CN114868846A

CN114868846A - 外源性一氧化氮供体gsno作为饲料添加剂的应用

Info

Publication number: CN114868846A
Application number: CN202210439195.4A
Authority: CN
Inventors: 王蔚; 赵付荣; 赖庆娜; 林镇跃; 陈建明
Original assignee: Minjiang University
Current assignee: Minjiang University
Priority date: 2022-04-25
Filing date: 2022-04-25
Publication date: 2022-08-09

Abstract

本发明属于饲料添加剂技术领域，公开了一种外源性一氧化氮供体GSNO作为饲料添加剂的应用，包括外源性一氧化氮供体GSNO在免疫增强饲料添加剂制备中的应用；所述免疫增强饲料添加剂用于提高对虾抗白斑综合征病毒感染免疫机能，所述免疫增强饲料添加剂使凡纳滨对虾体内维持可持续的NO供应，增强对虾的免疫功能。一氧化氮(NO)在宿主防御和免疫反应中起着重要作用，本发明采用NO外源供体化合物GSNO作为免疫增强饲料添加剂，使凡纳滨对虾体内维持可持续的NO供应，增强对虾的免疫功能。本发明能解决现有增强对虾内源性NO生成方法中影响其他氨基酸作用水平、半衰期短易于失活、受外界环境和病原免疫逃逸作用影响的缺点。

Description

外源性一氧化氮供体GSNO作为饲料添加剂的应用

技术领域

本发明属于饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种外源性一氧化氮供体GSNO作为饲料添加剂的应用。

背景技术

对虾由于其出肉率高、抗逆性强、生长快、繁殖期长的优点，已经成为我国重要的经济养殖虾类。然而随着我国对虾集约化养殖的发展，病害频繁爆发，给我国对虾产业造成巨大的经济损失。其中白斑综合征病毒是对虾爆发性死亡的主要病害，尚无有效防治药物。常规抗生素和消毒药物的使用，对病毒性疾病难以有效控制，而药物残留已经引起世界各国政府和消费者的高度重视。通过提高对虾非特异性免疫，增强机体对病害的抵抗能力，已经成为人们关注的热点。常见的措施有饲料中添加益生菌、维生素和其他营养供给以改善提高对虾抗病力，但是当对虾养殖过程中因温度盐度等变化发生环境胁迫时，传统免疫调节措施抵御病害的效果会受到影响。本发明采用饲料添加一氧化氮(NO)供体S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)的方法，能够提高对虾在遭受温度和盐度变化耐受力和病原抵抗能力，能有效预防对虾病害的爆发。

NO是生物的重要免疫和信使分子，广泛分布于各种动物和植物中，具有抑制和杀灭细菌、病毒和寄生虫的活性，以及调节神经递质释放的功能。生物体内NO的合成是由一氧化氮合成酶合酶(NOS)催化L-精氨酸与氧气发生反应生成L-瓜氨酸和NO。反应的过程还需要四氢生物蝶呤(BH4)作为辅酶。NO在生物组织中半衰期只有几秒钟，很快被氧化失去生物学活性。因此生物体NO的生物合成主要受到NOS、底物和辅酶浓度的调节。

为增加养殖对虾的免疫能力，传统提高对虾体内NO含量的方法是在饲料中补充L-精氨酸，采用这种方法能降低对虾的白斑综合征病毒(WSSV)感染对虾的7天累积死亡率。然而该法也有一定的局限性。首先，饲料中添加精氨酸易于与赖氨酸及组氨酸等产生颉颃作用，影响其他氨基酸作用的发挥；其次，精氨酸在硝化酶的作用下会迅速降解，导致血液中氨态氮浓度过高，影响机体健康；第三，近年来对虾体内潜伏性WSSV感染的情况已经日益普遍，病毒感染后能够抑制辅酶BH4的产生途径关键酶活性，降低NOS酶促反应的进行，此时饲料中精氨酸的添加无法继续维持NO的产生。

养殖过程中温度和盐度等理化条件的变化会提高对虾对病原的易感性，影响传统免疫调节措施抵御病害效果。通过增强对虾内源性NO可以提高对虾在遭受温度和盐度变化耐受力和病原抵抗能力。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有增强对虾内源性NO生成方法中存在影响其他氨基酸作用水平、半衰期短易于失活、受外界环境和病原免疫逃逸作用影响的缺点。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种外源性一氧化氮供体GSNO作为饲料添加剂的应用，尤其涉及一种外源性一氧化氮供体GSNO在提高对虾抗白斑综合征病毒感染免疫机能的应用。

本发明是这样实现的，一种外源性一氧化氮供体GSNO在免疫增强饲料添加剂制备中的应用。

进一步，所述免疫增强饲料添加剂用于提高对虾抗白斑综合征病毒感染免疫机能。

进一步，所述免疫增强饲料添加剂使凡纳滨对虾体内维持可持续的NO供应，增强对虾的免疫功能。

本发明的另一目的在于提供一种实施所述外源性一氧化氮供体GSNO在免疫增强饲料添加剂制备中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种实施所述的外源性一氧化氮供体GSNO的外源性一氧化氮供体GSNO的毒性测试方法，所述外源性一氧化氮供体GSNO的毒性测试方法包括：

采用卤虫毒性测试比较三种NO供体SNP、GSNO和DETA/NO对水生动物的毒性大小。

进一步，所述外源性一氧化氮供体GSNO的毒性测试方法还包括：

20～200μg/g GSNO加入对虾饲料，喂饲7天后进行感染实验。

本发明的另一目的在于提供一种实施所述的外源性一氧化氮供体GSNO对WSSV感染影响的测试方法，所述外源性一氧化氮供体GSNO对WSSV感染影响的测试方法包括：

GSNO加入对虾饲料，喂饲7天后进行实验，实现GSNO在对虾养殖海水温度或盐度变化后对WSSV易感性的影响的测试。

进一步，所述实验包括：

1)分别用WSSV行对虾感染；

2)对虾养殖海水温度从25℃分别降低到22、19和16℃后进行病毒感染；

3)海水盐度从30分别降低到25、20和15后进行病毒感染。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

本发明采用NO外源供体化合物GSNO作为免疫增强饲料添加剂，使凡纳滨对虾体内维持可持续的NO供应，增强对虾的免疫功能。

第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：

一氧化氮(NO)在宿主防御和免疫反应中起着重要作用，本发明能解决现有增强对虾内源性NO生成方法中影响其他氨基酸作用水平、半衰期短易于失活、受外界环境和病原免疫逃逸作用影响的缺点。

第三，本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

本发明的技术方案转化后能够提高对虾对WSSV病毒侵染的抵抗力，并且减少由养殖水体温度和盐度变化带来的对虾易感性，提高对虾抗病力而降低养殖过程中的死亡率，减少环境胁迫和病害带来的经济损失。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的凡纳滨对虾感染WSSV后48小时肌肉组织WSSV拷贝数示意图；其中，C表示凡纳滨对虾投喂基础饲料后感染WSSV病毒；T1、T2和T3分别表示凡纳滨对虾饲料中添加20、60和200μg/g的GSNO后感染WSSV病毒；

图2是本发明实施例提供的水温变化后感染WSSV病毒的凡纳滨对虾体内病毒拷贝数示意图；*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001；

图3是本发明实施例提供的养殖海水盐度变化后感染WSSV病毒的凡纳滨对虾体内病毒拷贝数示意图；*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种外源性一氧化氮供体GSNO作为饲料添加剂的应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。

本发明实施例提供的外源性一氧化氮供体GSNO在免疫增强饲料添加剂制备中的应用，所述免疫增强饲料添加剂用于提高对虾抗白斑综合征病毒感染免疫机能，所述免疫增强饲料添加剂使凡纳滨对虾体内维持可持续的NO供应，增强对虾的免疫功能。

本发明实施例提供的外源性一氧化氮供体GSNO的毒性测试方法包括：

本发明实施例提供的外源性一氧化氮供体GSNO对对虾WSSV易感性测试方法还包括：

GSNO加入对虾饲料，喂饲7天后进行实验：

1)分别用WSSV行对虾感染；

3)海水盐度从30分别降低到25、20和15后进行病毒感染。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

实施例1：NO供体对卤虫的毒性评价

卤虫对许多药物和有毒物质的敏感性比虾蟹高，而且广泛分布于不同盐度的水体中，其致死率常被用为毒性检测指标。为选择对环境生物毒性低的NO供体用于饲料添加剂，采用三种常用NO供体对卤虫进行毒性试验和安全评价。一期卤虫在23～25℃的条件下用人工海水(34g/L)孵化48小时后，分别与7个不同浓度(0.01、0.05、0.1、0.250、0.5、0.75和1mg/mL)的S-亚硝基谷胱甘肽GSNO(Sigma-aldich，美国)、硝普钠SNP(西亚试剂，中国)和二乙烯三胺/一氧化氮聚合物DETA/NO(Sigma-aldich，美国)共孵育。每个浓度三个平行，分别随机混合10只活跃性较强的卤虫。孵育24小时候后，观察并记录每组的死亡个体数。用解剖镜观察，以解剖针触动卤虫约5s卤虫触角不动为死亡标准，用浓度指数—概率单位法计算半致死浓度(LC₅₀)。采用Clarkson毒性指数比较卤虫死亡率结果：当LC₅₀>1000μg/mL为无毒性，500～1000μg/mL为低毒性，100～500μg/mL为中毒性，而0～100μg/mL为高毒性。结果显示，GSNO半致死浓度最高，为1632.51μg/mL，对卤虫无毒、SNP和DETA/NO的半致死浓度分别为546.82和269.51，对卤虫低毒。说明GSNO对水生动物的安全性优于SNP和DETA/NO。

实施例2：GSNO对凡纳滨对虾WSSV感染的影响

凡纳滨对虾运回实验室暂养7天，每日投喂对虾人工配合饵料3次，除去残饵和粪便，日换水量为30％。暂养后挑选活力较强的对虾(体重2.4±0.3g)分成3个实验组(T1、T2和T3)和1个对照组C，每个实验组3个重复。其中T1、T2和T3组分别投喂基础饲料中添加20、60和200μg/g的GSNO。在对照组C中投喂基础饲料。7天后，T1、T2、T3和C组的对虾分别注射5×10⁶拷贝数WSSV病毒。

在注射后48小时每组随机取9尾虾，分离肌肉组织，每三尾虾的肌肉混合在一起作为一个样品，共有三个平行样品，用基因组提取试剂盒(TaKaRa，中国)提取肌肉组织的基因组DNA，以含有WSSV片段的pMD-18-T质粒作为内参进行定量PCR(正向引物为：ATTGTCTCTCCTGACGTAC；反向引物为：CACATTCTTCACGAGTCTAC)，得到肌肉组织中WSSV拷贝数。结果如图1所示，与投喂基础饲料的对照组相比，饲料中添加20和60μg/g的GSNO的能够显著降低病毒在对虾体内的复制水平，说明20～60μg/g的GSNO能够增强对虾对WSSV感染的抵抗能力，但是更高的浓度GSNO(200μg/g)对对虾体内WSSV复制没有显著的抑制作用。

图1中，不含相同字母的组间差异显著(p<0.05)，含相同字母的组差异不显著(p>0.05)。C：凡纳滨对虾投喂基础饲料后感染WSSV病毒。T1、T2和T3：凡纳滨对虾饲料中添加20、60和200μg/g的GSNO后感染WSSV病毒。

实施例3：GSNO对温度胁迫下凡纳滨对虾WSSV感染的影响

WSSV的爆发不仅与对虾的免疫水平相关，还与环境因子密切相关。温度作为重要环境因素，能够影响生物体的新陈代谢、生长发育进化，器官分化、遗传生殖及衰老死亡等生理生化过程，环境温度变化会使对虾处于胁迫状态，生理状态剧变，机体不能适应环境变化而导致免疫力下降，增加病毒易感性和增殖速率，引起对虾大量死亡。

为分析GSNO对温度胁迫下凡纳滨对虾WSSV感染的影响，对虾分为8组，每组3个平行，实验组TT0、TT1、TT2和TT3组投喂基础饲料中添加20μg/g的GSNO，对照组C0、C1、C2和C3组投喂基础饲料。投喂7天后，TT1和C1组水温从25℃变化至22℃；TT2和C2组水温从25℃变化至19℃；TT3和C3组水温从25℃变化至16℃，各梯度用海水冰块调节，对照组PC和NC保持25℃。温度变化后24小时，用实施例2的方法对四组凡纳滨对虾进行WSSV人工感染，感染后48小时分析各组对虾肌肉组织中WSSV拷贝数，结果如图2所示。当温度变化在3和6℃时，投喂基础饲料的对虾体内WSSV病毒拷贝数高于对照组但是差异不显著，而水温变化为9℃时，喂基础饲料的对虾体内WSSV病毒拷贝数显著高于对照组，说明凡纳滨对虾对温度变化有较强的耐受性，当温度变化幅度为9℃时凡纳滨对虾对WSSV病毒的易感性显著提高。当投喂饲料添加20μg/g的GSNO后，对虾体内WSSV病毒水平显著低于基础饲料投喂组。GSNO投喂组对虾在经历三个不同水温变化梯度后WSSV病毒复制水平没有显著变化，说明GSNO能够降低对虾在温度胁迫下对病原的易感性。

实施例4：GSNO对盐度胁迫下凡纳滨对虾WSSV感染的影响

环境中盐度只有在对虾体液的等渗点附近，对虾才能保证正常的生理状态。水体中盐度变化会影响对虾的抗病能力，造成对虾体内WSSV快速增殖，是引起WSSV急性感染的关键影响因子之一。

为分析GSNO对盐度胁迫下凡纳滨对虾WSSV感染的影响，对虾分为8组，每组3个平行，实验组TS0、TS1、TS2和TS3组投喂基础饲料中添加20μg/g的GSNO，对照组C0、C1、C2和C3组投喂基础饲料。投喂7天后，TS1和C1组海水盐度从30变化至25；TS2和C2组海水盐度从30变化至20；TS3和C3组海水盐度从30变化至15，各梯度用淡水调节，对照组PC和NC保持盐度30。盐度变化后24小时，用实施例2的方法对四组凡纳滨对虾进行WSSV人工感染，感染后48小时分析各组对虾肌肉组织中WSSV拷贝数，结果如图3所示。结果显示，投喂基础饲料的凡纳滨对虾感染WSSV后体内病毒拷贝数随着盐度变化幅度的增加，而饲料中添加GSNO能削弱盐度变化对病毒复制的影响。比较盐度变化5、10和15的不同组投喂GSNO对虾，其体内WSSV病毒拷贝数与未经历养殖水体盐度变化的对照组之间都没有显著差异，表明饲料添加GSNO能够补偿盐度变化带来对虾对WSSV病毒的易感性提高，增强机体对恶劣生存环境的适应能力。

二、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。

1.采用卤虫毒性测试比较三种NO供体SNP、GSNO和DETA/NO对水生动物的毒性大小，结果显示GSNO半致死浓度最高，说明其毒性在三者中最低。

2.GSNO加入对虾饲料，喂饲30天后进行以下实验：

A.分别用WSSV进行对虾感染，结果显示GSNO能降低WSSV感染对虾体内病原复制水平和死亡率。

B.对虾养殖海水盐度从30分别降低到25、20和15，然后进行病毒感染，结果显示GSNO能降低这三种盐度突变的环境胁迫所引起对虾对WSSV的敏感性。

C.对虾养殖海水温度分别从25℃降低到22、19和16℃，然后进行病毒感染，结果显示GSNO能降低25℃突降到16℃温差带来的环境胁迫所导致对虾对WSSV的敏感性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种外源性一氧化氮供体GSNO在免疫增强饲料添加剂制备中的应用。

2.如权利要求1所述的外源性一氧化氮供体GSNO在免疫增强饲料添加剂制备中的应用，其特征在于，所述免疫增强饲料添加剂用于提高对虾抗白斑综合征病毒感染免疫机能。

3.如权利要求1所述的外源性一氧化氮供体GSNO在免疫增强饲料添加剂制备中的应用。

4.一种实施如权利要求1～3任意一项所述的外源性一氧化氮供体GSNO在免疫增强饲料添加剂制备中应用的外源性一氧化氮供体GSNO。

5.一种实施如权利要求4所述的外源性一氧化氮供体GSNO的外源性一氧化氮供体GSNO的毒性测试方法，所述外源性一氧化氮供体GSNO的毒性测试方法包括：

6.如权利要求5所述的外源性一氧化氮供体GSNO的毒性测试方法，其特征在于，所述外源性一氧化氮供体GSNO的毒性测试方法还包括：

20～200μg/g GSNO加入对虾饲料，喂饲7天后进行感染实验。

7.一种实施如权利要求4所述的外源性一氧化氮供体GSNO对WSSV感染影响的测试方法，其特征在于，所述外源性一氧化氮供体GSNO对WSSV感染影响的测试方法包括：

8.如权利要求7所述的外源性一氧化氮供体GSNO对WSSV感染影响的测试方法，其特征在于，所述实验包括：

1)分别用WSSV行对虾感染；

3)海水盐度从30分别降低到25、20和15后进行病毒感染。