CN114317656B - 一种生物活性带鱼肽微量元素螯合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物活性带鱼肽微量元素螯合物的制备方法，所述生物活性带鱼肽微量元素螯合物是由带鱼经过预处理、超临界萃取、酶解，然后与金属化合物在高能球磨机中进行螯合反应制备而成。本发明充分利用海洋资源，所制备的带鱼肽微量元素螯合物不仅可以达到均衡补充微量元素的目的，而且工艺简单，产率高，适合大批量产业化生产，可作为食品添加剂或营养补充剂的用途，广泛用于食品、饮料、化妆品、生物医药、健康医疗等领域。

Description

一种生物活性带鱼肽微量元素螯合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及有机微量元素螯合物加工技术领域，具体涉及一种生物活性带鱼肽微量元素螯合物及其制备方法。
背景技术
氨基酸和金属元素是人和动物所必需的营养素，这些营养素主要从食物中摄取。食物进入人体经胃和小肠消化后，蛋白质由长链肽变为短链肽。最新研究(林煌映《畜牧市场》2005年第8期，76-78)表明，蛋白质在肠腔内的最终水解产物，除氨基酸外，还有部分小肽。与游离氨基酸相比，小肽具有吸收速度快、耗能低、不易饱和，且各种肽之间的转运无竞争性与抑制性等特点。
氨基酸微量元素螯合物是由某种可溶性金属盐中的一个金属元素离子同氨基酸或短肽物质按一定的摩尔比以配位键和离子键结合而成有机微量元素螯合物。有作者(陈宝江，《中国饲料》2004年第5期，34-36)指出，小肽可提高矿物元素的吸收利用率，即小肽可与Ca、Zn、Cu、Fe等矿物元素形成螯合物，增加其可溶性，以利于机体吸收。
目前，国内外关于氨基酸微量元素螯合物的生产制备工艺主要采用磷酸化技术，硫醇化技术，超声技术和固相合成技术等。如专利CN94114854.8公开了一种氨基酸锌的制备方法，在烧杯中加入蒸馏水，将氨基酸溶解后加入氧化锌，然后在电炉上加热浓缩，冷却到室温后向混合液加入酒精搅拌至有大量的白色晶体析出，静置后过滤得到白色氨基酸锌螯合物晶体。专利CN201510807515.7中将复合氨基酸废液过滤后送入浓缩罐浓缩，然后脱色后得到复合氨基酸液体。同时将硫酸锌粉碎，然后和复合氨基酸液体送入化学反应釜于80℃条件下搅拌进行螯合反应，反应完成后，添加木质素，搅拌反应0.125小时后降温至常温，再添加控释剂，搅拌反应0.125小时，最后将上述反应物浓缩后进行干燥，粉碎即得氨基酸螯合锌粉末。这些方法的影响因素多且不易控制，易产生杂质，收率低（产率<70%），耗能大，产品的纯度低，分离困难。目前，高能球磨技术主要应用于生产粉尘、无定形化合物和金属化合物合金等。有研究发现，在高能球磨后，纳米鱼骨（NFB）悬浮液中的钙离子浓度显著增加，这表明钙在研磨过程中，从鱼骨释放到了悬浮液中，并在鱼骨粒径大小稳定后，释放量仍随球磨时间的延长而逐渐增加，高能湿法球磨可能成为制备氨基酸（肽）螯合物的有效新方法。
带鱼（Largehead Hairtail），别称刀鱼、牙带鱼，属于脊索动物门、鲈形目，体型呈带状。主要分布于西太平洋和印度洋，在中国的黄海、东海、渤海一直到南海都有分布，和大黄鱼、小黄鱼及乌贼并称为中国的四大海产。带鱼的平均蛋白含量达到18.4%以上，这使得它成为丰富的蛋白质原材料来源。蛋白质经过酶解等特殊处理，可以制备具备一些特殊生理、保健等功能的生物活性肽。
发明内容
针对该背景，本发明的目的是提供用于制备一种生物活性带鱼肽微量元素螯合物的简单、稳定和适用于工业化生产的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种生物活性带鱼肽微量元素螯合物是由带鱼经过预处理、超临界萃取、酶解，然后与金属化合物在高能球磨机中进行螯合反应后过滤喷雾干燥制备而成。
本发明提供了一种生物活性带鱼肽微量元素螯合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)带鱼预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块，用水清洗4～5次后进行破碎匀浆处理，得到带鱼肉浆；
(2)超临界萃取：采用超临界二氧化碳流体萃取技术除去带鱼肉浆中的脂类和腥味物质，然后用乙醇进行提取得到带鱼醇溶蛋白液；
(3)酶解：用蛋白酶对带鱼醇溶蛋白液进行酶解，在95～100℃条件下灭活，过滤，滤液在0.25 MPa压力下超滤，用分子质量为1ku的超滤膜超滤，得到分子质量为＜1ku的带鱼蛋白肽滤出液，将带鱼蛋白肽滤出液冻干后备用；
(4) 螯合：称取一定量带鱼蛋白肽溶于水中升温并保持至35～60℃，控制浓度为55%（浓度为干物质与水的质量比），按照比例加入一定量的金属元素原料，搅拌混合均匀，将料液转入高能球磨机的研磨腔，控制填充率和球磨时间，在2000r/min转速的条件下进行球磨，用孔径为0.1～0.45mm的滤膜过滤，备用；
(5)喷雾干燥：采用喷雾干燥法对滤液进行处理制备带鱼肽微量元素螯合物粉末。
作为优选，所述金属反应物原料可以为金属化合物,如氯化钙、氯化镁、硫酸锌、氯化锌、氧化镁、氧化钙、氧化锌等中的一种或几种。
作为优选，所述步骤（2）超临界萃取中，萃取工作压力为15～50MPa，温度为30～65℃，时间为0.5～4.0h，超临界二氧化碳流体的流量为20～50L/h，制得带鱼醇溶蛋白液。
作为优选，所述带鱼醇溶蛋白液无腥味并且脂类物质含量小于0.15%。
作为优选，所述步骤（2）超临界萃取中，乙醇提取时，乙醇浓度为60～90%，带鱼肉浆与乙醇的质量比为1∶6～20，提取温度为45～65℃，pH值为7.5～9.0。
作为优选，所述步骤（3）酶解中采用分步复合酶解法，第一步选用胃蛋白酶，底物浓度5～15wt%，酶浓度0.5～8wt%，酶解温度为33～39℃，pH值1～3，酶解时间2～6h，酶解后进行灭活，分离得到第一酶解液。第二步酶解在第一酶解液的基础上选用复合蛋白酶（风味蛋白酶与木瓜蛋白酶质量比例为2:3），底物浓度5～20%，酶浓度2～10%，酶解温度为45～65℃，pH值为6.0～7.5，酶解时间3～6h，
选用胃蛋白酶和复合蛋白酶（风味蛋白酶与木瓜蛋白酶质量比例为2:3）对带鱼醇溶蛋白进行分步复合酶解，得到带鱼酶解液中含芳香族氨基酸、支链氨基酸及小分子肽等混合物。第一步选择胃蛋白酶，可将带鱼醇溶蛋白切割成短肽且切割位置绝大多数在芳香族氨基酸与支链氨基酸的连接处，使酶解后生成氨基酸以及短肽的末端是芳香族氨基酸；第二步选择复合蛋白酶（风味蛋白酶与木瓜蛋白酶质量比例为2:3）在脱芳的同时还能切掉肽链端的部分疏水性氨基酸，达到脱苦、脱腥的效果，不仅酶解效率提高、酶解液的口感鲜甜。
作为优选，所述步骤(4)螯合反应用的带鱼肽分子量范围为＜1ku。
作为优选，所述步骤(4)中带鱼蛋白肽与金属化合物的质量比为3:1～7:1，填充率为50～90%、反应时间1~5h。
作为优选，所述步骤(5)中喷雾干燥的工艺参数为: 进风口温度150～300℃，出风口温度50～150℃，进料速度为40～80kg/h。
作为优选，所述的一种带鱼肽微量元素螯合物可作为食品添加剂或营养补充剂的用途，广泛用于食品、饮料、化妆品、生物医药、健康医疗等领域。
上述技术方案中，所述%为质量百分含量。
本发明相比现有技术具有以下有益效果：
(1) 本发明制备得到的带鱼肽螯合物，既能以中性分子配合物(螯合物)形式在生物体内不受阻碍地转运，又能被小肠整体吸收，这就显示出其营养的许多优势：可加快蛋白质的合成、提高矿物元素的吸收利用率、提高动物机体的免疫力、具有生理调节作用等。更为重要的是：人体吸收这类氨基酸短肽螯合物，可同时起到双补作用：既补充金属元素，又补充了氨基酸。将其制成保健品，将充分体现出营养保健的崭新理念。目前，有关源于带鱼酶解液所制备的带鱼肽微量元素螯合物，至今尚未发现有文献报道。
(2)本发明的方法的各个步骤和参数之间协同作用，可进一步保证带鱼肽微量元素螯合物的质量:采用超临界流体萃取技术能够有效脱除带鱼蛋白中的脂类以及腥味物质，得到有活性的带鱼蛋白，同时采用分步复合酶酶解，从根本上保证了带鱼肽的质量。
(3)本发明所制备的一种带鱼肽微量元素螯合物中的带鱼肽源于深海带鱼，来源更加绿色环保健康，充分利用了海洋资源。
(4)本发明所制得的一种带鱼肽微量元素螯合物符合食品级的要求，采用酶法制备带鱼肽并与金属离子发生螯合反应所制得，具有良好的化学、生化稳定性，抗氧化活性高，在体内溶解性好、容易被吸收、生物利用率高、无毒副作用、具有抗干扰，补充氨基酸和矿物质的双重作用，可作为食品添加剂或营养补充剂的用途，广泛用于食品、饮料、化妆品、生物医药、健康医疗等领域。
(5)本发明所述湿法球磨通过高速旋转球之间的摩擦、碰撞和挤压将料液研磨成纳米级，省去了干法球磨中的抽真空和氩气保护等复杂工艺，生产条件易于控制，易于实现产业化。本发明通过湿法球磨工艺在机械碰撞和物理剪切作用下，带鱼肽和金属元素原料的粒径不断降低，暴露带电基团增加，有利于金属离子和氨基与羧基配位，从而促进螯合反应。相对于普通湿法合成，进一步提高了带鱼肽微量元素螯合物的螯合率；并且该方法制备得到的带鱼肽微量元素螯合物的抗氧化活性、生物利用率和水溶液稳定性高。
附图说明
图1为五种酶解产物的水解度和抗氧化活性对比图；
图2为三种酶解方式的水解度和抗氧化活性对比图；
图3为未分级及超滤后各分级带鱼蛋白肽的螯合率的比较；
图4～图7为肽锌质量比、温度、时间、填充率对＜1ku带鱼蛋白肽螯合率的影响；
图8为实施例与对比例分别采用高能湿法球磨和普通湿法对制备带鱼肽螯合锌、带鱼肽螯合镁、带鱼肽螯合钙的螯合率影响；
图9为＜1ku带鱼肽红外光谱；
图10 为实施例1带鱼肽螯合锌的红外光谱；
图11为实施例1带鱼肽与锌螯合前后粉末含水量稳定性的对比；
图12为实施例1带鱼肽与锌螯合前后粉末色差稳定性的对比；
图13为带鱼酶解液、＜1ku带鱼肽与实施例1带鱼肽螯合锌对DPPH的清除效果；
图14为带鱼酶解液、＜1ku带鱼肽与实施例1带鱼肽螯合锌对羟自由基的清除效果；
图15为实施例1带鱼肽螯合锌和硫酸锌经胃部和肠道消化后的溶解率；
图16为实施例1带鱼肽螯合锌和硫酸锌经胃部和肠道消化后的透析率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种带鱼肽螯合锌及其制备方法，通过以下步骤制备：
(1)带鱼预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块，用水清洗4～5次后进行破碎匀浆处理，得到带鱼肉浆；
(2)超临界萃取：采用超临界二氧化碳流体萃取技术并除去带鱼肉浆中的脂类和腥味物质，萃取工作压力为30MPa，温度为50℃,超临界二氧化碳流体的流量为40L/h,时间为1.5h；乙醇提取时，乙醇浓度为65%，带鱼肉浆与乙醇的质量比为1∶10， 提取温度为45℃，pH值为8.0，提取得到带鱼醇溶蛋白液；所述带鱼醇溶蛋白液无腥味并且脂类物质含量小于0.15%。
(3)酶解：采用分步复合酶法进行酶解：第一步选用胃蛋白酶，底物浓度10wt%，酶浓度2.0wt%，酶解温度为37℃，pH值2.0，酶解时间2h，100℃下灭活1min过滤得到第一酶解液；第二步酶解在第一酶解液的基础上选用复合蛋白酶（风味蛋白酶与木瓜蛋白酶质量比例为2:3）酶解，底物浓度15wt%，酶浓度5wt%，酶解温度为50℃，pH值为6.5，酶解时间3.5h，酶解后于100℃下灭活1min，过滤得到带鱼酶解液；将酶解液在0.25MPa压力下超滤，用分子质量为1ku的超滤膜超滤，得到分子质量＜1ku的带鱼蛋白肽滤出液，将滤出液冻干，备用。
(4) 称取10kg带鱼蛋白肽溶于21.2kg水中升温并保持温度为50℃，加入硫酸锌配成肽锌质量比为6:1的肽锌溶液，充分溶解，搅拌混合均匀，然后将料液转入高能球磨机的研磨腔，在2000r/min的转速下进行球磨，控制填充率80%，球磨时间为3h。球磨结束用0.4mm的膜过滤后进行；
(5)喷雾干燥：将滤液进行喷雾干燥制得带鱼肽螯合锌干粉，所设置喷雾干燥的参数为进料速度40kg/h,转速为560r/min，进风温度为200℃，出风温度为103℃。
实施例2
一种带鱼肽螯合镁及其制备方法，通过以下步骤制备：
(1)带鱼预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块，用水清洗4～5次后进行破碎匀浆处理，得到带鱼肉浆；
(2)超临界萃取：采用超临界二氧化碳流体萃取技术并除去带鱼肉浆中的脂类和腥味物质，萃取工作压力为35MPa，温度为50℃,超临界二氧化碳流体的流量为45L/h,时间为2.5h，乙醇提取时，乙醇浓度为65%，带鱼肉浆与乙醇的质量比为1∶8， 提取温度为45℃，pH值为8.0，提取得到带鱼醇溶蛋白液；所述带鱼醇溶蛋白液无腥味并且脂类物质含量小于0.15%。
(3)酶解：采用分步复合酶法进行酶解：第一步选用胃蛋白酶，底物浓度8wt%，酶浓度2.0wt%，酶解温度为37℃，pH值2.0，酶解时间2h，100℃下灭活1min过滤得到第一酶解液；第二步酶解在第一酶解液的基础上选用复合蛋白酶（风味蛋白酶与木瓜蛋白酶质量比例为2:3）酶解，底物浓度15wt%，酶浓度4.5wt%，酶解温度为50℃，pH值为6.5，酶解时间4.5h，酶解后于100℃下灭活1min，过滤得到带鱼酶解液； 将酶解液在0.25MPa压力下超滤，用分子质量为1ku的超滤膜超滤，得到分子质量＜1ku的带鱼蛋白肽滤出液，将滤出液冻干，备用。
(4) 称取10kg带鱼蛋白肽溶于20.7kg水中升温并保持温度为50℃，加入氯化镁配成肽镁质量比为7:1的肽镁溶液，充分溶解，搅拌混合均匀，然后将料液转入高能球磨机的研磨腔，在2000r/min的转速下进行球磨，控制填充率70%，球磨时间为3h。球磨结束用0.4mm的膜过滤后进行；
(5)喷雾干燥：将滤液进行喷雾干燥制得带鱼肽螯合镁干粉，所设置喷雾干燥的参数为进料速度40kg/h,转速为560r/min，进风温度为200℃，出风温度为105℃。
实施例3
一种带鱼肽螯合钙的制备方法，通过以下步骤制备：
(1)带鱼预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块，用水清洗4～5次后进行破碎匀浆处理，得到带鱼肉浆；
(2)超临界萃取：采用超临界二氧化碳流体萃取技术并除去带鱼肉浆中的脂类和腥味物质，萃取工作压力为30MPa，温度为45℃,超临界二氧化碳流体的流量为40L/h,时间为2h，乙醇提取时，乙醇浓度为70%，带鱼肉浆与乙醇的质量比为1∶10，提取温度为50℃，pH值为8.0，提取得到带鱼醇溶蛋白液；所述带鱼醇溶蛋白液无腥味并且脂类物质含量小于0.15%。
(3)酶解：采用分步复合酶法进行酶解：第一步选用胃蛋白酶，底物浓度8wt%，酶浓度2.5wt%，酶解温度为37℃，pH值2.0，酶解时间2h，100℃下灭活1min过滤得到第一酶解液；第二步酶解在第一酶解液的基础上选用复合蛋白酶（风味蛋白酶与木瓜蛋白酶质量比例为2:3）酶解，底物浓度20wt%，酶浓度4wt%，酶解温度为50℃，pH值为6.0，酶解时间4h，酶解后于100℃下灭活1min，过滤得到带鱼酶解液；将酶解液在0.25MPa压力下超滤，用分子质量为1ku的超滤膜超滤，得到分子质量＜1ku的带鱼蛋白肽滤出液，将滤出液冻干，备用。
(4) 称取10kg带鱼蛋白肽溶于21.2kg水中升温并保持温度为50℃，加入氯化钙配成肽钙质量比为6:1的肽钙溶液，充分溶解，搅拌混合均匀，然后将料液转入高能球磨机的研磨腔，在2000r/min的转速下进行球磨，控制填充率80%，球磨时间为3h。球磨结束用0.4mm的膜过滤后进行；
(5)喷雾干燥：将滤液进行喷雾干燥制得带鱼肽螯合钙干粉，所设置喷雾干燥的参数为进料速度40kg/h,转速为560r/min，进风温度为200℃，出风温度为103℃。
对比例
对比例1普通湿法制备带鱼肽螯合锌
酶解工艺与实施例1完全相同。称取10kg冻干好的＜1ku带鱼蛋白肽和1.666kg硫酸锌粉末混合均匀，缓慢加入1.94kg水，充分搅拌成湿品状态，然后将物料于60℃烘箱中进行固相合成3h即得带鱼肽螯合锌成品。
对比例2普通湿法制备带鱼肽螯合镁
酶解工艺与实施例2完全相同。称取10kg冻干好的＜1ku带鱼蛋白肽和1.428kg氯化镁粉末混合均匀，缓慢加入1.9kg水，充分搅拌成湿品状态，然后将物料于60℃烘箱中进行固相合成3h即得带鱼肽螯合镁成品。
对比例3普通湿法制备带鱼肽螯合钙
酶解工艺与实施例3完全相同。称取10kg冻干好的＜1ku带鱼蛋白肽和1.666kg氯化钙粉末混合均匀，缓慢加入1.94kg水，充分搅拌成湿品状态，然后将物料于60℃烘箱中进行固相合成3h即得带鱼肽螯合钙成品。
试验例
试验例1
以实施例1为例，本试验例说明酶解和螯合实验条件的筛选。
(1)将带鱼醇溶蛋白作为原料，选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶(风味蛋白酶：木瓜蛋白酶质量比=2:3)、胃蛋白酶这五种蛋白酶，在各自最适酶解条件下对带鱼醇溶蛋白进行酶解(五种蛋白酶的酶解适宜条件如表1)，以水解度和DPPH自由基清除率为指标筛选出最适蛋白酶。
表1五种蛋白酶的酶解适宜条件
蛋白酶种类 最适温度/℃ 最适pH 酶浓度/%
碱性蛋白酶 50 9 3
中性蛋白酶 45 7 3
木瓜蛋白酶 50 6 3
复合蛋白酶 50 6 3
胃蛋白酶 37 2 3
① 水解度的测定：
吸取10mL酶解液，加入蒸馏水60mL后搅拌均匀，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH8.2时停止搅拌，记录体积; 加入中性甲醛10mL，再用NaOH标准溶液滴定至pH9.2，记下加入甲醛后消耗的氢氧化钠体积V。同时做空白实验，记录消耗的氢氧化钠体积V0。并用以下公式计算水解度。
式中：DH为水解度，%；
C为氢氧化钠溶液浓度，mol/L;
V为消耗氢氧化钠溶液的体积，mL
V0为空白消耗氢氧化钠体积，mL；
0.014为氮毫克当量；
M为样品中总氮含量,g。
② 抗氧化能力的测定：DPPH自由基清除率
取冷冻干燥样品，配制成1mg/ml，取2mL样品加入0.2mmol/L的DPPH乙醇混合溶液2mL，混合摇匀后在避光处静置30min，然后在517nm处测得吸光值Ai。以无水乙醇溶液代替DPPH 溶液作为空白组Aj，以等体积蒸馏水代替样品溶液作为对照组A0。
式中：Ai为样品组吸光度；
Aj为空白组吸光度；
A0为对照组吸光度；
蛋白酶活性位点的结构决定了它与底物的结合，并决定了底物如何与酶结合，因此具有特异性，这种特异性决定了酶水解的位置，当不同的蛋白酶作用于同一底物时，会产生不同的水解效果。从图1中可以看出，采用复合蛋白酶和胃蛋白酶水解度最高，说明该两种酶对带鱼蛋白的水解较为彻底。
从抗氧化活性来看，胃蛋白酶酶解液的DPPH自由基清除率最高，其次是复合蛋白酶，这与酶的特异性有关，不同酶所得到的氨基酸和肽的种类不同，从而会产生不同的抗氧化活性，综合考虑选择胃蛋白酶和复合蛋白酶。
(2)为了进一步提高酶解效率，增强抗氧化活性，选取复合蛋白酶和胃蛋白酶进行1:1分步酶解，以水解度和DPPH自由基清除率为指标，研究加酶方式对酶解效果的影响，按照表2的酶解条件分步考察三种加酶方式对酶解效果的影响。
表2 酶解方式
酶解方式 酶浓度/% pH 温度/℃ 时间/h
同时酶解 3 4 43 4
先胃蛋白酶后复合蛋白酶 3 2-6 37-50 2+2
先复合蛋白酶后胃蛋白酶 3 6-2 50-37 2+2
由图2结果知，当采用胃蛋白酶和复合蛋白酶(风味蛋白酶：木瓜蛋白酶质量比＝2:3)先后使用时，酶解液的水解度和DPPH自由基清除率最高，因此采用先胃蛋白酶后复合蛋白酶的水解方式。
（3）综合考虑水解度和抗氧化活性，用筛选出的蛋白酶酶解方式对带鱼醇溶蛋白进行酶解，水解条件用实验室前期优化的水解条件：第一步胃蛋白酶酶解，底物浓度10wt%，酶浓度2.0wt%，酶解温度为37℃，pH值2.0，酶解时间2h，100℃下灭活1min过滤得到第一酶解液；第二步酶解在第一酶解液的基础上选用复合蛋白酶，底物浓度15wt%，酶浓度5wt%，酶解温度为50℃，pH值为6.5，酶解时间3.5h，酶解后于100℃下灭活1min，过滤得到带鱼酶解液。
(4)将(3)制备出的酶解液在0.25MPa压力下超滤，依次用分子质量为10、5、2和1ku的超滤膜超滤，分别得到分子质量为>10ku、5-10 ku、2-5 ku、1-2 ku、＜1ku的带鱼蛋白肽滤出液，将酶解原液及分级的各级分的螯合肽段滤出液冻干后进行螯合实验。称取一定量冻干后的带鱼蛋白肽溶于去离子水中升温并保持温度50℃，加入硫酸锌配成肽锌质量比为5:1的肽锌溶液，充分溶解，搅拌混合均匀，然后将料液转入高能球磨机的研磨腔，在2000r/min的转速下进行球磨，控制填充率80%，球磨时间为3h。球磨结束过滤后进行喷雾干燥制得带鱼肽螯合锌干粉，检测螯合率和DPPH自由基清除率，所设置喷雾干燥的参数为进料速度40kg/h,转速为560r/min,进风温度为200℃，出风温度为103℃。
螯合率的测定方法如下：
取相同数量的样品加无水乙醇进行沉淀，静置3h后微滤，浓缩，再用乙醇进行沉淀，再静置3h，稀释100倍后取样，用火焰原子吸收法测定带鱼蛋白肽-硫酸锌原始物料的Zn2+总质量和滤液中游离锌的质量，按照下式计算螯合率：
螯合率(%)=（ZnT-ZnF）/ZnT* 100%
式中：
ZnT 表示原料中加入Zn2+的总质量(mg)；
ZnF 表示反应结束后未发生螯合反应的游离Zn2+质量(mg)
结果由图3可以看出，经过分级后的带鱼蛋白肽其螯合率均有所不同，这表明带鱼蛋白肽的分子量对螯合率起着重要作用，除了大于10ku肽段螯合率低于酶解原液，其他肽段显著增高，这是由于除去了大部分的大分子蛋白，使亲水性氨基酸含量增加而促进螯合反应。超滤后＜1ku肽段的螯合率最大，抗氧化活性最强，综合考虑选择分子质量为1ku的超滤膜作为工作用膜。
(5)称取一定量超滤后的带鱼蛋白肽溶于去离子水中升温并保持一定温度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃），加入硫酸锌配成肽锌质量比为(3:1,4:1,5:1,6:1,7:1)的肽锌溶液，充分溶解，搅拌混合均匀，然后将料液转入高能球磨机的研磨腔，在2000r/min的转速下进行球磨，控制填充率（50%、60%、70%、80%、90%），球磨时间为（1h、2h、3h、4h、5h）。球磨结束用0.4mm的膜过滤后进行喷雾干燥制得氨基酸螯合锌干粉，所设置喷雾干燥的参数为进料速度40kg/h,转速为560r/min,进风温度为200℃，出风温度为103℃。
结果如下：
从图4可知，当肽锌质量比为3:1时，由于锌离子含量过多，大量锌离子并没参与螯合导致螯合率较低，但肽锌质量比为7:1时，螯合率反而缓慢降低，这是因为锌离子已达到饱和状态，继续增加肽锌比反而降低肽利用率；当比值为6:1时，螯合率最大，最终选择带鱼蛋白肽与锌的比值范围5:1-7:1。
从图5可知，适当升温会促进螯合物的生成，45℃时带鱼肽螯合锌的螯合率最大，但温度过高在球磨的机械作用下会使多肽发生羰氨而降低螯合率，最终选择温度范围是40-50℃。
由图6可知，随着反应时间的延长螯合率随之增加，当反应时间超过3h后螯合率增加不明显，所以反应时间为3h螯合率最大。这可能是由于在球磨初期，钢球之间，钢球与物料之间的相互碰撞碾压使物料细化甚至达到纳米级促进了螯合反应。随着球磨的进行，螯合反应进一步产生，减少了物料与钢球之间的碰撞，此时螯合率增加的不明显。
填充率对带鱼肽螯合锌的螯合率影响如图7所示，从图中可以看出一定范围内随着填充率的增大，螯合率也呈现上升的趋势，但当填充率超过80%以后螯合率逐渐下降，这可能是填充率的增加促进了球磨时物料的充分接触，而过大的填充率会造成球磨过程中磨球和球罐的损耗，甚至引入杂质。
在单因素试验的基础上，选取肽锌质量比(A)、温度 (B)、时间(C)和填充率(D)4个因素作为自变量，螯合率(Y)为因变量，进行四因素三水平的正交实验，水平编码见表3，正交实验结果见表4。
表3 正交试验因素及水平编码
水平 A(质量比) B(温度/℃) C(时间/h) D(填充率/%)
-1 5 40 2 70
0 6 45 3 80
1 7 50 4 90
表4正交实验结果
编号 质量比 温度/℃ 时间/h 填充率/% 螯合率/%
1 5 40 2 70 47.4
2 5 45 3 80 73.3
3 5 50 4 90 61
4 6 40 3 90 84.1
5 6 45 4 70 65.2
6 6 50 2 80 82.7
7 7 40 4 80 70.4
8 7 45 2 90 51.2
9 7 50 3 70 64.6
K1 181.7 201.9 181.3 177.2
K2 232 189.7 222.3 226.4
K3 186.2 208.3 196.6 196.3
R 50.3 18.6 41 49.2
根据表4中的R可知，影响带鱼肽螯合锌的螯合率因素顺序为：A＞D＞C＞B。通过不同水平带鱼肽螯合锌的螯合率来看，最佳组合为A2B3C2D2，用A2B3C2D2组合做进一步的实验验证，螯合率为85.1%。
试验例2
本试验例说明实施例1～实施例3采用高能湿法球磨制备带鱼肽微量元素螯合物与对比例1～对比例3采用普通湿法对制备带鱼肽微量元素螯合物的螯合率影响。
由试验所测得实施例1~3与对比例1~3带鱼肽微量元素螯合物的螯合率如图8所示，从图中可以看出实施例的螯合率均比对比例高，说明高能湿法球磨比普通湿法能更进一步促进带鱼肽与锌离子的螯合，具有一定的优越性。
试验例3
本试验例以实施例1说明带鱼肽与锌螯合前后的结构表征。
从图9和图10可以看出，带鱼肽与Zn2+螯合后，各主要基团的吸收峰表现出一定程度的改变。带鱼肽在3250cm-1处有一较大的吸收峰，这可能是由N-H键的伸缩振动所产生的，当Zn2+螯合在带鱼肽上后，该峰移动到3280cm-1,波数增加30cm-1，是发生螯合的特征峰，可见带鱼肽中的氨基与Zn2+发生了螯合反应。带鱼肽中C=O键的伸缩振动于1640cm-1处附近有较强吸收峰，当肽与Zn2+螯合后移至1630cm-1处，可能是带鱼肽中的COO-参与了锌离子的配位反应，证明了带鱼肽螯合锌的生成。
试验例4
本试验例以实施例1说明带鱼肽螯合锌粉末的稳定性。
将带鱼肽螯合锌放置在温度（40±2）℃，相对湿度RH75%±5%的恒温恒湿培养箱中，避免光线直射，密闭保存12个月，测定其水分、色差和微生物菌落数的变化。
由图11可以看出，在常温条件下，样品的水分含量随储藏时间的延长而逐渐增加，可能是水蒸气逐渐透过PE袋进入，吸附到带鱼肽螯合锌粉末上，储藏12个月后水分含量变化不大。在40℃条件下，随着储藏时间的延长 ，样品的含水量并未出现明显变化，说明带鱼肽螯合锌的储藏稳定性较好，在较长的储藏时间内能保持其物理品质不变，不发生结块现象。
带鱼肽螯合锌粉末储藏期间色差变化如图12所示，在常温储藏条件下色差值逐渐增大后趋于稳定，而在40℃储藏条件下色差值虽有变化但波动不大，趋于稳定。
在加速实验过程中微生物各限量指标的检测数据如表5所示，可以看出各限量指标在（40±2）℃，相对湿度RH75%±5%的条件下存放14个月基本无变化，且均在规定范围内。
表5带鱼肽与锌螯合前后粉末微生物稳定性比较
试验例5
本试验例以实施例1说明带鱼肽与锌螯合前后的抗氧化活性分析。
将带鱼酶解原液，＜1ku带鱼肽和实施例1带鱼肽螯合锌配成浓度分别为1、2、3、4、5mg/mL的溶液，测定其抗氧化性能：①图13表明，三者都有清除DPPH自由基的作用。且随着浓度的增大对DPPH自由基的清除率缓慢升高，这表明体系的抗氧化作用逐步增强。同时，可以看出带鱼肽螯合锌对DPPH自由基的清除率明显高于未螯合的带鱼肽及酶解原液。②图14表明，三者都有清除羟自由基的作用，且随着浓度的增大，羟自由基清除率缓慢上升。同时，由图14可以看出带鱼肽螯合锌的羟自由基清除率明显高于未螯合的带鱼肽及酶解原液，这表明带鱼肽与锌螯合后有利于提高其抗氧化能力。
试验例6
本试验例以实施例1说明带鱼肽与锌螯合前后的体外模拟消化。
将实施例1带鱼肽螯合锌和硫酸锌溶解在去离子水中，用1mol/L的HCl调节溶液pH值至2.0，加入一定比例的胃蛋白酶，混合均匀，37℃震荡水浴2h；反应结束后，向混合体系中加入一定比例的胰酶和胆汁提取物，调节体系pH值至7.2，将此混合物移入到透析袋中(6000Da)，37℃震荡水浴2h。
(1)锌离子溶解率的测定
在模拟消化过程中，在胃蛋白消化2h后和胃蛋白酶-胰酶消化4h后取上清液，利用EDTA络合滴定法测定其中锌离子含量，以表示不同消化阶段的锌离子溶解率。
锌离子溶解率(%)==/>
V1：滴定上清液中锌离子所需要的EDTA溶液体积，mL；
V2：滴定等体积溶液中锌离子所需要的EDTA溶液体积，mL；
C：EDTA溶液的浓度，mol/L。
(2)锌离子透析率的测定
在胰酶消化后，取透析袋外的水溶液，利用EDTA络合滴定测定水溶液中锌离子含量，以表示透过模拟肠道的锌离子含量。
锌离子透析滤(%)==/>
V1：滴定上清液中锌离子所需要的EDTA溶液体积，mL；
V2：滴定等体积溶液中锌离子所需要的EDTA溶液体积，mL；
C：EDTA溶液的浓度，mol/L。
影响膳食中锌利用率的因素有很多，人体对饮食中锌的吸收率较低，主要原因是锌与植酸在小肠中可形成不溶的复合物，由于人类肠道缺少相应的植酸酶，这种不溶的锌-植酸复合物不能被人类吸收和利用，大大降低了锌的生物利用率，利用体外模拟胃肠道消化-透析法可以评价矿物质元素的生物利用率，氨基酸螯合锌和硫酸锌的透析率和溶解性依照Wolfgor等描述的实验方法进行测定，经胃肠道消化后，两种物质的溶解率和透析率如图15和图16所示。
由实验结果可知，实施例1中锌离子经胃部消化后的溶解率为97.96%,经肠道消化后的锌离子溶解率为53.62%；而硫酸锌中锌离子经胃、肠道消化后的溶解率分别为96.81％、34.73％；实施例1和硫酸锌中锌离子的透析率分别为42.64％、22.96％，带鱼肽螯合锌中锌离子的透析率显著高于硫酸锌中锌离子的透析率，虽然硫酸锌以溶解态存在于胃部环境中，但进入肠道环境后其溶解性显著下降，因此带鱼肽螯合锌中的锌离子更容易进入到肠道环境中，这表明，与硫酸锌相比，带鱼肽螯合锌的生物利用率更高。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种生物活性带鱼肽微量元素螯合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)带鱼预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块，用水清洗4～5次后进行破碎匀浆处理，得到带鱼肉浆；
(2)超临界萃取：采用超临界二氧化碳流体萃取技术并除去带鱼肉浆中的脂类和腥味物质，萃取工作压力为30MPa，温度为50℃,超临界二氧化碳流体的流量为40L/h,时间为1.5h；乙醇提取时，乙醇浓度为65%，带鱼肉浆与乙醇的质量比为1∶10，提取温度为45℃，pH值为8.0，提取得到带鱼醇溶蛋白液；所述带鱼醇溶蛋白液无腥味并且脂类物质含量小于0.15%；
(3)酶解：采用分步复合酶法进行酶解：第一步选用胃蛋白酶，底物浓度10wt%，酶浓度2.0wt%，酶解温度为37℃，pH值2.0，酶解时间2h，100℃下灭活1min过滤得到第一酶解液；第二步酶解在第一酶解液的基础上选用复合蛋白酶酶解，其中所述复合蛋白酶由风味蛋白酶与木瓜蛋白酶质量比例2:3组成，底物浓度15wt%，酶浓度5wt%，酶解温度为50℃，pH值为6.5，酶解时间3.5h，酶解后于100℃下灭活1min，过滤得到带鱼酶解液；将酶解液在0.25MPa压力下超滤，用分子质量为1ku的超滤膜超滤，得到分子质量＜1ku的带鱼蛋白肽滤出液，将滤出液冻干，备用；
(4) 称取10kg带鱼蛋白肽溶于21.2kg水中升温并保持温度为50℃，加入硫酸锌配成肽锌质量比为6:1的肽锌溶液，充分溶解，搅拌混合均匀，然后将料液转入高能球磨机的研磨腔，在2000r/min的转速下进行球磨，控制填充率80%，球磨时间为3h；球磨结束用0.4mm的膜过滤后进行；
(5)喷雾干燥：将滤液进行喷雾干燥制得带鱼肽螯合锌干粉，所设置喷雾干燥的参数为进料速度40kg/h,转速为560r/min，进风温度为200℃，出风温度为103℃。
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