CN109142560A - PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物及其应用和降低凡纳滨对虾中生物胺的方法 - Google Patents

PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物及其应用和降低凡纳滨对虾中生物胺的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PEG‑ACS/luxR‑siRNA纳米复合物及其降低凡纳滨对虾中生物胺含量的方法及其应用。主要包括以下步骤：(1)根据凡纳滨对虾中主要产胺菌腐败希瓦氏菌产胺相关基因luxR序列设计并制备小干扰核糖核酸(siRNA)；(2)以经PEG化之后的精氨酸修饰的壳聚糖为载体，得到稳定的PEG‑ACS/luxR‑siRNA纳米复合物；(3)将PEG‑ACS/luxR‑siRNA纳米复合物按一定的比例加入凡纳滨对虾中。实验证明该方法不影响凡纳滨对虾感官特征，并且抑制生物胺含量的效果显著，可降低凡纳滨对虾中生物胺含量80％以上，对其他水产品中生物胺的控制具有重要推广意义。

Description

PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物及其应用和降低凡纳滨对虾 中生物胺的方法
技术领域
本发明属于食品质量与安全领域，具体涉及一种PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物的制备方法及其应用于降低凡纳滨对虾中生物胺的策略。
背景技术
凡纳滨对虾又称南美白对虾，原产于南美地区，是世界上养殖产量最高的水产品之一。自1998年引入我国以来，凡纳对虾已逐步成为我国三大主产经济虾之首。凡纳滨对虾口味鲜美，营养丰富，然而其富含的蛋白质在蛋白酶的作用下转变为多肽和氨基酸，这些小分子物质很容易进一步转化为生物胺，且可达到相当高的浓度。研究发现，腐败希瓦氏菌是凡纳滨对虾冷藏过程中的优势腐败菌，具有强的蛋白质分解能力和产胺能力，同时也是贮藏过程中生物胺的主要产生菌。因此抑制腐败希瓦氏菌生物胺的合成，不仅可以延缓对虾的腐败进程，更是对凡纳滨对虾品质和安全有着重要的意义。
生物胺是由氨基酸脱羧或醛和酮氨基化形成的具有生物活性的小分子量含氮有机化合物。人体摄入过量的生物胺时会产生中毒现象，如头晕、头痛、高血压、心悸和呼吸紊乱等。此外，生物胺还是生成致癌物质亚硝胺类的前体物质，腐胺和尸胺不仅能加强组胺的毒性，而且还会与亚硝酸盐反应生成杂环类致癌亚硝胺。生物胺性质稳定，在高温下不易降解，目前降低生物胺的主要方法有超高压法、辐照法、外源添加化合物等。这些方法存在着操作要求高，成本高，效果不明显，易降低食品品质等缺点，难以在生产中应用和推广。
RNA干扰技术是通过小干扰RNA(siRNA)来达到使目的基因沉默的目的。本发明选用壳聚糖作为传递siRNA的载体构建的PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物，通过与凡纳滨对虾中主要产胺菌腐败希瓦氏菌产胺相关基因的mRNA特异性结合，从而达到使靶基因沉默的目的，进而抑制了凡纳滨对虾中生物胺的合成，有效的延缓凡纳滨对虾的腐败进程，具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物的制备方法及应用策略，通过抑制凡纳滨对虾贮藏中产胺菌产胺相关基因的表达，从而降低对虾中生物胺的含量。针对凡纳滨对虾目前所存在的质量安全问题提供了一种高效、易操作的生物胺含量降低方法，可延缓其腐败进程，提高食用安全性。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物，据凡纳滨对虾中主要产胺菌腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens WS 13)(CP028435)产胺相关基因luxR(SPWS13_0156)序列(SEQ NO:1)，设计luxR-siRNA，luxR-siRNA与PEG化的精氨酸修饰的壳聚糖反应得到PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物。
进一步，所述luxR-siRNA为双链，其序列为：
正义链：5'-UUAGAAAUGGAUAAAGUCGAU-3'，
反义链：5'-CGACUUUAUCCAUUUCUAACU-3'。
进一步，所述PEG化的精氨酸修饰的壳聚糖采用以下步骤制备：
精氨酸修饰壳聚糖的制备：壳聚糖溶于TEMED/HCl缓冲溶液(四甲基乙二胺缓冲溶液)中，然后向该溶液中加入与壳聚糖氨基等摩尔量的1-乙基-3(3-二甲胺丙基)碳二亚胺、N-羟基-丁二酰亚胺偶联剂，搅拌均匀后，再加入壳聚糖氨基摩尔量50～100％的精氨酸，在磁力搅拌下连续室温反应6～10h，然后经脱盐水透析和冷冻干燥处理得到精氨酸修饰的壳聚糖；
PEG-ACS的制备：取精氨酸修饰的壳聚糖，加入PEG-SPA，室温下反应，使用截留分子量为14000的透析袋透析，去掉未反应的PEG，得到PEG化的精氨酸修饰的壳聚糖。
进一步，PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物的制备：
(a)siRNA溶液的制备：用DEPC水溶解siRNA，制备浓度为18～25μM的siRNA溶液。
(b)用复凝聚的方法制备PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物，将PEG-ACS溶解于NaAc/HAc缓冲溶液中，与siRNA溶液分别置于50～55℃恒温水浴加热10～15min，然后将两种溶液等体积混合，迅速在涡旋混合器上混合30～40s，即得PEG-ACS/luxR-siRNA纳米粒。
进一步，所述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物的粒径为150～250nm。
进一步，所述PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物的制备方法为：
(1)根据凡纳滨对虾中主要产胺菌腐败希瓦氏菌的产胺相关基因luxR序列(SEQNO：1)：5'-ATCGACTTTATCCATTTCTAACT-3'，设计luxR-siRNA序列。
(2)制备luxR-siRNA，正义链：5'-UUAGAAAUGGAUAAAGUCGAU-3'，反义链：5'-CGACUUUAUCCAUUUCUAACU-3'。
(3)精氨酸修饰壳聚糖(ACS)的制备：称取1g分子量5x 104D，脱乙酰度为82％壳聚糖，溶于pH 4.5～5.0的TEMED/HCl缓冲溶液中，然后向该溶液中加入一定量的1-乙基-3(3-二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基-丁二酰亚胺(NHS)偶联剂，搅拌均匀后，再加入与壳聚糖氨基摩尔量50～100％的精氨酸，在磁力搅拌下室温反应6～10h，然后经脱盐水透析和冷冻干燥处理得到精氨酸修饰的壳聚糖。
(4)PEG化的精氨酸修饰的壳聚糖(PEG-ACS)的制备：取2.5mL，10mg/mL精氨酸修饰的壳聚糖，加入25mg的PEG-SPA，室温下反应4h。使用截留分子量为14000的透析袋透析，去掉未反应的PEG。得到PEG化的精氨酸修饰的壳聚糖。
(5)siRNA溶液的制备：用一定体积的DEPC水溶解10D siRNA，制备浓度为18～25μM的siRNA溶液，-20℃保存备用。siRNA反复冻融不得超过5次。
(6)PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物的制备：用复凝聚的方法制备PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物。将PEG-ACS溶解于NaAc/HAc缓冲溶液(pH 5.5)中，至PEG-ACS的质量分数为0.02％，过滤灭菌后置于4℃冰箱保存。将一定量的PEG-ACS溶液和siRNA溶液分别置于50～55℃恒温水浴加热10～15min，然后将两种溶液等体积混合，迅速在涡旋混合器上混合30～40s，即得PEG-ACS/luxR-siRNA纳米粒。制备的复合物置于4℃冰箱中保存。
(7)PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物按一定比例加入至凡纳滨对虾中。
优选地，步骤(1)中所述luxR-siRNA为双链，其序列为：
正义链：5'-UUAGAAAUGGAUAAAGUCGAU-3'；
反义链：5'-CGACUUUAUCCAUUUCUAACU-3'。
优选地，步骤(3)中所述的壳聚糖分子量为5x 104D，脱乙酰度为82％。
优选地，步骤(3)中所述的缓冲溶液pH约为4.5～5。
优选地，步骤(3)中所述的偶联剂的量为壳聚糖氨基等摩尔量。
优选地，步骤(3)中所述的精氨酸的量为壳聚糖氨基摩尔量的50％
优选地，步骤(4)中所述的ACS和PEG-SPA质量比为1:1。
优选地，步骤(4)中所述的透析袋的分子量为14000。
优选地，步骤(5)中所述的siRNA溶液浓度为18～25μM。
优选地，步骤(6)中所述的NaAc/HAc缓冲溶液pH为4.5～5.5。
优选地，步骤(6)中所述的PEG-ACS的质量分数为0.02％。
优选地，步骤(6)中所述的PEG-ACS与siRNA的质量比为90～110:1。
优选地，步骤(6)中所述的水浴温度为50～55℃，时间为10～15min。
优选地，步骤(6)中所述的涡旋混合器上混合时间为30～40s。
优选地，步骤(6)中所述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物的粒径为150～250nm。
优选地，步骤(7)中所述的比例为每千克虾加入0.18～0.35mmol纳米复合物。
本发明还提供上述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物在凡纳滨对虾贮藏中的应用。
进一步，将PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物在贮藏前加入至凡纳滨对虾，所述的比例为每千克凡纳滨对虾加入0.18～0.35mmol纳米复合物。
本发明还提供一种降低凡纳滨对虾贮藏中生物胺含量的方法，将上述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物在贮藏前加入凡纳滨对虾中。
与现有技术相比，本发明具备以下优点：
本发明制备了一种用于降低凡纳滨对虾中生物胺合成的PEG-ACS/siRNA纳米复合物，通过特异靶向腐败希瓦氏菌产胺相关基因luxR，与luxR基因的mRNA分子特异性结合后使mRNA分子降解，阻止了基因的表达，从根本上抑制了生物胺的合成。
RNA干扰技术是通过具有同源性的双链RNA诱导序列特异的目标基因的沉默，阻断其基因活性。根据碱基互补配对的原则，小干扰RNA(siRNA)有着很高的特异性，只对同源的靶基因起到干扰作用，对不相关的序列不起作用。同时，小干扰RNA(siRNA)又存在着高效性，少量的小干扰RNA(siRNA)就对基因表达沉默有着很高的效率。本发明选用改性之后的壳聚糖作为传递siRNA的载体，制备的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物具有效率高、靶向性强、无毒无害等优点。
本发明构建的聚乙二醇(PEG)-精氨酸修饰壳聚糖(ACS)/luxR-siRNA纳米复合物通过与靶基因mRNA的结合降解mRNA，能够有效的抑制靶基因的表达。经过大量实验证明，使用本发明的方法对凡纳滨对虾贮藏中生物胺的含量具有显著的降低作用。得到的产品与对照组相比，生物胺含量可显著降低80％以上。PEG-ACS/siRNA纳米复合物处理后的产品在色泽、滋味和气味等方面与对照组比较无显著差异。因此本发明在不影响凡纳滨对虾风味、色泽、营养的情况下，能够安全用于抑制凡纳滨对虾贮藏过程中生物胺的产生，有效延缓凡纳滨对虾的腐败进程，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
图1为4℃贮藏下凡纳滨对虾总胺变化情况。
图2为实施例1中4℃贮藏4d和10d时，凡纳滨对虾处理前后生物胺的含量对比。
图3为实施例2中4℃贮藏4d和10d时，凡纳滨对虾处理前后生物胺的含量对比。
图4为4℃贮藏6d时凡纳滨对虾的品质变化情况。
具体实施方式
下面将结合具体实施实例，对本发明的技术方案进行完整的描述。本发明实例选取不同含量的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物加入凡纳滨对虾中，产品生物胺含量可降低80％以上。
实施例1：PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物在凡纳滨对虾中的作用
(1)ACS的制备：称取1g壳聚糖，溶于pH 5.0的TEMED/HCl缓冲溶液中，然后向该溶液中加入1130mg的EDC和685mg NHS偶联剂，搅拌均匀后，再加入与壳聚糖氨基80％摩尔量的精氨酸，在磁力搅拌下室温反应8h，然后经脱盐水透析和冷冻干燥处理得到精氨酸修饰的壳聚糖。
(4)PEG-ACS的制备：取2.5mL，10mg/mL精氨酸修饰的壳聚糖，加入25mg的PEG-SPA，室温下反应4h。使用截留分子量为14000的透析袋透析，去掉未反应的PEG。得到PEG化的精氨酸修饰的壳聚糖。
(5)siRNA溶液的制备：用125μL DEPC水溶解10D siRNA，制备浓度为20μM的siRNA溶液，-20℃保存备用。
(6)PEG-ACS/luxR-siRNA的制备：将PEG-ACS溶解于NaAc/HAc缓冲溶液(pH5.5)中，至PEG-ACS的质量分数为0.02％，过滤灭菌后置于4℃冰箱保存。将PEG-ACS溶液和siRNA溶液分别置于50℃恒温水浴加热12min，然后按PEG-ACS与siRNA的质量比为100:1迅速在涡旋混合器上混合40s，即得PEG-ACS/luxR-siRNA纳米粒。制备的复合物置于4℃冰箱中保存。
(7)将PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物按每千克虾0.25mmol纳复合物在贮藏前加入凡纳滨对虾中。
(8)用HPLC检测产品中生物胺的含量，结果如表2所示。
表1 4℃贮藏下未经处理的凡纳滨对虾中生物胺的含量(mg/kg)
表2 4℃贮藏下PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物处理后凡纳滨对虾中生物胺的含量(mg/kg)
由表1和表2生物胺含量比较可得：PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物对凡纳滨对虾中生物胺的抑制达到83.3％左右。
结合图1可以看出，在4℃下贮藏0～2d时，处理组和对照组凡纳滨对虾总胺含量无明显差异，贮藏2～4d时，处理组和对照组凡纳滨对虾总胺含量差异不大。贮藏4～10d时，处理组和对照组凡纳滨对虾总胺含量有了明显差异。说明在贮藏期内，PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物对生物胺有明显的抑制作用。
结合图2可以进一步看出，在贮藏4d时，PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物对凡纳滨对虾中尸胺、腐胺、总胺的合成有极显著的抑制作用，对亚精胺的合成也有略微的抑制作用。在贮藏10d时，PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物对凡纳滨对虾中尸胺、腐胺、总胺的合成有极显著的抑制作用，对亚精胺的合成也有略微的抑制作用。
凡纳滨对虾在4℃贮藏6d时，采用微量凯氏定氮法测TVB-N值，按照GB4789.2-2016方法测定菌落总数，并对其色泽、气味、虾体肉质情况、虾头部和腹部的连接等进行感官评价，同时做对照，结果如图4所示，由图可得PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物对贮藏期间凡纳滨对虾的品质有极大的改善作用。
实施例2：PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物在凡纳滨对虾中的作用
(1)ACS的制备：称取0.5g壳聚糖，溶于pH 4.5的TEMED/HCl缓冲溶液中，然后向该溶液中加入567mg的EDC和340mg NHS偶联剂，搅拌均匀后，再加入与壳聚糖氨基50％摩尔量的精氨酸，在磁力搅拌下室温反应6h，然后经脱盐水透析和冷冻干燥处理得到精氨酸修饰的壳聚糖。
(4)PEG-ACS的制备：取2.5mL，10mg/mL精氨酸修饰的壳聚糖，加入25mg的PEG-SPA，室温下反应4h。使用截留分子量为14000的透析袋透析，去掉未反应的PEG。得到PEG化的精氨酸修饰的壳聚糖。
(5)siRNA溶液的制备：用DEPC水溶解10D siRNA，制备浓度为18μM的siRNA溶液，-20℃保存备用。
(6)PEG-ACS/luxR-siRNA的制备：将PEG-ACS溶解于NaAc/HAc缓冲溶液(pH 5.5)中，至PEG-ACS的质量分数为0.02％，过滤灭菌后置于4℃冰箱保存。将PEG-ACS溶液和siRNA溶液分别置于55℃恒温水浴加热10min，然后按PEG-ACS与siRNA的质量比为90:1迅速在涡旋混合器上混合30s，即得PEG-ACS/luxR-siRNA纳米粒。制备的复合物置于4℃冰箱中保存。
(7)将PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物按每千克虾0.2mmol纳米复合物加入冷藏的凡纳滨对虾中。
(8)用HPLC检测产品中生物胺的含量，结果如表3所示。
表3 4℃贮藏下PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物处理后凡纳滨对虾中生物胺的含量(mg/kg)
由表1和表3生物胺含量比较可得：PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物对凡纳滨对虾中生物胺的抑制达到82.1％左右。
结合图1可以看出，在4℃下贮藏0～2d时，处理组和对照组凡纳滨对虾总胺含量无明显差异，贮藏2～4d时，处理组和对照组凡纳滨对虾总胺含量差异不大。贮藏4～10d时，处理组和对照组凡纳滨对虾总胺含量有了明显差异。说明在贮藏期内，PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物对生物胺有明显的抑制作用。
结合图3可以进一步看出，在贮藏4d时，PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物对凡纳滨对虾中尸胺、腐胺、总胺的合成有极显著的抑制作用。在贮藏10d时，PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物对凡纳滨对虾中尸胺、腐胺、总胺的合成有极显著的抑制作用。
凡纳滨对虾在4℃贮藏6d时，采用微量凯氏定氮法测TVB-N值，按照GB4789.2-2016方法测定菌落总数，并对其色泽、气味、虾体肉质情况、虾头部和腹部的连接等进行感官评价，结果如图4所示，由图4可得PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物对贮藏期间凡纳滨对虾的品质有极大的改善作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工商大学
<120>
PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物及其应用和降低凡纳滨对虾中生物胺的方法
<130> 2018
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 663
<212> DNA
<213> 腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens ）
<400> 1
ttaagataaa tcgactttat ccatttctaa ctgggctaga gcaataaccg cttgagtacg 60
gttacgaacg cctaattttc tgaagatagc ggtggcatgg gccttaatgg tcgcttcaga 120
tacacctaag tcataggcga tttgtttatt gagtaaacct tcggcaaaca tttgcagcac 180
tttatattgc tgtggagtca gatccgacag tttacttgcc attttatcga tatcatcatc 240
ttcaatggga atgatttcag caccagcagg taaccaaata tccccaaaca atacggcact 300
cagcgcttct tttagcgttt ccatcgatgc agatttagga ataaacccac tgctgccgta 360
atggattgct cggctaattg tattgatatc ctcatgggca gaaatcacca caacgggaag 420
ctcaggatag tgagaacgta aatggatcaa tgtcgaatag ccgtgtgagc cgggcatttg 480
taagtcgagt aaaaccaagt cgtagcttac atcatgtgta tccaaaaccg tttgtaaggc 540
ttcggcactg tcggcttcat accatttggc ttgctcaaag gcactggtca atgcttgacg 600
tagtgcattt ctgaacaatg gatgatcatc tgcgataata atatttaagt tttcttgctt 660
cat 663

Claims (10)

1.一种PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物，其特征在于，根据凡纳滨对虾中主要产胺菌腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens WS 13)产胺相关基因luxR序列，设计luxR-siRNA，luxR-siRNA与PEG化的精氨酸修饰的壳聚糖反应得到PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物。
2.根据权利要求1所述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物，其特征在于，所述luxR-siRNA为双链，其序列为：
正义链：5'-UUAGAAAUGGAUAAAGUCGAU-3'，
反义链：5'-CGACUUUAUCCAUUUCUAACU-3'。
3.根据权利要求1所述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物，其特征在于，所述PEG化的精氨酸修饰的壳聚糖采用以下步骤制备：
(1)精氨酸修饰壳聚糖的制备：壳聚糖溶于TEMED/HCl缓冲溶液中，然后向该溶液中加入与壳聚糖氨基等摩尔量的1-乙基-3(3-二甲胺丙基)碳二亚胺和N-羟基-丁二酰亚胺偶联剂，搅拌均匀后，再加入壳聚糖氨基摩尔量50～100％的精氨酸，在磁力搅拌下连续室温反应6～10h，然后经脱盐水透析和冷冻干燥处理得到精氨酸修饰的壳聚糖；
(2)PEG-ACS的制备：取精氨酸修饰的壳聚糖，加入PEG-SPA，室温下反应，使用截留分子量为14000的透析袋透析，去掉未反应的PEG，得到PEG化的精氨酸修饰的壳聚糖。
4.根据权利要求1所述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物，其特征在于，
PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物的制备包括以下步骤：
(1)siRNA溶液的制备：用DEPC水溶解siRNA，制备浓度为18～25μM的siRNA溶液；
(2)用复凝聚的方法制备PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物，将PEG-ACS溶解于NaAc/HAc缓冲溶液中，与siRNA溶液分别置于50～55℃恒温水浴加热10～15min，然后将两种溶液等体积混合，迅速在涡旋混合器上混合30～40s，即得PEG-ACS/luxR-siRNA纳米粒。
5.根据权利要求1所述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物，其特征在于，所述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物的粒径为150～250nm。
6.根据权利要求1所述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物，其特征在于，所述PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物的制备方法为：
(1)根据凡纳滨对虾中主要产胺菌腐败希瓦氏菌的产胺相关基因luxR序列5'-ATCGACTTTATCCATTTCTAACT-3'，设计luxR-siRNA序列；
(2)luxR-siRNA的制备；
(3)精氨酸修饰壳聚糖的制备：称取1g分子量5x 104D，脱乙酰度为82％壳聚糖，溶于pH4.5～5.0的TEMED/HCl缓冲溶液中，然后向该溶液中加入与壳聚糖氨基等摩尔量的1-乙基-3(3-二甲胺丙基)碳二亚胺和N-羟基-丁二酰亚胺偶联剂，搅拌均匀后，再加入与壳聚糖氨基摩尔量50～100％的精氨酸，在磁力搅拌下室温反应6～10h，然后经脱盐水透析和冷冻干燥处理得到精氨酸修饰的壳聚糖；
(4)PEG化的精氨酸修饰的壳聚糖的制备：取精氨酸修饰的壳聚糖，加入PEG-SPA，室温下反应；使用截留分子量为14000的透析袋透析，去掉未反应的PEG，得到PEG化的精氨酸修饰的壳聚糖；
(5)siRNA溶液的制备：用DEPC水溶解siRNA，制备浓度为18～25μM的siRNA溶液，-20℃保存备用；
(6)PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物的制备：将PEG-ACS溶解于NaAc/HAc缓冲溶液中，至PEG-ACS的质量分数为0.02％，过滤灭菌后置于4℃冰箱保存；将PEG-ACS溶液和siRNA溶液分别置于50～55℃恒温水浴加热10～15min，然后将两种溶液等体积混合，迅速在涡旋混合器上混合30～40s，得PEG-ACS/luxR-siRNA纳米粒。
7.根据权利要求5所述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物，其特征在于，PEG-ACS与siRNA的质量比为90～110:1。
8.如权利要求1-6任意一项所述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物在凡纳滨对虾贮藏中的应用。
9.根据权利要求7所述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物在凡纳滨对虾贮藏中的应用，其特征在于，将PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物在贮藏前加至凡纳滨对虾，所述的比例为每千克凡纳滨对虾加入0.18～0.35mmol纳米复合物。
10.一种降低凡纳滨对虾贮藏中生物胺含量的方法，其特征在于，将权利要求1-6任意一项所述的PEG-ACS/luxR-siRNA纳米复合物加入凡纳滨对虾中。
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