ES2863023T3 - Composiciones de recubrimiento antimicrobianas - Google Patents

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Abstract

Una composición de recubrimiento antimicrobiana para recubrir artículos que comprende: un péptido de cecropina-melitina, en la que dicho péptido de cecropina-melitina tiene una cisteína en el extremo C-terminal; una nanopartícula unida a dicho péptido de cecropina-melitina en la que dicha nanopartícula es una nanopartícula metálica o una nanopartícula recubierta por una capa metálica, y en la que dicho metal es oro, titanio o mezclas de los mismos; una tiol-PEG-amina; en la que la nanopartícula está funcionalizada por cisteína y tiol-PEG-amina y en la que la composición es adecuada para unirse a la superficie del artículo.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de recubrimiento antimicrobianas
Campo técnico
El contenido dado a conocer se refiere a una composición de recubrimiento antimicrobiana para recubrir artículos que comprende un péptido antimicrobiano; una nanopartícula unida a dicho péptido antimicrobiano; en el que la composición es adecuada para unirse a la superficie del artículo. Dicha composición podría usarse como composición recubrimiento de dispositivos médicos y superficies de laboratorio.
Antecedentes
Se han investigado ampliamente nanopartículas metálicas para aplicaciones de biosensores, administración de fármacos, materiales antimicrobianos y otras aplicaciones biomédicas debido a sus propiedades de resonancia de plasmón superficial (SPR), estabilidad, biocompatibilidad, facilidad de síntesis y funcionalización superficial distintas1. Existen varios informes disponibles en la bibliografía sobre la preparación de nanopartículas metálicas antimicrobianas con un espectro antimicrobiano amplio23. Estos métodos implican o bien múltiples pasos, incluyendo síntesis de nanopartículas, funcionalización superficial y ocupación de materiales antimicrobianos o bien un método en un recipiente para sintetizar nanopartículas con propiedades antimicrobianas3. Sin embargo, existe la posibilidad de que las bacterias puedan adoptar resistencia contra estos nanomateriales debido a su exposición generalizada e indiscriminada a lo largo del tiempo, instigando problemas de salud pública en todo el mundo. Numerosos estudios han documentado la resistencia a la nanoplata y nanoalúmina con respecto a diferentes cepas de bacterias a través de múltiples mecanismos4. De hecho, esta resistencia también puede afectar a la resistencia de las bacterias contra otros tipos de agentes antimicrobianos4. Adicionalmente, la toxicidad de estas nanopartículas para células humanas depende del tamaño, la forma, la funcionalidad y la dosificación, y no se estudian en detalle las respuestas metabólicas e inmunológicas inducidas por estas partículas5.
Existe la necesidad urgente de desarrollar nanomateriales antimicrobianos con propiedades de no desencadenar resistencia a bacterias y toxicidad para las células humanas. Los péptidos antimicrobianos (AMP), descritos más adelante, son una clase prometedora de moléculas para cumplir con estos criterios debido a su modo de acción y representan una nueva generación de antibióticos. Recientemente, las nanopartículas de AMP autoensambladas, los a Mp cargados en nanopartículas de carbohidratos y AMP en combinación con nanopartículas de plata se han usado como potentes agentes antimicrobianos6. La actividad antimicrobiana de los AMP puede verse afectada por la degradación proteolítica y, por lo tanto, se han sintetizado diversos análogos de AMP con longitudes de cadena variables para impedir la degradación7. Por otro lado, la ocupación de péptidos en la superficie de las nanopartículas es un enfoque alternativo para impedir que experimenten degradación proteolítica4f8. Se han usado péptidos con diferentes propiedades biológicas para conjugar las nanopartículas de oro durante la etapa de síntesis para sus aplicaciones biológicas potenciales9. Además, se han sintetizado péptidos modificados mediante ingeniería usando técnicas de selección tales como presentación en fago, en superficie celular y en levadura para sintetizar nanopartículas metálicas10. Estos péptidos no solo se unen específica y fuertemente a una gama de diferentes superficies metálicas, semiconductoras, de óxido y de biomineral, sino que también controlan con precisión la forma y el tamaño de las nanopartículas inorgánicas mineralizadas a partir del átomo hacia arriba10. Sin embargo, surgen varias preguntas sobre el mecanismo de cómo los péptidos controlan la morfología y el tamaño de las nanopartículas. Si se entendiese mejor el mecanismo de síntesis, podrían usarse péptidos biológicamente significativos para sintetizar materiales avanzados para varias aplicaciones en biocatálisis, formación de imágenes, salud y terapéutica. Hasta donde sabemos, no se han hecho esfuerzos para sintetizar nanopartículas de oro antimicrobianas y biocompatibles usando AMP.
Además, las infecciones asociadas a implantes y dispositivos biomédicos son muy comunes en pacientes, lo que plantea serios desafíos para las industrias médica y sanitaria. A menudo se pone en práctica la retirada de implantes y la sustitución por un nuevo implante, lo que de hecho es un procedimiento expansivo. Las biopelículas formadas en la superficie del implante protegen al microorganismo de los antibióticos administrados convencionales y la respuesta inmune del cuerpo humano. Más allá de eso, la exposición de antibióticos durante períodos más largos puede promover el desarrollo de fenotipos de resistencia a los antibióticos, que conducen a efectos devastadores para controlar la infección en ausencia de tratamientos médicos válidos. Se han desarrollado diversos recubrimientos covalentes y no covalentes usando antibióticos (Rai, A.; Prabhune, A.; Perry, C. C. J. Mater. Chem. 2010, 20, 6789. b) Shukla, A.; Avadhany, S. N.; Fang, J. C. Hammond, P. T. Small 2010, 21, 2392. c) Hanna, H.; Benjamin, R.; Chatzinikolaou, I.; Alakech, B.; Richardson, D.; Masfield, P.; Dvorak, T.; Munsell, M.F.; Darouiche, R.; Kantarjian, H.; Raad, I. J. Clin. Oncol. 2004, 22, 3263. d) Aumsuwan, N.; McConnell, M.S. Urban, M. W. Biomacromol. 2009, 10, 623), sales de amonio cuaternario (Lee, S. B.; Koepsel, R. R.; Morley, S. W.; Matyjaszewski, K.; Sun, Y.; Russell. A. J. Biomacromol. 2004, 5, 877. b) Murata, H.; Koepsel. R. R.; Matyjaszewski, K.; Russell, A. J. Biomater. 2007, 28, 4870), derivados de fenol (Chung, D.; Papadakis, S. E.; Yam, K. L. Int. J. Food Sci. Technol. 2003, 38, 165), óxido de titanio (Fu, G.; Vary, P. S.; Lin, C-T. J. Phys. Chem. B 2005, 109, 8889. b) Matsunaga, T.; Tomoda, R.; Nakajima, T.; Nakamura, N.; Komine, T. Appl. Environ. Microbiol. 1988, 54. 1330) y metales pesados tales como plata (Silver, S. Fems Microbiol. Rev. 2003, 27, 341. b) Atiyeh, B. S.; Costagliola, M.; Hayek, S. N.; Dibo, S. A. Burns 2007, 33, 139.
c) Dowling, D. P.; Donnelly, K; McConnell, M. L.; Eloy, R.; Arnaud, M. N. Thin Solid Films 2001, 398, 602) y derivados de estaño (Omae, I. Appl. Organomet. Chem. 2003, 17, 81) para combatir la infección microbiana, sin embargo, hay un éxito limitado con estos recubrimientos para lograr superficies antimicrobianas potentes con menos efecto de citotoxicidad. Otro inconveniente de estas tecnologías es que probablemente los microorganismos desarrollarían resistencia contra estos recubrimientos después de usos frecuentes (Page K; Wilson, M.; Parkin, I. P. J. Mater. Chem.
2009, 19, 3819). Por tanto, existe un creciente interés por desarrollar recubrimientos robustos para implantes biomédicos con actividad antimicrobiana de amplio espectro, que no solo maten los microorganismos e impidan el crecimiento de biopelículas, sino que también tengan menos efecto en el desarrollo de resistencia bacteriana contra recubrimientos.
Como se dijo antes, los péptidos antimicrobianos (AMP), fármacos no clásicos, son alternativos a otros fármacos antimicrobianos debido a sus actividades antimicrobianas de amplio espectro y su capacidad para modular la respuesta inmune y la no toxicidad para las células huésped ((a) Onaizi, S. A.; Leong, S. S. J. Biotechnol. Adv. 2011, 29, 67. b) Costa, F. Carvalho, I. F. Montelaro, R. C. Gomes, P.; Martins, C. L. Acta Biomaterialia 2011, 7, 1431. c) Andreu, D.; Rivas, L. Biopolym. 1998, 47, 4 y Hilpert, K; Elliott, M.; Jenssen, H.; Kindrachuk, J.; Fjell, C. D.; Korner, J.; Winkler, D. F. H.; Weaver, L. L.; Henklein, P.; Ulrich, A. S.; Chiang, S. H. Y.; Farmer, S. W.; Pante, N.; Volkmer, R.; Hancock, R. E. W. Chem. Biol. 2009, 16, 58) Reddy, K. V.; Yedery, R. D.; Aranha, C. Int. J. Antimicrob. Agents 2004, 24, 536.). Los AMP son cortos (15-50 aminoácidos), de naturaleza altamente catiónica, con una gran variación en la carga positiva neta y tienen tendencia a adoptar estructuras anfipáticas ((a) Onaizi, S. A.; Leong, S. S. J. Biotechnol. Adv. 2011, 29, 67. b) Costa, F. Carvalho, I. F. Montelaro, R. C. Gomes, P.; Martins, C. L. Acta Biomaterialia 2011, 7, 1431. c) Andreu, D.; Rivas, L. Biopolym. 1998, 47, 4 y Hilpert, K.; Elliott, M.; Jenssen, H.; Kindrachuk, J.; Fjell, C. D.; Korner, J.; Winkler, D. F. H.; Weaver, L. L.; Henklein, P.; Ulrich, A. S.; Chiang, S. H. Y.; Farmer, S. W.; Pante, N.; Volkmer, R.; Hancock, R. E. W. Chem. Biol. 2009, 16, 58 y Reddy, K. V.; Yedery, R. D.; Aranha, C. Int. J. Antimicrob. Agents 2004, 24, 536; y a) Perron, G. G.; Zasloff, M.; Bell, G. Proc. Biol. Sci. 2006, 273, 251. b) Van't Hof, W.; Veerman, E. C.; Helmerhost, E. J.; Amerongen, A. V. Biol. Chem. 2001, 382, 597). En el último año, muchas estrategias como métodos físicos (ensamblaje capa por capa) ((a) Etienne, O.; Gasnier, C.; Taddei, C.; Voegel, J-C.; Aunis, D.; Schaaf, P. Metz-Boutigue, M-H.; Bolcato-Bellemin, A-L.; Egles, C. Biomater. 2005, 26, 6704. b) Etienne, O.; Picart, C.; Taddei, C.; Haikel, Y.; Dimarcq, J. L.; Schaaf, P.; Voegel, J. C.; Ogier, J. A.; Egles, C. Antimicrob. Agents Chemother. 2004, 48, 3662) y de inmovilización covalente ((a) Bagheri, M.; Beyermann, M.; Dathe, M. A. Antimicrob. Agents Chemotherap. 2009, 53, 1132. b) Haynie, S.L.; Crum, G. A.; Doele, B. A. Antimicrob. Agents Chemotherap. 1995, 39, 301. c) Ferreira, L.; Zumbuehl, A J. Mater. Chem. 2009, 19, 7796) se han notificado en la bibliografía para recubrimientos de AMP en diferentes superficies con mantenimiento de su actividad. Se han estudiado los efectos de diferentes parámetros incluyendo el tipo, la longitud y la flexibilidad de los espaciadores y la orientación y concentración de los AMP sobre la actividad de péptidos inmovilizados para desarrollar implantes y dispositivos antimicrobianos eficientes, seguros y duraderos ((a) Onaizi, S. A.; Leong, S. S. J. Biotechnol. Adv. 2011, 29, 67. b) Costa, F. Carvalho, I. F. Montelaro, R. C. Gomes, P.; Martins, C. L. Acta Biomaterialia 2011, 7, 1431. c) Andreu, D.; Rivas, L. Biopolym.
1998, 47, 4 y Hilpert, K.; Elliott, M.; Jenssen, H.; Kindrachuk, J.; Fjell, C. D.; Korner, J.; Winkler, D. F. H.; Weaver, L. L.; Henklein, P.; Ulrich, A. S.; Chiang, S. H. Y.; Farmer, S. W; Pante, N.; Volkmer, R.; Hancock, R. E. W. Chem. Biol.
2009, 16, 58 y Reddy, K. V.; Yedery, R. D.; Aranha, C. Int. J. Antimicrob. Agents 2004, 24, 536., y a) Perron, G. G.; Zasloff, M.; Bell, G. Proc. Biol. Sci. 2006, 273, 251. b) Van't Hof, W.; Veerman, E. C.; Helmerhost, E. J.; Amerongen, A. V. Biol. Chem. 2001, 382, 597 y a) Bagheri, M.; Beyermann, M.; Dathe, M. A. Antimicrob. Agents Chemotherap.
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En el presente documento se dan a conocer técnicas que se han desarrollado para proporcionar recubrimientos robustos de péptido antimicrobiano (AMP) sobre diversas superficies con actividad antimicrobiana en presencia de suero humano. La cecropinmelitina (CM) con cisteína en el extremo C-terminal se eligió como péptido antimicrobiano para ser inmovilizado sobre las superficies de vidrio y titanio recubiertas con nanopartículas de oro. El péptido CM es un péptido antimicrobiano híbrido con 15 longitudes de aminoácidos, que contiene secuencias de péptidos antimicrobianos de melitina y cecropina-A. Se usaron cistamina y tiol-PEG-amina para funcionalizar superficies para estudiar el efecto de la longitud de cadena y la flexibilidad de ambas moléculas sobre la actividad antimicrobiana del péptido CM ligado. Se inmovilizó una gran cantidad de péptido CM por centímetro cuadrado (1,02 mg/cm2) sobre la superficie funcionalizada con tiol-PEG-amina en comparación con otro método notificado ((b) Gao, G.; Yu, K.; Kindrachuk, J.; Brooks, D. E.; Hancock, R. E. W.; Kizhakkedathu, J. N. Biomacromol. 2011, 12, 3715. c) Gabriel, M.; Nazmi, K.; Veerman, E. C.; Amerongen, A. V. N.; Zentner, A. Bioconj.Chem. 2006, 17, 548 y Gao, G.; Lange, D.; Hi/pert, K; Ifindrachuk, J.; Zou, Y.; Cheng, J. T. J.; Kazemzadeh-Narbat, M.; Yu, K.; Wang, H.; Straus, S. K.; Brooks, D. E.; Chew, B. H.; Hancock, R. E. W.; Kizhakkedathu, J. N. Biomater. 2011, 32, 3899 y Kazemzadeh-Narbat, M.; Kindrachuk, J.; Duan, K.; Jenssen, H.; Hancock, R. E. W.; Wang, R. Biomater. 2010, 31, 9519). Una pequeña cantidad de péptido CM ligado a la superficie funcionalizada con cistamina actúa como bacteriostático, mientras que una gran cantidad ligada a una superficie funcionalizada con cistamina o tiol-PEG-amina actúa como bactericida, lo que se respalda mediante el análisis AFM. El péptido CM ligado a las superficies de titanio recubiertas con nanopartículas de oro mantiene la actividad antimicrobiana en presencia de suero humano con una excelente capacidad de reutilización durante cinco ciclos.
El documento US2008/292671 da a conocer un recubrimiento antimicrobiano que comprende poli-L-lisina y nanopartículas de plata que es adecuado para unirse a la superficie de artículos. Sin embargo, el documento no da a conocer nanopartículas metálicas unidas a dicho péptido antimicrobiano, siendo dichas nanopartículas nanopartículas metálicas o una nanopartícula cubierta por una capa metálica, y siendo dicho metal oro, titanio o mezclas de los mismos.
El documento WO2007/095393 da a conocer un dispositivo médico recubierto con un péptido antimicrobiano, incluyendo cecropina-melitina con cisteína en el extremo C-terminal. También se da a conocer el uso de ligaduras de PEG, así como el uso de grupos tiol o amina para reaccionar y unirse con el sustrato. Sin embargo, no se enseñan nanopartículas metálicas o nanopartículas con un recubrimiento metálico, que están funcionalizadas por cisteína y tiol-PEG-amina, en las que el metal es oro, titanio o mezclas de los mismos.
El documento WO2010/014940 da a conocer conjugados del antibiótico peptídico polimixina B con nanopartículas de oro, que se someten a prueba para determinar su actividad antimicrobiana.
Sumario
La presente invención se refiere a una composición de recubrimiento antimicrobiana para recubrir artículos que comprende:
un péptido de cecropina-melitina, teniendo dicho péptido de cecropina-melitina una cisteína en el extremo C-terminal;
una nanopartícula unida a dicho péptido de cecropina-melitina, siendo dicha nanopartícula una nanopartícula metálica o una nanopartícula cubierta por una capa metálica, y siendo dicho metal oro, titanio o mezclas de los mismos;
una tiol-PEG-amina;
estando la nanopartícula funcionalizada por cisteína y tiol-PEG-amina y siendo la composición adecuada para unirse a la superficie del artículo.
La invención se refiere también a un artículo recubierto con la composición de recubrimiento antimicrobiana anterior.
Las nanopartículas son nanopartículas metálicas o una nanopartícula cubierta por una capa metálica, en las que el metal es oro o titanio, o mezclas de los mismos, y las nanopartículas tienen un tamaño de entre 10-100 nm, preferiblemente 15-50 nm, más preferiblemente 20-30 nm.
En otra realización de la composición de recubrimiento antimicrobiana descrita, la composición puede comprender además un aglutinante, más preferiblemente un polímero, incluso más preferiblemente puede ser un policatión o un polianión. En una realización preferible dicho polímero puede ser una polidopamina.
En otra realización de la composición de recubrimiento antimicrobiana descrita, el aglutinante puede unirse a la superficie del artículo mediante calentamiento.
En otra realización de la composición de recubrimiento antimicrobiana descrita, la composición puede comprender además un tampón, preferiblemente seleccionado del siguiente grupo: TAPS, bicina, Tris, tricina, TAPSO, HEPES, TES, MOPS, PIPES, cacodilato, SSC, MES.
En otra realización de la composición de recubrimiento antimicrobiana descrita, la concentración de péptido antimicrobiano puede ser de entre 0,5 y 1 mM, preferentemente entre 0,20 y 0,10 mM.
En otra realización de la composición de recubrimiento antimicrobiana descrita podría usarse en medicina, preferentemente para recubrir un artículo con la composición antimicrobiana descrita. Más preferiblemente dicho artículo es un dispositivo médico, incluso más preferiblemente dicho dispositivo médico es un implante, un depresor de lengua, un termómetro médico, un medidor de azúcar en sangre, un robot médico, un implante de microchip, una herramienta quirúrgica o una neuroprótesis.
Otro aspecto se refiere a un proceso para recubrir artículos con la composición de recubrimiento antimicrobiana descrita que comprende las siguientes etapas:
• calentar una disolución acuosa que comprende ácido cloroáurico;
• añadir citrato de sodio y calentar la mezcla;
• limpiar el artículo;
• sumergir el artículo en una disolución que comprende un péptido antimicrobiano para funcionalizar el artículo; • sumergir el artículo funcionalizado en dicha mezcla calentada.
Descripción de los dibujos
Las figuras que se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones representan realizaciones del contenido de la divulgación, todas las demás son figuras de referencia
Figura 1: Espectros UV-Vis dependientes del tiempo de nanopartículas de oro sintetizadas en presencia de péptido CMC en condiciones de HH (A), HW (B) y WH (C) y WW (D).
Figura 2: Espectros UV-Vis dependientes del tiempo de nanopartículas de oro sintetizadas usando HEPES 200 en presencia de péptido CMC (A) y HEPES 100 mM en presencia de péptido CM (B). (C) Espectros UV-Vis de nanopartículas de oro sintetizadas usando HEPES 100 en ausencia de péptido (curva 1), en presencia de cisteína 0,25 mM (curva 2) y cisteína 0,25 mM y péptido CM (curva 3). (D) Espectros UV-Vis de nanopartículas de oro sintetizadas en presencia de péptido CMC usando HEPES 100 mM a pH 5 (curva 1), pH 6 (curva 2) y pH 7,5 (curva 3).
Figura 3: Imágenes de TEM representativas de nanopartículas de oro sintetizadas usando HEPES 100 mM en condiciones de HH (A), HW (B) W h (C) y (D) HEPES 200 mM en condición de HH en presencia de péptido CMC. (E) Imagen de TEM de nanopartículas de oro sintetizadas usando HEPES 100 mM en ausencia de péptido. (F) Imagen de TEM de nanopartículas de oro sintetizadas usando tampón HEPES 100 mM en presencia de péptido CM.
Figura 4: Imágenes de TEM representativas de nanopartículas de oro sintetizadas usando tampón HEPES 100 mM en presencia de cisteína (A) y cisteína y péptido CM (B). Nanopartículas de oro sintetizadas usando HEPES 100 mM a pH 5 (C) y pH 6 (D) en presencia de péptido CMC.
Figura 5: (A) Análisis de TGA de nanopartículas de oro sintetizadas en ausencia de péptido CMC (curva 1), y la presencia de péptido CMC en condiciones de WH (curva 2), HW (curva 3) y HH (curva 4). (B) Análisis de FTIR del péptido CMC (curva 1) y nanopartículas de oro sintetizadas en HH (curva 2), HW (curva 3), WH (curva 4). Curva 5, la figura 5B corresponde al espectro de FTIR de nanopartículas de oro sintetizadas usando tampón HEPES en ausencia de péptido CMC. Actividad antimicrobiana de diferente cantidad de Au NP sintetizadas con péptido CMC contra E. coli (C) y S. aureus (D).
Figura 6 : (A) Espectros UV-Vis de HH-Au NP (curva 1), después de incubarse con suero humano al 10 % (curva 2) y 1 mg/ml de tripsina (curva 3). Un cuadro de la figura A muestra espectros de UV-Vis de Au NP reducidas con ácido cítrico funcionalizadas con tiol-PEG (curva 1) y después de incubarse con suero humano al 10 % (curva 2). (B) Prueba de actividad antimicrobiana de HH-Au NP tratadas con suero humano y tripsina y péptido CMC tratado con tripsina contra E. coli.
Figura 7: Análisis del tamaño de partícula de nanopartículas de oro sintetizadas en presencia de péptido CMC usando HEPES 100 mM (pH 7,5) en condiciones de HH (A), HW (B) y WH (C), y HEPES 200 mM (pH 7,5) (D). Análisis del tamaño de partícula de nanopartículas de oro sintetizadas en presencia de péptido CM (E), cisteína (F) y cisteína y péptido CM (G). Análisis del tamaño de partícula de nanopartículas de oro sintetizadas en presencia de péptido CMC usando HEPES 100 mM a pH 5 (H) y pH 6 (I).
Figura 8 : Imágenes de TEM de bajo (A) y alto aumento (B) representativas de nanopartículas de oro sintetizadas en presencia de péptido CMC a pH 5.
Figura 9: Prueba de actividad antimicrobiana de diferentes concentraciones de péptido CMC contra E. coli.
Figura 10: Estudio de la actividad antimicrobiana de HH-Au NP almacenadas durante diferentes periodos y capacidad de reutilización contra E. coli.
Figura 11 -(A) El espectro UV-Vis de la disolución de nanopartículas de oro (B) Imagen de TEM de nanopartículas de oro sintetizadas usando el método de citrato (C) Imagen de AFM de la superficie de vidrio recubierto con nanopartículas de oro.
Figura 12 -(A) Cuantificación de grupos de aminas sobre superficies recubiertas con cistamina y tiol-PEG-amina a diferentes tiempos de incubación (B) Estimación del péptido CM inmovilizado sobre superficie recubierta con nanopartículas de oro (curva 1), superficies recubiertas con oro funcionalizadas con cistamina (curva 2), tiol-PEG-amina (curva 3), cistamina-sulfo GMBS (curva 4) y tiol-PEG-amina-sulfo GMBS (curva 5).
Figura 13 - Actividad antimicrobiana del péptido CM recubierto sobre superficies CS y NS contra Escherichia coli (A y B) y Staphilococcus aureus (C y D).
Figura 14 - Imágenes de AFM en modo de altura representativas de Escherichia coli tratada con péptido CM inmovilizado sobre superficies NS (A), CS (B) y control (E. coli ha crecido en disolución). Imágenes de modo de fase (D-F) y análisis de sección transversal (G-I) de las imágenes de modo de altura correspondientes (A-C).
Figura 15 -(A) Actividad antimicrobiana del péptido CM unido aleatoriamente sobre una superficie recubierta con Au NP. (B) Actividad antimicrobiana del péptido CM unido sobre diferentes proporciones de superficies de Au NP modificadas con tiol-PEG-amina y tiol-PEG-ácido. (C) Actividad antimicrobiana del péptido CM unido a una superficie de Ti recubierta con Au NP modificadas con N:C 1:1. (D) Estudio de capacidad de reutilización del péptido CM unido sobre la superficie de Ti recubierta con Au NP modificadas con N:C 1:1.
Figura 16 - Efecto del péptido CM soluble sobre la citotoxicidad de fibroblastos dérmicos humanos (NDHF) (7A) y de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) (7B). * p<0,05.
Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a una composición de recubrimiento antimicrobiana para recubrir artículos que comprende un péptido antimicrobiano; una nanopartícula unida a dicho péptido antimicrobiano; siendo la composición adecuada para unirse a la superficie del artículo.
Más preferiblemente: las nanopartículas son adecuadas para unirse a la superficie del artículo mediante calentamiento, o la composición comprende además un aglutinante para unir la composición a la superficie del artículo.
En el presente contenido, se estudió el impacto de las concentraciones de péptido antimicrobiano (por ejemplo: (cecropina-meletina) y tampón (por ejemplo: HEPES - ácido (4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico)), el pH del tampón y la cadena peptídica sobre el proceso de formación de nanopartículas de oro en condiciones ambientales usando enfoques experimentales y de modelado molecular. Se usan péptidos de cecropina-meletina (CM) con y sin cisteína en el extremo C-terminal para la síntesis de nanopartículas de oro. Se encuentra que el grupo tiol de residuos de cisteína desempeña un papel crítico en el control del tamaño y de la morfología de las nanopartículas de oro a través de los procesos de maduración digestiva y reactividad superficial. Las nanopartículas de oro ocupadas con péptido CM tienen excelentes propiedades de matar bacterias Gram-positivas y Gram-negativas en el intervalo de MIC de 10 |ig/ml en presencia de suero humano junto con resistencia a la degradación por proteasa y biocompatibilidad para células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y de fibroblastos dérmicos humanos normales (NDHF) hasta una concentración de 100 |ig/ml.
Además, se cree que la colonización bacteriana y las infecciones posteriores son una de las principales causas del fallo de los implantes biomédicos. Existen varios enfoques de recubrimientos antibióticos que usan sales de amonio cuaternario, policatión y materiales antimicrobianos fotosensibilizadores, sin embargo ninguno de ellos tuvo éxito debido a una menor actividad antimicrobiana y un mayor efecto de citotoxicidad. En el presente documento se describe un procedimiento para proporcionar un recubrimiento robusto sobre superficies de vidrio y titanio recubiertas con nanopartículas de oro usando péptido de cecropina-melitina (CM). El péptido CM se injertó covalentemente sobre superficies funcionalizadas con cistamina y tiol-PEG-amina usando el biligador sulfo-GMBS con el mantenimiento de su potente actividad antimicrobiana. Una pequeña cantidad de péptido CM de ligado sobre la superficie funcionalizada con cistamina-sulfo-GMBS actúa como bacteriostático mientras que una gran cantidad de péptido CM ligado sobre ambas superficies actúa como bactericida. El péptido CM ligado sobre monocapas autoensambladas binarias de tiol-PEG-amina y tiol-PEG-ácido tiene una potente actividad antimicrobiana en presencia de un 20 % de suero humano con excelente capacidad de reutilización de hasta 5 ciclos.
Preparación y caracterización de nanopartículas
Materiales
Se usaron HAuCl4.3H2O, NaH2PO4, Na2HPO4 (preferiblemente, Sigma-Aldrich) y HEPES (preferiblemente, Anal Chem) tal como se recibieron. Cecropina-melettina con cisteína (KWKLFKKIGAVLKVLC) y sin péptidos (KWKLFKKIGAVLKVL), preferiblemente de Caslo Laboratory, Dinamarca. Suero humano AB, preferiblemente, de Invitrogen.
Métodos
Se disolvieron inicialmente los péptidos CMC (péptido de cecropina-meletina con cisteína) y CM (cecropina-meletina sin cisteína) 0,5 mM en 50 |il de DMF seguido de la adición de 950 |il de HEPES (100 mM, pH 7,5) o agua milli-Q. Se añadieron iones de oro en disoluciones peptídicas (0,25 mM) para obtener la concentración de oro final de 0,5 mM en diferentes condiciones para la síntesis de nanopartículas de oro a 25 °C (tabla SI 1):
Figure imgf000007_0001
Tabla SI 1: Diferentes condiciones usadas para la síntesis de nanopartículas de oro en presencia de péptido CMC.
Se registraron espectros UV-Vis dependientes del tiempo, preferiblemente, usando un lector de microplacas BioTek synergy MX para monitoizar la reducción de iones de oro. También se sintetizaron nanopartículas de oro usando HEPES con una concentración similar de iones de oro sin péptidos. Para comprender el efecto del grupo tiol, se añadió cisteína 0,25 mM disuelta en HEPES en disoluciones de reducción que contenían iones de oro (0,5 mM) y HEPES (100 mM) o iones de oro, HEPES y péptido CM (0,25 mM) en la condición de HH. Se llevaron a cabo mediciones de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de muestras de nanopartículas de oro en Jeol. Se midió un mínimo de 100 nanopartículas usando software Image J para el análisis del tamaño de partícula. Las disoluciones de nanopartículas de oro sintetizadas se centrifugaron a 14000 rpm seguido de lavado con agua mill-Q para eliminar péptidos no reaccionados y HEPES. Las nanopartículas de oro centrifugadas se congelaron y secaron en frigorífico a 223 K. El análisis termogravimétrico (TGA) de nanopartículas de oro ocupadas con péptidos y nanopartículas de oro sintetizadas sin péptidos se realizó usando un intervalo de temperatura de 30-600 °C a una velocidad de calentamiento de 10 °C/min en presencia de gas de N2. Se analizó la unión del péptido sobre la superficie de nanopartículas de oro, preferiblemente mediante espectroscopía FTIR en modo ATR usando un espectrofotómetro JASCO a resoluciones de 4 citt1 con 64 barridos. Se midió el potencial Zeta (Q) de las nanopartículas de oro sintetizadas después de la centrifugación y la redispersión en HEPES, preferiblemente, usando un instrumento Brukerheaven a temperatura ambiente.
Pruebas de actividad antimicrobiana:
Se hicieron crecer S. aureus y E. coli a 37 °C y se mantuvieron sobre placas LB (preferiblemente, caldo Luria-Bertani con agar al 1,5 %). También se hicieron crecer bacterias en medios LB durante la noche a 37 °C y se cuantificaron los recuentos celulares mediante mediciones de DO 600. Diferentes cantidades de nanopartículas de oro ocupadas con péptidos, péptido (5-10 |ig/ml) y nanopartículas de oro reducidas con HEPES (10 |ig/ml) se añadieron a suspensiones bacterianas (105 bacterias/ml) en presencia de suero humano al 10 % y se incubaron durante 4 h a 37 °C. Se tomaron alícuotas de 100 |il de las respectivas suspensiones a intervalos de 2 h y se diluyeron en tampón PBS para dar 103 bacterias por ml y sembraron en placas de agar LB seguido de incubación a 37 °C. Se contaron las colonias después de 24 h de incubación. En otros experimentos, las nanopartículas de oro reducidas con ácido cítrico se funcionalizaron con 1 mg/ml de mPEG-tiol (5 kDa). Se sintetizaron nanopartículas de oro usando ácido cítrico tal como se describió anteriormente (11). Las nanopartículas de oro recubiertas con PEG y péptido CMC se incubaron con suero humano al 10 % durante 2 horas a 4 °C seguido de centrifugación a 14000 rpm para descartar suero humano libre. De manera similar, para estudiar la degradación por proteasa, las nanopartículas de oro recubiertas con CMC y los péptidos CMC desnudos se trataron con 1 mg/ml de tripsina (tampón fosfato pH 8) durante 2 h a 37 °C. Después de 2 h de reacción, la disolución de nanopartículas se sometió a centrifugación para eliminar la tripsina. Se realizó una prueba antimicrobiana con suero humano y nanopartículas de oro ocupadas con péptido tratado con tripsina contra E. coli.
Resultados:
La cinética de crecimiento de nanopartículas de oro sintetizadas en diferentes condiciones (HH, HW, WH y WW) usando tampón HEPES (100 mM y pH 7,5) y péptido de cecropina-meletina (CMC) (0,25 mM) a 25 °C se siguió mediante espectroscopía UV-Vis. La figura 1 muestra espectros UV-Vis de disoluciones de nanopartículas de oro sintetizadas en función del tiempo de reacción. Los espectros UV-Vis muestran claramente una banda de resonancia de plasmón superficial (SPR) intensa a 530 nm después de 7 días de reacción para todas las condiciones (figura 1A-C). La banda de SPR a 530 nm significa la síntesis de nanopartículas de oro esféricas con un tamaño que oscila entre 9 y 14 nm en todas las condiciones (figura 3A-C). La tasa de reducción de iones de oro fue más rápida en la condición de HH, alcanzándose la saturación en 7 días en comparación con las condiciones de HW y WH, en las que la saturación se alcanzó en 9 días (figura 1A-C). Los iones de oro se redujeron mediante una cantidad excesiva de HEPES, dando como resultado un aspecto de la disolución de amarillo claro a rosa después de 2 días en todas las condiciones. Los grupos tiol de péptidos CM forman un complejo con átomos de Au(0) a través de interacciones de electrostáticas y/o coordinadas en la fase inicial de reacción, conduciendo a un retraso en la formación de núcleos y posteriormente crecimiento de nanopartículas93, 9c. Este fenómeno podría explicarse por la inhibición de la reacción superficial, que actúa como etapa limitante del crecimiento, en la que los complejos de péptido CMC-Au(O) retardan la reacción superficial con iones de oro para formar núcleos9®, 12 Cabe mencionar aquí que el mecanismo de difusión limitada no es relevante en nuestro caso tal como se respalda por otros para la formación de nanopartículas de oro monodispersas usando HEPES y péptidos9ab12. Si este mecanismo existe, entonces una mayor concentración de HEPES debería sintetizar nanopartículas de oro a un ritmo más rápido debido a la presencia de una gran cantidad de radicales catiónicos centrados en N en comparación con el caso de HEPES 100 mM. Curiosamente, no se observaron cambios en la tasa de reducción de iones de oro (7 días) y la posición de la banda de SPR (530 nm) con HEPES 200 mM, lo que explica que la reactividad superficial de los núcleos controla la tasa de crecimiento (figura 2A). La concentración crítica de Au (0) libre, péptido y complejo de péptido-Au(O) en disolución de reacción son determinantes claves en el control del crecimiento y el tamaño de las nanopartículas. Por ejemplo, no se encontró síntesis ni agregación en disoluciones de reacción cuando las concentraciones de péptido se variaron por encima (tal como 0,5 y 1 mM) o por debajo de 0,25 mM (tal como 0,20 y 0,10 mM) respectivamente con la concentración constante de iones de oro (0,5 mM) en la condición de HH. Además, los procesos de concentración del tamaño y de maduración digestiva catalizados por el grupo tiol de péptidos tienen una contribución significativa en la reducción del tamaño de partícula y la polidispersidad durante un largo período de reacción (7 días)13 como se refleja en la transformación de banda de SPR ancha a estrecha con el tiempo (figura 1A-C). Se obtuvo evidencia de respaldo para esta observación mediante el análisis de TEM de nanopartículas sintetizadas en diferentes condiciones (HH, HW y WH con HEPES 100 mM). Los análisis de TEM y de tamaño de partícula revelaron que el tamaño de las nanopartículas de oro esféricas era de aproximadamente 9-14 nm para todas las condiciones, aunque también se observó una pequeña población de nanopartículas más grandes (20-25 nm) (figuras 3A-C y 7A-C). De manera similar, la nanopartícula de oro esférica de tamaño medio de 13 nm se sintetizó usando HEPES 200 mM (figura 3D). Por el contrario, los péptidos solos (sin HEPES en la condición de WW) no tienen capacidad para reducir los iones de oro (figura 1D) incluso después de 9 días de reacción, lo que indica que el HEPES y el péptido actúan como agentes reductores y de ocupación respectivamente (9a-c). En ausencia de péptido, los iones de oro se redujeron rápidamente por HEPES en el plazo de 30 min con la banda de SPR centrada a 740 nm, tal como se observó también por otros (curva 1, figura 2C)14. El mecanismo redox de la molécula de HEPES se ha estudiado en detalle previamente, en la que se forman radicales libres catiónicos centrados en N después de que el anillo de piperazina sustituido con N de HEPES se oxide por los iones de oro.
Para comprender el papel de la cadena peptídica en el proceso de formación de nanopartículas, se usó la misma secuencia de péptido sin grupo tiol (péptido CM) para la síntesis de nanopartículas de oro. La síntesis de nanopartículas de oro en la condición de HH era comparablemente rápida, saturándose la reducción en el plazo de 2 días, aunque comenzó a aparecer una solución roja después de 12 horas de reacción (figura 2B). El espectro UV-Vis mostró una banda de SPR a 530 nm similar a las nanopartículas de oro sintetizadas usando el péptido CMC (figuras 1 y 2B). Las imágenes de TEM y el análisis del tamaño de partícula mostraron nanopartículas de oro esféricas polidispersas de tamaño que oscila entre 8 y 35 nm (figuras 3F y 7E). La diferente dispersidad en el tamaño de las nanopartículas de oro para los péptidos tanto CMC como CM es consistente con su diferente fuerza de unión interfacial con Au(0) y la presencia y ausencia de proceso de maduración digestiva respectivamente. Dado que los péptidos CM pasivan el Au(0) modestamente a través de interacciones oro-amina, el retardo de la reacción superficial es leve y solo ralentiza ligeramente la tasa de crecimiento, pero no quela un número suficiente de Au(0) para formar el complejo de péptido-Au(O) con el fin de alterar sustancialmente la tasa de formación de núcleos. Las moléculas de HEPES convierten rápidamente iones de oro en Au(0), por lo que la concentración inicial de Au(0) es mayor en la disolución de reacción. El crecimiento de nanopartículas de oro polidispersas se produce a través de un mecanismo de crecimiento de múltiples etapas. Las pequeñas nanopartículas se forman en primer lugar en disolución en presencia de péptido, lo que limita el crecimiento a menos de 12 nm y produce una distribución de tamaño estrecha de esta población. Pueden formarse nanopartículas de oro más grandes a través de la agregación de nanopartículas más pequeñas tal como sugieren otros (15). Alternativamente, la mayoría de los péptidos se adsorbieron en la superficie de nanopartículas más pequeñas; pueden crecer nanopartículas más grandes (30 nm) con una menor restricción en términos de tiempo y tamaño impuestas sobre las mismas por menos péptidos. Además, la polidispersidad sugiere que no se produce un proceso de maduración digestiva debido a la ausencia del grupo tiol en el péptido CM.
De hecho, cuando se añadió cisteína (0,25 mM) en disolución que contenía HEPES e iones de oro sin péptidos, se observó que la síntesis de nanopartículas de oro era rápida (30 min) similar a la reacción sin cisteína (curva 1 y 2, figura 2C). Sin embargo, la posición de la banda de SPR se desplazó a azul drásticamente hasta 530 nm y se sintetizaron las nanopartículas de oro esféricas de tamaño medio de 13 nm en comparación con nanopartículas de oro multirramificadas formadas sin cisteína (figuras 3E y 4A). En otro caso, cuando se añadió una concentración molar similar de cisteína a la disolución de reacción que contenía péptido CM 0,25 mM, la capacidad reductora de las moléculas de HEPES estaba casi retardada; se observó una banda de SPR débil y ancha tras la síntesis de nanopartículas de oro esféricas de tamaño medio de 17 nm después de 9 días de reacción (curva 3, figura 2C y figura 4B). Estos datos sugieren que el grupo tiol se une preferentemente a la superficie de los núcleos de oro formados en disolución seguido de unión del péptido en lugar de la cantidad en exceso de HEPES. Los grupos tiol no interfieren en la reducción de los iones de oro por HEPES, pero la acción combinada de tiol y cadena peptídica desempeña un papel importante en el control de la tasa de crecimiento, el tamaño y la forma de las nanopartículas, lo cual coincide con la conclusión previa con el péptido CMC (figuras 3 y 4).
El pH del tampón HEPES también afecta a la tasa de reducción y al tamaño de las nanopartículas. El pH variable de la disolución de reacción altera la carga del péptido CMC y la especiación de iones de oro, lo que influye significativamente en la afinidad del péptido por Au(0), dando como resultado una relación desproporcionada de concentración crítica de complejo de péptido-Au(O) y Au(0) libre en la disolución de reacción. Con un pH decreciente del tampón HEPES, el tiempo de reducción de los iones de oro cambió drásticamente a 24 h y finalmente a 1 hora para pH 6 y 5 respectivamente (figura 2D). Por otro lado, se observó agregación de las nanopartículas de oro por encima de pH 7,5 (pH 8 y 9) en el plazo de 1 hora de reacción (datos no mostrados). Los espectros UV-Vis muestran que las bandas de SPR de nanopartículas de oro se desplazaron a rojo hasta 540 nm para pH 5 y 6 en comparación con pH 7,5 (figura 2D). Un desplazamiento a rojo en la banda de SPR es sintomático del aumento en el tamaño de las nanopartículas de oro. Este resultado coincide con los análisis de TEM, que muestran la síntesis de nanopartículas de tamaños medios de 17 nm y 35 nm para pH 5 y 6 respectivamente (figuras 4C,D y 7H,I). Las imágenes de TEM muestran claramente la formación de una gran población de nanopartículas de oro de múltiples formas (triángulos, hexágonos y aleatorias) a pH 5 y 6 debido a la ausencia de proceso de maduración digestiva en un tiempo de reacción limitado (1 y 24 h respectivamente) a 25 °C (figuras 4C,D y 8). Se usó el proceso de maduración digestiva para transformar nanopartículas polidispersas y prismáticas en nanopartículas esféricas con distribución de tamaño estrecho usando alcanotiol en condiciones de ebullición en 90 min (16). Después de comparar los datos obtenidos con los resultados de trabajos anteriores (9a-c,17) no existe una referencia experimental en términos de concentración de HEPS/péptido y el pH de la disolución de reacción para sintetizar nanopartículas de oro usando diferentes péptidos.
Se realizó un análisis termogravimétrico (TGA) de las nanopartículas de oro sintetizadas en diferentes condiciones para obtener información cuantitativa del contenido peptídico. La pérdida de peso del 2 al 8 % inicial en la región de temperatura de 30 a 240 °C se debe a la desorción de moléculas de agua de las muestras (figura 5A). La pérdida de peso del 26 % se encuentra para las nanopartículas de oro reducidas por HEPES en múltiples etapas distintas hasta 480 °C con una pérdida inicial gradual y luego rápida a temperatura más alta. En el caso de muestras de nanopartículas de oro ocupadas con péptido, hay una pérdida de peso rápida hasta 400 °C con una disminución de masa del 55, 43 y 38 % para las nanopartículas de oro sintetizadas en condiciones de HH, HW y WH respectivamente (figura 5A). La variación en la pérdida de peso se debe al hecho de que un gran número de nanopartículas de oro sintetizadas en la condición de HH consumen una gran cantidad de péptido en comparación con otras condiciones, conduciendo a densidades variables de péptido en la superficie de la nanopartícula (tabla 1). El número de nanopartículas se calculó usando la ecuación propuesta por Haiss et al. (18). El número de péptidos unidos a cada nanopartícula se determina usando el análisis de TGA descrito anteriormente (9d,19). La carga superficial de nanopartículas de oro sintetizadas en todas las condiciones se carga positivamente (+ 28 2 mV) similar al péptido nativo (+ 23 1 mV), confirmando la presencia de péptidos CMC en la superficie de nanopartículas y la estabilidad coloidal de la disolución de nanopartículas (tabla 1):
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Tabla 1: Estimación del número y la carga superficial y la densidad peptídica de nanopartículas de oro sintetizadas en diferentes condiciones.
Para complementar el análisis de TGA, se realizó una espectroscopia FTIR para analizar la unión del péptido sobre la superficie de nanopartículas de oro. La curva 1, figura 5B muestra la banda de amina-I característica a 1623 y 1650 cm-1, correspondiendo a estructuras secundarias de lámina p y hélice a predominantemente de los péptidos CMC. Los péptidos CMC tienen diferentes relaciones de estructuras de lámina p y hélice a, dependiendo de las composiciones de aminoácidos7®, b, 20 Sin embargo, el péptido CMC ocupado en la superficie de nanopartículas de oro mostró estructuras helicoidales aleatorias (banda de amina-I a 1646 cirr1) ya que los AMP se orientan en una estructura helicoidal aleatoria en disolución acuosa (curvas 2-4, figura 5B)7a, 20-21. No se encontró firma del péptido para las nanopartículas sintetizadas con HEPES en ausencia de péptido CMC (curva 5, figura 5B), que es concomitante con la carga superficial de nanopartículas (-33,5 mV).
Los péptidos CMC adoptan una estructura helicoidal a en presencia de membrana o disolventes orgánicos que promueven la hélice, lo que hace que actúen como un potente agente antimicrobiano20, 22. Con el fin de validar la actividad antimicrobiana de nanopartículas de oro sintetizadas en la condición de HH (HH-Au NP), se sometieron a prueba HH-Au NP contra bacterias Gram-positivas (S. aureus) y Gram-negativas (E. coli) para diferentes tiempos de incubación en presencia de suero humano al 10% para imitar la condición de cultivo tisular in vitro. Se eligieron las nanopartículas de oro sintetizadas en la condición de HH debido a la alta carga de péptido. La cantidad de HH-Au NP usada para la prueba antimicrobiana se tomó en el intervalo de concentración inhibitoria mínima (CIM) del péptido CMC (5 pg/ml) tal como se notificó previamente (figura 9). A medida que aumenta el tiempo de incubación, la unidad formadora de colonias (UFC) de ambas bacterias disminuyó con la cantidad creciente de HH-Au NP (figuras 5C y D). Las figuras 5C y D muestran que no se observó ninguna colonia bacteriana para la disolución de 10 |ig/ml de HH-Au NP después de 2 horas de incubación. La actividad de destrucción de 5 |ig/ml de HH-Au NP fue un poco lenta y la actividad antimicrobiana del 100 % se encontró después de 4 horas de incubación. Por tanto, la CIM de HH-Au NP es de 10 |ig/ml para ambas bacterias. Por otro lado, 10 |ig/ml de nanopartículas de oro (Au NP) reducidas por HEPES no mataron bacterias incluso después de 4 horas de incubación (figuras 5C y D). Es bien sabido que superficies modificadas por PEG impiden la adsorción de proteínas. La capa PEG puede proporcionar una capa interfacial para evitar que las proteínas se adsorban en la superficie de las nanopartículas subyacentes. Esta propiedad única de PEG depende del peso molecular, la longitud de cadena y la densidad de cadena interfacial de las moléculas de PEG. Las HH-Au NP se comportan de manera similar a las nanopartículas de oro recubiertas con PEG para resistir la adsorción de suero humano en la superficie de la nanopartícula de oro con el mantenimiento de la actividad antimicrobiana23. Para validar esta hipótesis, las HH-Au NP y nanopartículas de oro recubiertas con PEG (PEG-Au NP) se incubaron en suero humano al 10 % durante 2 horas. Se observó una banda de SPR aguda junto con ningún desplazamiento en la posición de la banda para ambas nanopartículas de oro en comparación con HH-Au NP y PEG-Au NP sin tratamiento, lo que indica que la monocapa proteica no se forma en la superficie de la nanopartícula (curvas 1 y 2, figura 6A y cuadro de la Figura 6A). Podría ser posible que se formara una submonocapa proteica sobre la superficie de las nanopartículas de oro, que no se detectó con la espectroscopía UV-Vis23b. Las HH-Au NP tratadas con suero humano (10 |ig/ml) mataron el 99 % de las bacterias (E. coli) en 2 horas de incubación en línea con nuestro experimento previo (figuras 5C, D y 6B). En comparación con las HH-Au NP, la actividad reducida de los péptidos CMC se observó en presencia de suero humano después de 4 horas de incubación incluso usando 10 |ig/ml, que es dos veces la CIM del péptido CMC (figuras 5C y D). El CMC es un péptido muy potente para destruir bacterias en 60 min de incubación en ausencia de suero humano, lo que indica que el suero humano reduce drásticamente la actividad del péptido (figura 9).
Los péptidos CMC altamente catiónicos se asocian en primer lugar con la membrana bacteriana a través de interacciones electrostáticas y entonces los péptidos, transformados en estructuras de hélice a después de haber entrado en contacto con la membrana, atraviesan la bicapa lipídica7e, 21'22. El péptido de cadena larga expande la superficie de la membrana tras la inserción para crear poros21, 22b. Se sugiere que la acción combinada de los péptidos para formar poros/canales iónicos y las nanopartículas de oro para generar orificios rompe completamente la membrana bacteriana, lo que conduce a la fuga del contenido celular y finalmente a la muerte celular. En sinergia con la acción anterior, las nanopartículas de oro insertadas pueden unirse al contenido celular (ADN) de las bacterias e impedir el procesamiento de transcripción y de traducción para reparar el daño2a, 4a.
La tripsina, una proteasa lítica que se encuentra en el sistema vivo, puede degradar los AMP, limitando de ese modo su potencial para convertirse en antibióticos de próxima generación. Hay varios informes en los que se adoptaron métodos costosos y tediosos para sintetizar diferentes analogías de péptidos CM con el fin de impedir su degradación por tripsina7e, 21, 24 Por el contrario, las HH-Au NP son resistentes a 1 mg/ml de tripsina y no mostraron ningún signo de agregación después de 2 horas de incubación que pueda atribuirse a nanopartículas asociadas a la protección de péptidos frente a proteasas (curva 3, figura 6A)4f8. No se encontró ninguna reducción en la actividad antimicrobiana de HH-Au NP contra E. coli mientras que el péptido CMC simple se degradó y no mostró ninguna actividad antimicrobiana tras el tratamiento con tripsina (figura 6B). El beneficio añadido del péptido CMC ocupado con nanopartículas de oro es su excelente estabilidad y el mantenimiento de la bioactividad durante 6 meses en condiciones refrigeradas (figura 10). Cabe señalar que se requiere que los péptidos CMC se almacenen a -20 °C para preservar su bioactividad. Además de la propiedad de almacenamiento, las HH-Au NP mostraron una leve reducción en la bioactividad después de 5 ciclos de uso repetido (figura 10).
Síntesis de nanopartículas de oro y recubrimientos sobre portaobjetos de vidrio
Materiales
Todos los productos químicos (dihidrocloruro de cistamina, citrato de sodio, fosfato monosódico, fosfato disódico, cloruro de oro (III) trihidrato, kit BCA), preferiblemente de Sigma Aldrich. Péptido CM con el 98% de pureza, preferiblemente de Caslo laboratory (Lyngby, Dinamarca). Tiol-PEG-amina (1 kDa) y tiol-PEG-ácido (1 kDa), preferiblemente de Creative PEG works (Winston Salem, Carolina del Norte, EE. UU.). Suero humano, preferiblemente de Invitrogen. Todos los componentes de medios para los medios bacterianos, preferiblemente de Frilabo, Portugal. Todos los objetos de vidrio se limpiaron con solución de jabón seguido de agua regia (1 ml de HNO3 (15,9 M): 3 ml de HCl (12 M)) y se enjuagaron con agua Milli-Q. Cubreobjetos de vidrio, preferiblemente de VWR y Menzel y discos de titanio. Se usaron Escherichia coli (E. coli) (ATCC 25922) y Staphylococcus aureus (S. aureus) (ATCC 6538) para el estudio antimicrobiano.
Métodos
Las nanopartículas de oro (Au NP) se sintetizaron usando el método de Turkevich (Turkevich, J.; Stevenson, P. L.; Hillier, J.; Discuss Faraday Soc. 1951, 11, 55. En general, se llevaron a ebullición 90 ml de disolución de HAuCU 10-4 M en un matraz Erlenmeyer seguido de la adición de 10 ml de 0,2 g de citrato de sodio. La disolución se llevó a ebullición hasta que el color de la disolución cambió de amarillo claro a rojo rubí. Los portaobjetos de vidrio circulares se limpiaron rigurosamente antes de su uso sumergiéndolos en solución piraña (30 % de H2O2 + 70 % de H2SO4) durante 1 h. Posteriormente se lavaron con abundantes cantidades de agua Milli-Q. Los portaobjetos de vidrio limpios se sumergieron en un 1 % de 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) en etanol durante 30 minutos seguido de limpieza con etanol. Los portaobjetos de vidrio funcionalizados con APTMS se sumergieron en la disolución de nanopartículas de oro durante 24 horas para depositar películas de oro. Las superficies recubiertas con nanopartículas de oro depositadas se lavaron dos veces con agua Milli-Q y se secaron suavemente con gas de N2. Para recubrir las nanopartículas de oro sobre la superficie de titanio (Ti), los discos de Ti se limpiaron con disolución de H2SO4 durante 30 min. Se siguieron otras etapas tal como se mencionó anteriormente.
Inmovilización de péptido CM
Se funcionalizaron superficies recubiertas con nanopartículas de oro con cistamina 20 mM y 1 mg/ml de tiol-PEG-amina (1 kDa) durante 24 h seguido de lavado con agua para eliminar las moléculas de amina no unidas. La cuantificación del grupo funcional amina presente en superficies de vidrio recubiertas con Au NP se cuantificó usando una prueba de picrato tal como se describió anteriormente (Lee, C. C. Y.; Loudon, G. M. Anal. Biochem. 1978, 94, 60). Se consideró que el coeficiente de extinción de amina era 134700 para la estimación de la concentración de moléculas de amina (Lee, C. C. Y.; Loudon, G. M. Anal. Biochem. 1978, 94, 60). Se incubó 1 mg/ml de sulfo-GMB recién preparado en tampón fosfato (pH 7,2) con superficies funcionalizadas con amina durante 2 h para modificar los grupos amina. Se realizó de nuevo la prueba de picrato para cuantificar el grupo amina libre en la superficie. Cabe señalar que las superficies de cistamina modificada y tiol-PEG-amina modificadas con sulfo-GMBS se denominarán superficies Cs y NS respectivamente a lo largo de todo el trabajo por simplicidad para explicar los resultados. Se incubaron diferentes concentraciones de péptido CM (1-3 mg/ml) disuelto en tampón fosfato (pH 7,2) con superficies CS y NS durante 24 h a 4 °C para la inmovilización covalente. El péptido no unido se eliminó lavando dos veces suavemente con tampón fosfato. La cantidad de péptido en la disolución peptídica restante después de la inmovilización y los lavados se cuantificó usando el método BCA según las instrucciones del fabricante (preferiblemente, Sigma Aldrich). Se calculó el péptido CM inmovilizado covalentemente por área superficial unitaria (mg/cm2) en diferentes superficies.
Estudio de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FITR)
La diferente fase de los procesos de recubrimiento se caracterizó usando un accesorio de reflexión total atenuada (ATR) golden Gate en un espectrofotómetro Jasco. Todas las muestras se secaron completamente antes de las mediciones de FTIR. Se registraron espectros a una resolución de 4 c irr1 promediándose 128 barridos y luego suavizándose mediante promediado de 11 puntos adyacentes.
Mediciones de ángulo de contacto
Se realizaron mediciones de ángulo de contacto mediante la adquisición de imágenes de gotas de agua de 5 |iL en superficie usando. Se tomó después una foto de la gota de agua inmediatamente para evitar problemas relacionados con el secado de la gota. Se tomaron tres imágenes de cada muestra de diferentes áreas de la superficie, se hicieron mediciones tangenciales en la interfase de la superficie de la gota y se calculó el ángulo de contacto. La relación entre los grupos funcionales y el ángulo de contacto del agua se evaluó usando la ecuación de Wenzel, en la que el ángulo de contacto aparente de un líquido sobre una superficie depende de la rugosidad y composición química de la superficie (Wenzel, R. N. Ind. Eng. Chem. 1936, 28, 988).
Mediciones de espectroscopía de fotoemisión de rayos X (XPS)
Actividad antimicrobiana
Se hicieron crecer bacterias Gram-positivas (S. aureus) y Gram-negativas (E. coli) en medios de caldo Luria (LB) durante 24 h a 37 °C. Se transfirieron 100 |il de suspensiones bacterianas a viales estériles que contenían 5 ml de medio LB y se incubaron durante 2 h a 37 °C para obtener un crecimiento de bacterias de fase logarítmica media, luego se diluyeron adicionalmente usando medios LB para lograr 105 UFC/ml de bacterias. Se incubaron superficies ligadas a CM en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2, PBS) durante 4 h para lixiviar cualquier péptido CM no unido y adsorbido físicamente. Para someter a prueba la actividad antimicrobiana del péptido CM ligado, se incubaron diferentes superficies con péptido CM en 105 UFC/ml de suspensiones de S. aureus y E. coli a 37 °C durante 4 h. Se tomaron alícuotas (100 |il) de las respectivas disoluciones bacterianas a intervalos de 30 min y se diluyeron hasta 105 UFC/ml en PBS y luego se sembraron en placas de agar LB seguido de incubación a 37 °C. Se contaron las colonias que se hicieron crecer en placas. Todas las pruebas de actividad antibacteriana se realizaron por triplicado y se realizaron en diferentes momentos para certificar la reproducibilidad de los datos. La solución lixiviada también se sometió a prueba contra E. coli y no se observó muerte de bacterias. Para someter a prueba la capacidad de reutilización de la superficie de vidrio recubierta con péptido CM, esta superficie se incubó en E. coli durante 4 h, luego se lavó con PBS y se secó al aire.
Para someter a prueba la actividad antimicrobiana del péptido CM ligado en presencia de suero humano (HS), se modificó ligeramente el procedimiento de funcionalización anterior con tiol-PEG-amina. Después de la funcionalización de las superficies de vidrio recubiertas con Au NP con 1 mg/ml de tiol-PEG-amina, estas superficies se incubaron adicionalmente con diferente cantidad de disolución de tiol-PEG-ácido durante 12 h para obtener diferentes relaciones molares de amina y ácido (las diferentes relaciones molares de amina con respecto a ácido se designaron como 1:1, 2 :1, 3:1, 4.1 y 5:1 N:C en el manuscrito). Después de 12 h, las superficies funcionalizadas se lavaron con etanol para eliminar las moléculas no unidas. Otras etapas para inmovilizar el péptido CM sobre estas superficies fueron similares a las mencionadas anteriormente usando 3 mg/ml de péptido CM. Se incubaron las superficies N:C ligadas a CM con un suero humano al 20 % durante 2 h seguido de lavado con PBS estéril. Se diluyó suero humano (HS) PBS para obtener una concentración del 20 %. Las superficies N:C tratadas con HS se sometieron a prueba contra E. coli. De manera similar, se inmovilizaron superficies de titanio recubiertas con nanopartículas de Au con 3 mg/ml de péptido CM usando química superficial N:C 1:1. Se trataron las superficies de Ti recubiertas con nanopartícula de Au inmobilizadas con CM con suero humano al 20 % durante 2 horas seguido de la prueba de actividad antimicrobiana contra E. coli.
Cultivos celulares
Para evaluar la citotoxicidad inducida por superficies inmovilizadas con péptido CM se usaron dos tipos de células humanas tales como células de vena umbilical endoteliales humanas (HUVEC) como modelo para tejidos vascularizados y fibroblastos humanos dérmicos normales (NDHF), uno de los tipos celulares más comunes presentes en el tejido conjuntivo humano. Se cultivaron HUVEC (preferiblemente, Lonza, número de cat. CC-2517, Walkersville, Maryland, EE. UU.) usando medios de factor de crecimiento endotelial-2 (EGM-2), medios de kit de bala (preferiblemente, Lonza, número de cat. CC-3156) durante al menos 24 h antes de su uso adicional. Se usaron pases por debajo de seis para todos los experimentos.
Se cultivaron células NDHF (preferiblemente, Lonza, número de cat. CC-2511) con medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (preferiblemente, Sigma, número de cat. D5796) suplementado con el 10 % (v/v) de suero bovino fetal (preferiblemente, Gibco, origen aprobado por la UE, número de cat. 10270-106, Grand Island, NY, EE. UU.) y 1 % (v/v) de penicilina/estreptomicina (preferiblemente, Lonza, número de cat. DE17-602E). Se usaron células NDHF por debajo del paso número diez con el fin de mantener el estado celular primario durante el tiempo de los ensayos realizados.
Se cultivaron células tanto HUVEC como NDHF en sus respectivos medios en matraces de cultivo tisular con 75 cm2 de superficie (BD, Falcon). Las células se tripsinizaron, centrifugaron y contaron para evaluar adecuadamente el número de células antes de la siembra en las placas de cultivo tisular apropiadas para investigaciones de citotoxicidad.
Interacción del péptido CM soluble con células
Se cultivaron células HUVEC y NDHF tal como se mencionó anteriormente y se sembraron en placa a una densidad de 4,2x103 células/cm2 en placas de 24 pocillos. Se permitió que las células crecieran 24 h antes de realizar cualquier experimento. Se incubaron diferentes concentraciones de disoluciones de péptidos CM (50, 30, 20, 10, 5, 2,5 y 1 |ig/ml) con ambas células durante 24 horas para evaluar el efecto de citotoxicidad de los péptidos CM usando un ensayo de actividad metabólica celular MTT.
Ensayo MTT
Se lavaron inicialmente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) caliente. Se incubaron células tratadas con diferentes concentraciones de péptidos CM después de 24 h con solución de trabajo de disolución de sal de bromuro de tetrazolio con azul de tiazolilo (MTT) (10 ml de medio a 1 ml de disolución madre de sal de tetrazolio, 5 mg/ml en PBS) durante 3 h a 37 °C en la incubadora de CO2 con el 5 % de aire y el 95 % de CO2. Después de 3h de incubación, los cristales de formazán púrpuras formados se disolvieron mediante dimetilsulfóxido (DMSO) usando una suave agitación de la placa de prueba en un agitador orbital. Se midió la absorbancia a 540 nm con referencia a 670 nm en un espectrofotómetro de UV-visible (SynergyMX de Biotek Instruments, Winooski, VT, Estados Unidos) (no entiendo por referencia).
En el caso del ensayo de contacto directo, posteriormente explicado detalladamente, las muestras se transfirieron a una nueva placa antes de la adición de la solución de trabajo MTT para evitar errores de cálculo en la actividad celular. Usando esta estrategia solo se tienen en cuenta las células que estuvieron en contacto con la superficie sometida a prueba. Para la condición de TCPS, se normalizaron los valores obtenidos para la misma área superficial que las muestras modificadas para tener para todas las condiciones la misma área superficial.
Ensayo de extracción
Se realizó un ensayo de extracción para evaluar si algún péptido CM lixiviado de superficies en medios tiene efecto sobre la actividad metabólica de ambas células. Se esterilizaron superficies recubiertas con Au NP, recubiertas con N:C (1:1) y recubiertas con péptido CM inmovilizado sobre N:C (1.) durante 20 min usando una fuente de luz UV en campana de flujo laminar antes de preparar los extractos. Se prepararon los extractos según la norma internacional ISO 10993-5 y ambos medios de cultivo estuvieron en contacto con las superficies mencionadas anteriormente de 3 cm2 de área durante 24 h en condiciones estériles en una incubadora a 37 °C con agitación suave. Los medios recuperados del tratamiento superficial actúan como extractos. Las células se sembraron a una densidad de 4,2x103 células/cm2 y se les permitió crecer 24 h antes de añadir los extractos a los pocillos. La relación del área superficial de las muestras con respecto a los medios se mantuvo constante a 3 cm2/ml en cada experimento. Los extractos se mantuvieron en contacto con las células sembradas durante 24 h, seguido de la evaluación de la citotoxicidad usando un ensayo MTT.
Ensayo de contacto directo
Se usaron diferentes superficies estériles bajo luz UV tal como se mencionó anteriormente para el ensayo de contacto directo. Ambas células se sembraron a una densidad de 4x104 células/cm2 encima de diferentes superficies y se permitieron crecer durante 24 h antes de evaluar la citotoxicidad usando un ensayo MTT.
Las muestras se transfirieron a una nueva placa con el fin de evitar errores de cálculo en la actividad celular medida y de tener en cuenta solo las células que estaban en contacto con la superficie sometida a prueba. Para la condición de TCPS, se normalizaron los valores obtenidos para la misma área superficial que las muestras modificadas para tener para todas las condiciones la misma área superficial (no entendí).
Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Para estos análisis se usaron diferentes tipos de superficies de vidrio modificadas: cubreobjetos de vidrio recubiertos con nanopartículas de oro como control y cubreobjetos de vidrio recubiertos con oro y péptido híbrido antimicrobiano de cecropina-melitina como muestras de prueba de AMP.
Diferentes superficies usadas para el ensayo de contacto directo con células HUVEC y NDHF. Además, también se observaron muestras de superficies recubiertas con oro y AMP sin ningún cultivo celular por motivos de control.
Se realizó una obtención de imágenes con microscopio electrónico de barrido usando un FEG ESEM/EDS/EBSD FEI Quanta 400 FEG ESEM/EDAX Genesis X4M (necesario escribir solo el nombre del modelo).
Con fines de cuantificación, se realizaron diez imágenes de diferentes campos de las diferentes muestras en un total de tres réplicas (para las células NDHF solo se obtuvieron imágenes de dos réplicas) por condición. El número de células presentes por área superficial se calculó y se representó en un gráfico para comprender mejor el número total de células presentes en cada tipo de superficie. Se capturaron imágenes para este propósito usando un aumento de 200x. Además, la morfología celular se analizó detalladamente usando imágenes capturadas con aumentos mayores tales como 5000x, 40000x, 100000x o 200000x.
Se realizó una interpretación más precisa de las células y partículas presentes en estas muestras usando espectro dispersivo de energía (EDS), que se adquirió para puntos de área específicos y para permitir una diferenciación apropiada entre material orgánico y de oro.
Ensayo basado en liberación de lactato deshidrogenasa (LDH)
Se realizó un ensayo de liberación de LDH para células tratadas con diferentes superficies en condiciones similares usadas para mediciones de contacto directo. Se usaron tres réplicas por condición para obtener datos estadísticamente significativos. El ensayo de lactato deshidrogenasa es un método simple y preciso y el ensayo se basa en la reducción de NAD a NADH por LDH. Permite una determinación de la integridad de la membrana en función de la cantidad de LDH citoplasmática liberada a los medios.
Se determinaron la liberación de LDH y las respectivas mediciones de LDH total según el procedimiento del fabricante (preferiblemente, Sigma, número de cat. TOX7). Para la cuantificación total de LDH, se usó tampón de lisis de ensayo de LDH antes de recuperar la muestra para las pruebas. Para todas las muestras, se añadió un volumen de mezcla de ensayo de LDH, igual a dos veces el volumen de medio que debe someterse a prueba, en una placa opaca que tiene medios de células tratadas con diferentes superficies. La placa se protegió de la luz con papel de aluminio y se incubó durante 20-30 minutos. Usando un espectrofotómetro (preferiblemente, Synergy Mx, Biotek Instruments), se determinó la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm y el fondo a 690 nm. Posteriormente se restó el valor de la lectura obtenida de longitud de onda primaria (490 nm).
Evaluación del potencial de membrana
Se sembraron las células en cámaras Labtek estériles de 8 pocillos y se cultivaron durante al menos 24 h. Posteriormente, se tiñeron las células ligadas después de lavarse con una disolución del 0,5 % de albúmina sérica bovina en solución salina tamponada con fosfato. Se permitió que una mezcla de yoduro de propidio y yoduro de 3,3'-dipentiloxacarbocianina (DioC5) (1 mg/ml) reaccionara con las células durante 10 min a 37 °C. Las células tratadas se lavaron luego con PBS y se obtuvieron imágenes usando un microscopio fluorescente (Zeiss, Alemania). Se capturaron al menos tres imágenes de cada condición con fines de cuantificación. Se analizaron las imágenes usando el software Image J 1.45S (National Institutes of Health, EE. UU.) y se examinaron ambos canales por separado. Se invirtió la imagen del canal correspondiente al tinte de yoduro propidio que etiqueta las células muertas usando el software mencionado antes del recuento. Además, las imágenes del canal correspondiente a DiOC 5 se usaron tal como se adquirieron y se utilizó el pluggin de recuento de células para la cuantificación manual del número total de células que expresan la molécula de interés (no claro). Todos los datos se representaron en consecuencia.
Análisis estadístico
Para todos los experimentos se analizaron al menos tres réplicas. Los datos se analizaron usando software Prism para Macintosh (versión 4.0b, GraphPad Software, Inc., 2004) y se representaron en el formato gráfico. Se realizó la prueba de la t-student estadística para comparar diferentes grupos usando un intervalo de confianza del 95 %.
Resultados
Se sintetizaron nanopartículas de oro (Au NP) usando el método de Turkevich ampliamente conocido (Wenzel, R. N. Ind. Eng. Chem. 1936, 28, 988). Las nanopartículas de oro estabilizadas con citrato se caracterizaron usando espectroscopía UV-Vis y análisis de TEM. La figura 1A muestra el espectro UV-vis de nanopartículas de oro con banda de resonancia de plasmón superficial (SPR) a 520 nm, que indica la síntesis de nanopartículas de oro esféricas. Se obtuvo evidencia de respaldo de esta observación mediante el análisis de TEM de esta disolución (figura 11). La imagen de TEM muestra la síntesis de nanopartículas de oro esféricas con el tamaño de 20 nm (figura 1B). Las nanopartículas de oro sintetizadas se usaron para la fabricación de películas de oro sobre el portaobjetos de vidrio. La imagen de AFM muestra una distribución uniforme de nanopartículas de oro sobre el portaobjetos de vidrio funcionalizado con silano (figura 1C). A menudo se emplean moléculas de amina para funcionalizar superficies para proporcionar compatibilidad a las biomoléculas, ya que se sabe que los polímeros que contienen amina interaccionan fuertemente a través de la fisisorción sobre superficies de vidrio (Song, J.; Chen, J.; Klapperich, C. M.; Eng, V.; Bertozzi, C. R. J. Mater. Chem. 2004, 14, 2643). El grupo silano del 3-aminopropiltrimetoxisilano reacciona con la superficie de vidrio a través del enlace siloxano, mientras que los grupos de aminas están disponibles para interaccionar con las nanopartículas de oro mediante interacciones electrostáticas (Karakouz, T.; Maoz, B.M.; Lando, G.; Vaskevich, A.; Rubinstein, I. ACS Appl. Mater. Interfaces 2011, 3, 978).
Con el fin de inmovilizar el péptido CM sobre las superficies recubiertas con Au NP, se eligieron cistamina y tiol-PEG-amina como espaciadores para funcionalizar superficies (esquema 1). La cistamina reacciona con el oro en caso de escisión del enlace disulfuro sulfuro-sulfuro y la tiol-PEG-amina reacciona a través del grupo tiol, conduciendo a la disponibilidad de dos grupos amina por molécula en la superficie recubierta con cistamina en comparación con un grupo amina por molécula en la superficie recubierta con tiol-PEG-amina (Rai, A.; Perry, C. C. Langmuir 2010, 26, 4152). Sin embargo, la prueba de picrato muestra 1,5 veces más grupos amina en superficies recubiertas con cistamina que con tiol-PEG-amina después de 24 horas de incubación, lo cual coincide en gran medida con el análisis de XPS (figura 3 y tablas 2 y 3):
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Tabla 2 - Mediciones de densidad de amina y de ángulo de contacto de películas preparadas sobre superficies recubiertas con Au NP.
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Tabla 3: Composición atómica (% at.) de superficies en diversas etapas de recubrimiento medidas
Hay un pequeño aumento en el número de grupos amina en ambas superficies después de 1 hora de incubación; sin embargo, es crucial incubar durante 24 horas para obtener la monocapa organizada en la superficie (figura 3) ((a) Wang, H.; Chen, S. F.; Li, L. Y.; Jiang, S. Y. Langmuir 2005, 21, 2633. b) Dietrich, P. M.; Graf, N.; Gross, T.; Lippitz, A.; Krakert, S.; Schupbach, B.; Terfort, A.; Unger, W. E. S. Surf. Interface Anal. 2010, 42, 1184).
Sulfo-GMBS es un reticulante heterobifuncional que contiene grupos éster NHS y meleimida. Después de la modificación con sulfo-GMBS, la banda de amina a 1630 cm-1 desapareció debido a la reacción covalente con el grupo éster N-hidroxisuccinimida (NHS) del sulfo-GMBS y aparecen nuevas bandas. De manera similar, se observó un aumento en el número de nitrógenos (% de N) y oxígenos (% de O) en el análisis de XPS para las superficies modificadas con sulfo-GMBS (tabla 3). No se detectaron grupos amina usando la prueba de picrato, lo que indica la modificación de grupos amina con sulfo-GMBS (tabla 2). El péptido CM que tiene un grupo sulfhidrilo (grupo -SH) en el extremo C-terminal reacciona covalentemente con el grupo maleimida disponible libremente de sulfo-GMBS sobre las superficies recubiertas con Au NP. Las curvas en la figura muestran las amida-I (modo de estiramiento C=O) y amida-II (modo de flexión N-H) características a 1640 y 1560 cirr1 respectivamente. El análisis de XPS muestra la presencia de elemento de azufre solo sobre superficies recubiertas con péptido CM en vez de en otras superficies, lo que indica la presencia de péptido CM unido covalentemente sobre superficies tanto NS como CS (tabla 3).
Se estima que la cantidad de péptido CM inmovilizado covalentemente sobre la superficie NS es mayor que aquella sobre la superficie CS, aunque el número de grupos amina es mayor sobre la superficie funcionalizada con cistamina. El análisis de XPS muestra que los % de C, N y O son mayores sobre la superficie NS (tabla 3). Esto se debe probablemente al hecho de que la tiol-PEG-amina de cadena flexible y larga sobre la superficie NS promueve una mayor inmovilización, difusión lateral y empaquetado denso por reordenamiento interfacial del péptido CM en comparación con la superficie CS rigidizada en la que los impedimentos estéricos entre péptidos CM dominan para inhibir la adsorción adicional (a) Hylton, D. M.; Klee, D.; Fabry, M.; Hocker, J. Colloid Interface Sci. 1999, 220, 198. b) Kleijn, M.; Norde, W. Heterog. Chem. Rev. 1995, 2, 157). Además, el recubrimiento de nanopartículas de oro sobre la superficie de vidrio genera una alta rugosidad, lo que a su vez conduce a la inmovilización de una mayor cantidad de péptido por cm2 de área superficial que otros procedimientos notificados (b) Gao, G.; Yu, K.; Kindrachuk, J.; Brooks, D. E.; Hancock, R. E.W.; Kizhakkedathu, J. N. Biomacromol. 2011, 12, 3715. c) Gabriel, M.; Nazmi, K.; Veerman, E. C.; Amerongen, A. V. N.; Zentner, A. Bioconj.Chem. 2006, 17, 548 y Gao, G.; Lange, D.; Hilpert, K.; Kindrachuk, J.; Zou, Y.; Cheng, J. T. J.; Kazemzadeh- Narbat, M.; Yu, K.; Wang, R.; Straus, S. K.; Brooks, D. E.; Chew, B. H.; Hancock, R. E.W.; Kizhakkedathu, J. N. Biomater. 2011, 32, 3899 y Kazemzadeh-Narbat, M.; Kindrachuk, J.; Duan, K.; Jenssen, H.; Hancock, R. E. W.; Wang, R. Biomater. 2010, 31, 9519). La figura 3B muestra una gran cantidad de inmovilización del péptido CM sobre ambas superficies con una cantidad creciente, sin embargo se encuentra poca adsorción en las superficies recubiertas con oro, cistamina y tiol-PEG-amina sin modificarse con sulfo-GMB debido a interacciones físicas no específicas. La composición química de las películas cambió en cada fase del proceso de recubrimiento, dando como resultado la variación del ángulo de contacto (tabla 2). La tendencia en el aumento del ángulo de contacto refleja la humectabilidad variable de los diferentes grupos funcionales presentes sobre ambas superficies, que están en consonancia con el análisis de XPS (tablas 2 y 3). Las superficies modificadas con Au NP y amina son hidrófilas, mientras que la superficie recubierta con péptido CM es hidrófoba debido a la presencia de un gran porcentaje de aminoácidos hidrófobos, lo que contribuye a la generación de comportamiento hidrófobo para las superficies recubiertas con péptido (tabla 2 ).
El péptido CM es de naturaleza altamente catiónica y adopta estructuras bien definidas tras interacciones con membranas bacterianas en disolución y estos cambios estructurales están relacionados con su potente actividad antimicrobiana ((a) Zasloff, M. Nature 2002, 415, 389. b) Brogden, K.A. Nat. Rev. Microbiol. 2005, 3, 238. c) Bastos, M.; Bai, G.; Gomes, P.; Andreu, D.; Goormaghtigh, E.; Prieto, M. Biophys J. 2008, 94, 2128. d) Melo, M. N.; Ferre, R.; Castanho, M. A. Nat. Rev. Microbiol. 2009, 7, 245). En el caso de péptido CM ligado sobre la superficie, la autolisis y la muerte bacteriana podían desencadenarse debido a la alteración de la electrostática superficial de la membrana bacteriana o la penetración del péptido en la membrana bacteriana tras interacciones electrostáticas con la superficie cargada positivamente local ((d) Hilpert, K.; Elliott, M.; Jenssen, H.; Kindrachuk, J.; Fjell, C. D.; Korner, J.; Winkler, D. F. H.; Weaver, L. L.; Henklein, P.; Ulrich, A. S.; Chiang, S. H. Y.; Farmer, S. W.; Pante, N.; Volkmer, R.; Hancock, R. E. W. Chem. Biol. 2009, 16, 58 y Jelokhani-Niaraki, M.; Prenner, E. J.; Kay, C. M.; McElhaney, R. N.; Hodges, R. S. J.
Pept. Res. 2002, 60, 23). Por tanto, la alta densidad de carga en la superficie asociada con la cantidad de péptido, la flexibilidad y la longitud del espaciador pueden contribuir a la actividad antimicrobiana de superficies ligadas con péptido CM. Con el fin de verificar la actividad de superficies ligadas con péptido CM, se sometieron a prueba diferentes cantidades de superficies inmovilizadas con péptido CM contra bacterias Gram-positivas (S. aureus) y Gram-negativas (E. coli). A medida que aumenta el tiempo de incubación, las UFC de S. aureus y E. coli disminuyen con una cantidad creciente de péptido CM sobre las superficies NS y CS, mostrando evidencia de la efectividad de las superficies ligadas con péptido Cm para su actividad antibacteriana (figura 4). En el caso de la superficie CS ligada con péptido CM, se mataron el 98 % de las bacterias (E. coli y S. aureus) después de 4 h de incubación, aunque la superficie con una baja cantidad de péptido CM inmovilizado (0,29 mg/cm2) no estaba disponible para matar bacterias después de 2 h de incubación (figuras 4A y C). En general, la superficie CS con una baja cantidad de péptido actúa como bacteriostático, mientras que la superficie CS con una gran cantidad de péptido actúa como bactericida como también se observa por otros (Humblot, V.; Yala, J-F.; Thebault, P.; Boukerma, K.; Hequet, A.; Berjeaud, J-M.; Pradier, C-M. Biomater. 2009, 30, 3503). En contraste con la superficie CS, diferentes cantidades de péptido CM ligado sobre las superficies NS actúan como bacteriostáticos, matándose el 98 % de las bacterias por superficie que tiene 0,89 y 0,38 mg/cm2 de péptido después de 2 y 4 h de incubación respectivamente (figuras 4B y D). De manera interesante, la superficie NS que contiene 1,02 mg/cm2 de péptido mata el 100 % de las bacterias después de 1,30 h de incubación, lo que hace que esta superficie sea ideal para su estudio adicional (figuras 4B y D).
Las superficies de control, tales como superficies de oro recubiertas con cistamina y tiol-PEG-amina, no mostraron actividad antimicrobiana (datos no mostrados). La actividad antimicrobiana potenciada del péptido CM sobre la superficie NS se debe al efecto combinado de una gran cantidad de péptido, flexibilidad y cadena larga de la molécula de tiol-PEG-amina. La cadena larga y el hinchamiento de tiol-PEG-amina en presencia de tampón debido a su propiedad de hinchamiento en agua mueve el péptido CM adicionalmente de la superficie, reduciendo de ese modo la interacción entre el péptido y la superficie con el mantenimiento de la actividad de péptido CM ((a) Banerjee, I.; Pangule, R. C.; Kane, R. S. Adv. Mater. 2011, 23, 690. b) Liu, Z.; Wang, L.; Bao, C.; Li, X.; Cao, L. Dai, K.; Zhu, L. Biomacromol. 2011, 12, 2389). Además, la flexibilidad de la molécula de tiol-PEG-amina proporciona movilidad lateral al péptido y una gran cantidad de péptido en la superficie restringe la libertad conformacional del péptido CM, dando como resultado una mejor interacción con la membrana bacteriana y por tanto el aumento de la actividad bactericida (Onaizi, S. A.; Leong, S. S. J. Biotechnol. Adv. 2011, 29, 67. b) Costa, F. Carvalho, I. F. Montelaro, R. C. Gomes, P.; Martins, C. L. Acta Biomaterialia 2011, 7, 1431 y a) Humblot, V.; Yala, J-F.; Thebault, P.; Boukerma, K.; Hequet, A.; Berjeaud, J-M.; Pradier, C-M. Biomater. 2009, 30, 3503. b) Gao, G.; Yu, K.; Kindrachuk, J.; Brooks, D. E.; Hancock, R. E.W.; Kizhakkedathu, J. N. Biomacromol. 2011, 12, 3715. c) Gabriel, M.; Nazmi, K.; Veerman, E. C.; Amerongen, A. V. N.; Zentner, A. Bioconj.Chem. 2006, 17, 548. d) Hilpert, K.; Elliott, M.; Jenssen, H.; Kindrachuk, J.; Fjell, C. D.; Korner, J.; Winkler, D. F. H.; Weaver, L. L.; Henklein, P.; Ulrich, A. S.; Chiang, S. H. Y.; Farmer, S. W.; Pante, N.; Volkmer, R.; Hancock, R. E. W. Chem. Biol. 2009, 16, 58. e) Steven, H.D.; Hotchkiss, J. H. J. Appl. Polym. Sci. 2008, 110, 2665. f) Appendini, P.; Hotchkiss, J. H. J. Appl. Polym. Sci. 2001, 81,609. g) Cho, W. M.; Joshi, B. P.; Cho, H.; Lee, K. H. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17, 5772.). Estos resultados sugieren que una baja cantidad de péptido junto con una longitud de cadena de espaciador corta promueve la propiedad bacteriostática, tal vez al alterar un bajo nivel de electrostática de membrana bacteriana. Mientras, una alta cantidad de péptido con longitud de cadena de espaciador corta o larga induce actividad bactericida en combinación con penetración de péptido en la membrana y alteración de la electrostática de la membrana (figura 4).
El mecanismo de actividad antimicrobiana está respaldado por el análisis de AFM. Una imagen de AFM en modo de altura muestra una membrana gravemente dañada y perforada de E. coli tratada con superficie NS ligada con péptido CM, mientras que la pared celular lisa de E. coli se observa en experimento de control, en el que se incuban bacterias en una superficie recubierta con Au NP (figuras 5A y C). Puede ser posible que la alteración electrostática por péptido ligado sobre la superficie NS cree poros en la pared celular bacteriana seguido de penetración del péptido para formar un “agujero”, lo que conduce a la fuga del contenido celular y la muerte de las bacterias (figuras 5A y D). El “agujero” en la imagen de AFM se observa debido al movimiento libre de la membrana dañada en comparación con la membrana intacta por la punta de AFM durante el barrido (4a). En la imagen de modo de fase, puede verse claramente que la capa de pared celular externa está intacta después de la exposición a la superficie NS ligada con péptido CM (figura 5D). E. coli tratado con superficie CS ligada con péptido CM (0,29 mg/cm2) tiene una pared celular rugosa sin ningún “agujero” debido a una alteración menor de la electrostática de la membrana (figuras 5B y E), lo que corrobora la propiedad bacterostática observada de la superficie (figura 4A). El análisis de sección transversal reveló el aumento de la rugosidad con la disminución de la altura debido al colapso de la pared celular de E. coli para la superficie NS ligada con péptido CM que la de la pared celular menos rugosa de E. coli para la superficie CS ligada con péptido CM (figura 5G-I). Por tanto, nuestros resultados sugieren fuertemente que la química superficial adecuada y la cantidad de péptido antimicrobiano ligado a la superficie son críticos para obtener la potente actividad antimicrobiana.
La orientación del péptido CM inmovilizado sobre la superficie es un criterio importante para lograr su actividad máxima. La figura 6A muestra la actividad antimicrobiana del péptido CM inmovilizado aleatoriamente sobre una superficie modificada con tiol-PEG-ácido. La destrucción comparativamente baja (48 %) de E. coli se encontró después de 4 h de incubación, lo que probablemente está relacionado con el hecho de que la mayoría de los aminoácidos básicos podrían no ser accesibles para la membrana bacteriana (figura 6A). Por otro lado, la conjugación del extremo C-terminal rige la orientación apropiada del péptido CM junto con aminoácidos básicos libres presentes en el extremo N-terminal y facilita una mejor interacción con la membrana bacteriana cargada negativamente, lo que podría explicar el efecto perjudicial del péptido CM ligado (98 % de actividad) (figura 4). Otros investigadores también han observado tendencias similares, aunque existe ambigüedad en la bibliografía sobre el efecto de la orientación sobre la actividad del péptido antimicrobiano (Haynie, S.L.; Crum, G. A.; Doele, B. A. Antimicrob. Agents Chemotherap. 1995, 39, 301 y b) Gao, G.; Yu, K.; Kindrachuk, J.; Brooks, D. E.; Hancock, R. E.W.; Kizhakkedathu, J. N. Biomacromol. 2011, 12, 3715. c) Gabriel, M.; Nazmi, K.; Veerman, E. C.; Amerongen, A. V. N.; Zentner, A. Bioconj.Chem. 2006, 17, 548).
Hasta donde sabemos, no existe ningún trabajo de investigación disponible relacionado con la actividad antimicrobiana del péptido ligado en presencia de suero humano. La superficie de NS ligada a péptido CM no mostró ninguna actividad antimicrobiana tras incubarse la superficie en suero humano al 20 % durante 2 h. Es posible que el suero humano se adsorba en la parte superior de la superficie ligada del péptido CM e inhiba la actividad del péptido CM. Por tanto, el procedimiento de recubrimiento se modificó ligeramente introduciendo diferentes relaciones molares de moléculas de tiol-PEG-amina con respecto a tiol-PEG-ácido. El fundamento detrás del uso de moléculas de PEG mixtas era crear la superficie de tipo zwitteriónico y la alta densidad de moléculas de PEG sobre la superficie para evitar la adsorción de suero humano ((a) Banerjee, I.; Pangule, R. C.; Kane, R. S. Adv. Mater. 2011, 23, 690., y a) Holmlin, R. E.; Chen, X.; Chapman, R. G.; Takayama, S.; Whitesides, G. M. Langmuir 2001, 17, 2841. b) Vaisocherova, H.; Yang, W.; Zhang, Z.; Cao, Z.; Cheng, G.; Pillarik, M.; Homola, J.; Jiang, S. Anal. Chem. 2008, 80, 7894. c) Chapman, R. G.; Ostuni, E.; Yan, L.; Whitesides, G. M. Langmuir 2000, 16, 6927). La figura 6B muestra que la relación 1:1 de superficie N:C es capaz de matar al 85 % de la población de E. coli en comparación con superficies con otra relación molar después de 4 h de incubación. La medición del ángulo de contacto indica que la superficie de relación 1:1 es más hidrófila que superficies con otras relaciones molares, lo que hace que esta superficie sea resistente a la adsorción sérica, protegiendo de ese modo la actividad antimicrobiana del péptido CM ligado (tabla 2). En línea con el procedimiento anterior, el péptido CM ligado a la superficie de titanio recubierta con Au NP mostró una actividad antimicrobiana comparablemente similar en 4 h de incubación en presencia de suero humano (figura 6C). El resultado sugiere que este procedimiento podría ser útil para recubrir el péptido antimicrobiano en implantes ortopédicos y dentales para sus aplicaciones biomédicas. El recubrimiento del péptido CM sobre la superficie de Ti recubierta con Au NP era muy robusto, manteniéndose la actividad antimicrobiana después de cinco ciclos de uso repetido (figura 6D). Los cinco ciclos se completaron en 10 días con una frecuencia de 2 días para cada ciclo. La actividad antimicrobiana se redujo ligeramente después de cada ciclo de uso, pero mató de manera eficiente las bacterias (90 %) incluso después de cinco ciclos en relación con bacterias incubadas con superficie de Ti control (figura 6D).
Análisis de citotoxicidad celular
Cecropina-melitina (CM) es un péptido antimicrobiano en uso durante muchos años.
Se pusieron diferentes concentraciones de péptido de cecropina-melitina soluble en contacto con células tanto NDHF como HUVEC previamente cultivadas durante 24 h en placas de 24 pocillos de TCPS. El objetivo era demostrar que el péptido CM no afecta a las células al tiempo que es activo matando células bacterianas.
En estos experimentos se detectó que altos niveles de péptido CM soluble tenían efectos perjudiciales estadísticamente significativos en la actividad metabólica de células NDHF después de 24 h de contacto directo entre células y péptido soluble. Se encontró que las concentraciones de CM de entre 10 y 2,5 |ig/ml eran particularmente efectivas disminuyendo la actividad metabólica celular medida indirectamente a través de la capacidad de las células para transformar la sal de MTT en cristales de formazán. Se obtuvieron resultados similares para experimentos con HUVEC. Para este tipo de célula también se detectó una influencia negativa del péptido CM soluble para la concentración de 1 |ig/ml, lo que confirma que las células endoteliales son un sistema celular no robusto como los fibroblastos o esto está respaldado por el mayor valor de desviación estándar determinado para la condición de 2,5 |ig/ml de péptido soluble CM.
También se realizaron ensayos de extracción usando, para ese propósito, medios que han estado en contacto con diferentes superficies durante 24h con agitación suave (150 rpm) a 37 °C. En este caso, el objetivo principal era evaluar si había algunas partículas que se iban a lixiviar de las superficies y por lo tanto afectarían al comportamiento de las células que estaban en cultivo. Se detectó que, en el caso de los cultivos de células HUVEC, los extractos provenientes de superficies modificadas por AMP eran células afectadas drásticamente y su actividad metabólica disminuyó. Se añadió un control negativo a este conjunto de condiciones con el fin de destruir las células y tener un valor negativo para esta influencia, en este caso peróxido de hidrógeno, que era efectivo para este propósito.
A continuación, se muestra el contacto directo de células HUVEC con superficies modificadas. Los resultados muestran que existen diferencias entre las muestras modificadas con péptidos AMP y las modificadas con PEG-amina (PEG-NH2) y PEG-COOH solamente (muestras de química NC). Los controles para este experimento comprendían células sembradas en plástico tratado con cultivo tisular (TCPS) y en cubreobjetos de vidrio no modificados que se lavaron previamente en etanol y se secaron con gas de nitrógeno, así como se esterilizaron como todas las demás superficies.
Se encontraron diferencias significativas entre las superficies modificadas por AMP y las no modificadas, ya sea tratadas con oro y tratadas con oro más química CN. Por tanto, parece probable que la presencia del péptido esté influyendo en el comportamiento celular en contacto con estas superficies específicas.
También se realizaron experimentos adicionales con fibroblastos dérmicos humanos normales (NDHF) con el fin de confirmar si se obtendrían los mismos resultados. Los resultados obtenidos en este caso mostraron que los fibroblastos en contacto directo con superficies modificadas con AMP tenían una disminución de la actividad metabólica. En consecuencia, se obtuvieron resultados similares para ambos tipos celulares.
Los fibroblastos y las células endoteliales de vena umbilical humana tendrían diferentes papeles en el mantenimiento de poblaciones celulares específicas en el tejido humano adulto y por este motivo se investigaron en este caso. En este ensayo particular se comportaron de la misma manera, aunque se sabe que las células endoteliales son células más sensibles que los fibroblastos.
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de recubrimiento antimicrobiana para recubrir artículos que comprende:
un péptido de cecropina-melitina, en la que dicho péptido de cecropina-melitina tiene una cisteína en el extremo C-terminal;
una nanopartícula unida a dicho péptido de cecropina-melitina en la que dicha nanopartícula es una nanopartícula metálica o una nanopartícula recubierta por una capa metálica, y en la que dicho metal es oro, titanio o mezclas de los mismos;
una tiol-PEG-amina;
en la que la nanopartícula está funcionalizada por cisteína y tiol-PEG-amina y
en la que la composición es adecuada para unirse a la superficie del artículo.
2. La composición según la reivindicación anterior, que comprende además un aglutinante.
3. La composición según la reivindicación anterior, en la que dicho aglutinante es un polímero.
4. La composición según la reivindicación anterior, en la que dicho polímero es un policatión o polianión.
5. -La composición según la reivindicación 4, en la que dicho polímero es una polidopamina.
6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición se une a la superficie del artículo mediante calentamiento.
7. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas nanopartículas pueden obtenerse usando un péptido de cecropina-melitina como plantilla.
8. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un tampón.
9. La composición según la reivindicación anterior, en la que la nanopartícula es oro y el tampón es HEPES.
10. La composición según las reivindicaciones anteriores, en la que la concentración del péptido de cecropinamelitina es de entre 0,10 y 1 mM, preferentemente entre 0,1 y 0,5 mM.
11. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha nanopartícula tiene un tamaño de entre 10-100 nm, preferiblemente 15-50 nm, más preferiblemente 20-30 nm.
12. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en medicina, preferiblemente como agente antimicrobiológico.
13. Un artículo recubierto con la composición de recubrimiento antimicrobiana descrita en las reivindicaciones 1­ 12.
14. El artículo según la reivindicación anterior, siendo dicho artículo un dispositivo médico, en el que en particular dicho dispositivo médico es un implante, un depresor de lengua, un termómetro médico, un medidor de azúcar en sangre, un robot médico, un implante de microchip, una herramienta quirúrgica o una neuroprótesis.
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