CN105755027A - 一种基于miRNA137调节DAT基因表达的方法 - Google Patents

一种基于miRNA137调节DAT基因表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种调节细胞中的多巴胺转运体基因表达的方法，包括以下步骤：提高所述细胞中的微小RNA?137(miRNA?137)(SEQ.ID.NO:1)量从而下调所述DAT基因的表达；或降低所述细胞中的miRNA?137量，从而上调所述DAT基因的表达。miRNA?137或其抑制剂用于制备降低人细胞摄取多巴胺的药物的应用。一种用于调节人细胞摄取多巴胺的组合物，其包含miRNA?137或其抑制剂，以及药学可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、佐剂中的一种或多种。

Description

一种基于miRNA137调节DAT基因表达的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学和医药领域。更特别地，涉及调节多巴胺转运体(DAT)的基因表达的微小RNA(miRNA)。
背景技术
多巴胺是中枢神经系统最重要的神经递质之一，通过激活多巴胺受体，参与运动调节、情感、认知、药物成瘾、神经内分泌调节等生命活动。再摄取是神经递质通过突触前膜从突触间隙消除的正常机制，精神活性物质作用的一个重要机制是阻断神经递质从突触前膜释放后的再摄取。阻断再摄取，神经递质的正常效应被放大。多巴胺转运体介导的细胞膜钠依赖性再摄取过程实现多巴胺信号的终断，这对神经细胞多巴胺稳态的维持发挥着至关重要的作用。
miRNA是一类高度保守的单链非编码小RNA，由约20-22个单核苷酸组成，广泛存在于真核生物中，参与转录后水平或翻译水平的调控。miRNA在真核生物基因调控中起着重要作用，广泛参与细胞增殖、分化、发育、代谢、凋亡以及其他多种生命活动。miRNA具有高度保守性、时序性和组织特异性等特征，通过与靶基因不完全互补结合，一种miRNA可调节多种靶基因表达。目前，已在人体内发现数百种miRNA并已知其序列。
本发明正是通过寻找参与神经细胞摄取多巴胺的基因调控通路中的miRNA，并调节神经细胞中这样的miRNA的量来实现调节神经细胞对多巴胺的摄取进而调节神经细胞中的多巴胺的量。
发明内容
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种调节细胞中的多巴胺转运体(DAT)基因表达的方法，其特征在于，包括提高所述细胞中的微小RNA-137(miRNA-137)(SEQIDNO:1)含量从而下调所述DAT基因的表达；或降低所述细胞中miRNA-137的量，从而上调所述DAT基因的表达。通过调控细胞中的DAT基因表达，可调节细胞对多巴胺的摄取。
进一步地，提高所述细胞中的miRNA-137的量可通过将miRNA-137模拟物(SEQIDNO:2)转染至所述细胞中来进行；降低所述细胞中的miRNA-137的量可通过将miRNA-137抑制剂(SEQIDNO:3)转染至所述细胞中来进行。
进一步地，所述细胞可为人神经细胞。
本发明还提供了miRNA-137在制备调节人细胞摄取多巴胺的药物中的用途，所述miRNA-137可体现为miRNA-137模拟物，或miRNA-137基因与强启动子构建成的遗传构建体。
本发明还提供了miRNA-137抑制剂在制备增加人细胞摄取多巴胺的药物中的用途，所述miRNA-137抑制剂可体现为miRNA-137反义序列，或miRNA-136反义序列基因与强启动子构建成的遗传构建体。
本发明还提供了一种用于调节人细胞摄取多巴胺的量的组合物，其包含miRNA-137或其抑制剂，并且还包含药学可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、佐剂中的一种或多种。
附图说明
图1为psiCHECK2质粒图谱，DAT基因的3’UTR序列顺着转录方向插在多克隆位点XhoI与NotI之间；
图2为表征转染了带有DAT基因3’UTR序列psiCHECK2质粒并且分别转染了miRNA-137模拟物(miR-137)、miRNA-137抑制剂(anti-miR-137)或对照miRNA(ctl-miR)的细胞中的相对荧光素酶活性的柱状图；
图3为表征分别转染了miRNA-137模拟物(miR-137)、miRNA-137抑制剂(anti-miR-137)或对照miRNA(ctl-miR)的细胞中相对mRNA表达量的柱状图；
图4为分别转染了miRNA-137模拟物(miR-137)、miRNA-137抑制剂(anti-miR-137)和对照miRNA(ctl-miR)的细胞的总蛋白以抗DAT抗体为一抗做的western印迹；
图5为表征分别转染了miRNA-137模拟物(miR-137)、miRNA-137抑制剂(anti-miR-137)和对照miRNA(ctl-miR)的细胞中相对多巴胺水平的柱状图。
在以上附图的柱状图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
在本发明中，发明人使用miRanda(http://www.microrna.org)得到关于人类、果蝇和斑马鱼基因组的miRNA靶基因的预测信息以及miRNA在不同组织的表达谱，使用TargetScan(http://www.targetscan.org)基于靶mRNA序列的进化保守等特征预测动物的miRNA靶基因，出乎意料地发现，DAT基因的3’UTR中存在miRNA-137可能的作用靶点。在这基础上，通过荧光素酶表达活性分析、mRNA及蛋白质水平分析、功能水平分析，最终证实可通过调节细胞中miRNA-137的量来调节DAT基因的表达，进而控制细胞内的多巴胺浓度。
miRNA模拟物是一种合成的双链寡核糖核苷酸，其中一条链为具有相应miRNA的序列的链，另一条链反向互补链，并且，在具有相应miRNA序列的链上具有末端修饰的核苷酸类似物。当将miRNA模拟物转染至细胞中后，反向互补链立刻被细胞内环境中存在的RNA酶降解，而具有miRNA序列的链因为这样的修饰而保持长时间不被降解，由此增大了miRNA的半衰期，提高了miRNA的有效浓度。
miRNA抑制剂与miRNA模拟物正好相反，其在反向互补链上具有末端修饰的核苷酸类似物。将miRNA模拟物转染至细胞中后，具有miRNA序列的链立刻被细胞内环境中存在的RNA酶降解，而反向互补链因为这样的修饰而保持长时间不被降解，由此增大了反向互补链的半衰期，提高了反向互补链的有效浓度。反向互补链结合细胞中相应的内源miRNA，使其不能发挥功能，从而降低了miRNA的有效浓度。
在本文以及所附权利要求书和序列表中，针对miRNA-137模拟物和miRNA-137抑制剂所示出的序列都为其有效序列，即，在转染至细胞中后未被分解的那条链的序列。
在本发明中，通过将miRNA-137模拟物或miRNA-137抑制剂转染至细胞中，以提高或降低细胞中的miRNA-137的量，由此来下调或上调DAT基因的表达，从而影响细胞对多巴胺的摄取。
miRNA模拟物和抑制剂在许多生化试剂公司有售，或可提供序列让生化公司合成，例如天根生化科技公司、广州市锐博生物科技有限公司等。本发明实施例中使用的miRNA-137模拟物和抑制剂购自广州市锐博生物科技有限公司。
材料与方法
以下方法是实验的一般方法，在具体实验过程中可进行一些必要的修改。
1.细胞培养
将SK-N-SH神经母细胞瘤(得自美国模式培养物集存库，ATCCHTB-11)接种于添加了10％胎牛血清和0.1g/L的丙酮酸钠的MEM培养基中，在37℃和5％CO2下培养。
2.质粒构建和转染
使用细胞基因组为模板，通过PCR扩增得到DAT基因的3’UTR(SEQIDNO:4)的片段(约2kb)，将该片段插入psiCHECK2质粒(Promega,Madison,WI,USA)(图1)荧光素酶报告基因hRluc上游的多克隆位点XhoI与NotI之间。按照制造商的说明书，使用Lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)试剂将带有DAT基因的3’UTR的序列的质粒转染到SK-N-SH神经母细胞瘤中。
3.miRNA-137模拟物或抑制剂的转染
miRNA-137模拟物和抑制剂购自广州市锐博生物科技有限公司。根据制造商的说明书，使用LipofectamineRNAiMAX试剂(Invitrogen)将miRNA-137模拟物或抑制剂转染至上述具有psiCHECK2质粒的SK-N-SH神经母细胞瘤中。转染方法如下：
1)转染前一天用不含抗生素的生长培养基接种细胞，细胞密度5×104/ml，100μl/孔(以96孔板为例)，使转染时的平坦单层细胞密度能够达到约70％；
2)按每孔10μl的量用Opti-MEM减血清培养液稀释miRNA，使其在最终孵育时的工作浓度为50-250nM；
3)转染试剂LipofectamineRNAiMAX使用前先轻轻混合，然后按每孔10μl的量用Opti-MEM减血清培养液稀释0.2μl转染试剂，轻柔混合；
4)将稀释好的转染试剂和miRNA混合在一起，总体积20μl，轻柔混合，室温孵育10至20分钟；
5)向含有细胞和培养基的培养板中每孔加入20μl混合物，轻轻摆动细胞培养板混合均匀；
6)恒温37℃的CO2培养箱中孵育24至72小时后完成转染，收集细胞用于进一步分析。
实施例
实施例1.荧光素酶报告基因表达活性分析
使用Dual-luciferaseReporterAssaySystem(Promega,E1910)，根据制造商说明书来分析其中转染了带有DAT基因3’UTR的psiCHECK2质粒并且分别转染了miRNA-137模拟物、miRNA-137抑制剂和阴性对照双链miRNA(也购自广州市锐博生物科技有限公司，转染方法与miRNA-137模拟物或抑制剂相同)的SK-N-SH神经母细胞瘤中的相对荧光素酶活性。
结果如图2所示，转染了miRNA-137模拟物的细胞(miR-137)中，荧光素酶活性是对照(ctl-miR)中的40％(p<0.01)左右，而转染了miRNA-137抑制剂的细胞(anti-miR-137)中，荧光素酶活性是对照(ctl-miR)中的1.2倍(p<0.05)以上。该结果说明miRNA-137模拟物通过DAT基因3’UTR抑制的荧光素酶的表达；并且miRNA-137抑制剂促进该酶的表达。
实施例2.mRNA水平分析
使用荧光素酶报告基因表达质粒转染SK-N-SH细胞，孵育5小时，然后分别用miRNA-137模拟物或抑制剂转染，孵育48小时。转染后培养24小时，然后通过使用SVTotalRNAIsolationSystem(Promega)提取RNA，使用GoScriptReverseTranscriptionSystem将RNA反转录成cDNA，所得的cDNA稀释10倍，进行实时定量PCR，CFX96Real-timeSystem(Bio-Rad,California,USA)，使用SYBRPremixExTaqKit(TAKARA,Dalian,China)，用GAPDH作为内标，分析mRNA表达水平。
结果如图3所示，转染了miRNA-137模拟物的细胞(miR-137)中，mRNA活性是对照(ctl-miR)中的40％左右(p<0.01)，而转染了miRNA-137抑制剂的细胞(anti-miR-137)中，mRNA活性是对照(ctl-miR)中的约1.4倍(p<0.05)以上。该结果说明miRNA-137模拟物降低该mRNA的活性；并且miRNA-137抑制剂提高该mRNA的活性。
实施例3.DAT蛋白表达水平分析
培养24小时后，用RIPA细胞裂解液(25mMTris-HCl,150mMNaCl,1％NP-40,1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS,pH7.6)处理细胞样品，进行12％的SDS-PAGE电泳，
然后进行western印迹，将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜(Millipore,Bedford,MA)上，封闭。一抗使用鼠抗人DAT抗体(1:1000–1:2000,Abcam,USA,Productcode:ab5990，ab111468)，二抗使用山羊抗鼠(1:1,000；CellSignalingTechnologyInc.,Beverly,Massachusetts,USA)。等体积混合Luminol和Peroxide试剂(ThermoFisherScientific)配制发光液，向转印有蛋白质的一面PVDF膜上滴加发光液，凝胶成像仪ChemiDocMPImagingSystem(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)中曝光显色。
结果如图4所示，与转染了对照miRNA的细胞相比，转染了miRNA-137的细胞中，DAT蛋白量降低，并且转染了miRNA-137抑制剂的细胞中，DAT蛋白量升高。该结果说明，miRNA-137模拟物降低DAT蛋白的表达，并且miRNA抑制剂提高DAT蛋白的表达。
实施例4.多巴胺浓度的分析
将细胞涂布于24孔培养皿(200,000细胞/孔)，用miRNA-137模拟物、miRNA-137抑制剂和阴性对照双链miRNA进行转染，孵育48小时。然后将细胞与5μg/ml盐酸多巴胺孵育5小时，使用多巴胺ELISA试剂盒(Elabscience,Wuhan,Hubei,China,Productcode:E-EL-0046c)测定细胞内多巴胺浓度。
结果如图5所示，转染了miRNA-137模拟物的细胞(miR-137)中，多巴胺是对照(ctl-miR)中的60％左右(p<0.01)，而转染了miRNA-137抑制剂的细胞(anti-miR-137)中，多巴胺略高于对照(ctl-miR)，但是没有统计学显著性。该结果说明miRNA-137模拟使神经细胞中的多巴胺浓度降低；而miRNA-137抑制剂对多巴胺浓度影响不大。
通过以上实施例，证明了miRNA-137模拟物的转染能够降低细胞对多巴胺的摄取，因此miRNA-137模拟物可用于降低人细胞摄取多巴胺，并且可用于制备降低人细胞摄取多巴胺的药物；同时证明了miRNA-137抑制剂的转染能够增加细胞对多巴胺的摄取，因此miRNA-137抑制剂可用于增加人细胞摄取多巴胺，并且可用于制备增加人细胞摄取多巴胺的药物。
本发明还设想了用于降低人细胞摄取多巴胺的组合物，其包含miRNA模拟物，并且还可包含药学可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或佐剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种调节细胞中的多巴胺转运体基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：提高所述细胞中的miRNA-137的量，从而下调所述多巴胺转运体基因的表达；或降低所述细胞中的miRNA-137量，从而上调所述多巴胺转运体基因的表达；miRNA-137的序列如SEQ.ID.NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提高所述细胞中的miRNA-137的量通过将miRNA-137模拟物转染至所述细胞中来进行，miRNA-137模拟物的序列如SEQIDNO:2所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述降低所述细胞中的miRNA-137的量通过将miRNA-137抑制剂转染至所述细胞中来进行，miRNA-137抑制剂的序列如SEQIDNO:3所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为人神经细胞。
5.miRNA-137及其抑制剂在制备降低人细胞摄取多巴胺的药物的应用。
6.一种用于调节人神经细胞摄取多巴胺的组合物，其特征在于，包含miRNA-137或其抑制剂，以及药学可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、佐剂中的一种或多种。
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