一种壳聚糖氨基烷基化衍生物
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖氨基烷基化衍生物及其制备方法,以及其用作非病毒型基因载体的用途。
背景技术
基因治疗是一种利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内使之表达,从而使疾病得到治疗的技术,已经引起越来越多的关注。目前基因治疗的关键技术是基因递送载体的选择,理想的基因载体既要有较好的安全性又要有较高的转染效率。
壳聚糖是一种天然的高分子多糖,为不多见的无生物毒性的碱性多糖,具有优良的生物相容性和生物可降解性,低免疫原性,同时还表现出独特的跨细胞膜能力。壳聚糖利用它结构中的游离氨基在酸性条件下带正电荷的特性,能与带负电荷的DNA形成聚电解质复合物,具有保护DNA免遭核酸酶降解等优点,并可通过控制复合物表面性质控制其生理行为。壳聚糖/DNA复合物主要通过穿过细胞膜将基因转运到细胞中起到基因递送的作用,其转染过程如下:首先,将DNA包裹在纳米粒中或吸附在其表面,通过细胞内吞作用转移进入细胞,形成内含体,由于溶酶体及复合物膨胀使内含体裂解,DNA从内含体释放,进入细胞质中,再进一步进入核内转录、表达。在该过程中,DNA必须从内含体中脱离出来才能实现对细胞的转染,否则将随着内含体进入溶酶体而被其中的核酸酶降解,因此抑制溶酶体内酶的活性和促进内含体膜的破裂可以提高细胞的转染效率。但是,由于壳聚糖上氨基的酸度系数只有6.5左右,因此壳聚糖只能在偏酸的条件下溶解,在生理pH条件下却无法很好地溶解,而且氨基所带正电荷的非常的微弱,不利于壳聚糖的进一步应用。
壳聚糖骨架上丰富的羟基和氨基使其易于化学修饰,增加其靶向性,有利于进一步提高基因递送的效率。因而,壳聚糖及其衍生物有望成为安全有效的阳离子基因载体。但与病毒基因载体相比,壳聚糖存在着基因转染效率低的问题。壳聚糖相对分子质量越大,电荷密度越高,其包载DNA的能力也越强,但大相对分子质量壳聚糖带来的关键问题是水溶性差。为了克服壳聚糖溶解性低的缺点,提高基因进入机体细胞的效率,提高药物的治疗效果,现有技术已经存在了各种不同的壳聚糖氨基烷基化衍生物。
本发明设计合成一种新的壳聚糖氨基烷基化衍生物,主要是利用壳聚糖骨架上的氨基与氯乙胺反应形成中间体,这个中间体所带的氨基可以继续和N,N-二甲基-2-氯乙胺发生亲核取代反应,从而得到目标的产物。这种新的壳聚糖氨基烷基化衍生物载体具有比壳聚糖更高的溶解性和正电荷密度,从而转染效率将会得到显著的提高,并且具有细胞毒性进一步降低的特点。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题,本发明设计合成一种新的壳聚糖氨基烷基化衍生物,主要是利用壳聚糖骨架上的氨基与氯乙胺反应形成中间体,这个中间体所带的氨基可以继续和N,N-二甲基-2-氯乙胺发生亲核取代反应,从而得到目标的产物。这种新的壳聚糖氨基烷基化衍生物载体具有比壳聚糖更高的溶解性和正电荷密度,从而转染效率将会得到显著的提高,并且具有细胞毒性进一步降低的特点。
本发明提供一种壳聚糖氨基烷基化衍生物,其结构式如下:
其中,n为壳聚糖氨基烷基化衍生物的重复单元的个数。
本发明还提供了上述壳聚糖氨基烷基化衍生物的制备方法,该方法包括以下步骤:
其中,n为壳聚糖氨基烷基化衍生物的重复单元的个数。
所述制备步骤更具体包括:
(1)将壳聚糖加入到2-氯乙胺盐酸盐的水溶液中,并加热至50℃,向该混合物中缓慢滴加氢氧化钠水溶液,并在50℃搅拌5小时,混合物变澄清,冷却后,进行透析2天,透析液进行冷冻干燥,得到棉花状的固体;
(2)将第一步中反应得到的2-氯乙胺修饰的壳聚糖溶解在到N,N-二甲基-2-氯乙胺盐酸盐的水溶液中,并加热至50℃,向该混合物中缓慢滴加氢氧化钠的水溶液,并在50℃搅拌4小时,冷却后,进行透析2天,透析液进行冷冻干燥,得到棉花状的成品。
本发明中,所述壳聚糖氨基烷基化衍生物可以与核酸自组装形成纳米复合物,所述的核酸可以是含有编码遗传标记的质粒DNA序列,所述的遗传标记可为绿色荧光蛋白基因。
此外,本发明提供了由所述壳聚糖氨基烷基化衍生物和DNA所构成的纳米复合物及其制备方法。该方法包括:将本发明的壳聚糖氨基烷基化衍生物和质粒DNA分别用去离子水溶解,混合,室温静置,壳聚糖氨基烷基化衍生物和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。
本发明的壳聚糖氨基烷基化衍生物可用于将核酸递送到细胞中。
本发明的用作非病毒基因载体壳聚糖氨基烷基化衍生物与核酸形成的纳米复合物体外转染细胞的方法步骤为:将制备好的DNA复合物转染293T细胞,细胞培养48小时后,在荧光显微镜下观察转染结果,若细胞发出绿色荧光,即为转染成功。
本发明的有益之处在于:
本发明设计合成的壳聚糖氨基烷基化衍生物,主要是利用壳聚糖骨架上的氨基与氯乙胺反应形成中间体,这个中间体所带的氨基可以继续和N,N-二甲基-2-氯乙胺发生亲核取代反应,从而得到目标的产物。这种新的壳聚糖氨基烷基化衍生物载体具有比壳聚糖更高的溶解性和正电荷密度,从而转染效率将会得到显著的提高,并且具有细胞毒性不会增加的特点。
附图说明
图1为本发明壳聚糖氨基烷基化衍生物的分子式。
图2为傅里叶变换红外光谱结果:
A代表壳聚糖
B代表中间产物:被2-氯乙胺盐酸盐修饰的壳聚糖
C代表终产物:被2-氯乙胺盐酸盐和N,N-二甲基-2-氯乙胺盐酸盐混合修饰后的壳聚糖。
图3为核磁共振图:
A代表中间产物:被2-氯乙胺盐酸盐修饰的壳聚糖
B代表终产物:被2-氯乙胺盐酸盐和N,N-二甲基-2-氯乙胺盐酸盐混合修饰后的壳聚糖。
图4为细胞毒性实验结果。
图5为转染效率实验结果。
具体实施方式
实施例1壳聚糖氨基烷基化衍生物的合成:
(1)将壳聚糖(500mg)加入到2-氯乙胺盐酸盐(8.7g)的25mL水溶液中,并加热至50℃。向该混合物中缓慢滴加氢氧化钠(3.0g)的25mL水溶液,并在50℃搅拌5小时。混合物变澄清,冷却后,进行透析2天。透析液进行冷冻干燥,得到棉花状的固体666mg。
(2)将第一步中反应得到的2-氯乙胺修饰的壳聚糖(285mg)溶解在到N,N-二甲基-2-氯乙胺盐酸盐(5.6g)的13mL水溶液中,并加热至50℃。向该混合物中缓慢滴加氢氧化钠(1.56g)的13mL水溶液,并在50℃搅拌4小时。冷却后,进行透析2天。透析液进行冷冻干燥,得到棉花状的固体779mg。
其反应式为:
实施例2傅里叶变换红外光谱:
结果如附图2所示:
中间产物的红外分析
在3700-2600cm-1的高波数区域,由于单纯氯乙胺修饰壳聚糖是在商品化壳聚糖的基础上引入了更多的NH2和CH2基团,因此,在3405cm-1附近的O-H、N-H伸缩振动峰,特别是3072,2921cm-1附近的C-H伸缩振动峰增强、变宽。
对比1069cm-1υ(C-O)(二级醇羟基)和1025cm-1υ(C-O)(一级醇羟基)附近的两个峰,可以看出,在壳聚糖中二级醇υ(C-O)信号只是略高于一级醇的υ(C-O)信号,而单纯氯乙胺修饰的壳聚糖中二级醇υ(C-O)信号显著高于一级醇的υ(C-O)信号,这是因为一级醇(6-OH)具有更高的反应活性,因此选择性地生成了更多的醚键修饰。
在566cm-1的低频区,壳聚糖中的相应信号很弱,而单纯氯乙胺修饰壳聚糖中相应信号则增强变宽,这是因为单纯氯乙胺修饰壳聚糖中氨基种类很多,除了壳聚糖环上的原有的氨基,还引入了一级胺、二级胺、三级胺等不同类别的氨基。
终产物红外分析
在3700-2600cm-1的高频区域,由于混合型修饰壳聚糖比壳聚糖以及单纯氯乙胺修饰壳聚糖具有更多CH2基团,所以在3010,2964cm-1附近的C-H伸缩振动峰增强、变宽。
对比1066cm-1υ(C-O)(二级醇羟基)和1028cm-1υ(C-O)(一级醇羟基)附近的两个峰,可以看出在壳聚糖中二级醇υ(C-O)信号只是略高于一级醇的υ(C-O)信号,单纯氯乙胺修饰的壳聚糖中二级醇υ(C-O)信号显著高于一级醇的υ(C-O)信号,而氯乙胺和N,N-二甲基氯乙胺混合型修饰的壳聚糖中二级醇υ(C-O)信号与一级醇的υ(C-O)信号相当,这说明在单纯氯乙胺修饰壳聚糖的基础上,第二次修饰将相当量的烷基链引入到了3-OH上。
相应地在代表醚键的吸收位置1107cm-1处新增一个峰,再次证实样品中有更多醚键。
实施例3核磁共振结果:
结果如附图3所示。
中间产物
化学位移4.4-4.7ppm处是壳聚糖中异头质子信号,化学位移3.4-4.0ppm处是壳聚糖骨架中糖环质子(除异头质子外)的信号,化学位移3.3-2.5ppm处是由氯乙胺修饰引入的乙基CH2-CH2信号,化学位移2.0ppm附近是商品化壳聚糖中残余的乙酰氨基的CH3信号。
终产物
化学位移4.7-2.75ppm之间的峰形比单纯氯乙胺修饰的壳聚糖要复杂得多,这主要是由于引入的乙基和甲基信号都在这个范围,和壳聚糖原有的糖环质子信号重合,导致峰形十分复杂。由于高分子化合物结构的微观不均一性,导致无法有效归属各个质子信号的具体化学位移。结合红外和核磁可知,我们在壳聚糖的骨架上引进了大量含氨基、甲基、亚甲基的烷基链。
实施例4壳聚糖氨基烷基化衍生物-DNA复合物的制备:
将实施例1制备得到的壳聚糖氨基烷基化衍生物用去离子水溶解,配成1毫克/毫升的溶液;质粒DNA为含有绿色荧光蛋白基因的质粒DNA(pEGFP-N1),用去离子水溶解质粒,得到浓度为0.2毫克/毫升的DNA溶液;
按实施例1制得的壳聚糖氨基烷基化衍生物与质粒DNA溶液按不同质量比(1:1,5:1,10:1,20:1,30:1)混合30秒,室温静置0.5小时,壳聚糖氨基烷基化衍生物-质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。
实施例5细胞毒性试验
用MTS法测定壳聚糖氨基烷基化衍生物细胞毒性,选择293T细胞作为测试细胞。
收集对数期细胞,将293T细胞按5000/孔接种在96孔板中,孵育至50%到70%融合后,弃去培养基,加入用培养基稀释的各个浓度的壳聚糖氨基烷基化衍生物(载体浓度选择对应转染浓度),终体积控制在100μl。另设细胞空白对照孔、未修饰壳聚糖,阳性对照PEI,每孔3复孔。48小时后每孔加入20μlMTS,于培养箱再孵育4小时,然后在490nm下检测吸光度。结果见图4。
结果显示:当载体浓度达到73.2μg/mL时,细胞一直保持85%以上的细胞存活率,表明载体具有很低的生物毒性以及良好的生物相容性。
实施例6体外转染
转染方法:将293T细胞以1×105个细胞/孔的密度接种到12孔培养板中,置5%CO2,37℃培养箱中培养24h后,更换新鲜完全培养基,分别加入实施例4制得的壳聚糖氨基烷基化衍生物-DNA复合物,继续培养48h。同样以未修饰壳聚糖和PEI作为对照。48h后,收集细胞作流式分析。结果见图5。
结果显示:壳聚糖氨基烷基化衍生物-DNA复合物对293T细胞的转染效率随着壳聚糖氨基烷基化衍生物和DNA质量比例的增加而增加,当壳聚糖氨基烷基化衍生物和DNA质量比为30:1时,转染效率达到65.33%。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。