CN111393552B - 聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物作为基因载体的制备和应用 - Google Patents

聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物作为基因载体的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提公开一种聚乙烯胺‑精氨酸接枝衍生物作为基因载体的制备和应用。首先采用自由基聚合及水解两步合成法制备聚乙烯胺，然后利用缩合剂将聚乙烯胺与精氨酸脱水缩合制备聚乙烯胺‑精氨酸接枝衍生物。本发明提供的聚乙烯胺‑精氨酸基因载体在聚乙烯胺侧链氨基上接枝具有胍基结构的精氨酸，所制备的聚合物毒性小，与siRNA形成复合物的粒径小，在多种癌细胞中基因转染效果好，是一种具有良好应用前景的阳离子聚合物基因载体。

Description

聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物作为基因载体的制备和应用
技术领域
本发明属于高分子化学及生物材料技术领域，具体涉及聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物的制备及其在基因载体中的应用。
背景技术
基因治疗是20世纪90年代发展起来的一种全新的疾病治疗手段，因其潜在的价值和有效性为现代医疗学的发展开辟了一条新道路。但目前基因载体存在体内转染效率低、毒性高和安全性小等问题，不能满足临床应用的需求。
基因治疗可分为体外治疗和体内治疗两种模式。体外治疗是指从患者体内获取某种细胞并对其进行基因改造，然后将其增殖培养，再移植入患者体内以实现治疗的目的。此疗法技术成熟、安全高、对载体要求较低，但适用范围窄，仅适用于骨髓等可移植细胞，而且存在移植后基因表达关闭现象。体内基因治疗是指通过基因载体将治疗基因直接导入靶器官或靶组织，不受细胞种类的限制，不必进行细胞收集，基因改造等操作，此疗法简单易行，应用前景广阔。但核酸类基因药物由于自身所带负电荷与细胞膜之间存在静电排斥作用，细胞摄取能力低，又易被体内广泛存在的核酸酶所降解，内涵体清除，靶向性差，导致治疗效果差。因此，开发安全有效的基因药物载体是实现基因治疗的关键技术之一。
基因载体主要分为两大类：病毒载体和非病毒载体。腺病毒和逆转录病毒等病毒载体，虽然转染率高，但因其具有免疫原性，易整合或插入宿主基因组，导致宿主细胞癌变，严重限制了它的应用。与之相比，非病毒载体如胶束、脂质体、无机纳米粒子因其具有低免疫原性，安全性大，制备方法简易和结构易于修饰等优点而逐渐成为研究热点。特别是非病毒载体中的高分子阳离子聚合物，可利用自身携带的正电荷，通过静电作用与核酸物质形成复合纳米粒，是一种极具有应用前景的基因载体。
阳离子聚合物中的聚乙烯（亚）胺类具有线型、梳状或者树型等多样性的结构，其主链或者侧链都带有能与DNA和RNA结合的官能团，包括氨基、亚氨基、次氨基、季铵基团以及其它带正电荷基团，因而具有较高的载基因能力。但该类聚合物对正常细胞毒性较大，限制了它在临床上的应用。除了对现有载体进行结构优化和生物学研究，构建多样化的新载体也是基因治疗研发的重点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物基因载体。
本发明的目的在于提供一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物基因载体的制备方法。
本发明的目的在于提供一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物基因载体的应用。
本发明提供了一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物基因载体，包括聚乙烯胺骨架和与所述通过酰氨键接枝到骨架的具有胍基结构的精氨酸。所述聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物的原料为N-乙烯甲酰胺和精氨酸单体。
本发明的技术方案概括如下：
一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物基因载体的制备方法，包括如下步骤：
（1）、聚乙烯胺的合成：
首先将N-乙烯甲酰胺单体和引发剂在水溶剂中和60~80℃温度下反应得到聚N-乙烯甲酰胺。然后将聚N-乙烯甲酰胺在碱性水溶剂中和70~80℃温度下水解反应，经丙酮沉淀干燥后得聚乙烯胺。聚乙烯胺通式如下式（I）所示：
Figure 852928DEST_PATH_IMAGE002
优选地，N-乙烯甲酰胺单体与引发剂的质量比为100: (0.2~2)。
其中所述的引发剂为2,2-偶氮二异丁基脒二盐酸盐，简称AIBA。
（2）、将步骤（1）所得聚乙烯胺、精氨酸和缩合剂，在2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液（MES）中常温下反应24 h后，经透析袋透析后得到聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物。
所述聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物的数均分子量为2.5×103～2.0×104。
上述缩合剂为碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与聚乙烯胺的质量比为1：1:(0.2～5)。
上述的聚乙烯胺与精氨酸的质量比为1：（0.5～2）。
上述MES缓冲液的pH为5.5~6.5。
上述MES缓冲液作为反应介质。
上述的透析袋的截留分子量为2000，去除精氨酸自身反应的副产物及残留引发剂。
本发明所提供的一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物基因载体的制备方法，其特征在于步骤（1）所得产物，优选数均分子量为2.5×103～1.0×104的聚乙烯胺。
本发明所提供的一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物基因载体的制备方法，其特征在于步骤（2）中所使用的反应介质为MES反应介质。
本发明所提供的一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物基因载体的制备方法，具有合成过程简单，易于操作等优点。
本发明所提供的一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物基因载体的制备方法，引发剂和副产物等杂质后处理简易，纯化度高。
本发明所提供的一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物基因载体，具有较高的电荷密度，在生理条件下可有效压缩siRNA形成复合纳米粒。聚乙烯胺-精氨酸与siRNA 质量比为(0.1~20) :1，更优选为(0.14~10) :1。。
本发明所提供的一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物基因载体，与聚乙烯胺相比，具有更低的细胞毒性。
本发明所提供的一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物基因载体，可实现在多种癌细胞中高效转染核酸类基因药物。在体外转染实验结果表明，与某商用脂质体转染剂相比，聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物具有更高效率的基因转染，这些结果凸显聚乙烯胺-精氨酸作为基因载体的优点，有望成为一类新型的转基因材料，并具有商业化的潜力。
附图说明
图1为本发明所述的聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物红外光谱图。
图2为本发明所述的聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物与siRNA复合物的粒径和zeta电位图。
图3为本发明所述的聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物与siRNA复合物的琼脂糖凝胶电泳试验结果示意图。
图4为本发明所述的聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物与siRNA的复合物在神经斯旺细胞（RSC96）细胞中的细胞毒性图。
图5为本发明所述的聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物在小鼠黑色素瘤细胞（B16F1）中转染siRNA荧光图。
图6为本发明所述的聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物在人肺癌细胞（A549）中转染siRNA荧光图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
N-乙烯甲酰胺简称为NVF。
聚N-乙烯甲酰胺简称为PNVF。
聚乙烯胺简称为PVAm。
精氨酸简称为Arg。
聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物简称PVAm-Arg。
碳二亚胺简称EDC。
N-羟基琥珀酰亚胺简称NHS。
2,2-偶氮二异丁基脒二盐酸盐简称AIBA。
2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液简称MES缓冲液
siRNA 序列号为5’-UUGUUUUGGAGCGAAAdTdT-3’(正义链），5’-UUUCGCUCCAAAACAAdTdT-3’(反义链)， 购买自上海吉玛制药技术有限公司。
实例1
聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物的制备。
制备反应式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
1）将N-乙烯甲酰胺、 2,2-偶氮二异丁基脒二盐酸盐和水放置于100 mL反应瓶中，其中N-乙烯甲酰胺单体与引发剂2,2-偶氮二异丁基脒二盐酸盐的质量比为100 :1，于恒温水浴锅在60～80℃下冷凝回流反应，反应至溶液变成凝胶状，适当降温后，将其用适量的水溶解倒出，并用丙酮沉淀得聚N-乙烯甲酰胺。
2）将步骤1）制得的聚N-乙烯甲酰胺用水溶解后，加入浓度为40wt% NaOH水解， 然后转移至50 mL反应瓶中，于70～80℃下回流水解，将粘稠的反应液从反应瓶中倒至干净的烧杯中，再用丙酮沉淀，将沉淀物烘干得聚乙烯胺（PVAm），凝胶渗透色谱法测得数均分子量为4.7×103。
3）将步骤2）制得的聚乙烯胺和精氨酸溶于pH为5.5~6.5的MES缓冲液中。然后加入EDC和NHS，上述的碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）与聚乙烯胺质量比为1:1:1, 所述聚乙烯胺与所述的精氨酸的质量比为1: 1，在磁力搅拌下室温连续搅拌反应12～24 h后，以水为透析介质，用截留分子量为2000的透析袋透析，最后于真空烘干得聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物（PVAm-Arg），凝胶渗透色谱法测得数均分子量为6.3×103。
Figure 429403DEST_PATH_IMAGE004
对实例1中的线型高分子PVAm-Arg进行如下方面的检测
（1）将PVAm-Arg分别经KBr压片后在傅里叶红外光谱仪上测试。
在图1聚乙烯胺-精氨酸的红外谱图中，在3400 cm-1处出现了聚乙烯胺—NH2的特征峰，1460 cm-1和787 cm-1分别为精氨酸的羧基的对称伸缩振动峰和弯曲振动峰。在1560cm-1和1133 cm-1出现的吸收峰归属于由聚乙烯胺和精氨酸相互反应生成的酰胺键。因此可以能够判断聚乙烯胺和精氨酸的成功连接。
（2）PVAm-Arg与siRNA复合物的制备
将PVAm-Arg与siRNA按照质量比为0.14、0.2、0.5、1、2、5的比例混合后，静置30min后，用激光粒度仪/电位仪检测其粒径大小和电位。
PVAm-Arg与siRNA形成复合物的粒径和电位如图2所示，复合物的平均粒径均为纳米尺寸。特别在质量比为1:1时复合物的平均粒径为72±2 nm, 分散性良好，分散系数为0.146，其电位大小为+15.5 mV，满足细胞吞噬的要求。
（3）琼脂糖凝胶电泳实验
分别取上述制备的PVAm-Arg与siRNA复合物，加入凝胶加样孔内，以RNA为阴性对照。电泳条件：10 g/L琼脂糖(含0.5 μg/LYeared染料)，1×TAE缓冲液，电压100 V，电泳时间20 min。RNA条带在紫外灯下进行观察，最后用凝胶成像仪成像拍照。
凝胶电泳结果如图3所示，当质量比大于0.2时，聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物能完全阻滞siRNA的迁移，因此PVAm-Arg具有很强的siRNA复合能力。
（4）PVAm-Arg的细胞毒性试验
待神经施旺细胞（RSC96）细胞生长密度为80 ~ 90%时，经胰酶消化后，将细胞按照3000个细胞/孔的密度接种于将96孔板种，每孔200 μL，培养24 h后，吸去每孔中的旧培养液，分别加入浓度为0、1、10、25 μg/mL的聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物，每孔200 μL，每个浓度4个复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养24 h后更换正常培养液继续培养48 h后。每孔加MTT溶液，继续孵育4 h后，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。在酶标仪490 nm波长处读取光度值(A)，根据公式（1）计算细胞存活率：
细胞存活率（%）=实验组A490/阴性对照组A490×100 （1）
PVAm-Arg的细胞毒性如图4所示，当精氨酸的浓度在0~25 µg/mL范围内，RSC96细胞的存活率没有显著的差别，均高于80%。而聚乙烯胺的细胞毒性随着浓度的提高而明显增大，在RSC96细胞中加入10 µg/mL浓度的聚乙烯胺后，细胞的存活率降至41%。而在相同浓度下，聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物的细胞存活率仍达到80%左右，即使在高浓度下，细胞存活率仍超过60%，由此可见，PVAm-Arg聚合物有望作为细胞毒性小、安全的基因载体。
（5）PVAm-Arg与siRNA的复合物在黑色素瘤细胞B16F1中转染试验。
通过小鼠黑色素瘤细胞B16F1来评价PVAm-Arg对siRNA的转染效率。将处于生长对数期的B16F1细胞按照每孔1.2×104的细胞密度接种于24孔板中，然后在5%CO2，37℃条件下继续培养24 h。当细胞密度达到70%-80%时，吸去培养板中旧的培养基，加入PVAm-Arg/siRNA复合物纳米粒，其中每孔复合物中含有0.26 μg的siRNA，以抗小鼠黑色素瘤siRNA为报告基因，商用脂质体（GP-siRNA-mate plus）转染剂为阳性对照。转染后，用预冷的PBS洗涤两次，加入4%的戊二醛固化，然后接着用PBS洗3次，最后每孔加入浓度为1 μg/mL的DAPI染料进行细胞核染色，用PBS洗涤后转至荧光显微镜下进行拍照观察。图5为转染6 h后，PVAm-Arg聚合物和商用脂质体转染剂在B16F1细胞中对siRNA的转染效率。PVAm-Arg聚合物在B16F1细胞中实现高转染，且比商用脂质体转染率高。
实例2
实例1的PVAm-Arg与siRNA的复合物在人肺癌细胞中转染试验。
将处于生长对数期的A549人肺癌细胞按照每孔1.2×104的细胞密度接种于24孔板中，然后在5%CO2，37℃条件下继续培养24 h。当细胞密度达到70%~80%时，吸去培养板中旧的培养基，加入实例1的步骤（3）制得的PVAm-Arg/siRNA复合物纳米粒。其中每孔复合物中含有0.26 μg的siRNA，以抗小鼠黑色素瘤siRNA为报告基因，商用脂质体（GP-siRNA-mateplus）转染剂为阳性对照。转染后，用预冷的PBS洗涤两次，加入4%的戊二醛固化,然后接着用PBS洗3次，每次5 min，最后每孔加入浓度为1 μg/mL的DAPI染料进行细胞核染色，用PBS洗涤后转至荧光显微镜下进行拍照观察。图6为转染6 h后，聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物和商用脂质体转染剂在A549细胞中对siRNA的转染效率。聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物在A549细胞中实现高转染。

Claims (5)

1.一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物的制备方法，包括以下步骤：
1) 采用N-乙烯甲酰胺单体为原料在引发剂的作用下通过自由基聚合制备聚N-乙烯甲酰胺；
2) 在强碱性加热条件下水解聚N-乙烯甲酰胺得到聚乙烯胺；
3) 步骤2）得到的聚乙烯胺通过碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）在弱酸缓冲液中脱水缩合，将精氨酸接枝到聚乙烯胺使其结构枝化，形成聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物；
步骤1)中引发剂为2,2-偶氮二异丁基脒二盐酸盐，N-乙烯甲酰胺单体与所述的引发剂质量比例为100: (0.2~2)，自由基聚合的条件为于恒温水浴锅在60～80℃下冷凝回流反应；
步骤3)中碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与聚乙烯胺质量比为1：1:(0.2～5); 所述聚乙烯胺与所述的精氨酸的质量比为1: (0.5~2)；
步骤3)中弱酸缓冲液为2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，pH为5.5~6.5；
所述聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物数均分子量为2.5×103～2.0×104。
2.权利要求1所述的制备方法制得一种聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物。
3.根据权利要求2所述的聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物，其特征在于，所述聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物是以聚乙烯胺为主链，且通过酰氨键接枝在聚乙烯胺上的精氨酸。
4.权利要求2或3所述的聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物在基因载体中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物用作核酸类药物输送的载体。
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