CN102643861A - 一种高效shRNA分子在抗WSSV中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效shRNA分子在抗WSSV中的应用，包括：将体重7～9g、PCR检测阴性的健康南美白对虾在室内池塘暂养1周后，用胰岛素注射器于南美白对虾第四腹节的一侧肌肉注射50μL/只shRNA分子，4h后于第四腹节的对侧肌肉注射50μL/只WSSV感染液，在水温27～28℃、每天换水1/2、24h持续充气的条件下养殖，WSSV感染4天后检测显示，南美白对虾体内WSSV的增殖被shRNA高效抑制。本发明shRNA分子可显著抑制WSSV在对虾体内的增殖，大幅降低WSSV感染虾的累积死亡率，有效降低WSSV对对虾组织的损伤，抗WSSV效率高、副作用小。

Description

一种高效shRNA分子在抗WSSV中的应用

技术领域

本发明属于RNAi抗病毒领域，特别涉及一种高效shRNA分子在抗WSSV中的应用。

背景技术

对虾是热带亚热带浅海最占优势的甲壳动物，具有种类多，种群数量大，繁殖力强，生长迅速，肉味鲜美等特点。自从上世纪70年代末开始，对虾养殖迅速发展成为一个支柱产业，不仅解决了成千上万人的劳动就业问题，而且给财政带来了成百上千亿美金的收入和给百姓带来了高质量的食品。但是，随着集约化养殖技术的不断提高和养殖面积的不断扩大，对虾养殖产量不断上升，其病害问题也日益严重。到目前为止，已发现的养殖对虾疾病有30多种，在过去几年中，对虾疾病造成的损失高达上亿美元。引起对虾疾病的病原主要有病毒、细菌、真菌和寄生虫，其中对虾病毒性疾病是对虾养殖业面临的最严重的问题。作为对虾白斑症(white spot disease，WSD)的病原，对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)以其对宿主的泛嗜性、高致病性以及高致死率而位居对虾病毒病之首。

对虾一般在感染WSSV48h后即可出现典型症状——红体和甲壳白斑，3～10 d内死亡率可高达100％。因此，自从1993年该病首次暴发以来，几乎每年均给我国对虾养殖业带来巨大经济损失，塘口绝收现象常有发生。与其他无脊椎动物一样，对虾特异性免疫机制的缺乏大大增加了对其病毒防治的难度。由于疾病频发和专用防治药物的匮乏，导致各种消毒、防治药物的滥用；养殖生态系统遭到持续破坏，海洋生态平衡和水产养殖业的可持续发展受到严重威胁。可以说，在某种程度上对虾病害的有效控制决定了对虾养殖业的可持续发展。到目前为止，虽然在研究人员的努力下虾类免疫与防治已经有了相当大的进展，但仍然停留在非特异增强机体抗病能力方面，因此在遇到WSSV这样发病迅即、病死率高的病原感染时，往往难以胜任，因而，寻求高效特异的WSSV防治方法仍然是病毒研究的重中之重。

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是在真核细胞中由双链RNA(dsRNA)诱导的特异性RNA降解过程，在细胞水平和动植物体内均表现出高效特异的抗病毒能力。近几年的相关研究证明，RNAi在水生无脊椎动物体内也能激发高效的抗病毒效应。由于WSSV基因组序列已经明确，因此，运用RNA干扰技术抗WSSV、研究抗病毒专用制剂是完全可能的。我国的水产研究专家黄倢、何建国、章晓波等团队均实施了RNAi技术抗WSSV的研究，并取得了很好的抗病毒效果。我们也在近几年进行了相关研究，并研究获得自行设计的高效RNA干扰分子。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效shRNA分子在抗WSSV中的应用，该shRNA分子可显著抑制WSSV在对虾体内的增殖，大幅降低WSSV感染虾的累积死亡率，有效降低WSSV对对虾组织的损伤，抗WSSV效率高、副作用小。

本发明的一种高效shRNA分子在抗WSSV中的应用，包括：

将体重7～9g、PCR检测阴性的健康南美白对虾在室内池塘暂养1周后，用胰岛素注射器于南美白对虾第四腹节的一侧肌肉注射50μL/只shRNA分子，4h后于第四腹节的对侧肌肉注射50μL/只WSSV感染液，在水温27～28℃、每天换水1/2、24h持续充气的条件下养殖，WSSV感染4天后检测得南美白对虾体内WSSV的增殖被shRNA抑制。

所述shRNA分子shWR的序列为：

5’-GGACCAACAAACCCAAGAAUUGAAGAAGUUCUUGGGUUUGUUGGUCCUU-3’。

所述shWR的制备方法包括：

(1)选取WSSV早期复制相关酶的编码序列；

(2)利用软件生成抗WSSV的小RNA干扰分子；

(3)按照已公布的小RNA序列设计规则，选择一个理论上高效的小RNA分子(siRNA)；

(3)把该siRNA构建成shRNA分子，记为shWR。

所述步骤(1)中的WSSV早期复制相关酶为核糖核酸还原酶。

有益效果

本发明的shRNA分子可显著抑制WSSV在对虾体内的增殖，大幅降低WSSV感染虾的累积死亡率，有效降低WSSV对对虾组织的损伤，抗WSSV效率高、副作用小；研究结果表明，本发明的shRNA分子具有高效性和病毒特异性，可有效弥补对虾特异免疫机制的缺陷，因此，可作为抗WSSV药物研制的新的候选制剂。

附图说明

图1是shRNA分子(shWR和HK)降低南美白对虾死亡率的效果对比图；图示为WSSV感染7天后的各组对虾累积死亡率；

图2是shRNA分子(shWR和HK)抑制南美白对虾体内WSSV增殖的效果对比图；图中显示的是WSSV感染4天后对虾体内的WSSV感染量(相对于同期阳性对照体内病毒感染量的相对定量)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

shRNA分子shWR抗WSSV试验(RNA干扰试验)

体重7～9g、PCR检测阴性的健康凡纳滨对虾在室内池塘暂养1周后，随机分成2个shRNA干扰组(shWR和HK)、1个阳性对照组(WSSV)和1个阴性对照组(Negative)，每组15只对虾，分别暂养于90L的白色玻纤桶中。用胰岛素注射器分别于干扰组凡纳滨对虾第四腹节的一侧肌肉注射50μL/只shRNA(25μg)，4h后于对侧肌肉注射50μL/只WSSV感染液；与此同时，阳性对照组分别注射50μL/只0.01mol/L PBS(pH 74)和50μL/只WSSV感染液，而阴性对照组2次均注射50μL/只0.01mol/L PBS(pH 74)。对虾养殖水温控制在27～28℃，每天换水1/2，24h持续充气。

实施例2

shRNA分子(shWR)降低对虾死亡率实验

按实施例1的方法实施RNAi实验。每天观察4次，及时捡出死亡和濒死对虾，记录死亡数，并且以WSSV特异PCR引物检测死亡对虾，持续观察7d。

实施例3

shRNA分子(shWR)抑制南美白对虾体内WSSV增殖实验

按实施例1的方法实施RNAi实验。WSSV感染4天后，所有对虾均剪取背部肌肉，用组织基因组DNA提取试剂盒(Tiangen)抽提总DNA，然后根据宝生物SYBR Premix Ex Taq(real time)试剂盒的说明定量上述目的基因和看家基因的特异片段。相对定量检测条件为95℃预变性30s；95℃ 5s，57℃ 20s，72℃ 17s，循环45次(ABI StepOnePlus Instrument)。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳后检测。

用于定量PCR的引物分别为P1、P2和P3、P4。其中，P1：5′-TGTGACCAAGACCATCGAA-3′和P2：5′-CCACACCTTGAATGTTCCC-3′；扩增WSSV特异基因片段；P3：5′-GATCGAGTGGAGGGCAAGT-3′和P4：5′-ACGACCATTCGGGCTGTA-3′用于扩增看家基因，作为上样参照。

实施例4

shRNA分子(shWR)保护对虾组织的实验

WSSV感染4天后，随机收集对照组、shWR干扰组对虾，分别采集肝胰腺、肌肉和鳃组织，浸入10％甲醛溶液保存。然后石蜡包埋，苏木精-伊红染色，制作石蜡超薄切片，光镜观察shRNA分子抗WSSV的效果。

Claims (3)

1.一种高效shRNA分子在抗WSSV中的应用，包括：

将体重7～9g、PCR检测阴性的健康南美白对虾在室内池塘暂养1周后，用胰岛素注射器于南美白对虾第四腹节的一侧肌肉注射50μL/只shRNA分子，4h后于第四腹节的对侧肌肉注射50μL/只WSSV感染液，在水温27～28℃、每天换水1/2、24h持续充气的条件下养殖，WSSV感染4天后检测显示，南美白对虾体内WSSV的增殖被shRNA抑制。

2.根据权利要求1所述的一种高效shRNA分子在抗WSSV中的应用，其特征在于：所述shRNA分子shWR的序列为：

5’-GGACCAACAAACCCAAGAAUUGAAGAAGUUCUUGGGUUUGUUGGUCCUU-3’。

3.根据权利要求1所述的一种高效shRNA分子在抗WSSV中的应用，其特征在于：所述shWR的制备方法包括：

(1)选取WSSV早期复制相关酶的编码序列；

(2)利用软件生成抗WSSV的小RNA干扰分子；

(3)按照已公布的小RNA序列设计规则，选择一个理论上高效的小RNA分子；

(3)把该siRNA构建成shRNA分子，记为shWR。

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