照射时间为10 s，紫外光照射强度为10 mW/CM2开始打印，打印完成后，将所得的复合水凝胶支架用水冲洗，然后浸泡于磷酸盐缓冲液中；
（5）3D打印的抗菌水凝胶修复支架的制备：
①将盐酸多巴胺溶解于三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲溶液中，配制成浓度为10mg/mL的盐酸多巴胺溶液；然后将经3D打印所制得的复合水凝胶支架浸泡于盐酸多巴胺溶液中，进行反应，用水冲洗，得到聚多巴胺表面修饰处理的复合水凝胶支架；
②抗菌肽LL37溶解于磷酸盐缓冲溶液中，配制成抗菌肽LL37溶液；然后将聚多巴胺表面修饰处理的复合水凝胶支架浸泡于抗菌肽LL37溶液中，静置，然后用水冲洗，得到3D打印的抗菌水凝胶修复支架。
4.根据权利要求3所述的3D打印的抗菌水凝胶修复支架的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的透明质酸钠是分子量为1×106～1.2×106kDa的透明质酸钠；
步骤（1）和（2）中所述的反应的条件为10℃反应24h；
步骤（1）和（2）中所述的纯化的步骤为通过截留分子量为14000的透析袋透析3天进行纯化；
步骤（2）中所述的氧化海藻酸钠为通过高碘酸钾氧化海藻酸钠得到的氧化海藻酸钠。
5.根据权利要求4所述的3D打印的抗菌水凝胶修复支架的制备方法，其特征在于：
所述的通过高碘酸钾氧化得到的氧化海藻酸钠由如下步骤制备得到：按质量比m海藻酸钠：m高碘酸钠=2:1在海藻酸钠水溶液中加入高碘酸钠，避光搅拌反应，然后加入与高碘酸钠等摩尔量的乙二醇终止反应，再加入无水乙醇使产物析出，抽滤，真空干燥，得到氧化海藻酸钠。
6.根据权利要求3所述的3D打印的抗菌水凝胶修复支架的制备方法，其特征在于：
步骤（3）③中所述的甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液和所述的甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液按质量比20～80：20～80配比混合；
步骤（5）②中所述的抗菌肽LL37溶液的用量为按如下成分的质量比计算得到：甲基丙烯酰化透明质酸钠水凝胶前体溶液：甲基丙烯酰化氧化海藻酸钠水凝胶前体溶液：抗菌肽LL37=（20～80）：（20～80）：（0.1～0.5）。
7.根据权利要求3所述的3D打印的抗菌水凝胶修复支架的制备方法，其特征在于：
步骤（4）中所述的3D打印为使用3D systems ProX 800打印机进行打印；
步骤（4）①中所述的氯化钙溶液的浓度为质量百分比2%，温度为4℃；
步骤（5）①中所述的反应的条件为于无菌环境中放置3～4小时；
步骤（5）②中所述的静置的条件为于无菌环境中放置12～18小时。
8.一种3D打印的抗菌水凝胶修复支架，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。
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