CN113875751B - 一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的制备方法与应用 - Google Patents

一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113875751B
CN113875751B CN202110943806.4A CN202110943806A CN113875751B CN 113875751 B CN113875751 B CN 113875751B CN 202110943806 A CN202110943806 A CN 202110943806A CN 113875751 B CN113875751 B CN 113875751B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactoferrin
solution
antibacterial
gold
fiber aggregate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110943806.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113875751A (zh
Inventor
阮奇珺
周漪波
何伊颖
黄启红
方舒婷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute Of Testing And Analysis Guangdong Academy Of Sciences Guangzhou Analysis And Testing Center China
Original Assignee
Institute Of Testing And Analysis Guangdong Academy Of Sciences Guangzhou Analysis And Testing Center China
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute Of Testing And Analysis Guangdong Academy Of Sciences Guangzhou Analysis And Testing Center China filed Critical Institute Of Testing And Analysis Guangdong Academy Of Sciences Guangzhou Analysis And Testing Center China
Priority to CN202110943806.4A priority Critical patent/CN113875751B/zh
Publication of CN113875751A publication Critical patent/CN113875751A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113875751B publication Critical patent/CN113875751B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing solids as carriers or diluents
    • A01N25/10—Macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N59/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing elements or inorganic compounds
    • A01N59/16—Heavy metals; Compounds thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)

Abstract

本发明公开了一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的制备方法与应用，所述制备方法包括：(1)制备脱铁乳铁蛋白溶液；(2)往脱铁乳铁蛋白溶液中加入四氯金酸，并调节溶液的pH至碱性，之后水浴加热，得到以脱铁乳铁蛋白为模板原位合成的金纳米簇；(3)将原位合成有金纳米簇的脱铁乳铁蛋白调节pH至酸性，之后水浴加热，得到负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体。本发明采用乳铁蛋白作为模板合成金纳米簇，并将负载金纳米簇的乳铁蛋白转化为纤维聚集体，利用纤维聚集体包裹细菌及能够与细胞膜相互作用的特性，实现金纳米簇和纤维聚集体的协同抗菌作用,所制得的材料在食品直接接触抗菌材料领域具有广阔应用前景。

Description

一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及金纳米簇技术领域，特别是涉及一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的制备方法与应用。
背景技术
微生物是引起食物腐败变质的主要因素，在食物直接接触材料中添加抗菌材料可以有效延缓食物腐败，减少致病菌引起的食源性疾病。这不仅要求抗菌材料能抑制微生物生长，而且要求抗菌材料具有较高的生物安全性，能够保证不易引起耐药性。人们对于新型抗菌材料的需求日益增加，近来纳米材料研究报道较多，但是如同银、铜及其它金属氧化物等纳米颗粒，尽管具备一定的抗菌特性，但对于人体有一定的毒性，不适宜制成食品接触用抗菌材料。
金是一种惰性贵金属，性质稳定，不易分解为离子，相对安全性更高。金纳米簇是由几个到几十个金原子组成的团簇结构。由于金纳米簇的量子尺寸效应，其失去传统金纳米颗粒的局部表面等离子体共振特性，但研究发现金纳米簇具有氧化酶和过氧化物酶催化活性，金纳米簇进入细胞后诱导ROS产出增加，因此金纳米簇具备一定的抗菌特性。公开号为CN111658758A的中国发明专利文献公开了一种抗菌金纳米簇及其制备方法与应用，采用一种抗菌多肽制备具有抗菌功能的金纳米簇。但是该技术方案通过化学合成产生的抗菌多肽在应用到食品接触材料中时，从经济性和安全性方面来看都不具备优势。公开号为CN107971481A的中国发明专利文献公开了具有抗菌活性的金纳米簇及其制备方法和应用，金纳米簇由巯基配体修饰，包括巯基修饰季胺盐、巯基修饰穿膜肽和巯基嘧啶。但是巯基配体本身有一定毒性的，限制了其在食品接触材料中的应用。因此亟待开发一种配体安全性高、满足食品接触级别的新型金纳米簇抗菌材料。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的制备方法与应用，采用乳铁蛋白作为模板原位合成金纳米簇，并将负载金纳米簇的乳铁蛋白转化为纤维聚集体，利用纤维聚集体包裹细菌及与细胞膜相互作用的特性，实现金纳米簇和纤维聚集体的协同抗菌作用，在食品直接接触抗菌材料领域具有广阔应用前景。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备脱铁乳铁蛋白溶液；
(2)往步骤(1)制得的脱铁乳铁蛋白溶液中加入四氯金酸，并调节溶液的pH至碱性，之后水浴加热，得到以脱铁乳铁蛋白作为模板的原位合成的金纳米簇；
(3)将步骤(2)制得的金纳米簇进行透析，透析完成后调节溶液的 pH至酸性，之后水浴加热，得到负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤(1)包括：称取0.8g天然乳铁蛋白于玻璃瓶中，加入10mL蒸馏水，充分搅拌溶解；将充分搅拌溶解后的乳铁蛋白溶液注入透析袋中，并将透析袋置于柠檬酸溶液中，在室温下透析2～3d，当透析袋中的溶液由红褐色变为无色时，将柠檬酸溶液更换为蒸馏水，并调节乳铁蛋白溶液的pH至中性；最后利用蒸馏水将透析后的乳铁蛋白溶液进行稀释，使其终浓度为40mg/mL，得到脱铁后的乳铁蛋白溶液。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤(2)包括：各取2.285mL步骤(1)制得的脱铁乳铁蛋白溶液置于3个玻璃瓶中，分别在各玻璃瓶中加入2.285mL、1.425mL和0.571mL的HAuCl4溶液，之后各加入NaOH 溶液调节pH至12.0，加入蒸馏水使每个玻璃瓶中溶液的终体积为 4.57mL，最后充分混匀，将各玻璃瓶在37℃水浴中加热24～28h，分别制得金含量浓度依次为1mM、2.5mM、4mM的金纳米簇。
作为上述方案的进一步改进，所述HAuCl4溶液的浓度为8mM，所述NaOH溶液的浓度为1M。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤(3)包括：将步骤(2)制得的金纳米簇注入透析袋中，并将透析袋置于蒸馏水中，在室温下透析至中性，透析完成后用HCl调节溶液的pH至2.0，之后将溶液充分混匀，在90℃水浴中加热24h，得到的产物即为负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体。
发明人发现许多蛋白质经一定条件处理都能形成富含β-折叠结构的淀粉样蛋白纤维，同时蛋白质作为金纳米簇的载体具有良好的生物降解性。天然的乳铁蛋白本身是一种生物安全性较高的蛋白质，可以被人体摄入作为营养补充物质。乳铁蛋白柔性结构及其所含有的丰富功能性氨基酸可作为金纳米簇还原的良好模板。因此本发明采用乳铁蛋白作为模板原位合成金纳米簇，并将负载金纳米簇的乳铁蛋白转化为纤维聚集体，利用纤维聚集体包裹细菌及能够与细胞膜相互作用的特性，充分发挥金纳米簇和纤维聚集体的协同抗菌作用。
本发明第二方面在于提供一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体，所述抗菌乳铁蛋白纤维聚集体由如上所述的制备方法制备得到。
本发明第三方面在于提供如上所述的负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体在抑制金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒沙门氏菌中的应用。
本发明第四方面在于提供如上所述的负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体在促进细菌产生活性氧中的应用。
本发明第五方面在于提供如上所述的负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体在制备食品直接接触抗菌材料中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明利用食品级原料脱铁乳铁蛋白作为模板，原位还原合成金纳米簇，再诱导负载金纳米簇的乳铁蛋白组装成富含β-折叠结构的纤维聚集体，利用纤维聚集体包裹细菌及与细胞膜相互作用的特性，充分发挥金纳米簇和纤维聚集体的协同抗菌作用，所得产物可用于制造食品级抗菌材料，安全性较高，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1a是本发明实施例4中乳铁蛋白，不同金含量的Au@apo-lactofe rrin在370nm激发波长下产生的荧光光谱图；
图1b是本发明实施例4中不同pH的Au@apo-lactoferrin，Au@Fibri l在370nm激发波长下产生的荧光光谱图(金含量为2.5mM的Au@apo-lac toferrin和Au@Fibril在370nm激发波长下所产生的荧光光谱图)；
图1c是本发明实施例4中Au@apo-lactoferrin，Au@Fibril在365nm 紫外灯照射下的荧光照片(金含量为2.5mM的Au@apo-lactoferrin和 Au@Fibril在365nm紫外灯照射下产生的荧光图)；
图2是本发明实施例5中乳铁蛋白纤维与Au@Fibril的刚果红染色差减光谱图；
图3a是本发明实施例5中乳铁蛋白纤维的圆二色光谱图；
图3b是本发明实施例5中金含量为2.5mM的Au@apo-lactoferrin以及加热形成的Au@Fibril的圆二色光谱图(金含量为2.5mM的 Au@apo-lactoferrin和Au@Fibril的圆二色光谱图)；
图3c是本发明实施例5中乳铁蛋白纤维与不同金含量的Au@Fibril 的圆二色光谱图；
图4a-d依次是本发明实施例5中乳铁蛋白溶液、乳铁蛋白纤维、 Au@apo-lactoferrin以及加热形成的Au@Fibril的TEM图片；
图5是本发明实施例5中乳铁蛋白、纯乳铁蛋白纤维以及Au@Fibril 调整为pH7.0后测定的Zeta电位值统计图；
图6a-c依次是本发明实施例6中对照组、Au@apo-lactoferri实验组、Au@Fibril实验组的金黄色葡萄球菌菌落计数琼脂平板图；
图6d-f依次是本发明实施例6中对照组、Au@apo-lactoferri实验组、Au@Fibril实验组的乙型副伤寒沙门氏菌菌落计数琼脂平板图；
图7a、b分别是本发明实施例6中不同浓度的Au@apo-lactoferrin 和Au@Fibri样品对于金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒沙门氏菌的抑制效果统计图；
图8是本发明实施例6中0.0625mg/mL浓度的Au@apo-lactoferrin 和Au@Fibril样品对于金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒沙门氏菌的时间- 杀菌曲线；
图9a-b是本发明实施例7中金黄色葡萄球菌未经过Au@Fibril作用以及经过Au@Fibril作用后的SEM图片；
图9c-d是本发明实施例7中乙型副伤寒沙门氏菌未经过Au@Fibril 作用以及经过Au@Fibril作用后的SEM图片；
图10a是本发明实施例8中经Au@Fibril(金含量：2.5mM)处理后的金黄色葡萄球菌产生的活性氧示意图；
图10b是本发明实施例8中经Au@Fibril(金含量：2.5mM)处理后的乙型副伤寒沙门氏菌产生的活性氧示意图；
图10c是本发明实施例8中金黄色葡萄球菌产生的活性氧相对荧光强度统计图；
图10d是本发明实施例8中乙型副伤寒沙门氏菌产生的活性氧相对荧光强度统计图；
图11是本发明实施例9中经Au@Fibril处理后的caco-2细胞存活率统计图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
以下如无特殊说明，单位M代表mol/L，mM代表mmol/L，nM代表 nmol/L，μM代表μmol/L。
实施例1：
脱铁乳铁蛋白(apo-lactoferrin)的制备
称取0.8g天然乳铁蛋白于玻璃瓶中，加入10mL蒸馏水，充分搅拌溶解。将搅拌混匀后的乳铁蛋白溶液(浓度：80mg/mL)注入透析袋中，并将该透析袋置于柠檬酸溶液中，在室温下透析2d，当透析袋中的溶液由红褐色变为无色即表示透析完成，铁离子已被除去，此时将柠檬酸溶液更换成蒸馏水，从而除去多余的柠檬酸，并将乳铁蛋白溶液的pH调节至中性。最后将透析后的乳铁蛋白溶液利用蒸馏水进行稀释，使其终浓度为40mg/mL。
实施例2：
以脱铁乳铁蛋白(apo-lactoferrin)为模板原位合成金纳米簇 (Au@apo-lactoferrin)
各取2.285mL实施例1制得的乳铁蛋白溶液(浓度：40mg/mL)置于3个玻璃瓶中，往各玻璃瓶中分别加入2.285mL、1.425mL和0.571 25mL的HAuCl4溶液(浓度：8mM)，利用NaOH(浓度：1mM)调节溶液的pH至12.0，并加入蒸馏水使得每个玻璃瓶中溶液的终体积为4.57mL，充分混匀，之后将各玻璃瓶在37℃水浴中加热24h，分别制得不同金含量浓度(依次为：1mM、2.5mM、4mM)的金纳米簇(Au@apo-lacto ferrin)溶液。
实施例3：
抗菌乳铁蛋白纤维聚集体(Au@Fibril)的制备
将实施例2制得的金纳米簇(Au@apo-lactoferrin)溶液注入透析袋中，将透析袋置于5L蒸馏水中，在室温下透析至中性。透析完成后用HCl调节溶液的pH至2.0，之后充分混匀，在90℃水浴中加热24h，所得产物即为负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体(Au@Fibril)。
实施例4：
金纳米簇的性质表征
采用荧光分光光度计测定金纳米簇在370nm激发下的荧光发射光谱。将实施例1的脱铁乳铁蛋白溶液、实施例2的金纳米簇 (Au@apo-lactoferrin)溶液、实施例3的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体 (Au@Fibril)溶液进行100倍稀释，稀释后各取200μL置于微量荧光比色皿中，设置激发波长为370nm，扫描速度为1500nm/min，响应时间为0.8s，波长范围为370～800nm。
图1a显示的是乳铁蛋白以及不同金含量的Au@apo-lactoferrin 在370nm激发波长下产生的荧光光谱图；图1b显示的是不同pH的 Au@apo-lactoferrin和Au@Fibril在370nm激发波长下产生的荧光光谱图。从图1a、b可以看出，三种不同金含量的Au@apo-lactoferrin 在630nm处具有发射峰，说明金纳米簇已形成；Au@apo-lactoferrin 经酸热处理形成淀粉样纤维聚集体Au@Fibril后，发射波长发生蓝移。图1c显示Au@apo-lactoferrin和Au@Fibril在365nm紫外灯照射下荧光照片。从图1c可以看出，pH12.0 Au@apo-lactoferrin(图1c中1 号样品)、pH7.0 Au@apo-lactoferrin(图1c中2号样品)均呈现出粉红色，Au@Fibril(图1c中3号样品)呈现出橙色。
实施例5：
刚果红染色、圆二色光谱、透射电镜及电位测定用以表征抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的结构
刚果红染色：将刚果红母液(浓度：10mM)稀释50倍制成工作液，取40μL抗菌乳铁蛋白纤维聚集体(Au@Fibril)溶液样品加入4mL工作液混合均匀，静置30min。使用紫外-可见光光度计进行波长扫描，扫描范围为400nm～600nm。未添加样品的刚果红工作液作为空白进行扣除，可以得到差减紫外光谱。
圆二色光谱：将抗菌乳铁蛋白纤维聚集体(Au@Fibril)溶液样品稀释成一定浓度的溶液，使用圆二色光谱仪进行波长扫描，于室温下测定，带宽1.0nm，扫描测定波长范围为190～250nm，扫描速度为50nm/min。
图2显示的是乳铁蛋白纤维与Au@Fibril的刚果红染色差减光谱图；从图2可以看出，刚果红差减光谱在530nm范围内出现最大吸收峰，说明纯乳铁蛋白纤维和Au@Fibril的β-折叠结构与刚果红染料发生结合。Au@Fibril的峰位值随着金含量的增加而减少，说明β-折叠结构减少，金纳米簇影响纤维β-折叠结构的形成。
图3a是乳铁蛋白纤维的圆二色光谱图；图3b是金含量为2.5mM 的Au@apo-lactoferrin以及加热形成的Au@Fibril的圆二色光谱图；图3c是乳铁蛋白纤维与不同金含量的Au@Fibril的圆二色光谱图。从图3a-c可以看出，加热时间和金含量对于纤维形成有影响。随着加热时间延长，谱图负峰向低波长移动，负峰振幅明显增加，说明α-螺旋结构减少，β-折叠结构增加，所以形成了富含β-折叠的淀粉样纤维结构。而且更多的原位金纳米簇使Au@Fibril的β-折叠结构的形成变缓。
图4a-d依次是乳铁蛋白溶液、乳铁蛋白纤维、Au@apo-lactoferrin 以及加热形成的Au@Fibril的TEM图片。从图4a-d可以看出，加热前的乳铁蛋白的形态是球状，而加热后形成了直径约为50nm纤维聚集体。 Au@apo-lactoferrin在加热前为纳米团簇形态，其尺寸较小。经过24h， 90℃的加热后可以形成纤维形态。
图5是乳铁蛋白、纯乳铁蛋白纤维以及Au@Fibril调整为pH7.0 后测定的Zeta电位值统计图。从图5可以看出，除了Au@Fibril(金含量：4mM),其它样品均为带正电粒子，其中Au@Fibril(金含量：2.5mM) 所携带的正电粒子最多，其电位值为6.32mV。带正电荷有利于纤维与细菌的相互作用。
实施例6：
抗菌乳铁蛋白纤维聚集体(Au@Fibril)的抗菌能力测定
取金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒沙门氏菌，分别加入其对应的液体培养基中，于摇床37℃进行培育，培育24h后，于多个离心管中各加入2mL培养液，用无菌生理盐水洗涤2次，并复溶于无菌生理盐水中。利用NaOH(浓度：1M)将Au@Fibril溶液和Au@apo-lactoferrin 溶液的pH调节至中性，并进行梯度稀释(8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、 1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125 mg/mL、0.015625mg/mL)，将金黄色葡萄球菌液加入稀释后的Au@Fibr il溶液和Au@apo-lactoferrin溶液作为实验组，并同时设置空白对照组；将乙型副伤寒沙门氏菌液加入稀释后的Au@Fibril溶液和Au@apo -lactoferrin溶液作为实验组，并同时设置空白对照组；控制溶液中最终的菌浓度均为107CFU/mL。将含有菌液的各样品于37℃培养箱中进行孵育，于2h、6h、24h取出样品，利用生理盐水稀释至菌浓度为1 06CFU/mL和105CFU/mL，涂布于营养琼脂上。将涂布好的平板放置37℃烘箱中培养24h后进行菌落计数。
图6a-c依次是对照组、Au@apo-lactoferri实验组、Au@Fibril 实验组的金黄色葡萄球菌菌落计数琼脂平板图；图6d-f依次是对照组、 Au@apo-lactoferri实验组、Au@Fibril实验组的乙型副伤寒沙门氏菌菌落计数琼脂平板图。从图6a-f可以看出，经过0.0625mg/mL的 Au@Fibril(金含量：2.5mM)和Au@apo-lactoferrin(金含量：2.5mM) 处理后，可以观察到相对于对照组平板菌落数有明显减少，并且 Au@Fibril效果更为明显。对比Au@Fibril对两种细菌的抑菌效果，处理金黄色葡萄球菌的效果优于处理乙型副伤寒沙门氏菌。
图7a、b分别是不同浓度的Au@apo-lactoferrin和Au@Fibri样品对于金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒沙门氏菌的抑制效果统计图。从图7a、b可以看出，经过Au@Fibril处理的菌落数明显低于经过Au@a po-lactoferrin处理的菌落数，约有10倍差距；当样品浓度接近于0. 0625mg/mL时，抑菌效果较好；并且无论是Au@apo-lactoferrin还是 Au@Fibril，金含量为2.5mM的样品抑菌能力相较于其它样品较强。其中，Au@Fibril对于金黄色葡萄球菌效果更为显著，经过Au@Fibril(金含量：2.5mM)的金黄色葡萄球菌菌落数下降三个数量级，而对于乙型副伤寒沙门氏菌仅下降两个数量级。
图8是0.0625mg/mL浓度的Au@apo-lactoferrin和Au@Fibril样品对于金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒沙门氏菌的时间-杀菌曲线。从图 8可以看出，随着处理时间的增加，菌落数出现明显的减少；在2h时 Au@Fibril和Au@apo-lactoferrin抑菌效果差别不大，但随着时间的增强，Au@Fibril抑菌效果优于Au@apo-lactoferrin，且对于金黄色葡萄球菌效果更明显，下降了三个数量级。
实施例7：
扫描电子显微镜观察细菌形态
Au@Fibril处理后的乙型副伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，通过离心后回收细菌，用PBS缓冲溶液清洗2次。加入戊二醛固定细菌。梯度乙醇进行脱水，最后再用100％酒精进行重悬，取2μL所得悬液滴于云母片上观察。
图9a-b是金黄色葡萄球菌未经过Au@Fibril作用以及经过 Au@Fibril作用后的TEM图片；图9c-d是乙型副伤寒沙门氏菌未经过 Au@Fibril作用以及经过Au@Fibril作用后的TEM图片。从图9a-d可以看出，经过Au@Fibril处理24h后，金黄色葡萄球菌的形态与未经过任何处理的金黄色葡萄球菌具有明显的差异，后者细胞结构完整，具有饱满的球形形态，表面光滑。而前者经过处理后大部分菌体形态发生变化，形态不再是均匀球形，表面有缺口，菌体外有碎片和丝物体，表明经过Au@Fibril的处理后，纤维会黏附在菌体上，且Au@Fibril 可以破坏金黄色葡萄球菌的细胞膜，引起细胞膜的通透性增加，使得内容物流出；而乙型副伤寒沙门氏菌同样经过Au@Fibril处理后，纤维也会附着在菌落上，且细胞表面有明显突起且部分菌体表面有缺口。因此表明Au@Fibril对于乙型副伤寒沙门氏菌的细胞膜也有一定的破坏作用。扫描电子显微镜的结果显示Au@Fibril可以通过破坏细胞膜的方式达到杀菌效果。
实施例8：
荧光显微镜检测金纳米簇诱导的活性氧(ROS)
利用活性氧检测试剂盒(含有DCFH-DA荧光探针)对于细胞内产生活性氧进行检测。稀释乙型副伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌原菌液，使其浓度均为108CFU/mL，通过离心后回收细菌，并用PBS缓冲溶液清洗2次。除去上清后加入稀释好的DCFH-DA，37℃下孵育20min。洗涤三次后加入不同浓度的Au@Fibril和活性氧阳性对照，通过荧光显微镜进行观察，激发波长为488nm，发射波长为522nm。
图10a是经Au@Fibril(金含量：2.5mM)处理后的金黄色葡萄球菌产生的活性氧示意图；图10b是经Au@Fibril(金含量：2.5mM)处理后的乙型副伤寒沙门氏菌产生的活性氧示意图；图10c是金黄色葡萄球菌产生的活性氧相对荧光强度统计图；图10d是乙型副伤寒沙门氏菌产生的活性氧相对荧光强度统计图。从图10a-d可以看出，经过 Au@Fibril处理后的细菌产生大量活性氧，因此与探针结合后可以发出明亮绿光。相比于纯乳铁蛋白纤维作用的细菌产生ROS量仅为16％，而经过Au@Fibril作用的细菌产生ROS量得到了大幅度的提高，其中 Au@Fibril(金含量：2.5mM)的效果最佳。诱导细菌产生大量ROS是 Au@Fibril的主要抗菌机制。
实施例9：
细胞毒性检测
采用MTT细胞增殖检测试剂盒测定抗菌材料的细胞毒性。使用96 孔板进行检测，每个孔中加入10μL 5000个细胞，并加入10μL样品进行刺激，在培养箱中孵育24h。然后每孔加入10μLMTT溶液，使得每孔中其浓度为0.5mg/mL。混匀后置于含有5％CO2，37℃的培养箱中孵育4h。加入100μLFormazan溶解液，震荡10min后，利用酶标仪于570nm测定其吸光度。
图11是经Au@Fibril处理后的caco-2细胞存活率统计图。从图 11可以看出，纯乳铁蛋白纤维作用的细胞存活率较为稳定，数值维持在90％左右，说明其基本无细胞毒性；对于Au@Fibril，细胞存活率会随着浓度的增加而出现降低，但是经Au@Fibril(金含量：1mM)、Au@Fibril(金含量：2.5mM)处理后的细胞存活率都达到80％以上，而且Au@Fibril(金含量：4mM)在高浓度时细胞存活率在50％以上，说明Au@Fibril具有较好抗菌效果的同时其对细胞的毒性也较低。
本发明以脱铁乳铁蛋白作为模板原位还原氯金酸，调节氯金酸添加量，获取三种不同金含量的金纳米簇(Au@apo-lactoferrin)。 Au@apo-lactoferrin在紫外激发下于630nm处发射荧光。经pH 2.0， 90℃加热后Au@apo-lactoferrin形成带正电的纤维聚集体Au@Fibril。将Au@Fibril作用于金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒沙门氏菌，可以明显看到Au@Fibril对于两种细菌均有一定程度的抑制作用，抗菌率可达到90％。分析其抗菌机理，应为Au@Fibril吸附在细胞膜上，造成细胞膜损伤，并诱导细菌产生大量的活性氧，从而达到抗菌的目的。 Au@Fibril对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌也均有一定的抗菌效果，且革兰氏阳性菌对于Au@Fibril较为敏感；同时Au@Fibril的细胞毒性较小。本发明采用食品级的原料合成金纳米簇，并将负载金纳米簇的乳铁蛋白转化为纤维聚集体，利用纤维聚集体包裹细菌及与细胞膜相互作用的特性，充分发挥金纳米簇和纤维聚集体的协同抗菌作用，具有广阔的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备脱铁乳铁蛋白溶液：称取0.8g天然乳铁蛋白于玻璃瓶中，加入10mL蒸馏水，充分搅拌溶解；将充分搅拌溶解后的乳铁蛋白溶液注入透析袋中，并将透析袋置于柠檬酸溶液中，在室温下透析2～3d，当透析袋中的溶液由红褐色变为无色时，将柠檬酸溶液更换为蒸馏水，并调节乳铁蛋白溶液的pH至中性；最后利用蒸馏水将透析后的乳铁蛋白溶液进行稀释，使其终浓度为40mg/mL，得到脱铁后的乳铁蛋白溶液；
(2) 各取2.285mL步骤(1)制得的脱铁乳铁蛋白溶液置于3个玻璃瓶中，分别在各玻璃瓶中加入2.285mL、1.425mL和0.571mL 8mM的HAuCl4溶液，之后各加入 1M NaOH溶液调节pH至12.0，加入蒸馏水使每个玻璃瓶中溶液的终体积为4.57mL，最后充分混匀，将各玻璃瓶在37℃水浴中加热24～28h，分别制得金含量浓度依次为1mM、2.5mM、4mM的金纳米簇；
(3) 将步骤(2)制得的金纳米簇注入透析袋中，并将透析袋置于蒸馏水中，在室温下透析至中性，透析完成后用HCl调节溶液的pH至2.0，之后将溶液充分混匀，在90℃水浴中加热24h，得到的产物即为负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体。
2.一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体，其特征在于，由权利要求1所述的制备方法制备得到。
3.如权利要求2所述的负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体在抑制金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒沙门氏菌中的应用。
4.如权利要求2所述的负载金纳木簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体在促进细菌产生活性氧中的应用。
5.如权利要求2所述的负载金纳木簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体在制备食品直接接触抗菌材料中的应用。
CN202110943806.4A 2021-08-17 2021-08-17 一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的制备方法与应用 Active CN113875751B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110943806.4A CN113875751B (zh) 2021-08-17 2021-08-17 一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110943806.4A CN113875751B (zh) 2021-08-17 2021-08-17 一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113875751A CN113875751A (zh) 2022-01-04
CN113875751B true CN113875751B (zh) 2022-06-07

Family

ID=79010716

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110943806.4A Active CN113875751B (zh) 2021-08-17 2021-08-17 一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113875751B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102887537A (zh) * 2012-11-03 2013-01-23 郑鸣 一种乳铁蛋白修饰的硫化锌纳米材料及其制备方法
CN106177924A (zh) * 2016-07-15 2016-12-07 黑龙江省科学院高技术研究院 纳米级乳铁蛋白壳聚糖微粒的制备方法
CN111602672A (zh) * 2020-06-01 2020-09-01 南方科技大学 一种抗菌纳米材料及其制备方法和应用
CN111658758A (zh) * 2020-05-27 2020-09-15 华南理工大学 一种抗菌金纳米簇及其制备方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102887537A (zh) * 2012-11-03 2013-01-23 郑鸣 一种乳铁蛋白修饰的硫化锌纳米材料及其制备方法
CN106177924A (zh) * 2016-07-15 2016-12-07 黑龙江省科学院高技术研究院 纳米级乳铁蛋白壳聚糖微粒的制备方法
CN111658758A (zh) * 2020-05-27 2020-09-15 华南理工大学 一种抗菌金纳米簇及其制备方法与应用
CN111602672A (zh) * 2020-06-01 2020-09-01 南方科技大学 一种抗菌纳米材料及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113875751A (zh) 2022-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mohamed et al. Eco-friendly mycogenic synthesis of ZnO and CuO nanoparticles for in vitro antibacterial, antibiofilm, and antifungal applications
Oves et al. Antibacterial silver nanomaterial synthesis from Mesoflavibacter zeaxanthinifaciens and targeting biofilm formation
Gao et al. One step synthesis of antimicrobial peptide protected silver nanoparticles: The core-shell mutual enhancement of antibacterial activity
Fayaz et al. Vancomycin bound biogenic gold nanoparticles: a different perspective for development of anti VRSA agents
Verma et al. Mechanistic insight into the rapid one-step facile biofabrication of antibacterial silver nanoparticles from bacterial release and their biogenicity and concentration-dependent in vitro cytotoxicity to colon cells
Shams et al. Cu/H 3 BTC MOF as a potential antibacterial therapeutic agent against Staphylococcus aureus and Escherichia coli
Rai et al. Three Phoma spp. synthesised novel silver nanoparticles that possess excellent antimicrobial efficacy
Zhou et al. Antifungal activity of silver nanoparticles synthesized by iturin against Candida albicans in vitro and in vivo
Patra et al. Damage of lipopolysaccharides in outer cell membrane and production of ROS-mediated stress within bacteria makes nano zinc oxide a bactericidal agent
San Keskin et al. Biosynthesis of noble selenium nanoparticles from Lysinibacillus sp. NOSK for antimicrobial, antibiofilm activity, and biocompatibility
Aimei et al. Effect of Ce3+ on membrane permeability of Escherichia coli cell
Zhang et al. An enhanced antibacterial nanoflowers AgPW@ PDA@ Nisin constructed from polyoxometalate and nisin
Gao et al. One-step synthesis of carbon dots for selective bacterial inactivation and bacterial differentiation
Elkomy Antimicrobial screening of silver nanoparticles synthesized by marine cyanobacterium Phormidium formosum
CN111944524A (zh) 蓝色发光抗菌碳点及其制备方法和应用
Kirtiwar et al. Effect of nutrient media on antibacterial activity of silver nanoparticles synthesized using Neolamarckia cadamba
Manikandan et al. Biosynthesis of Iron Nanoparticles from Pleurotus florida and its Antimicrobial Activity against Selected Human Pathogens.
Salih et al. Synthesis, characterization and evaluation of antibacterial efficacy of zinc oxide nanoparticles
Shao et al. Light activation of gold nanorods but not gold nanospheres enhance antibacterial effect through photodynamic and photothermal mechanisms
Vona et al. Polydopamine coating of living diatom microalgae
Deng et al. Facile synthesis of long-term stable silver nanoparticles by kaempferol and their enhanced antibacterial activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus
Gholami‐Shabani et al. Physicochemical properties, anticancer and antimicrobial activities of metallic nanoparticles green synthesized by Aspergillus kambarensis
Shnawa et al. Antimicrobial activity of plant-extract-mediated synthesis of Silver-Zinc Oxide nanocomposites and their acaricidal efficacy on Hyalomma marginatum ticks
Thakur et al. Effect of doped ZnO nanoparticles on bacterial cell morphology and biochemical composition
CN113875751B (zh) 一种负载金纳米簇的抗菌乳铁蛋白纤维聚集体的制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant