CN109913453B - 一种AMO-miR-137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用 - Google Patents

一种AMO-miR-137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种AMO‑miR‑137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用，所述高效抵抗WSSV的AMO‑miR‑137的序列为：5’‑ACGUGUAUUCUCAAGCAAUAA‑3’。本发明的AMO‑miR‑137能抑制WSSV在拟穴青蟹、日本囊对虾及克氏原螯虾体内的增殖，显著提高虾血淋巴细胞的活力，增强虾对病毒的抵抗能力，高效的抑制WSSV病毒的传播感染。本发明的AMO‑miR‑137适用范围广泛，不仅适用于海水养殖的日本囊对虾及拟穴青蟹，同样也适用于淡水养殖的克氏原螯虾。本发明的AMO‑miR‑137分子质量小易降解，不会破坏养殖生态平衡，且不会对人的身体健康造成危害，绿色环保；为水产养殖中抗白斑综合症病毒提供了一种潜在的药物，不仅适用于预防，也可适用在已爆发白斑综合症的虾蟹的养殖过程。

Description

一种AMO-miR-137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的 应用
技术领域
本发明涉及水产养殖的病毒性疾病防治领域，尤其涉及一种AMO-miR-137在制备抗白斑综合症病毒抑制剂中的作用。
背景技术
拟穴青蟹(Scylla paramamosain)，简称青蟹，具有生长快、肉质鲜美、营养价值高等特点，在海产市场中备受青睐，是我国东南沿海重要经济蟹类之一，也是许多国家人工养殖的主要海洋蟹类品种。日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)俗称车虾，分布十分广泛，从非洲东部海域、红海到朝鲜日本一带都有分布，在我国主要分布在东海和南海。其具有肉质鲜美、营养价值高、生存能力强、等特点，是对虾中价值最高的一个品种。克氏原螯虾(Procambarus clarkii)因其形态与海水龙虾相似，因而被称为淡水龙虾。1929年由日本引进我国，具有生长快、易饲养、食性杂、养殖方法灵活、抗病能力强等优势，该虾肉味鲜美，营养丰富，是新兴的淡水养殖品种。
但是随着现代化高密度养殖的发展，养殖过程中疾病的爆发日趋频繁，细菌、病毒感染等引起的各种疾病给水产养殖业带来了日益严重的影响，给国家的农业收入造成了巨大的损失。疾病监控困难严重制约了水产养殖业的可持续发展。尤其是伴随着近年各种虾蟹混养模式的快速发展，一些原发于虾类的疾病也通过接触或水体传染给了蟹类，对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrom virus，WSSV)就是一个典型事件。WSSV对宿主具有泛嗜性，几乎所有的十足甲壳类都会被感染，且传播途径众多。一旦出现WSSV感染，如果不及时采取措施，极容易形成爆发之势，难以控制。
与脊椎动物不一样的是，无脊椎动物缺少以抗原抗体特异性为基础的获得性免疫系统，其主要依靠一系列的先天性免疫机制来抵御病原微生物的入侵和进一步感染，这大大增加了养殖过程中的病毒防治工作的难度。现有的防治措施有：使用广谱性的抗生素，此法虽有一定效果，但作用时间短，药物残留严重，污染环境，还有可能催生耐药菌而严重危害人类健康，影响生态平衡以及海水与淡水养殖业的可持续发展，因此筛选抗白斑综合症病毒的高效、安全的药物具有重要的意义。
miRNA是长度约为21-24个核苷酸的单链RNA，通过与靶基因mRNA配对结合，进而抑制靶基因的表达，发挥着转录后调控的功能。最近的研究表明，miRNA在宿主与病毒的互作过程中发挥着关键的作用，miRNA作为抗病毒治疗的候选药物具备良好的应用前景。
目前关于抵抗WSSV的药物发明较少，主要有拟穴青蟹抗脂多糖因子SP-ALF2(专利号：201110327329.5)，其为一种体外原核表达的重组蛋白，制备方法较繁琐。此外，还有防治小龙虾白斑综合症的免疫增强剂(专利号：201611090048.1)，其由维生素E、酵母核酸、左旋咪唑、干扰素、聚乙二醇制成。此免疫增强剂需溶解至水中，搅拌混匀后喷洒至小龙虾养殖水域，并在3至4小时后，重复喷洒一次。再如，Cq-Nslabp基因及其蛋白在鳌虾抗病毒中的应用(专利号：201810031865.2)等。上述发明步骤繁琐，或者所需材料种类繁多且见效慢。其所包含的材料分子质量相对较大，降解难易程度未知，其残留是否会影响人体健康也未知，其是否会影响养殖生态平衡也未知。因此，寻找方法简单，分子质量较小，易降解，有效的防治方法极为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小RNA反义核酸AMO-miR-137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用，本发明的小RNA反义核酸AMO-miR-137能够抑制WSSV在拟穴青蟹、日本囊对虾和克氏原螯虾体内的复制，有效抑制病毒的传播感染，以解决WSSV对海水及淡水养殖虾蟹类感染并致死的现象等问题。
一种高效抵抗WSSV的AMO-miR-137，序列为：5’-ACGUGUAUUCUCAAGCAAUAA-3’。
上述高效抵抗WSSV的AMO-miR-137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用。
进一步的，所述制剂包括含AMO-miR-137的饲料添加剂、固体或者液体药物。
进一步的，所述广谱抗白斑综合症病毒制剂可用于甲壳类动物。
进一步的，所述甲壳类动物包括海水养殖蟹类、海水养殖虾类和淡水养殖虾类。
进一步的，所述甲壳类动物包括日本对虾、克氏原螯虾和拟穴青蟹。
一种包含上述高效抵抗WSSV的AMO-miR-137的制剂。
本发明通过研究miRNA在WSSV感染过程中的表达情况，发现拟穴青蟹受到白斑综合症病毒感染后体内的miR-137显著下调，表明miR-137可能参与了宿主病毒间的互作过程，是潜在的WSSV防治的新靶点。随后对拟穴青蟹进行攻毒实验并分别在青蟹体内过表达及抑制miR-137。结果表明上调miR-137的表达量后宿主体内病毒拷贝数显著增加，相反利用AMO-miR-137抑制miR-137的表达量后宿主体内的病毒拷贝数显著下降，其作用机制是诱导宿主细胞发生凋亡进而抑制WSSV在拟穴青蟹体内的复制。此外，为了证明AMO-miR-137作为抗WSSV药物的泛适性，我们在日本囊对虾及克氏原螯虾中进行了相关功能验证试验，发现AMO-miR-137能够抑制WSSV在日本囊对虾及克氏原螯虾体内的增殖，显著提高虾血淋巴细胞的活力，增强虾对病毒的抵抗能力。因此，AMO-miR-137有望成为抗WSSV的新药物，广泛应用于水产养殖过程中WSSV的防治工作。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)适用范围广泛，不仅适用于海水养殖的拟穴青蟹及日本囊对虾，同样也适用于淡水养殖的克氏原螯虾，是一种潜在的广谱抗WSSV的药物，广泛应用于水产养殖过程中WSSV的防治工作。
(2)本发明AMO-miR-137属于核酸合成物，分子质量小易降解，不会破坏养殖生态平衡，且不会对人的身体健康造成危害，绿色环保。
(3)本发明的抗白斑综合症病毒制剂可以只包含AMO-miR-137单一的化学物，本发明更易应用于实际生产。
(4)本发明AMO-miR-137，不仅适用于预防，也可适用在已爆发白斑综合症的虾蟹的养殖过程。本发明AMO-miR-137可显著抑制WSSV在宿主体内的复制，有效抑制病毒的进一步传播。
附图说明
图1为WSSV感染拟穴青蟹后，拟穴青蟹血细胞中miR-137的表达量。
图2为miR-137模拟物对拟穴青蟹血细胞中miR-137表达量的影响；将miR-137及miR-137-scrambled分别注射至拟穴青蟹体内，利用qPCR检测血细胞中miR-137的表达量。
图3为miR-137模拟物对拟穴青蟹体内WSSV复制的影响；将miR-137或miR-137-scrambled混合WSSV后分别向拟穴青蟹体内注射；检测WSSV感染青蟹0、24和48小时后WSSV的拷贝数。
图4为AMO-miR-137对拟穴青蟹血细胞中miR-137表达量的影响；将AMO-miR-137及AMO-miR-137-scrambled分别注射至拟穴青蟹体内，利用qPCR检测血细胞中miR-137的表达量。
图5为AMO-miR-137对拟穴青蟹体内WSSV复制的影响；将AMO-miR-137或AMO-miR-137-scrambled混合WSSV后分别向拟穴青蟹体内注射；检测WSSV感染青蟹0、24和48小时后WSSV的拷贝数。
图6为AMO-miR-137对拟穴青蟹体内血淋巴细胞活力的影响；WSSV感染后，实验组注射AMO-miR-137，对照组注射AMO-miR-137-scrambled，处理48h后检测拟穴青蟹体内的血淋巴细胞活力。
图7为AMO-miR-137拟穴青蟹血淋巴细胞凋亡的影响，将AMO-miR-137，AMO-miR-137-scrambled或PBS溶液混合WSSV后注射至青蟹体内，用流式细胞仪检测WSSV感染48小时后青蟹血淋巴细胞的凋亡。
图8为AMO-miR-137分子处理后WSSV在日本囊对虾体内增殖的拷贝数；对照组注射WSSV或WSSV+AMO-miR-137-scrambled，图示为感染0h，24h，48h后各组日本囊对虾体内WSSV的拷贝数。
图9为AMO-miR-137分子处理后WSSV在克氏原螯虾体内增殖的拷贝数；对照组注射WSSV或WSSV+AMO-miR-137-scrambled，图示为感染0h，24h，48h后各组克氏原螯虾体内WSSV的拷贝数。
图10为AMO-miR-137对日本囊对虾及克氏原螯虾体内血淋巴细胞活力的影响；WSSV感染日本囊对虾及克氏原螯虾后，注射AMO-miR-137，对照组注射AMO-miR-137-scrambled，处理48h后检测各组日本囊对虾及克氏原螯虾体内的血淋巴细胞活力。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
WSSV感染后拟穴青蟹体内miR-137表达量的检测试验
将体重30-40g,qRT–PCR检测WSSV为阴性的拟穴青蟹在室内海水水箱中于10‰盐度，25℃水温条件下驯养一周后，从拟穴青蟹第四附肢上注射200μL/只，106拷贝数的WSSV感染液，感染0h、24h和48h后分别收集血细胞，用MagMAXTM mirVanaTM Total RNAIsolation提取试剂盒提取RNA,然后再用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒进行cDNA合成，所用的引物为5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACACGTGTAT-3’，再利用qRT-PCR检测miR-137表达量，所用引物为P1和P2。
P1:5’-CGCCGTTATTGCTTGAGA-3’；
P2:5’-TGCAGGGTCCGAGGTCACTG-3’。
结果见图1，WSSV感染后，拟穴青蟹血淋巴中miR-137表达量显著下调，表明miR-137可能参与了宿主病毒间的互作过程，因此，miR-137是潜在的WSSV防治的新靶点。
实施例2：
miR-137模拟物上调青蟹体内miR-137表达量的试验
按实施例1的方法随机将拟穴青蟹分成3组，实验组注射100μL/只miR-137(10nM)，阴性对照组分别注射100μL/只miR-137-scrambled(10nM)或100μL/只PBS。并于48h后收集血细胞并按实施例1方法检测青蟹血细胞中miR-137的表达量。
结果见图2，结果表明注射miR-137模拟物可以显著上调青蟹体内miR-137的表达量，可用于后续功能试验。
实施例3：
miR-137模拟物促进WSSV在拟穴青蟹体内增殖的试验
按实施例2中方法将拟穴青蟹随机分为3组，实验组注射100μL/只106拷贝数的WSSV感染液与100μL/只miR-137(10nM)的混合液，阴性对照组分别注射100μL/只106拷贝数的WSSV感染液与100μL/只miR-137-scrambled(10nM)的混合液或100μL/只106拷贝数WSSV的感染液。分别于0h、24h和48h后剪取青蟹附肢肌肉，用组织基因DNA提取试剂盒(Tiangen)抽提总DNA，然后用qRT-PCR进行病毒拷贝数的检测。所用引物为P3和P4。
P3:5’-CAAATCTCCCCTTCATCTACTCAAC-3’；
P4:5’-AATAATTTTCCCGTTTCTGAATAGA-3’。
结果见图3，结果表明拟穴青蟹被WSSV感染后，注射miR-137模拟物能够促进病毒在体内的复制，因此，为筛选抗WSSV的药物，后续试验使用miR-137的反义核酸AMO-miR-137进行抗病毒试验。
实施例4：
AMO-miR-137抑制青蟹体内miR-137表达量的试验
按实施例2方法，实验组注射100μL/只AMO-miR-137(10nM)，阴性对照组分别注射100μL/只AMO-miR-137-scrambled(10nM)或100μL/只PBS。并于48h后收集血细胞并按实施例1方法检测拟穴青蟹血细胞中miR-137的表达量。
结果见图4，结果表明注射AMO-miR-137可以显著抑制青蟹体内miR-137的表达量，可用于后续功能试验。
实施例5：
AMO-miR-137抑制WSSV在拟穴青蟹体内增殖的试验
按实施例3实验组注射100μL/只106拷贝数的WSSV感染液与100μL/只AMO-miR-137(10nM)的混合液，阴性对照组分别注射100μL/只106拷贝数的WSSV感染液与100μL/只AMO-miR-137-scrambled(10nM)的混合液或100μL/只106拷贝数WSSV的感染液。分别于0h、24h和48h后按实施案例3的方法检测病毒拷贝数。
结果见图5，结果表明拟穴青蟹被WSSV感染后，注射AMO-miR-137能够显著抑制病毒在体内的复制，增加拟穴青蟹的抗病毒能力。
实施例6：
AMO-miR-137增强WSSV感染后拟穴青蟹体内血淋巴细胞活力的试验
将健康的拟穴青蟹分为4组，第一组只注射WSSV，第2组注射WSSV和AMO-miR-137，第3组注射WSSV和AMO-miR-137-scrambled，第4组不处理，注射方法参考实施例5。注射48h后，收集青蟹血淋巴细胞，并利用Abnova公司的Cell Viability Assay Kit(GreenFluorescence)试剂盒检测血淋巴细胞的活力。
结果见图6，WSSV感染后，拟穴青蟹体内血淋巴细胞活力急剧降低。相较于对照组WSSV和WSSV+AMO-miR-137-scrambled，同时注射WSSV和AMO-miR-137的实验组青蟹体内血淋巴细胞活力显著升高，表明注射本发明AMO-miR-137能够显著提高病毒感染后青蟹血淋巴细胞的活力，能够增强拟穴青蟹对病毒的抵抗能力。
实施例7：
AMO-miR-137促进拟穴青蟹血细胞凋亡的试验
按实施例5实验组注射100μL/只106拷贝数的WSSV感染液与100μL/只AMO-miR-137(10nM)的混合液，阴性对照组分别注射100μL/只106拷贝数的WSSV感染液与100μL/只AMO-miR-137-scrambled(10nM)的混合液或100μL/只PBS。48h后，收集青蟹的血淋巴细胞，用FITC Annexin V Apoptosis Detection试剂盒(BD Pharmingen TM)进行染色处理，用细胞筛网过滤后通过流式细胞仪检测血淋巴细胞的凋亡情况。
结果见图7，结果表明AMO-miR-137处理青蟹后，青蟹血细胞凋亡水平比AMO-miR-137-scrambled及PBS处理组显著性升高。说明正常情况下拟穴青蟹细胞凋亡水平很低，而当宿主遭到病毒攻击时，会启动细胞凋亡程序来抑制病毒的进一步传播，但整体幅度有限，不能充分满足抗病毒需求，而注射AMO-miR-137能使宿主细胞凋亡水平迅速提高，进而有效抑制病毒在宿主体内的进一步复制。
实施例8：
AMO-miR-137抑制WSSV在日本囊对虾及克氏原螯虾体内增殖的试验
取体重为10-12g的日本囊对虾和克氏原螯虾在实验室暂养一周以上，取qPCR检测WSSV为阴性的健康的虾进行实验。实验实施中，将选取的虾随机分为3组：WSSV阳性对照组，WSSV+AMO-miR-137干扰实验组，WSSV+AMO-miR-137-scrambled阴性对照组,每组9只分别养在玻璃缸内。用1mL医用注射器肌肉注射100μL/只AMO-miR-137(10nM)的混合液或100μL/只106拷贝数WSSV的感染液。养殖过程中持续充氧，每天换水一次,换水体积为总体积的1/3。分别于0h、24h和48h后按实施案例3的方法检测病毒拷贝数。
结果见图8和图9，AMO-miR-137注射后24和48小时，日本囊对虾及克氏原螯虾体内WSSV的拷贝数显著低于AMO-miR-137-scrambled的阴性对照组及仅注射WSSV的阳性对照组，表明注射AMO-miR-137可以显著抑制WSSV在日本囊对虾及克氏原螯虾体内的增殖。
实施例9：
AMO-miR-137增强WSSV感染后日本囊对虾及克氏原螯虾体内血淋巴细胞活力的试验
将体重10-12g的健康日本囊对虾和克氏原螯虾分别用海水和淡水在室内养殖池暂养一周后分为4组，每组9只。第一组只注射WSSV，第2组注射WSSV和AMO-miR-137，第3组注射WSSV和AMO-miR-137-scrambled，第4组不处理，注射方法见实施例8。注射48h后，每个组随机抽取5只虾，收集虾血淋巴细胞，并利用Abnova公司的Cell Viability Assay Kit(Green Fluorescence)试剂盒检测血淋巴细胞的活力。
结果见图10，WSSV感染后，日本囊对虾和克氏原螯虾体内血淋巴细胞活力急剧降低。相较于对照组WSSV和WSSV+AMO-miR-137-scrambled，同时注射WSSV和AMO-miR-137的实验组虾体内血淋巴细胞活力显著升高，表明注射本发明AMO-miR-137能够显著提高病毒感染后虾血淋巴细胞的活力，能够增强日本囊对虾和克氏原螯虾对病毒的抵抗能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 汕头大学
<120> 一种AMO-miR-137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 未知
<400> 1
acguguauuc ucaagcaaua a 21

Claims (2)

1.一种高效抵抗WSSV的AMO-miR-137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用，其特征在于，所述高效抵抗WSSV的AMO-miR-137的序列为：5’-ACGUGUAUUCUCAAGCAAUAA-3’；所述广谱抗白斑综合症病毒制剂用于甲壳类动物；所述甲壳类动物为日本囊对虾、克氏原螯虾和拟穴青蟹。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂包括含AMO-miR-137的固体或者液体药物。
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