CN111602672A - 一种抗菌纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗菌纳米材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗菌纳米材料及其制备方法和应用，所述抗菌纳米材料为氨基苯酚修饰的金纳米颗粒，所述氨基苯酚通过金‑氨键修饰在所述金纳米颗粒表面。所述氨基苯酚与金纳米颗粒结合之后，所得抗菌纳米材料表面的羟基能够靶向细菌表面的多糖，通过破坏细菌细胞壁进而增加细胞膜的通透性，并且所述氨基苯酚作为功能基团与细菌16S核糖体RNA结合，抑制蛋白质合成，进而杀灭细菌，达到较好的抗菌效果。同时，所述抗菌纳米材料表面带负电，具有优异的生物相容性，且不会诱发细菌产生耐药性，与氨基糖苷类药物等肾毒性药物相比，还具有较高的生物安全性。

Description

一种抗菌纳米材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种抗菌纳米材料及其制备方法和应用，尤其涉及一种具有抗菌效果的氨基苯酚修饰的金纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素耐药性的增加是一个重大的公共卫生问题，多药耐药菌株的流行已经成为一个严重的问题，阻碍了世界范围内严重感染疾病的治疗。据了解，超过70％的细菌对一种或多种抗生素具有耐药性。革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)可引起尿路、胃肠道和肺部感染，而革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌)可引起皮肤和软骨组织的感染。
氨基糖苷类抗生素是一类广谱抗生素，自1944年以来被广泛用于治疗各类细菌感染及威胁生命的传染病。与其他抗生素一样，误用和滥用会导致重要微生物病原体产生耐药性。此外，氨基糖苷在生理pH值下带正电，这导致了其生物毒性加剧，如肾毒性、耳毒性和神经肌肉阻滞。这些缺点极大地阻碍了氨基糖苷类药物在临床中的应用。氨基苯酚(Aminophenol)是一种医药中间体用于生产抗结核药物，具有氨基糖苷类抗生素关键单元的类似结构。
CN101225093A公开了新的氨基糖苷类衍生物，与现有的氨基糖苷类抗生素相比，抗菌谱广、抗菌活性高，尤其是对耐药菌具有较高的抗菌活性，具有良好的临床使用价值。将制备氨基糖苷类化合物及其盐，作为必需的活性成分的药物组合物，用于治疗和/或预防感染性疾病的药物，但该方法制备复杂，治疗小鼠体内感染使用剂量高达60mg/kg。
由于临床和市场需求的增长，新型抗菌药物的开发迫在眉睫，国内外学者在细菌感染方面利用各类材料制备了多种不同的抗菌剂。由于纳米材料具有比表面积大，表面功能化程度高，物理化学性质独特的特性，为开发新型抗菌药物提供了巨大的可能性。其中，金纳米粒子具有低毒、易功能化、多价、易检测和光热活性等优点，被认为是最佳的抗菌候选材料之一。
CN108210515A公开了一种新型纳米金复合抗菌剂及其制备方法。该新型纳米金复合抗菌剂，为负载硫酸庆大霉素的纳米金颗粒。该方法包括在氯金酸中加入聚乙烯吡咯烷酮，搅拌均匀后加入硫酸庆大霉素，然后加入硼氢化钠溶液还原氯金酸溶液，同时负载硫酸庆大霉素，通过透析去除溶液中未负载的硫酸庆大霉素，得到纳米金复合抗菌剂。所得纳米金复合抗菌剂对抗革兰氏阳性菌、抗革兰氏阴性菌和真菌均具有很好抑菌效果。然而该抗菌剂无法从根本减少抗生素的使用，更无法避免细菌耐药性的产生，其纳米金颗粒本质上只是承担了一种药物载体的作用，方便硫酸庆大霉素在体内的分散和流动。
CN103242525A公开了一种聚邻羟基苯酚抗菌材料及其制备方法，采用邻氨基苯酚为原料，在酸性溶液中通过化学氧化合成聚邻氨基苯酚高分子抗菌材料。然而，所得到的聚邻氨基苯酚抗菌材料为微米级尺寸，且不容易在体内循环和代谢，同时其制备过程需要使用强酸等有机溶剂，若其残留在体内会引起生物毒性和环境污染。
针对现有抗菌材料容易产生耐药性、生物安全性差、抗菌靶点及机理不明确、制备方法复杂、尺寸较大不利于体内循环且储存困难等缺点，本领域急需开发一种纳米级的、具有优异生物相容性、抗菌机理明确的抗菌纳米材料，来应对多药耐药菌产生的感染问题。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供了一种抗菌纳米材料及其制备方法和应用，抗菌纳米材料制备方法简便，且具有较好的生物安全性，能有效针对多药耐药菌感染。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种抗菌纳米材料，所述抗菌纳米材料为氨基苯酚修饰的金纳米颗粒，所述氨基苯酚通过金-氨键修饰在所述金纳米颗粒表面。
本发明中，选用含有氨基和羟基功能团的氨基苯酚与金纳米颗粒结合，所述氨基苯酚本身不具有抗菌活性，当其与金纳米颗粒结合之后便能起到抗菌作用。所得材料表面的多个羟基能够靶向细菌表面的多糖，通过破坏细菌细胞壁进而增加细胞膜的通透性，且抗菌靶点明确，所述氨基苯酚作为功能基团与细菌16S核糖体RNA结合，抑制蛋白质合成，进而杀灭细菌，达到较好的抗菌效果，尤其是对氨基糖苷类抗生素耐药的细菌抗菌效果较好；同时，所述抗菌纳米材料表面带负电，具有优异的生物相容性。
作为本发明优选的技术方案，所述氨基苯酚包括邻氨基苯酚(2AP)、对氨基苯酚(4AP)或间氨基苯酚(3AP)中的任意一种或至少两种的组合。邻氨基苯酚、间氨基苯酚和对氨基苯酚均可与所述金纳米颗粒结合形成本发明所提供的仿生抗生素。
同时，当其中任意两者混合或三种同时混合结合在金纳米颗粒表面时，理论上得到的金纳米颗粒也具有抗菌效果，但是无法预测其抗菌效果是否变化或者如何变化，并且由于无法预测各种氨基苯酚的结合比例以及一些微观元素的影响，所以即使得到实验结果也无法判断到底是何种原因导致的变化，因此，本发明中优选为将单一的氨基苯酚结合在金纳米颗粒表面。
优选地，所述金纳米颗粒采用硼氢化钠还原法制备得到。金纳米颗粒在制备时选用硼氢化钠还原法进行制备，氨基苯酚能够在金纳米颗粒形成的同时修饰到金纳米颗粒表面，形成过程和修饰过程可以一步进行，使制备方法较为简单，同时修饰的效率较高，最终得到的颗粒抗菌效果也较好。
优选地，所述抗菌纳米材料的粒径为2～8nm，例如可以是2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm或8nm等。所得抗菌纳米材料的粒径较小，为纳米级，容易在体内循环和代谢。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的抗菌纳米材料的制备方法，包括如下步骤：将氨基苯酚与制备金纳米颗粒的反应液混合、反应，得到所述抗菌纳米材料。
本发明提供的制备方法简单，在多种金纳米颗粒的制备方法中特异地选择了硼氢化钠还原法，实现一步法制备所述抗菌纳米材料，即在制备金纳米颗粒的同时实现氨基苯酚对其的修饰，制备方法简单快速，且有利于氨基苯酚与金纳米颗粒的结合，修饰程度高，所得纳米材料的抗菌效果也较好。
作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将氯金酸、氨基苯酚、pH调节剂、稳定剂和水混合，溶解后得到反应液；
(2)将硼氢化钠加入步骤(1)所述的反应液中反应，透析、灭菌后得到所述抗菌纳米材料。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述氯金酸的摩尔浓度为1-10mM，例如可以是2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM或9mM等。
优选地，所述氨基苯酚的摩尔浓度为1-10mM，例如可以是2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM或9mM等。
优选地，步骤(1)所述pH调节剂包括三乙胺。本发明中，所述pH调节剂用于调节溶液至弱碱性，以增强氨基苯酚的溶解性，也可以使用其他弱碱性的材料代替。
优选地，所述三乙胺的终浓度为0.1-0.15％，例如可以是0.105％、0.11％、0.115％、0.12％、0.125％、0.13％、0.135％、0.14％或0.145％等。
优选地，步骤(1)所述稳定剂包括吐温80。吐温80为一种表面活性剂，能够使合成的金纳米颗粒长期稳定，易于长期存储。
优选地，所述吐温80的终浓度为0.5-1g/L，例如可以是0.55g/L、0.6g/L、0.65g/L、0.7g/L、0.75g/L、0.8g/L、0.85g/L、0.9g/L或0.95g/L等。
优选地，步骤(1)所述溶解时的温度为-5～5℃，例如可以是-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃或4℃等，优选为0℃，即步骤(1)所述溶解可以在冰水浴中进行。示例性的，步骤(1)的具体操作为：先将三水氯金酸和氨基苯酚溶于水，所得三水氯金酸的摩尔浓度为1-10mM，氨基苯酚的摩尔浓度为1-10mM，再加入三乙胺和吐温80，所述三乙胺的终浓度为0.1-0.15％，吐温80的终浓度为0.5-1g/L，并在冰水浴条件下混合5-15min。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)所述硼氢化钠溶于水后在搅拌的条件下加入的步骤(1)所述的反应液中。
优选地，所述硼氢化钠溶于水后的浓度为2-5g/L，例如可以是2.2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L或4.8g/L等。
优选地，所述搅拌时的转速为800-1200r/min，例如可以是820r/min、850r/min、900r/min、950r/min、1000r/min、1050r/min、1100r/min、1150r/min或1180r/min等。
优选地，步骤(2)所述反应的时间为1.5-3h，例如可以是1.6h、1.8h、2h、2.2h、2.4h、2.5h、2.8h或2.9h等。
优选地，步骤(2)所述反应的温度为-5～5℃，例如可以是-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃或4℃等，优选为0℃，即步骤(2)所述反应可以在冰水浴中进行。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中采用透析袋进行透析。
优选地，所述透析袋的截留分子量为12-15kDa，例如可以是12.2kDa、12.5kDa、12.8kDa、13kDa、13.5kDa、13.8kDa、14kDa、14.5kDa或14.8kDa等。
优选地，步骤(2)所述透析的时间为20-30h，例如可以是21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h或29h等。
优选地，步骤(2)所述灭菌的方法为使用0.22μm的过滤器过滤灭菌。
作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将三水氯金酸和氨基苯酚溶于水，所得三水氯金酸的摩尔浓度为1-10mM，氨基苯酚的摩尔浓度为1-10mM，再加入三乙胺和吐温80，所述三乙胺的终浓度为0.1-0.15％，吐温80的终浓度为0.5-1g/L，并在-5-5℃中混合5-15min；
(2)将2-5g/L硼氢化钠溶解于水中，在转速为800-1200r/min的搅拌下逐滴添加至步骤(1)所述的反应液中，反应1.5-3h，再用透析袋透析20-30h，透析袋的截留分子量为12-15kDa，通过0.22微米过滤器过滤灭菌，得到所述抗菌纳米材料。
第三方面，如第一方面所述的抗菌纳米材料在制备抗菌组合物或抗菌药物中的应用，优选为制备治疗抗耐氨基糖苷抗生素细菌感染的药物。
本发明所述的抗菌纳米材料适用于多种感染、预防性治疗或公共场所消毒等情况，有望应用于制备医疗器械、安全化妆品、烧伤敷料，在水处理或食品保存等方面也可以使用，同时，还可以用来制备治疗腹腔感染的抗菌药物。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种抗菌纳米材料AP_Au NPs，是一种氨基苯酚修饰的金纳米颗粒，其中氨基苯酚是一种药物中间体；AP_Au NPs作为一种仿生抗生素，尺寸较小，为纳米级，且不使用有机溶剂体系，其表面带负电，具有优异的生物相容性，不会诱发细菌产生耐药性；与氨基糖苷类药物(如庆大霉素)等肾毒性药物相比，具有较高的生物安全性；
(2)本发明提供的抗菌纳米材料具有准确的抗菌机理，抗菌靶点明确，可以与16S核糖体RNA结合，阻断细菌蛋白的合成，具有广谱抗菌作用，尤其是对氨基糖苷类抗生素耐药的细菌效果优异，可针对耐氨基糖苷抗生素的多种细菌；而且所述抗菌纳米材料还可以破坏庆大霉素不能破坏的细菌细胞壁，针对多药耐药细菌效果显著；
(3)本发明提供的氨基苯酚修饰的金纳米颗粒的制备方法简单，合成的颗粒稳定易于储存，具有大规模生产的潜力和广泛的临床应用前景。
附图说明
图1为本发明设计合成氨基苯酚修饰的金纳米颗粒的抗菌原理示意图。
图2(a)为实施例1制备的抗菌纳米材料的形貌表征图(标尺50nm)。
图2(b)为实施例1制备的抗菌纳米材料的形貌表征图(标尺20nm)。
图3(a)为实施例2制备的抗菌纳米材料的形貌表征图(标尺50nm)。
图3(b)为实施例2制备的抗菌纳米材料的形貌表征图(标尺20nm)。
图4(a)为实施例3制备的抗菌纳米材料的形貌表征图(标尺50nm)。
图4(b)为实施例3制备的抗菌纳米材料的形貌表征图(标尺20nm)。
图5为实施例1-3提供的抗菌纳米材料的紫外-可见吸收光谱图。
图6(a)为不同浓度的2AP_Au NPs在560nm处的吸光度柱状图。
图6(b)为不同浓度的3AP_Au NPs在560nm处的吸光度柱状图。
图6(c)为不同浓度的4AP_Au NPs在560nm处的吸光度柱状图。
图7(a)为试验例1中样品处理S.a和MRSA后得到的扫描电子显微镜表征图(标尺1μm)。
图7(b)为试验例1中样品处理E.coli和MDR E.coli后得到的扫描电子显微镜表征图(标尺1μm)。
图7(c)为试验例1中样品处理S.a和MRSA并脱水后得到的透射电子显微镜表征图(标尺0.2μm)。
图7(d)为试验例1中样品处理E.coli和MDR E.coli并脱水后得到的透射电子显微镜表征图(标尺0.5μm)。
图8为试验例2中得到的凝胶电泳检测图。
图9(a)为试验例3中S.a感染下不同时间点小鼠的存活率曲线图。
图9(b)为试验例3中MRSA感染下不同时间点小鼠的存活率曲线图。
图9(c)为试验例3中E.coli感染下不同时间点小鼠的存活率曲线图。
图9(d)为试验例3中MDR E.coli感染下不同时间点小鼠的存活率曲线图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，所述三水氯金酸的分子量为393.83，购自国药集团化学试剂有限公司；扫描电子显微镜(SEM，SU8220，HITACHI，Japan)；透射电子显微镜(TEM，Tecnai G220S-TWIN，FEI company，USA)；透析袋(14kDa MW cut-off，Solarbio)；
本发明设计的原理图如图1所示：首先，制备抗菌纳米材料，氨基苯酚通过金-氨键修饰在金纳米颗粒表面，一个金纳米颗粒可以结合若干个氨基苯酚作为功能基团，并将所得金纳米颗粒注射到细菌感染的小鼠体内，金纳米颗粒通过表面的多羟基靶向细菌表面的多糖，破坏细菌细胞壁，增加细胞膜的通透性，氨基苯酚再与核糖体30S亚基内的16S rRNA结合，抑制蛋白质合成，进而杀灭细菌。
以下实施例中，提供三种抗菌纳米材料，包括邻氨基苯酚修饰的金纳米颗粒、间氨基苯酚修饰的金纳米颗粒和对氨基苯酚修饰的金纳米颗粒，并分别记为2AP_Au NPs、3AP_Au NPs和4AP_Au NPs。
实施例1
本实施例提供一种抗菌纳米材料，所述抗菌纳米材料为邻氨基苯酚修饰的金纳米颗粒(2AP_Au NPs)，其具体制备步骤如下：
(1)在圆底烧瓶中，将0.05mmol的三水氯金酸和0.05mmol的邻氨基苯酚(2AP，分子量109.13)加入10mL去离子水中。再加入50μL的三乙胺和30mg的吐温80，并在冰水浴中混合10min直至分子完全溶解。
(2)将6mg硼氢化钠溶解于2mL去离子水中，在1000r/min的剧烈搅拌下逐滴添加圆底烧瓶中，瓶中的溶液颜色立即由无色变成棕色，保持此反应条件再反应2h。
(3)将获得的邻氨基苯硼酸还原的金纳米颗粒用透析袋透析24h以除去未处理的化学物质。将纳米颗粒通过0.22μm过滤器(Millipore)过滤灭菌，得到所述邻氨基苯酚修饰的金纳米颗粒，并保存于4℃冰箱备用。
通过透射电子显微镜进行对2AP_Au NPs的形态进行表征，观察结果如图2(a)和图2(b)所示。其中，图2(a)为标尺为50nm时金纳米颗粒的形态表征图，图2(b)为图2(a)中框线部分的金纳米颗粒在标尺为20nm时的形态表征图。
实施例2
本实施例提供一种抗菌纳米材料，所述抗菌纳米材料为间氨基苯酚修饰的金纳米颗粒(3AP_Au NPs)，其具体制备步骤如下：
(1)在圆底烧瓶中，将0.05mmol的三水氯金酸和0.05mmol的间氨基苯酚(3AP，分子量109.13)加入10mL去离子水中。再加入50μL的三乙胺和30mg的吐温80，并在冰水浴中混合10min直至分子完全溶解。
步骤(2)和(3)与实施例1中制备邻氨基苯酚修饰的金纳米颗粒的步骤相同。
通过透射电子显微镜进行对3AP_Au NPs的形态进行表征，观察结果如图3(a)和图3(b)所示。其中，图3(a)为标尺为50nm时金纳米颗粒的形态表征图，图3(b)为图3(a)中框线部分的金纳米颗粒在标尺为20nm时的形态表征图。
实施例3
本实施例提供一种抗菌纳米材料，所述抗菌纳米材料为对氨基苯酚修饰的金纳米颗粒(4AP_Au NPs)，其具体制备步骤如下：
(1)在圆底烧瓶中，将0.05mmol的三水氯金酸和0.05mmol的对氨基苯酚(4AP，分子量109.13)加入10mL去离子水中。再加入50μL的三乙胺和30mg的吐温80，并在冰水浴中混合10min直至分子完全溶解。
步骤(2)和(3)与实施例1中制备邻氨基苯酚修饰的金纳米颗粒的步骤相同。
通过透射电子显微镜进行对4AP_Au NPs的形态进行表征，观察结果如图4(a)和图4(b)所示。其中，图4(a)为标尺为50nm时金纳米颗粒的形态表征图，图4(b)为图4(a)中框线部分的金纳米颗粒在标尺为20nm时的形态表征图。
表征及性能测试
以下对实施例1-3提供的三种抗菌纳米材料进行光谱表征以及性能测试。
1、光谱表征
实施例1-3提供的三种抗菌纳米材料的紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)测试结果如图5所示。由图可知，三种抗菌纳米材料在540nm左右出现明显峰，且3AP_Au NPs的光密度最高。
2、抗菌性能测试
对实施例1-3提供的抗菌纳米材料的抗菌性能进行表征。
选用常见的敏感株细菌及临床分离的多药耐药细菌，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌各6种，在液体细菌培养基中培养。其中，革兰氏阴性菌包括大肠杆菌(E.coli)、多药耐药大肠杆菌(MDR E.coli)、鲍曼不动杆菌(A.b)、多药耐药鲍曼不动杆菌(MDR A.b)、铜绿假单胞菌(P.a)和多药耐药铜绿假单胞菌(MDR P.a)六种；革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌(S.a)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表面葡萄球菌(S.e)、多药耐药表面葡萄球菌(MDR S.e)、粪肠球菌(E.f)和多药耐药粪肠球菌(MDR E.f)六种。
将金纳米颗粒稀释2-128倍后分别加入接有细菌的培养基中，细菌的接种浓度为1×104CFU/mL，在37℃培养24h后，分别测试细菌悬浮液浊度在600nm处(OD600)的光密度来分析金纳米颗粒的最低抑菌浓度(μg/mL)，并与庆大霉素(Gen)进行对比，结果如下表1所示：
表1
Figure BDA0002518288260000121
由上表可知，抗菌纳米材料对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有较好的抑制效果，尤其是对于MDR E.coli、MDR A.b、MDR P.a、MRSA、MDR S.e和MDR E.f，庆大霉素的最低抑菌浓度明显大于64μg/mL，而本发明中提供的抗菌纳米材料的最低抑菌浓度小于等8μg/mL。
3、生物安全性表征
对实施例1-3提供的抗菌纳米材料的生物安全性进行表征。
为了验证AP_Au NPs潜在的临床应用，需要对其血液相容性进行测试，将新鲜血液以1500r/min离心15min收集红细胞，再将实施例1-3提供的三种AP_Au NPs在生理盐水中稀释至不同浓度，并以生理盐水为阴性对照，水为阳性对照，37℃孵育4h后，测试在560nm处(OD560)的吸光度，分析金纳米颗粒的生物安全性。
结果如图6(a)、图6(b)和图6(c)所示，由三种不同纳米颗粒的吸光度柱状图可以看出，4～128μg/mL的纳米颗粒的吸光度略高于生理盐水，且随着浓度的升高而升高，但是远远小于水的吸光度。
试验例1
本试验例通过检测细菌细胞壁的通透性和形态变化来探讨4AP_Au NPs的抗菌机制。
将4AP_Au NPs与不同种类的细菌(包括S.a、MRSA、E.coli、MDR E.coli)在37℃下孵育4h，并将细菌样品用2.5％戊二醛和乙醇脱水固定，进行扫描电子显微镜表征，结果如图7(a)和图7(b)所示，其中control表示空白对照组，由图可知，经过4AP_Au NPs孵育的细菌，形态明显发生变化；
将脱水后的样品切成超薄薄片，用2％乙酸铀酰和0.2％柠檬酸铅染色，用于透射电子显微镜表征，结果如图7(c)和图7(d)所示，其中control表示空白对照组，由图可知，经过4AP_Au NPs孵育的细菌，细胞壁被破坏，细菌无法维持原有形态并发生溶解。
试验例2
本试验例通过与细菌16S核糖RNA结合实验验证4AP_Au NPs的抗菌靶点。
通过凝胶电泳检测4AP_Au NPs与16S核糖RNA验证两者的结合，结果如图8所示，其第1泳道为DNA marker，第2泳道为空白对照，第3泳道为16S rRNA，第4泳道庆大霉素与16SrRNA共孵育，第5泳道为未经修饰的Au NPs与16S rRNA共孵育，第6泳道为4AP_Au NPs与16SrRNA共孵育。
其中，在第3泳道至第6泳道均在图片下方呈现出一条微弱的条带，条带的位置变化有效的验证了4AP_Au NPs抗菌靶点为细菌16S核糖RNA。
试验例3
通过构建不同细菌感染的小鼠腹腔感染模型验证4AP_Au NPs的体内治疗效果。
实验小鼠分为4组，每组27只，分别感染大肠杆菌、多药耐药大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，同时以庆大霉素和生理盐水作为对照，使用剂量为10mg/kg，记录不同时间点小鼠的存活状态，结果如图9(a)～图9(d)所示。
其中，图9(a)为S.a感染下分别使用4AP_Au NPs、Gen和生理盐水(图中为Control组)后的小鼠在0-72h时的存活率；使用4AP_Au NPs和Gen的小鼠存活率均为100％，而Control组小鼠在12h时已经全部死亡。
图9(b)为MRSA感染下分别使用4AP_Au NPs、Gen和生理盐水后的小鼠在0-72h时的存活率；使用4AP_Au NPs的小鼠存活率为100％，使用Gen的小鼠在24h时全部死亡，使用生理盐水的小鼠在12h时全部死亡。
图9(c)为E.coli感染下分别使用4AP_Au NPs、Gen和生理盐水后的小鼠在0-72h时的存活率；使用4AP_Au NPs和Gen的小鼠存活率为100％，使用生理盐水的小鼠在12h时全部死亡。
图9(d)为MDR E.coli感染下分别使用4AP_Au NPs、Gen和生理盐水后的小鼠在0-72h时的存活率；。使用4AP_Au NPs的小鼠存活率为100％，使用Gen的小鼠在24h时全部死亡，使用生理盐水的小鼠在12h时全部死亡。
本发明还使用小鼠腹腔感染模型验证了2AP_Au NPs和3AP_Au NPs体内治疗效果，同样的，2AP_Au NPs和3AP_Au NPs也具有较好的抗菌效果，出于篇幅以及简明的考虑，此处不再赘述。
综上所述，本发明提供的抗菌纳米材料AP_Au NPs可以与16S核糖体RNA结合，阻断细菌蛋白的合成，具有广谱抗菌作用，尤其是对氨基糖苷类抗生素耐药的细菌效果优异。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种抗菌纳米材料，其特征在于，所述抗菌纳米材料为氨基苯酚修饰的金纳米颗粒，所述氨基苯酚通过金-氨键修饰在所述金纳米颗粒表面。
2.根据权利要求1所述的抗菌纳米材料，其特征在于，所述氨基苯酚包括邻氨基苯酚、对氨基苯酚或间氨基苯酚中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述金纳米颗粒采用硼氢化钠还原法制备得到；
优选地，所述抗菌纳米材料的粒径为2～8nm。
3.一种如权利要求1或2所述的抗菌纳米材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将氨基苯酚与制备金纳米颗粒的反应液混合、反应，得到所述抗菌纳米材料。
4.根据权利要求3所述的抗菌纳米材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将氯金酸、氨基苯酚、pH调节剂、稳定剂和水混合，溶解后得到反应液；
(2)将硼氢化钠加入步骤(1)所述的反应液中反应，透析、灭菌后得到所述抗菌纳米材料。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述氯金酸的摩尔浓度为1-10mM；
优选地，步骤(1)所述氨基苯酚的摩尔浓度为1-10mM；
优选地，步骤(1)所述pH调节剂包括三乙胺；
优选地，所述三乙胺的终浓度为0.1-0.15％；
优选地，步骤(1)所述稳定剂包括吐温80；
优选地，步骤(1)所述吐温80的终浓度为0.5-1g/L；
优选地，步骤(1)所述溶解时的温度为-5～5℃，优选为0℃。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述硼氢化钠溶于水后在搅拌的条件下加入的步骤(1)所述的反应液中；
优选地，所述硼氢化钠溶于水后的浓度为2-5g/L；
优选地，所述搅拌时的转速为800-1200r/min。
7.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述反应的时间为1.5-3h；
优选地，步骤(2)所述反应的温度为-5～5℃，优选为0℃。
8.根据权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中采用透析袋进行透析；
优选地，所述透析袋的截留分子量为12-15kDa；
优选地，步骤(2)所述透析的时间为20-30h；
优选地，步骤(2)所述灭菌的方法为使用0.22μm的过滤器过滤灭菌。
9.根据权利要求4-8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将三水氯金酸和氨基苯酚溶于水，所得三水氯金酸的摩尔浓度为1-10mM，氨基苯酚的摩尔浓度为1-10mM，再加入三乙胺和吐温80，所述三乙胺的终浓度为0.1-0.15％，吐温80的终浓度为0.5-1g/L，并在-5-5℃中混合5-15min；
(2)将2-5g/L硼氢化钠溶解于水中，在转速为800-1200r/min的搅拌下逐滴添加至步骤(1)所述的反应液中，反应1.5-3h，再用透析袋透析20-30h，透析袋的截留分子量为12-15kDa，通过0.22微米过滤器过滤灭菌，得到所述抗菌纳米材料。
10.如权利要求1或2所述的抗菌纳米材料在制备抗菌组合物或抗菌药物中的应用，优选为在制备治疗抗氨基糖苷抗生素细菌感染的药物中的应用。
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