CN105724826B - 一种对虾饲料添加剂及其应用 - Google Patents

Abstract

一种对虾饲料添加剂及其应用，涉及饲料添加剂。所述对虾饲料添加剂为L‑精氨酸，中文别名：精氨酸，L‑2氨基‑5‑胍基戊酸，胍基戊氨酸，L‑胍基戊氨酸；L‑精氨酸的分子式为C₆H₁₄N₄O₂；分子量为174.20。所述对虾饲料添加剂可在制备抗对虾白斑综合征病毒饲料中应用。将所述对虾饲料添加剂L‑精氨酸加入对虾饲料中预混后，50～60℃烘干，即得抗对虾白斑综合征病毒饲料。通过实验验证了饲料中添加L‑精氨酸能够有效减少白斑综合征病毒攻毒后的对虾死亡率；注射L‑精氨酸能够显著抑制对虾白斑综合征病毒在对虾体内增殖速度。

Description

一种对虾饲料添加剂及其应用

技术领域

本发明涉及饲料添加剂，尤其是涉及一种对虾饲料添加剂及其应用。

背景技术

对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是一种双链DNA病毒。主要感染并寄生在对虾的鳃、肌肉、造血组织、胃、肠、血细胞、心脏、眼、神经等重要系统，导致器官及组织病变，及至全身性系统性的坏死。此病的感染率极高，也是目前导致养殖凡纳滨对虾死亡率最高的病毒。由于病毒有严格的细胞寄生特性，目前尚无有效的化学药物可预防和治疗对虾白斑综合征病毒引起的疾病，通过饲料给药来进行预防白斑综合征病毒感染是生产中最为可行的方式，但是目前关于高效抑制对虾白斑杆状病毒在对虾体内增殖的饲料添加剂还不多见。

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，属于节肢动物门甲壳纲十足目对虾科对虾属，原产于中南美太平洋海岸水域，生长气候为热带、亚热带、暖温带、温带海域。目前在全球36个国家实现人工养殖，是当前世界上养殖产量最高的对虾种类。于1988年引入我国后迅速遍及全国。白斑综合征病毒感染是导致凡纳滨对虾死亡的最重要原因之一，给养殖业带来巨大损失。同时，由于对虾属于无脊椎动物，缺乏特异性免疫系统，无法制备有效的特定疫苗用于白斑综合征病毒防治。

L-精氨酸是生物体内合成一氧化氮(NO)的唯一前体，NO是重要的信号分子，在机体的生命活动中具有重要作用。另外，精氨酸也是鸟氨酸循环中的一个组成成分，具有极其重要的生理功能。目前在哺乳动物中的发现的精氨酸的功能包括：促进肝脏代谢、维持氮平衡、促进伤口愈合、防止胸腺退化、降低肿瘤转移率等方面(参见：Nat Rev Immunol,2005,5,641–654.)。在对虾中，研究表明，饲料中添加精氨酸可以提高对虾抗氧化酶等活性(参见：Aquaculture,2012,364–365:252-258；Aquaculture,1992,108:87-95.Aquaculture,1998,164:95-104.)。但是，抗氧化酶活力的高低与对虾抵抗白斑综合征病毒感染能力之间的关系尚不清楚，关于L-精氨酸是否能够抑制对虾白斑综合征病毒的作用也尚未见报道。

白斑综合征病毒(WSSV)严重危害对虾养殖业，对我国乃至全世界凡纳滨对虾的养殖业造成了巨大损失。每年单因白斑综合征病毒的发生与流行就使得全球对虾产量减少一半，我国每年因该病造成的损失高达30-50亿元。但是，目前还没有有效的防治措施，养殖对虾感病率高(例如，2014年农业部抽检的福建样品阳性率为100％，2014年中国水生动物卫生状况报告，农业部渔业渔政管理局，中国农业出版社)。因此，通过饲料给药预防白斑综合征病毒在体内的增殖是生产中最为可行的方式。但是，确定有效的针对白斑综合征的免疫增强剂仍鲜见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种对虾饲料添加剂。

本发明的目的是提供所述对虾饲料添加剂在制备抗对虾白斑综合征病毒饲料中的应用。

所述对虾饲料添加剂为L-精氨酸(L-arginine)，中文别名：精氨酸，L-2氨基-5-胍基戊酸，胍基戊氨酸，L-胍基戊氨酸；L-精氨酸的分子式为C₆H₁₄N₄O₂；分子量为174.20，L-精氨酸的结构式如下：

所述对虾饲料添加剂可在制备抗对虾白斑综合征病毒饲料中应用。

所述应用的方法可为：将所述对虾饲料添加剂L-精氨酸加入对虾饲料中预混后，50～60℃烘干，即得抗对虾白斑综合征病毒饲料。

所述对虾饲料添加剂L-精氨酸与对虾饲料的质量比可为(1～8)∶100，优选4∶100。

所述烘干的温度可为55℃。

所选对虾饲料可采用市售对虾饲料，优选粤海牌对虾基础饲料；所述对虾可选用凡纳滨对虾。

本发明通过实验验证了饲料中添加L-精氨酸能够有效减少白斑综合征病毒攻毒后的对虾死亡率；注射L-精氨酸能够显著抑制对虾白斑综合征病毒在对虾体内增殖速度。

本发明所述对虾饲料添加剂L-精氨酸是天然产生的物质，是蛋白质代谢分解的产物，不会再被蛋白酶降解，经试验证明对凡纳滨对虾无害，长期使用安全无风险。在对虾的基础饲料中添加40g/kg的L-精氨酸提高对虾抵抗白斑综合征病毒的能力，明显降低攻毒后的对虾死亡率。注射一次0.4mg/g的L-精氨酸能够在48h内有效抑制白斑综合征病毒在凡纳滨对虾体内的增殖。应用本发明的对虾饲料添加剂，能有效降低生产中感染白斑综合征病毒后凡纳滨对虾的死亡率，具有显著的经济效益与社会效益，市场前景广阔。

本发明公开了一种抗对虾白斑综合征病毒饲料添加剂及其应用。所述添加剂是L-精氨酸，所述应用是将L-精氨酸按照干重百分数1～8％加入常用对虾配合饲料混匀后，50～60℃烘干，获得抗对虾白斑综合征病毒饲料；L-精氨酸添加剂能够明显提高对虾抗白斑综合征病毒的能力，显著降低白斑综合征病毒攻毒后对虾的死亡率，有效抑制白斑综合征病毒在对虾体内的增殖。由于水产养殖环境的特殊性，该方式更符合生产实际，有广阔的应用前景。

与现有其他技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明的饲料添加剂L-精氨酸，是多种生物的天然生化代谢产物，广泛存在于各种食物中，为各种蛋白质的基本组成；是人体的一种半必需氨基酸，在医学领域具有重要功能，长期食用对凡纳滨对虾及人无害，在白斑综合征发病高峰期短暂使用无风险，对人体安全无风险，并具有多种重要生理功能。由于水产养殖及对虾免疫系统的特点，饲料添加防治对虾白斑综合征病毒的方式更符合生产实际，应用前景更广阔。

附图说明

图1为半定量PCR检测白斑综合征病毒在对虾体内的增殖。

图2为感染后不同时间白斑综合征病毒在对虾体内的增殖量(基于图1的结果，用ImageJ根据灰度计算对虾白斑综合征病毒增殖量)。

图3为注射L-精氨酸后采用半定量PCR检测白斑综合征病毒在对虾体内的增殖。

图4为注射L-精氨酸后感染后不同时间白斑综合征病毒在对虾体内的增殖(基于图3的结果，用ImageJ根据灰度计算对虾白斑综合征病毒增殖量)。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1，人工感染后白斑综合征病毒在对虾体内的增殖情况

选取体重3.0±0.5g的凡纳滨对虾，每尾对虾注射50μL 10⁸拷贝数的白斑综合征病毒(以对虾生理盐水作为溶剂)，每组每个时间点随机取10尾对虾，每个组设3个平行重复，收集注射白斑综合征病毒后6、24、48h的对虾鳃与肌肉组织，混合后提取总RNA，以半定量PCR方法检测白斑综合征病毒增殖情况(检测方法及所用引物序列参见申请人课题组之前发表的文章：Dis Aqua Org,2011,96:9-20)。结果发现，人工感染前所用的对虾为白斑杆状病毒粒子阴性，采用注射的方式仅一次，对虾全部感染病毒粒子，随着时间的延长，病毒粒子增殖呈线性增加，表明实验所用的对虾为没有隐性感染白斑综合征病毒病毒粒子的健康对虾，白斑综合征病毒粒子活力及致病性均较强。

实施例2，饲料添加L-精氨酸后，凡纳滨对虾死亡率的变化

选用体重在3g左右的无WSSV感染的上述凡纳滨对虾，随机分成4组，即组1～组4，每组3个重复，每个重复10尾对虾。未添加L-精氨酸的对虾基础饲料(粤海牌，市售)作为对照组(组1)，每千克对虾基础饲料中添加L-精氨酸10g(组2)，20g(组3)，40g(组4)，80g(组5)(市售粤海牌饲料中分别添加L-精氨酸获得)，每日投饵2次，连续投喂7天后，组1～组4投喂感染白斑综合征病毒死亡对虾的肌肉攻毒(对虾具有蚕食同类病弱虾或死虾的习性，养殖中吃掉感染白斑综合征病毒的病虾或死虾，是其感染该病毒的重要途径)，连续攻毒2天，每天1次；换水。期间继续投喂基础饲料或实验饲料，并统计死亡情况。饲料中添加不同剂量的L-精氨酸对凡纳滨对虾死亡率，对抗白斑综合征病毒的免疫保护率的影响结果见表1所示。结果表明，对照组及投喂添加L-精氨酸浓度为80g/kg组在7天内，对虾各死亡1尾；添加10g/kg，20g/kg及50g/kg的L-精氨酸的实验组均无对虾死亡，证明该添加剂对凡纳滨对虾是安全的。投喂含饲料中添加L-精氨酸浓度为10g/kg，20g/kg，40g/kg和80g/kg的饲料7天，在用白斑综合征病毒攻毒后的结果表明，组3，组4与组5的凡纳滨对虾死亡数量明显低于对照组(组1)及低L-精氨酸剂量投喂组(组2)；考虑到养殖成本，建议饲料中40g/kg的添加量能够有效减少白斑综合征病毒引起的对虾死亡率。

表1饲料添加L-精氨酸后，对虾死亡率变化

组别	饲料	投喂7d后对虾死亡数	攻毒7d后对虾死亡数
				1	基础饲料	0.33±0.58a	9.67±0.58a
2	基础饲料添加L-精氨酸10g/kg	0±0a	7.67±1.00b
				3	基础饲料添加L-精氨酸20g/kg	0±0a	6.67±0.58b
4	基础饲料添加L-精氨酸40g/kg	0±0a	5.33±0.58c
				5	基础饲料添加L-精氨酸80g/kg	0.33±0.58a	5.00±1.00c

注：不同字母代表与同时间取样的组之间差异显著，P<0.05。

实施例3，人工注射L-精氨酸对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒体内增殖的影响。

采用上述对虾，组1为对照组，每尾对虾注射50μL的对虾生理盐溶液，注射对虾白斑综合征病毒组，组2为实验组，每尾对虾注射0.4mg/g体重的L-精氨酸(溶于50μL对虾生理盐溶液)；组1与组2注射24h后，人工注射10⁸拷贝数的白斑综合征病毒粒子(溶于50μL对虾生理盐溶液)进行攻毒，攻毒后收集6h，24h及48h对虾的鳃及组织，采用半定量PCR的方法检测对虾体内白斑综合征病毒的增殖(检测方法及所用引物如上所述，参见：Dis Aqua Org,2011,96:9-20)。结果表明，与对照组相比，注射L-精氨酸的实验组能够显著降低白斑综合征病毒在对虾体内的增殖。

扩增WSSV在对虾体内增殖的引物序列：

F：5’-TAT TGT CTC TCC TGA CGT AC-3’

R：5’-CAC ATT CTT CAC GAG TCT AC-3’

(参见文献：Antiviral Res,2007,73:126–131。)

对虾生理盐：

15mM CaCl₂,7mM KCl,12.5mMMgCl₂.6H₂O,7.4mMNaHCO₃,336mMNaCl,pH,7.4(参见：Pathology in marine science.1998.Academic Press,San Diego,CA,p 533–538)

半定量PCR检测白斑综合征病毒在对虾体内的增殖参见图1；注射10⁸拷贝数的白斑综合征病毒(WSSV)粒子，检测其在凡纳滨对虾体内的0～96h内的增殖情况。实验所用凡纳滨对虾在人工感染WSSV前未检测到白斑综合征病毒粒子(0h)，随着人工感染时间的延长，白斑综合征病毒(WSSV)粒子在对虾体内增殖量呈线性增加；N＝3。感染后不同时间，白斑综合征病毒在对虾体内的增殖量参见图2，图2为基于图1的结果，用ImageJ根据灰度计算对虾白斑综合征病毒增殖量。

注射L-精氨酸后，采用半定量PCR检测白斑综合征病毒在对虾体内的增殖参见图3；每尾对虾注射2mg的L-精氨酸<溶于50μL的对虾生理盐溶液>24h后，人工注射10⁸拷贝数的白斑综合征病毒粒子，在注射后不同时间检测病毒增值量与对照组的差异；凡纳滨对虾注射50μL生理盐溶液24h后，人工注射同样剂量的白斑综合征病毒粒子作为对照组，N＝3。注射L-精氨酸后，感染后不同时间白斑综合征病毒在对虾体内的增殖参见图4；图4为基于图3的结果，用ImageJ根据灰度计算对虾白斑综合征病毒增殖量。图4中，*代表差异显著P<0.05；**代表差异极显著P<0.01。

本发明通过详实的实验数据证明每千克基础对虾饲料中添加10～80g的L-精氨酸均不会导致对虾的死亡，并且均能够有效降低白斑综合征病毒感染后的对虾死亡率；按照养殖成本，建议饲料中L-精氨酸添加量为40g/kg；为了证实其保护效果及机制，还对每尾对虾注射0.4mg/g体重的L-精氨酸，发现一次注射后在48h内显著抑制白斑综合征病毒在凡纳滨对虾体内的增殖。本发明为对虾养殖生产中预防白斑综合征病毒的爆发及死亡提供了一种安全、简单、有效的新方法。

Claims (6)

1.对虾饲料添加剂在制备抗对虾白斑综合征病毒饲料中应用，其特征在于所述对虾饲料添加剂为L-精氨酸，中文别名：精氨酸，L-2氨基-5-胍基戊酸，胍基戊氨酸，L-胍基戊氨酸；L-精氨酸的分子式为C₆H₁₄N₄O₂；分子量为174.20，L-精氨酸的结构式如下：

其具体方法为：将所述对虾饲料添加剂加入对虾饲料中预混后，50～60℃烘干，即得抗对虾白斑综合征病毒饲料；所述对虾饲料添加剂与对虾饲料的质量比为(1～8)∶100。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于所述对虾饲料添加剂与对虾饲料的质量比为4∶100。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于所述烘干的温度为55℃。

4.如权利要求1所述应用，其特征在于所述对虾饲料采用市售对虾饲料。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于所述市售对虾饲料采用粤海牌对虾基础饲料。

6.如权利要求1所述应用，其特征在于所述对虾选用凡纳滨对虾。