CN109609504B - 一种miR-276模拟物在制备广谱抗白斑综合症病毒药物中的应用 - Google Patents

一种miR-276模拟物在制备广谱抗白斑综合症病毒药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种miR‑276模拟物在制备广谱抗白斑综合症病毒药物中的应用，所述miR‑276模拟物为人工合成的日本对虾miR‑276，序列为：5'‑TAGGAACTTCATACCGTGCTCT‑3’。所述miR‑276在日本对虾受到WSSV感染后含量显著上升；能显著抑制WSSV的在日本对虾体内的复制，提高对虾的抗病毒能力，显著提升对虾的存活率；也能抑制WSSV在克氏原螯虾及拟穴青蟹体内的复制。miR‑276模拟物可作为一种高效预防WSSV的感染及传播新的药物，应用范围广泛，不仅适用于海水养殖的日本对虾和拟穴青蟹，同时适用于淡水养殖的克氏原螯虾，对食品安全也没有影响，有利于水产养殖业的长期可持续发展。

Description

一种miR-276模拟物在制备广谱抗白斑综合症病毒药物中的 应用
技术领域
本发明属于水产养殖的病毒防治领域，尤其涉及一种miR-276模拟物及其在制备广谱抗白斑综合症病毒药物中的应用。
背景技术
日本对虾在世界范围内分布广泛，在我国主要分布在长江以南沿海区域。其肉质鲜嫩，营养丰富，是许多国家和地区的重要养殖对象。在20世纪80年代，我国对虾养殖业的发展带动了我国水产养殖业的迅猛发展，促进了我国沿海地区的经济增长，但20世纪90年代初，对虾病毒性感染在养殖场开始蔓延，导致当时的对虾养殖业经济效益直线下降。近年来，由于环境污染及养殖密度过大等因素的影响，对虾疾病亦是频繁爆发。
拟穴青蟹(Scylla paramamosain)在我国主要分布在东海和南海一带，浙江、福建、台湾、广东等沿海区域为拟穴青蟹主要产地。近年来，随着我国青蟹养殖和人工育苗技术的不断提高与相关研究工作的不断深入，该品种已经成为我国重要的海水养殖经济蟹类，年产量近15万吨，年产值愈100亿(2016年数据)。然而随着海水养殖规模的不断扩大、集约化程度的不断提高，青蟹接触病原的机会越来越多，新发病原和暴发性流行病的发生均呈显著上升趋势。细菌、病毒感染等引起的各种疾病给青蟹的养殖带来了日益严重的影响，给国家的农业收入带来了重大损失。
克氏原螯虾，又称为淡水龙虾或小龙虾，20世纪30年代引入我国，是我国淡水虾类中的一种重要资源。我克氏原螯虾具有较高的营养价值和食疗作用，其国内外需求量逐年上升，至2017年，我国小龙虾产量突破100万吨，经济总产值突破2600亿元。近年来，克氏原螯虾病害的发生与流行导致其养殖产量降低、品质下滑。因此，迫切需要了解克氏原螯虾的病害及相关防治措施，以保证克氏原螯虾产业的持续发展。
白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是水产养殖过程中的常见病毒性病原，WSSV对宿主具有泛嗜性，传播途径众多，几乎所有的十足甲壳类生物都会被感染，由WSSV引发的白斑综合症给水产养殖业带来巨大的经济损失，迄今为止仍缺乏有效的防治方法。其病毒复合体主要对宿主的造血组织、结缔组织、前后肠的上皮、血细胞、鳃等系统进行感染破坏。WSSV感染率较高且复制能力极强，一旦发病得不到及时治疗，很可能导致整个养殖池绝产，给我国水产养殖业造成了极大的经济损失。现阶段抗生素等手段在水产养殖病害的防治过程中被大量使用，但与之而来的是药物残留问题日益严重，给食品安全问题造成了严重威胁，严重制约了水产养殖业的可持续发展。因此，寻找高效环保的WSSV防治手段迫在眉睫。
miRNA是长度约为21-24个核苷酸的单链RNA，通过与靶基因mRNA配对结合，进而抑制靶基因的表达，发挥着转录后调控的功能。最近的研究表明，miRNA在宿主与病毒的互作过程中发挥着关键的作用，miRNA作为抗病毒治疗的候选药物具备良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供miR-276模拟物在制备广谱抗白斑综合症病毒药物中的应用，以解决现阶段水产养殖的集约化程度越来越高，WSSV作为一种泛嗜性病毒，许多水产养殖品种常同时被WSSV感染，而现阶段却没有成熟的应对机制等问题。
一种miR-276模拟物，为人工合成的日本对虾miR-276，序列为：5'-TAGGAACTTCATACCGTGCTCT-3’。
所述miR-276在日本对虾受到WSSV感染后含量显著上升。将WSSV注射至日本对虾体内，随后进行miRNA测序，发现日本对虾被WSSV感染后体内miR-276含量持续上调，表明miR-276可能在宿主的抗病毒免疫调控中发挥着重要的作用。
一种miR-276模拟物在制备广谱抗白斑综合症病毒药物中的应用。
进一步的，所述广谱抗白斑综合症病毒药物可用于甲壳类动物。
进一步的，所述甲壳类动物包括日本对虾、克氏原螯虾和拟穴青蟹。
进一步的，所述miR-276模拟物可抑制白斑综合症病毒在日本对虾体内的复制。将WSSV与miR-276模拟物共同注射至日本对虾体内。与对照组相比，miR-276模拟物处理组虾体内病毒的复制显著受到抑制。
进一步的，所述miR-276模拟物可降低白斑综合症病毒感染导致的日本对虾的死亡。将WSSV与miR-276模拟物共同注射至日本对虾体内。与对照组相比，miR-276模拟物处理组的死亡率大幅降低。
进一步的，所述miR-276模拟物可抑制白斑综合症病毒在克氏原螯虾体内的复制。将WSSV与miR-276模拟物共同注射至克氏原螯虾体内。与对照组相比，miR-276模拟物处理组克氏原螯虾体内病毒的复制显著受到抑制。
进一步的，所述miR-276模拟物可抑制白斑综合症病毒在拟穴青蟹体内的复制。将WSSV与miR-276模拟物共同注射至拟穴青蟹体内。与对照组相比，miR-276模拟物处理组拟穴青蟹体内病毒的复制显著受到抑制。
一种所述miR-276模拟物的制剂。可高效预防WSSV的感染及传播。
所述制剂包括饲料添加剂、固体或者液体药物。
与现有技术相比，本发明通过miRNA测序筛选出来的宿主-病毒互作过程中的关键物质，体外合成上述miR-276模拟物并注射至日本对虾体内能显著抑制WSSV的复制，有效降低WSSV感染所致的虾死亡。本发明能够同时抑制WSSV在多种甲壳类水产养殖品种体内的复制，本发明应用范围广泛，不仅适用于海水养殖的日本对虾和拟穴青蟹，同时适用于淡水养殖的克氏原螯虾。因此，miR-276模拟物有望成为一种防治WSSV感染的新型药物，广泛应用于水产养殖过程中病毒类疾病的防治工作。此外，miR-276在日本对虾体内本身就存在，其作为药物不会破坏养殖过程中的生态平衡，对食品安全也没有影响，有利于水产养殖业的长期可持续发展。
附图说明
图1为WSSV刺激日本对虾后，miR-276表达量的变化热图，由绿色到红色表示表达量逐渐升高；
图2为日本对虾感染WSSV不同时间段后(0h、24h、36h和48h)体内病毒拷贝数柱形图；
图3为miR-276模拟物对WSSV致死日本对虾的影响；
图4为拟穴青蟹感染WSSV不同时间段后(0h、24h、36h和48h)体内病毒拷贝数柱形图；
图5为克氏原螯虾感染WSSV不同时间段后(0h、24h、36h和48h)体内病毒拷贝数柱形图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：
筛选日本对虾体内抗WSSV感染关键miRNA的试验
将体重10g左右的日本对虾于25℃暂养3天后，用1ml注射器于虾第2-3腹节肌肉注射50μL/只PBS缓冲液或WSSV感染液。分别在注射后的0h、12h、24h取虾血细胞用于miRNA测序。
向实验组日本对虾中注射WSSV，对照组对虾中注射PBS,分别在12h和24h后取实验组和对照组对虾的血淋巴，处理后进行microRNA测序。
结果见图1，结果表明日本对虾受到WSSV感染12h及24h后体内miR-276的表达量持续显著上升，表明miR-276参与了宿主对病毒的免疫响应，是潜在的抗病毒靶点。
实施例2：
miR-276模拟物抑制WSSV在日本对虾体内增殖的试验
给日本对虾注射50μL/只WSSV感染液，随后注射50μg/只合成的miR-276模拟物(5'-TAGGAACTTCATACCGTGCTCT-3’)，对照组为打乱序列的miR-276核苷酸(miR-276-scrambled：5'-GTTCTTCAAGTCACACACTGTG-3’)。WSSV感染0h、24h、36h和48h后取适量虾背部肌肉，然后用TAKARA的Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)试剂盒检测WSSV目的基因片段，检测引物分别为P1，P2。
P1:5’-ATGTCTGCATCTTTAAT-3’；P2:5’-TTATGACACAAACCTAT-3’。
结果见图2，miR-276模拟物注射后36h和48h，日本对虾体内WSSV的拷贝数显著低于注射miR-276-scrambled的对照组，表明miR-276模拟物对WSSV在日本对虾体内的复制具有显著的抑制作用。
实施例3：
miR-276模拟物降低WSSV感染后日本对虾累积死亡率的试验
将体重10g左右的日本对虾于25℃暂养3天后分为5组，无处理组、PBS注射组、WSSV注射组、WSSV+miR-276注射组和WSSV+miR-276-scrambled注射组，每组20只。注射方法见实施例1，每天观察3次持续观察5天，及时清理死虾并记录死亡数。
结果见图3，注射后的五天内，WSSV注射组和WSSV+miR-276-scrambled注射组这两组日本对虾的死亡率逐渐上升，在第五天死亡率几乎达到了100％。相比之下，WSSV+miR-276注射组日本对虾死亡率显著下降，表明WSSV感染日本对虾后，注射miR-276模拟物可大幅降低由WSSV感染所导致的虾死亡。
实施例4：
miR-276模拟物抑制WSSV在拟穴青蟹及克氏原螯虾体内增殖的试验实施方式同实施例2。
结果见图4和图5，miR-276模拟物注射后36h和48h，拟穴青蟹及克氏原螯虾体内WSSV的拷贝数显著低于注射miR-276-scrambled的对照组，表明miR-276模拟物对WSSV在拟穴青蟹及克氏原螯虾体内的复制具有显著的抑制作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 汕头大学
<120> 一种miR-276模拟物在制备广谱抗白斑综合症病毒药物中的应用
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
taggaacttc ataccgtgct ct 22

Claims (7)

1.一种miR-276模拟物在制备广谱抗白斑综合症病毒药物中的应用，所述miR-276模拟物为人工合成的日本对虾miR-276，序列为：5'-TAGGAACTTCATACCGTGCTCT-3’。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述广谱抗白斑综合症病毒药物可用于甲壳类动物。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述甲壳类动物包括日本对虾、克氏原螯虾和拟穴青蟹。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述miR-276模拟物可抑制白斑综合症病毒在日本对虾体内的复制。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述miR-276模拟物可降低白斑综合症病毒感染导致的日本对虾的死亡。
6.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述miR-276模拟物可抑制白斑综合症病毒在克氏原螯虾体内的复制。
7.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述miR-276模拟物可抑制白斑综合症病毒在拟穴青蟹体内的复制。
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