KR100751105B1 - 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법, 이를 함유하는조성물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 중으로 형질감염되도록 디자인한 핵산의 제형에 유용한 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 티타늄 (IV) 이소프로폭사이드와 나트륨 보로하이드라이드의 존재하에 작용화된 헤미아세탈로 폴리알킬렌이민을 처리함에 있다.
폴리알킬렌이민, 헤미아세탈, 티타늄 이소프로폭사이드, 나트륨 보로하이드라이드
Description
본 발명은 세포에 형질감염시키기 위한 핵산의 제형에 유용한 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법에 관한 것이다.
생물공학의 발달로, 핵산을 세포에 효과적으로 전달시킬 가능성이 여러가지 생물공학 적용에서 기초적인 기술이 되었다. 이것은 예를 들면, 재조합 단백질의 생산을 위해, 혹은 실험실에서 유전자 발현의 조절, 유전자의 클로닝 또는 DNA가 관여하는 기타 조작을 연구하기 위해 핵산을 세포에 시험관내 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 이것은 또한 예를 들면, 표지 연구 또는 치료적 접근법을 위한 백신을 제조하기 위해 핵산을 세포에 생체내 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 이것은 또한 후속 재투여하기 위해 유기체로부터 취해진 세포에 유전자를 전달하는 단계를 포함할 수 있다(예를 들면, 트랜스제닉 동물의 생산을 위해).
현재, 유전자를 세포에 전달하기 위해 가장 통상적으로 사용되는 수단은 바이러스 벡터의 사용이다. 그러나, 이것이 위험성이 전혀 없는 것은 아니기 때문에, 합성 벡터의 사용을 기본으로 하는 여러가지 다른 방법이 제안되었다. 이러한 합성 벡터는 두 가지의 주기능이 있다: 형질감염될 핵산의 작제 및 압축과, 원형질 막 및 임의로 두 핵막을 가로지르는 이동의 촉진.
이에 따라 여러가지 부류의 합성 벡터가 제안되었다. 이들 중에서도, 폴리알킬렌이민과 같은 양이온성 중합체가 특히 유리하다. 그 이유는 이들이 특히 생체내에서의 핵산의 형질감염 중에 비교적 효과적인 것으로 밝혀졌고, 또한 비교적 낮은 독성을 보이기 때문이다. 또한 이들이 핵산과 함께 형성하는 복합체("폴리플렉스 polyplex"로도 알려짐)이 주입 부위로부터 비교적 잘 확산되는 것으로 관찰되었다(J. S. Remy 등, Advanced Drug Delivery Reviews, 30, 1998, pp. 85-95).
또한, 현재 장기, 조직, 세포형 또는 특정 세포 구획에 대해 적당한 핵산을 표적화할 수 있는 벡터를 제공할 수 있는 것이 필수적인 것 같은데, 그 이유는 형질감염되는 핵산이 나머지 체내로 비호적하게 확산되지 않으면서 표적 세포와 효과적으로 상호작용함을 보장할 수 있는 것이 중요하기 때문이다. 의도된 목적은 표적 세포 외의 세포에서의 핵산의 모든 비특이적 작용을 회피하는 것이다. 이에 따라 갈락토실 폴리에틸렌이민이 갈락토스에 상응하는 세포 수용체(렉틴)를 지니고 있는 세포에 플라스미드를 시험관내 전달하기 위한 효과적인 벡터임이 알려졌다(Zanta 등, Bioconj. Chem., 8(2), 1997, p. 839; T. Bettinger 등, Bioconj. Chem., 1999).
지금까지, 예를 들어, 갈락토실 폴리에틸렌이민과 같은 중합체는 나트륨 시아노보로하이드라이드의 존재하에 폴리에틸렌이민과 함께 올리고사카라이드의 작용 에 의해 수득되었다. 그러나, 이 시약은 값비싸고 그 중에서도 특히 매우 독성인 단점을 가진다. 비교적 양이온성인 최종 산물에서 잔류 시아나이드 이온 존재의 잠재적인 위험성은 약학적으로 사용할 가능성을 제거한다. 또한, 폴리알킬렌이민이 중합체이고 작은 분자가 아니어서 다수의 용매, 특히 비극성 용매에서 불용성이기 때문에 대안의 제조방법에 대한 연구가 지금까지 결실이 없었다. 이에 따라, 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드를 사용하는 대안 방법의 사용이 불가능하다. 수성 황산중 나트륨 보로하이드라이드 및 피리딘/보레인 혼합물의 사용 또한 양이온성 중합체와 비상용성인 것으로 밝혀졌다. 따라서 폴리알킬렌이민과 같은 양이온성 중합체와 상용성이고, 약학적으로 허용 가능한 시약만을 포함하는 대안의 방법을 개발할 필요가 있는 것 같다.
이에 따라 티타늄 (IV) 이소프로폭사이드 및 나트륨 보로하이드라이드의 존재하에 폴리알킬렌이민을 작용화된 헤미아세탈로 처리함에 의한 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조가 가능하다는 것이 밝혀졌다.
이러한 방법은 예를 들어, 알콜과 같이 폴리알킬렌아민과 상용성인 용매에서 수행될 수 있고, 덜 비싸고 비교적 비독성인 시약만을 포함하는 장점을 가진다.
Bhattacharyya 등의 여러 문헌(J. Org. Chem., 1995, 60, pp. 4928-4929; Synlett, 1995, pp. 1079-1080; J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1998, pp. 2527-2531)이 하기의 케톤 또는 알데하이드로부터 아민의 제조방법을 기술하고 있다:
반응식
상기식에서, R 및 R'는 서로 독립적으로, 수소 원자, 알킬 그룹 또는 아릴 그룹을 나타내거나, 함께 임의로 헤테로 원자를 함유하는 5원, 6원 또는 7원의 사이클로알킬 그룹을 형성하고, R1 및 R2는 서로 독립적으로, 수소 원자 또는 하이드록실이나 에스테르로 임의 치환된 알킬 그룹을 나타내거나, 이와 달리 R1과 R2가 함께 임의로 헤테로 원자를 함유하는 5원 또는 6원의 사이클로알킬 그룹을 형성한다. 그러나, 이러한 방법은 상응하는 케톤 또는 알데하이드로부터 하나의 아민기만을 포함하는 작은 분자, 즉 구체적으로 말하면 비중합체 분자의 제조 상황에서만 기술되어 있다.
본 발명에 따라서, 출발 폴리알킬렌이민은 화학식 1을 가진다:
상기식에서, R은 수소 원자 또는 화학식 2의 그룹을 나타내고, n은 2 내지 10의 정수이며, p 및 q는 정수이고, 합 p+q가 중합체의 평균 분자량이 100 Da 내지 107 Da이도록 하는 것으로 생각된다.
화학식 1에서, n의 값과 그룹 R은 다양한 단위 -NR-(CH2)n-과 -(CH2)n
-NH- 사이에서 다양할 수 있다고 생각된다. 따라서, 화학식 1은 직쇄 중합체 및 측쇄 중합체와, 단독중합체 및 헤테로중합체를 포함한다.
n은 바람직하게는 2 내지 5이다. 바람직한 중합체는 예를 들면, 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 폴리프로필렌이민(PPI)이다. 또한, 본 발명을 수행하기에 바람직하고 형질감염에 가장 효과적인 것으로 보여지는 중합체는 평균 분자량이 103 내지 5 ×106인 것들이다. 예시의 방법으로, 평균 분자량 50,000 Da(PEI 50K), 25,000 Da(PEI 25K) 또는 22,000 Da(PEI 22K)의 폴리에틸렌이민이나 이와 달리 800,000 Da(PPI 800K)의 폴리프로필렌이민이 언급될 수 있다.
본 발명에 사용되는 폴리알킬렌이민은 당업자에게 알려져 있는 다양한 방법에 따라 수득될 수 있다. 예를 들면, 이들은 음이온성 중합 조건하에서 상응하는 단량체(들)로부터 화학적으로 합성될 수 있거나(예를 들면, 에틸렌이민의 중합), 이산 또는 디아민의 중축합에 의해 수득되는 폴리아미드의 환원이나, 이와 달리 디알데하이드의 디아민과의 중축합에 의해 수득되는 이민의 환원에 의해 합성될 수 있다. 또한, 예를 들어, PEI 25K, PEI 22K 또는 PPI 800K와 같은 다수의 폴리알킬 렌이민이 시판되고 있다.
본 발명의 목적상, 표현 "작용화된 폴리알킬렌이민"은 표적화 요소가 공유결합하는 폴리알킬렌이민 유형의 양이온성 중합체를 의미한다. 이러한 표적화 요소가 목적하는 특정 세포형, 목적하는 특정 조직 또는 목적하는 특정 세포 구획에의 핵산의 전달을 추진한다. 표적화 요소와 폴리알킬렌이민 간의 공유결합은 작용화된 헤미아세탈, 즉 치환체 중 하나가 상기의 표적화 요소인 헤미아세탈과 앞서 언급한 반응 조건하에서 반응시킴으로써 달성된다.
좀더 구체적으로 말하면, 본 발명의 목적상, 표현 " 작용화된 헤미아세탈"은 하기 화학식을 가지는 임의의 분자를 의미한다.
화학식
상기식에서, n은 0 또는 1에 해당하고, R1, R2, R3 및 R4는 동일하거나 상이하고 서로 독립적으로, 수소 원자, 수행되는 반응과 상용성인 그룹 또는 표적화 요소를 나타내며, 치환체 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 및 하나만이 표적화 요소인 것으로 생각된다.
상용성 그룹의 예로서, 하이드록실, 탄소수 1 내지 4(1 내지 4C)의 알킬 또는 하이드록시알킬(1 내지 4C)이 언급될 수 있다.
표적화 요소는 헤미아세탈에 직접 그래프팅될 수 있거나, 이작용성 결합 분자("링커"로도 알려짐)를 통해 그래프팅된다. 링커가 상기 표적화 요소를 헤미아세탈에 그래프팅시키고/시키거나(그렇지 않으면 그래프팅이 화학적 측면에서 가능하지 않을 수도 있다), 상기 표적화 요소를 헤미아세탈로부터 간격을 두게 한다. 표현 "이작용성 결합 분자"는 표적화 요소와 공유결합할 수 있는 적어도 하나의 작용기 및 헤미아세탈과 공유결합할 수 있는 적어도 하나의 작용기를 포함하는 임의의 분자를 의미한다.
본 발명의 목적상, 용어 "표적화 요소"는 핵산의 전달을 추진할 수 있는 임의 분자를 의미한다. 이 표적화 요소는 목적하는 특정 세포형 또는 목적하는 특정 조직(종양 세포, 간 세포, 조혈 세포 등)에 DNA의 전달을 추진하기 위한 세포외 표적화 요소일 수 있다. 이것은 또한 바람직한 특정 세포 구획(예를 들면, 미토콘드리아 또는 핵)에 핵산의 전달을 추진하기 위한 세포내 표적화 요소일 수도 있다.
본 발명의 상황에서 사용될 수 있는 표적화 요소 중에서도, 당, 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 지질, 신경매개물질, 호르몬 및 비타민, 또는 이들의 유도체가 언급될 수 있다. 바람직하게는, 이들은 예를 들면, 당, 펩타이드 또는 항체나 항체 단편, 세포 수용체 리간드나 이의 단편 및 수용체나 수용체 단편과 같은 단백질이다. 구체적으로 말하면, 이들은 성장인자 수용체 리간드, 사이토카인 수용체 리간드, 세포성 렉틴 수용체 리간드 또는 인테그린과 같은 부착 단백질의 수용체에 대해 친화성을 가지는 RGD 서열의 리간드일 수 있다. 또한 트랜스페린 수용체, HDL 및 LDL 또는 폴레이트 트랜스포터가 언급될 수 있다. 표적화 요소는 또 한 아시알로당단백질 또는 Sialyl Lewis X와 같은 시알릴을 위한 수용체와 같은 렉틴을 표적화하기 위한 당일 수 있거나, 이와 달리 항체 단편 Fab 또는 단일쇄 항체(ScFv)일 수도 있다. 예시의 방법으로, 상기 당은 단당류, 이당류 또는 삼당류 중에서 선택될 수 있다. 이것은 예를 들면, 갈락토스, 만노스, 퓨코스, 람노스, 락토스 또는 말토스일 수 있다.
반응은 일반적으로 알콜 용매, 예를 들면 메탄올 또는 에탄올 중 100℃ 내지 30℃의 온도에서 수행된다. 본 방법은 바람직하게는 에탄올 중 실온, 즉 18℃ 내지 25℃의 온도에서 수행된다.
또한, 도입되는 중합체 몰당 티타늄 (IV) 이소프로폭사이드 25몰 내지 100몰이 일반적으로 사용되고, 더욱 바람직하게는 중합체 몰당 티타늄 (IV) 이소프로폭사이드 40몰 내지 60몰이 사용된다.
사용되는 티타늄 (IV) 이소프로폭사이드 양의 50% 내지 80%(몰)에 해당하는 나트륨 보로하이드라이드의 양이 또한 반응 혼합물에 도입된다.
본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해 사용되는 작용화된 헤미아세탈의 양은 달성하기 위한 목적하는 그래프팅 정도에 좌우된다. 유리하게는 중합체 몰당 작용화된 헤미아세탈 6몰 내지 100몰이 사용된다.
사용되는 작용화 헤미아세탈의 양에 따라, 1% 내지 20%, 바람직하게는 4% 내지 20%의 범위일 수 있는 정도로 작용화되는 폴리알킬렌이민이 수득된다. 당이 표적화 요소로 사용되면, 폴리알킬렌이민에 그래프팅되는 당의 %는 특히 레조르시놀법을 사용하여 측정될 수 있다. 이 방법은 예비투석된 작용화된 폴리알킬렌이민을 레조르시놀 및 황산으로 처리한 다음, 90℃에서 20분간 가열하는 단계로 이루어진다. 냉각시킨 후에, 495 nm에서의 흡광도를 측정하고 참조 샘플(표준 용액)과 비교한다. 투석은 그래프팅되지 않은 표적 성분을 제거하고, 참조 샘플과 비교한 수치가 그래프팅된 표적 성분의 양을 측정한다. 이 방법은 이것이 중합체를 포함하여, 작은 분자를 위해 통상적으로 수행되는 NMR(핵 자기 공명) 또는 질량 측정에 의해 특징분석할 수 없기 때문에, 또한 수득된 산물을 특징분석하기 위한 1 이상의 신뢰성 있는 수단을 구성한다.
본 발명에 따른 방법은 특정 구체적 조직, 특정 구체적 세포형 또는 특정 구체적 세포 구획을 표적화할 수 있는 핵산 전달 벡터를 제조하기 위해, 값싸고 비교적 비독성인 대안적 방법을 구성하기 때문에, 특히 유리하다. 또한, 당으로 작용화된 폴리알킬렌이민이 비작용화된 폴리알킬렌이민보다 세포에 관해 덜 독성임이 주목된다.
작용화된 폴리알킬렌이민은 세포로 핵산을 형질감염시키는 데 유용하다. 이러한 목적으로, 작용화된 폴리알킬렌이민을, "폴리플렉스"(이 경우에, 방법은 형질감염이라기 보다는 "폴리펙션"이라 언급할 수 있다)로 알려진 복합체를 형성하기 위하여 1 이상의 핵산과 혼합할 수 있다. 최적의 형질감염 효율을 수득하기 위하여, 작용화된 폴리알킬렌이민과 핵산의 비율은 바람직하게는 형성된 폴리플렉스가 전체적으로 중성 또는 약간 양성이도록 선택된다. 일반적으로, 상기 비율은 침전되지 않는 양성 폴리플렉스를 형성하도록, 단, 이는 또한 독성을 증가시키기 때문에 형성되는 폴리플렉스의 양이온성을 과도하게 증가시키지 않도록 선택된다. 따라서, 상기 비율은 경우에 따라 측정되어야 한다. 그러나, 상기 비율은 일반적으로는 작용화된 폴리알킬렌이민내 아민 및 핵산내 포스페이트의 몰비가 0.1 내지 50, 바람직하게는 0.5 내지 20이도록 선택된다. 말할 것도 없이, 이 비율은 사용되는 폴리알킬렌이민, 핵산, 표적 세포, 투여 또는 예상되는 적용(특히 형질감염될 세포의 유형)에 따른 방법에 따라 당업자에 의해 쉽게 변용되고 최적화될 수 있다.
상기 폴리플렉스에서, 핵산은 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 중 하나일 수 있다. 이는 천연 또는 인공 서열, 특히 게놈 DNA(gDNA), 상보 DNA(cDNA), 전령 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보좀 RNA(rRNA), 변형 또는 비변형 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열을 포함할 수 있다. 이 핵산은 예를 들면, 인간, 동물, 식물, 박테리아 또는 바이러스 기원일 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 기술, 구체적으로는 라이브러리를 스크리닝함으로써, 화학 합성으로써 또는 라이브러리를 스크리닝하여 수득된 서열의 화학 또는 효소 변형을 포함하는 혼합법에 의해 수득될 수 있다.
데옥시리보핵산에 관해 더욱 구체적으로는, 이들은 싱글- 또는 더블-스트랜드 및 짧은 올리고뉴클레오타이드 또는 더욱 긴 서열일 수 있다. 구체적으로, 핵산은 예를 들면, 플라스미드, 벡터, 에피좀 또는 발현 카세트로 유리하게 이루어질 수 있다. 이 데옥시리보핵산은 구체적으로, 복제의 기능성 또는 비기능성 기원, 1 이상의 마커 유전자, 전사 또는 복제를 위한 조절 서열, 해당 치료 유전자, 변형 또는 비변형 안티센스 서열, 또는 다른 세포 구획에 대한 결합 지역을 표적 세포로운반할 수 있다.
핵산은 바람직하게는 조절 서열, 예를 들면 1 이상의 프로모터 및 전사 종결자의 조절하에, 표적 세포에서 활성인 1 이상의 해당 치료 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 목적상, "해당 치료 유전자"라는 표현은 구체적으로, 치료 효과를 가지는 단백질 산물을 암호화하는 임의 유전자를 의미한다. 따라서 암호화된 단백질 산물은 구체적으로 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 이 단백질 산물은 표적 세포에 관하여 외생성, 상동성 또는 내생성일 수 있는데, 즉 이 세포가 다른 병상을 보이지 않을 경우 정상적으로는 표적 세포에서 발현되는 산물이다. 이러한 경우, 단백질의 발현은 예를 들면, 세포에서의 불충분한 발현, 또는 변형 때문에 비활성이거나 약하게 활성일 뿐인 단백질의 발현을 극복할 수 있게 하거나, 또는 대안적으로는 상기 단백질을 과잉발현할 수 있게 한다. 해당 치료 유전자는 또한 예를 들면, 증가된 안정성 또는 변형 활성을 가지는 세포 단백질의 돌연변이를 암호화할 수 있다. 단백질 산물은 또한 표적 세포에 대해 상동성일 수 있다. 이러한 경우, 예를 들면, 상보적 또는 세포에서 결손인 활성을 제공하는 발현된 단백질은, 세포를 병상과 싸울 수 있게 하거나, 또는 면역반응을 자극할 수 있다.
본 발명의 목적을 위한 치료제인 산물로는, 예를 들면, 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인(예를 들면, 인터루킨, 인터페론 또는 TNF: FR 92/03120), 성장 인자, 신경 전달물질 또는 이들의 전구체 또는 합성 효소, 트로픽(trophic) 인자(예를 들면, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF, NT3, NT5 또는 HARP/플레이오트로핀), 아포지방단백질(예를 들면, ApoAI, APoAIV 또는 APoE: FR 93/05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 91/11947), 뮤코비시도시스(mucoviscidosis)와 관련된 CFTR 단백질, 암 억제 유전자(예를 들면, p53, Rb, Rap1A, DCC, 또는 k-rev: FR 93/04745), 응고에 관련된 인자(예를 들면, VII, VIII 및 IX 인자)를 암호화하는 유전자, DNA 수선에 관련된 유전자, 자살 유전자(티미딘 키나제, 시토신 데아미나제), 헤모글로빈 유전자 또는 다른 단백질 트랜스포터, 및 대사 또는 이화 효소로 구성될 수 있다.
해당 치료 핵산은 또한, 표적 세포에서의 이의 발현이 유전자 발현 또는 세포질 mRNA의 전사를 조절할 수 있는 유전자 또는 안티센스 서열일 수 있다. 이러한 서열은 예를 들면, EP 140 308에 기재된 기술에 따라, 세포질 mRNA에 상보적인 RNA로서 표적 세포로 전사될 수 있고, 따라서 이의 단백질로의 해독을 방지한다. 치료 유전자는 또한 표적 RNA를 선택적으로 파괴할 수 있는 리보자임을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다(EP 321 201).
상기 언급하였듯이, 핵산은 또한 인간 또는 동물내 면역 반응을 생성할 수 있는 항원 펩타이드를 암호화하는 1 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 특정 양태에서, 본 발명은 특히 미생물, 바이러스 또는 암에 대한, 인간 또는 동물에 적용되는 백신 또는 면역치료제의 생산을 허용한다. 이들은 구체적으로, Epstein Barr 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스(EP 185 573), 슈도레이비스(pseudorabies) 바이러스, "syncitia 형성 바이러스", 다른 바이러스에 특이적인 항원 펩타이드 또는 암에 특이적인 항원 펩타이드일 수 있다(Ep 259 212).
핵산은 또한 바람직하게는 원하는 세포 또는 기관에서 해당 치료 유전자 및/또는 항원 펩타이드를 암호화하는 유전자의 발현을 허용하는 서열을 포함한다. 이는 이러한 서열이 감염된 세포에서 작용할 때 고려하에서 자연적으로 유전자의 발현의 원인인 서열일 수 있다. 이들은 또한 상이한 기원(다른 단백질 발현의 원인, 또는 심지어 합성)의 서열일 수 있다. 이들은 구체적으로, 진핵 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 이들은 감염하고자 하는 세포의 게놈으로부터 기원하는 프로모터 서열일 수 있다. 마찬가지로, 이들은 바이러스 게놈으로부터 유래하는 프로모터 서열일 수 있다. 이러한 관점에서, 예를 들면, E1A, MLP, CMV 또는 RSV 유전자의 프로모터를 들 수 있다. 뿐만 아니라, 이러한 발현 서열은, 예를 들면 활성화 서열 또는 조절 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 이 서열은 또한 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다.
따라서 형성된 폴리플렉스는 예를 들면, 국소, 피부, 구강, 직장, 질, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피, 기관지내 또는 복막내 투여의 목적으로 제형될 수 있다. 형성된 폴리플렉스는 바람직하게는 주사가능한 제형을 위한, 구체적으로는 원하는 기관으로 직접 주사가능한, 또는 국소 투여(피부 및/또는 점막)를 위한, 약학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 경우에 따라 만들어질 용액이 주사 가능하도록 멸균수 또는 생리식염수가 첨가된, 구체적으로는 멸균, 등장액 또는 건조 조성물, 특히 동결 조성물일 수 있다. 주사 및 다수의 투여에 사용되는 핵산의 용량은 다양한 파라미터의 함수에 따라, 구체적으로 사용된 투여 방법, 관련 병리, 발현될 유전자 또는 원하는 치료 기간의 함수에 따라 변용될 수 있 다. 투여의 방법에 관해 더욱 구체적으로는, 이는 조직, 예를 들면 암, 또는 순환계로의 직접 주사, 또는 주사 또는 이식에 의한 생체내 재이식에 따르는 배양으로의 세포 치료일 수 있다. 본 발명의 본문에서 고려되는 조직은, 예를 들면, 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 이자, 신장, 방광, 위, 소장, 정소, 난소, 직장, 신경계, 눈, 선 또는 연결 조직이다.
상기 기술된 폴리플렉스를 포함하는 조성물은 세포로 핵산을 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 조성물은 질병, 특히 단백질 산물 또는 핵산 산물의 결손의 결과인 질병을 치료하기 위하여 의학적 산물을 제조하는 데 사용될 수 있다.
세포로 핵산을 전달하기 위한 한 가지 방법은 하기 단계를 수행하는 것으로 이루어진다:
(1) 상기 폴리플렉스를 포함하는 조성물을 형성한 다음,
(2) (1)에서 형성된 조성물과 접촉시켜 세포를 배치한다.
전술한 배열 외에도, 본 발명은 또한 하기 실시예 및 도면으로부터 드러날 것이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않고 본 발명을 설명하는 것으로서 고려되어야 할, 다른 특징 및 이점을 포함한다.
도 1: 3 내지 28 범위의 전하비(+/-)에서 다양한 글리코실 폴리알킬렌이민/DNA 제형물에 대한, ECV304 세포에서 RLU/ug의 단백질내 루시퍼라제 활성을 나타내는 히스토그램(RLU: 상대적 광 단위("Relative Light Unit")).
흑색 연속선으로서의 곡선은 사용된 각 제형물 [3a], [3b], [4a] 및 [4b]에 대한 글리코실 폴리알킬렌이민 및 DNA 간의 전하비(+/-)에 따르는 세포 생존의 %를 나타낸다.
도 2: 3 내지 28 범위의 전하비(+/-)에서 다양한 글리코실 폴리알킬렌이민/DNA 제형물에 대한, HeLa 세포에서 RLU/ug의 단백질내 루시퍼라제 활성을 나타내는 히스토그램(RLU: 상대적 광 단위("Relative Light Unit")).
흑색 연속선으로서의 곡선은 사용된 각 제형물 [3a], [3b], [4a] 및 [4b]에 대한 글리코실 폴리알킬렌이민 및 DNA 간의 전하비(+/-)에 따르는 세포 생존의 %를 나타낸다.
도 3: 3 내지 28 범위의 전하비(+/-)에서 다양한 글리코실 폴리알킬렌이민/DNA 제형물에 대한, HepG2 세포에서 RLU/ug의 단백질내 루시퍼라제 활성을 나타내는 히스토그램(RLU: 상대적 광 단위("Relative Light Unit")).
흑색 연속선으로서의 곡선은 사용된 각 제형물 [3a], [3b], [4a] 및 [4b]에 대한 글리코실 폴리알킬렌이민 및 DNA간의 전하비(+/-)에 따르는 세포 생존의 %를 나타낸다.
도 4: 세포로 DNA를 전달하는 실험에서 사용된 pXL2774 플라스미드의 개략도.
실시예 1: 4% PEI-말토스 [3a]의 제조
수행된 반응은 하기와 같이 개략적으로 기재될 수 있다:
0.02 mmol의 PEI 25 KDa(500 mg, Aldrich)를 20 ml의 무수 에탄올에 용해시킨다. 0.7 mmol의 말토스(252 mg)를 이어서 가하고 수득된 용액을 질소 대기하에 15분간 혼합한다. 1 mmol의 티타늄 IV 이소프로폭사이드(0.3 ml)를 반응 혼합물에 서서히 가하고 밤새 교반을 지속한다. 0.75 mmol의 나트륨 보로하이드라이드(28.5 mg)를 이어서 가하고 교반을 8시간 동안 지속한다. 반응 혼합물을 이어서 여과한 다음 10 ml가 되게 농축시킨다. 생성 용액을 최종적으로 12시간 동안 투석한다(사이즈 12000의 배제 막). 수율은 80%이다.
그래프팅된 말토스 잔기의 %는 전술한 레조르시놀법으로 측정된다: 23 말토스 잔기가 PEI 25 KDa 상으로 그래프팅되며, 이는 4%의 아미노 그룹의 그래프팅 정도에 상응한다.
실시예 2: 12% PEI-말토스 [3b]의 제조
0.02 mmol의 PEI 25 KDa(500 mg, Aldrich)를 20 ml의 무수 에탄올에 용해시킨다. 2 mmol의 말토스(720 mg)를 이어서 가하고 수득된 용액을 질소 대기하에 15분간 혼합한다. 2.7 mmol의 티타늄 IV 이소프로폭사이드(0.8 ml)를 반응 혼합물에 서서히 가하고 밤새 교반을 지속한다. 2 mmol의 나트륨 보로하이드라이드(76 mg)를 이어서 가하고 교반을 8시간 동안 지속한다. 반응 혼합물을 이어서 여과한 다음 10 ml가 되게 농축시킨다. 생성 용액을 최종적으로 12시간 동안 투석한다(사이즈 12000의 배제 막). 수율은 80%이다.
그래프팅된 말토스 잔기의 %는 전술한 레조르시놀법으로 측정된다: 70 말토스 잔기가 PEI 25 KDa 상으로 그래프팅되며, 이는 12%의 아미노 그룹의 그래프팅 정도에 상응한다.
실시예 3: 6% PEI-락토스 [4a]의 제조
0.02 mmol의 PEI 25 KDa(500 mg, Aldrich)를 20 ml의 무수 에탄올에 용해시 킨다. 1 mmol의 락토스(360 mg)를 이어서 가하고 수득된 용액을 질소 대기하에 15분간 혼합한다. 1.35 mmol의 티타늄 IV 이소프로폭사이드(0.4 ml)를 반응 혼합물에 서서히 가하고 밤새 교반을 지속한다. 1 mmol의 나트륨 보로하이드라이드(38 mg)를 이어서 가하고 교반을 8시간 동안 지속한다. 반응 혼합물을 이어서 여과한 다음 10 ml가 되게 농축시킨다. 생성 용액을 최종적으로 12시간 동안 투석한다(사이즈 12000의 배제 막). 수율은 80%이다.
그래프팅된 락토스 잔기의 %는 전술한 레조르시놀법으로 측정된다: 35 락토스 잔기가 PEI 25 KDa 상으로 그래프팅되며, 이는 6%의 아미노 그룹의 그래프팅 정도에 상응한다.
실시예 4: 17% PEI-락토스 [4b]의 제조
0.02 mmol의 PEI 25 KDa(500 mg, Aldrich)를 20 ml의 무수 에탄올에 용해시킨다. 3 mmol의 락토스(1080 mg)를 이어서 가하고 수득된 용액을 질소 대기하에 15분간 혼합한다. 4 mmol의 티타늄 IV 이소프로폭사이드(1.2 ml)를 반응 혼합물에 서서히 가하고 밤새 교반을 지속한다. 3 mmol의 나트륨 보로하이드라이드(114 mg)을 이어서 가하고 교반을 8시간 동안 지속한다. 반응 혼합물을 이어서 여과한 다음 10 ml가 되게 농축시킨다. 생성 용액을 최종적으로 12시간 동안 투석한다(사이즈 12000의 배제 막). 수율은 80%이다.
그래프팅된 락토스 잔기의 %는 전술한 레조르시놀법으로 측정된다: 99 락토스 잔기가 PEI 25 KDa 상으로 그래프팅되며, 이는 17%의 아미노 그룹의 그래프팅 정도에 상응한다.
용례: 각종 세포형에서 4% 및 12% PEI-말토스와 또는 6% 및 17% PEI-락토스와 복그래프팅를 형성한 플라스미드 DNA의 시험관내 형질감염
본 실시예는 상기 합성된 작용화된 폴리알킬렌이민의 세포 중으로의 DNA 형질감염능을 설명한다.
사용되는 DNA는 150 mM 나트륨 클로라이드의 혼합물에 80 ㎍/ml의 농도로 용해시킨 플라스미드 pXL2774이다. 이 플라스미드는 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터의 조절하에 루시퍼라제를 암호화하는 luc 유전자를 함유한다. 크기는 4500 bp이다. 이 플라스미드의 개략도를 도 4에 나타내었다. 플라스미드 pXL2774는 특허출원 WO 97/35002에 기술된 방법에 따라 정제된다.
목적하는 전하비에 따라 가변 농도로, 용적에 대한 플라스미드 pXL2774 용적의 용액을 물에 희석한 작용화된 PEI의 용액과 혼합시켜 폴리플렉스를 제조한다.
24-웰 마이크로플레이트를 웰당 60,000 HeLa 세포(ATCC)로 접종하고, 24시간 후에 형질감염시킨다. 폴리플렉스 용액 50 ㎕를 각각의 웰에 적가한다. 혈청의 부재하에서, 배지에 형질감염 2시간 전에 FCS(태 송아지 혈청)로 사전에 보충한다. 이어서, 세포를 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 이어서, 복그래프팅를 함유하는 배지를 제거한 다음 DMEM과 10% 태 송아지 혈청의 혼합물로 대체한다. 이어서, 세포를 다시 24시간 동안 배양한다. 최종적으로, 세포를 용해시킨 다음 루시퍼라제 시험 키트(Promega) 및 Dynex MLX 광도계를 사용하여 시험한다. 아울러, 폴리플렉스의 독성을 세포 용해물의 농도를 측정함으로써 평가하고 용해물내 단백질 ㎍당 효소 활성으로서 나타낸다.
도 1, 2 및 3에 나타낸 결과는 DNA와의 가변적인 전하비에 대해 상기 합성된 각종 작용화된 PEI로 및 3종의 상이한 세포주에서 형질감염 효능을 나타낸다.
전체적으로는, 고도의 그래프팅으로 PEI로부터 형성된 폴리플렉스가 사용될 때를 제외하고는 전달 효능이 비교적 높은 것으로 판명된다(12% PEI-말토스로의 효능은 4% PEI-말토스로의 효능보다 낮고 17% PEI-락토스로의 효능은 6% PEI-락토스로의 것보다 낮다). 따라서, 그래프팅 정도는 구상되는 적용에 따라 최적화하는 것이 중요한 파라미터이다.
또한, 아미노 그룹을 작용화된 헤미아세탈로 치환시키는 것이 세포에 대하여, 특히 높은 DNA 전하비에서, PEI에 의해 유도된 독성을 현저히 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로는, 세포의 생존%(도 1, 2 및 3)는 DNA의 형질감염을 위해 비작용화된 PEI를 사용하여 수득되는 것보다 훨씬 더 높게 잔류한다.
따라서, 본 실시예는 신뢰할 만하고 저렴한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 작용화된 폴리알킬렌이민이 DNA를 세포 중으로 형질감염시키기 위한 양호한 후보임을 보여준다.
Claims (22)
- 폴리알킬렌이민이 티타늄 (IV) 이소프로폭사이드와 나트륨 보로하이드라이드의 존재하에 작용화된 헤미아세탈로 처리됨을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 방법이 알콜 용매 중에서 수행됨을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 2 항에 있어서, 알콜 용매가 메탄올 또는 에탄올임을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 방법이 또한 10 내지 30℃의 온도에서 수행됨을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 폴리알킬렌이민 mol당 25 내지 100 mol의 티타늄 (IV) 이소프로폭사이드가 사용됨을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 사용된 티타늄 (IV) 이소프로폭사이드의 양에 대해 50 내지 80%(몰)에 해당하는 양의 나트륨 보로하이드라이드가 사용됨을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 폴리알킬렌이민 mol당 6 내지 100 mol의 작용화된 헤미아세탈이 사용됨을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 출발 폴리알킬렌이민이 화학식 I로 표현됨을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.화학식 1
화학식 2
상기식에서,R은 수소 원자 또는 화학식 II의 그룹을 나타내고,n은 2 내지 10의 정수이며,p 및 q는 정수이고, p와 q의 합은 중합체의 평균 분자량이 100 내지 107 Da가 되게하는 값이다. - 제 8 항에 있어서, 출발 폴리알킬렌이민이 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 폴리프로필렌이민(PPI)임을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 9 항에 있어서, 출발 폴리알킬렌이민이 평균 분자량 50,000 내지 25,000 Da의 폴리에틸렌이민 또는 평균 분자량 800,000 Da의 폴리프로필렌이민 중에서 선택됨을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 작용화된 헤미아세탈이 하기 화학식으로 표현됨을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.화학식
상기식에서,n은 0 또는 1이고,R1, R2, R3 및 R4는 동일하거나 상이하고, 상호 독립적으로 수소 원자, 수행되는 반응과 상용성인 그룹 또는 표적화 요소를 나타내며,치환체 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 또는 하나만이 표적화 요소이다. - 제 11 항에 있어서, 상용성 그룹이 하이드록실, 탄소수 1 내지 4(1 내지 4C)의 알킬 또는 하이드록시알킬(1 내지 4C) 중에서 선택됨을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 11 항에 있어서, 표적화 요소가 당, 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 지질, 신경매개물질, 호르몬 및 비타민, 또는 이들의 유도체 충에서 선택됨을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 13 항에 있어서, 효적화 요소가 성장 인자 수용체 리간드, 사이토카인 수용체 리간드, 세포 렉틴 수용체 리간드, 인테그린 같은 부착 단백질의 수용체에 친화성을 띠는 RGE 서열의 리간드, 트랜스페린 수용체, HDL, LDL, 폴레이트 트랜스포터, Sialyl Lewis X, 항체 단편 Fab, 단일쇄 항체(ScFv) 및 모노-, 디- 또는 트리사카라이드 중에서 선택됨을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 14 항에 있어서, 사카라이드가 갈락토스, 만노스, 퓨코스, 람노스, 락토스 및 말토스 중에서 선택됨을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 폴리알킬렌이민 상에 그래프팅된 작용화된 헤미아세탈의 %가 1 내지 20%임을 특징으로 하는, 작용화된 폴리알킬렌이민의 제조방법.
- 제 1 항에 따른 방법에 의해 수득된 적어도 하나의 작용화된 폴리알킬렌이민 및 적어도 하나의 핵산을 포함하고, 시아나이드가 존재하지 않는 조성물.
- 제 17 항에 있어서, 핵산이 데옥시리보핵산 또는 리보핵산임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 18 항에 있어서, 핵산이 조절 서열의 조절하에 치료 목적의 하나 이상의 유전자를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 따른 방법에 의해 제조된 작용화된 폴리알킬렌 이민을 핵산에 첨가하는 단계를 포함하는, 시아나이드가 존재하지 않는 세포 형질감염용 조성물의 제조 방법.
- 삭제
- (1) 제 17 항에서 정의된 조성물을 형성한 다음,(2) 세포를 (1)에서 형성된 조성물과 접촉상태로 배치하는 단계를 포함하는, 세포 중으로 핵산의 전달방법.
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