JP2000135082A - 核酸との複合体および関連組成物の調製のためのカチオンポリマ―の使用 - Google Patents
核酸との複合体および関連組成物の調製のためのカチオンポリマ―の使用Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】カチオンポリマーおよび核酸を含む複合体およ
び組成物に関するものである。細胞一層詳しくは哺乳類
細胞中へ核酸を搬送する方法に関する。 【解決手段】 ａ）次の一般式： ［式中，重合度ｐは２から１００００００であり，Ｒ１
，Ｒ２ およびＲ３ は各［ＣＨ−ＣＨ２ ］繰返しにお
いて相互に独立にＨ，炭素原子１から２０のアルキルま
たは炭素原子５から７のアリールであり，ｎは０または
１であり，ただしポリマーの全長において少なくとも一
つのｎは１である］の少なくとも一種のポリマー，およ
び ｂ）少なくとも一種の核酸を含む複合体。核酸の細胞内
搬送に使用し得るこれら複合体を含む医薬組成物。
び組成物に関するものである。細胞一層詳しくは哺乳類
細胞中へ核酸を搬送する方法に関する。 【解決手段】 ａ）次の一般式： ［式中，重合度ｐは２から１００００００であり，Ｒ１
，Ｒ２ およびＲ３ は各［ＣＨ−ＣＨ２ ］繰返しにお
いて相互に独立にＨ，炭素原子１から２０のアルキルま
たは炭素原子５から７のアリールであり，ｎは０または
１であり，ただしポリマーの全長において少なくとも一
つのｎは１である］の少なくとも一種のポリマー，およ
び ｂ）少なくとも一種の核酸を含む複合体。核酸の細胞内
搬送に使用し得るこれら複合体を含む医薬組成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は，カチオンポリマー
および核酸を含む複合体および組成物に関するものであ
る。一層具体的には本発明は，細胞一層詳しくは哺乳類
細胞中へ核酸を搬送する方法に関する。
および核酸を含む複合体および組成物に関するものであ
る。一層具体的には本発明は，細胞一層詳しくは哺乳類
細胞中へ核酸を搬送する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般的には遺伝子治療は，機能遺伝子導
入による永久治療がなされ得る遺伝性欠乏症（嚢胞性繊
維症，ジストロフイー，血友病，．．．）に主として適
用され得るものと理解されている。しかし，一層大きな
疾病群特に獲得疾病（がん，ＡＩＤＳ，多発性硬化
症，．．．）は宿主細胞を過渡的に操作して有益タンパ
ク質を生産させることにより治療できるかもしれない。
入による永久治療がなされ得る遺伝性欠乏症（嚢胞性繊
維症，ジストロフイー，血友病，．．．）に主として適
用され得るものと理解されている。しかし，一層大きな
疾病群特に獲得疾病（がん，ＡＩＤＳ，多発性硬化
症，．．．）は宿主細胞を過渡的に操作して有益タンパ
ク質を生産させることにより治療できるかもしれない。
【０００３】遺伝子治療の他の応用は予防接種である。
この点に関しては，脊椎動物の細胞内に導入された核酸
によりコードされる免疫原性産物が，主要組織適合性抗
原に関連して上記細胞により発現および分泌されるかま
たは提供され，これにより発現された免疫原に対する免
疫応答が引き出される。機能核酸は各種の技法により細
胞中に導入でき，過渡的トランスフェクションと呼称さ
れる目的遺伝子の過渡的発現か，または宿主ゲノム中へ
の核酸の組み込みから生ずる宿主細胞の永久形質転換の
いずれかの結果を生ずる。
この点に関しては，脊椎動物の細胞内に導入された核酸
によりコードされる免疫原性産物が，主要組織適合性抗
原に関連して上記細胞により発現および分泌されるかま
たは提供され，これにより発現された免疫原に対する免
疫応答が引き出される。機能核酸は各種の技法により細
胞中に導入でき，過渡的トランスフェクションと呼称さ
れる目的遺伝子の過渡的発現か，または宿主ゲノム中へ
の核酸の組み込みから生ずる宿主細胞の永久形質転換の
いずれかの結果を生ずる。
【０００４】遺伝子治療の成功は，生物細胞中への遺伝
子情報の有効な搬送および細胞内での遺伝子情報の有効
な発現にかかっている。今日までに採用される大半の搬
送機構中には，ウイルスベクタ−特にアデノウイルス−
およびレトロウイルスベクターが包含される。ウイルス
は，細胞膜横断，エンドソームおよびリソソーム分解か
らの逃避，およびそれらのゲノムを最終的に核に搬送し
てウイルスゲノムを発現させることを包含する，この目
標達成のための，多様で高度に精巧な機構を発達させて
きた。結論的にウイルスはヒトに適用される予防接種ま
たは遺伝子治療において遺伝子搬送用の多数の用途に使
用されている。ウイルスの使用には多くの欠点がある：
レトロウイルスベクターは大きな寸法のＤＮＡ（例えば
ジストロフイン遺伝子，約１３ｋｂ）を収容できない，
レトロウイルスゲノムは宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ
て受容細胞中での遺伝子変化を起こし，感染性ウイルス
粒子が生物内または環境中へ伝播する可能性があり；ア
デノウイルスベクターは治療した患者に強い免疫応答を
誘発し得る（Mc Coy ら，1995, Human GeneTherapy,
6, 1553-1560; Yang ら，1996, Immunity, 1, 433-44
2）。これらの欠点にも係わらず，ウイルスベクターは
効率が良いので今日では最も有用な搬送システムであ
る。
子情報の有効な搬送および細胞内での遺伝子情報の有効
な発現にかかっている。今日までに採用される大半の搬
送機構中には，ウイルスベクタ−特にアデノウイルス−
およびレトロウイルスベクターが包含される。ウイルス
は，細胞膜横断，エンドソームおよびリソソーム分解か
らの逃避，およびそれらのゲノムを最終的に核に搬送し
てウイルスゲノムを発現させることを包含する，この目
標達成のための，多様で高度に精巧な機構を発達させて
きた。結論的にウイルスはヒトに適用される予防接種ま
たは遺伝子治療において遺伝子搬送用の多数の用途に使
用されている。ウイルスの使用には多くの欠点がある：
レトロウイルスベクターは大きな寸法のＤＮＡ（例えば
ジストロフイン遺伝子，約１３ｋｂ）を収容できない，
レトロウイルスゲノムは宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ
て受容細胞中での遺伝子変化を起こし，感染性ウイルス
粒子が生物内または環境中へ伝播する可能性があり；ア
デノウイルスベクターは治療した患者に強い免疫応答を
誘発し得る（Mc Coy ら，1995, Human GeneTherapy,
6, 1553-1560; Yang ら，1996, Immunity, 1, 433-44
2）。これらの欠点にも係わらず，ウイルスベクターは
効率が良いので今日では最も有用な搬送システムであ
る。
【０００５】1990年に Wolffら（Science, 247, 1465-1
468 ）は，特別の搬送システムなしに直接マウス骨格筋
中に裸のＲＮＡまたはＤＮＡを注射すると，筋細胞内に
リポーター遺伝子が発現することを示した。これらの結
果はin vivo で核酸自体が，ある種細胞中に到達し得る
ことを示すものではあるが，負に荷電した細胞膜を通じ
ての核酸の通過を核酸のポリアニオン性が主原因で制約
するので，そのトランスフェクション効率は実際上極め
て限定的に留まることが観察された。
468 ）は，特別の搬送システムなしに直接マウス骨格筋
中に裸のＲＮＡまたはＤＮＡを注射すると，筋細胞内に
リポーター遺伝子が発現することを示した。これらの結
果はin vivo で核酸自体が，ある種細胞中に到達し得る
ことを示すものではあるが，負に荷電した細胞膜を通じ
ての核酸の通過を核酸のポリアニオン性が主原因で制約
するので，そのトランスフェクション効率は実際上極め
て限定的に留まることが観察された。
【０００６】大量生産，安全性，トランスフェクション
し得る細胞の標的化，低抗原性および大きな断片のＤＮ
Ａを搬送し得る能力についての有利性を付与する細胞内
核酸摂取を改善する目的で，非ウイルス合成ベクターの
使用に準拠した各種方法が文献に提案された。
し得る細胞の標的化，低抗原性および大きな断片のＤＮ
Ａを搬送し得る能力についての有利性を付与する細胞内
核酸摂取を改善する目的で，非ウイルス合成ベクターの
使用に準拠した各種方法が文献に提案された。
【０００７】かくして1989年に Felgnerら（Nature, 33
7, 387-388）は，核酸等の大きなアニオン分子を細胞中
に導入し易くする目的で，カチオン脂質の採用を提案し
た。これらのカチオン脂質はアニオン分子と複合体を形
成し得るので，これらの分子の負電荷を中和して複合体
を緻密にする傾向があり，よって細胞中へのその導入を
好都合にする。脂質仲介トランスフェクション化合物の
例は，ＤＯＴＭＡ（Felgner ら，1987, PNAS, 84, 7413
-7417 ），ＤＯＧＳもしくは Transfectam Ｔ Ｍ (Behr
ら，1989, PNAS, 86, 6982-6986 ），ＤＭＲＩＥもしく
はＤＯＲＩＥ（Felgner ら, 1993, Methods 5, 67-75),
ＤＣ−ＣＨＯＬ（Gao et Huang, 1991, BBRC, 179, 280
-285），ＤＯＴＡＰＴＭ （McLachlan ら，1995, Gene
Therapy, 2, 674-622）もしくはLipofectamine ＴＭ
である。
7, 387-388）は，核酸等の大きなアニオン分子を細胞中
に導入し易くする目的で，カチオン脂質の採用を提案し
た。これらのカチオン脂質はアニオン分子と複合体を形
成し得るので，これらの分子の負電荷を中和して複合体
を緻密にする傾向があり，よって細胞中へのその導入を
好都合にする。脂質仲介トランスフェクション化合物の
例は，ＤＯＴＭＡ（Felgner ら，1987, PNAS, 84, 7413
-7417 ），ＤＯＧＳもしくは Transfectam Ｔ Ｍ (Behr
ら，1989, PNAS, 86, 6982-6986 ），ＤＭＲＩＥもしく
はＤＯＲＩＥ（Felgner ら, 1993, Methods 5, 67-75),
ＤＣ−ＣＨＯＬ（Gao et Huang, 1991, BBRC, 179, 280
-285），ＤＯＴＡＰＴＭ （McLachlan ら，1995, Gene
Therapy, 2, 674-622）もしくはLipofectamine ＴＭ
である。
【０００８】ポリマー仲介トランスフェクションに準拠
する非ウイルス搬送の他のシステムが開発された。例え
ばポリアミドアミン（Haensler et Szoka, 1993, Bioco
njugate Chem.,4, 372-379），樹状ポリマー（WO 95/24
221 号），ポリエチレンイミンもしくはポリプロピレン
イミン（WO 96/02655 号），ポリリシン（US-A-5,595,8
97号またはFR-A-2 719 316号）等のアニオンポリマーの
細胞搬送用への使用について多数の報告がある。
する非ウイルス搬送の他のシステムが開発された。例え
ばポリアミドアミン（Haensler et Szoka, 1993, Bioco
njugate Chem.,4, 372-379），樹状ポリマー（WO 95/24
221 号），ポリエチレンイミンもしくはポリプロピレン
イミン（WO 96/02655 号），ポリリシン（US-A-5,595,8
97号またはFR-A-2 719 316号）等のアニオンポリマーの
細胞搬送用への使用について多数の報告がある。
【０００９】しかしながら幾つかの研究（例えば Mahat
o らの J. Pharm. Sci., 1995, 84,1267-1271, Thierry
らの 1995, PNAS 92, 9742-9746 ）によれば，複合核
酸の細胞への移入効率は，特に in vivo 移入では複合
体と細胞膜との相互反応，関与細胞の型，カチオン成分
の脂質組成，アニオン分子で形成された複合体の寸法，
および特に，異なった複合体成分の正対負の電荷比の関
数として変動し得ることが示された。現今，細胞膜と複
合体との相互反応および細胞中への複合体の移入を可能
にする機構についてはほとんど知られておらず，進行中
の研究も極めて経験的範囲内に留まる。この結果，文献
に既に記載のものとは異なった性質を有する複合体に準
拠した細胞内核酸摂取増進のための改良方法の開発の必
要性がある。
o らの J. Pharm. Sci., 1995, 84,1267-1271, Thierry
らの 1995, PNAS 92, 9742-9746 ）によれば，複合核
酸の細胞への移入効率は，特に in vivo 移入では複合
体と細胞膜との相互反応，関与細胞の型，カチオン成分
の脂質組成，アニオン分子で形成された複合体の寸法，
および特に，異なった複合体成分の正対負の電荷比の関
数として変動し得ることが示された。現今，細胞膜と複
合体との相互反応および細胞中への複合体の移入を可能
にする機構についてはほとんど知られておらず，進行中
の研究も極めて経験的範囲内に留まる。この結果，文献
に既に記載のものとは異なった性質を有する複合体に準
拠した細胞内核酸摂取増進のための改良方法の開発の必
要性がある。
【００１０】ポリビニルアミンは特定ダイエット食中で
のコレステロール血症制御剤として既に医薬組成物にお
いて使用されている（EP-A-580 078号, EP-A-580 079
号）が，遺伝子治療的用途にこれを適用するまで当業者
を刺激するには至っていない。
のコレステロール血症制御剤として既に医薬組成物にお
いて使用されている（EP-A-580 078号, EP-A-580 079
号）が，遺伝子治療的用途にこれを適用するまで当業者
を刺激するには至っていない。
【００１１】US-A-5,629,184 号公報は，各種濃度
（０．５から７５モル％）のビニルアミンとビニルアル
コールとの共重合体を含むポリヌクレオチドの，細胞摂
取用組成物を記載する。この著者らはこれら組成物を i
n vitro で試験して，一般に，高濃度のアミノは細胞崩
壊を来す細胞毒に至り，一方，低濃度のものはポリヌク
レオチドのエンドソーム／リソソーム分布に帰着すると
いう結論に達した。
（０．５から７５モル％）のビニルアミンとビニルアル
コールとの共重合体を含むポリヌクレオチドの，細胞摂
取用組成物を記載する。この著者らはこれら組成物を i
n vitro で試験して，一般に，高濃度のアミノは細胞崩
壊を来す細胞毒に至り，一方，低濃度のものはポリヌク
レオチドのエンドソーム／リソソーム分布に帰着すると
いう結論に達した。
【００１２】フランス特許出願 FR 97/09209号および F
R 97/15807号（出願番号）は，次の一般式：
R 97/15807号（出願番号）は，次の一般式：
【化３】 ［式中，ｐは２から１０００の範囲である］のポリアリ
ルアミンは細胞には比較的毒性があるので遺伝子治療用
途には適用されないことを示す。
ルアミンは細胞には比較的毒性があるので遺伝子治療用
途には適用されないことを示す。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】この度本発明者は，細
胞中への核酸の細胞搬送を低毒性で遂行する有効なシス
テムを予想外にも提供し，したがって in vivo での遺
伝子治療への応用を見い出し得る，カチオンポリマー含
有新規複合体および組成物を確認した。
胞中への核酸の細胞搬送を低毒性で遂行する有効なシス
テムを予想外にも提供し，したがって in vivo での遺
伝子治療への応用を見い出し得る，カチオンポリマー含
有新規複合体および組成物を確認した。
【００１４】
【発明を解決するための手段】かくして本発明は先ず： ａ）一般式；
【化４】 ［式中，重合度ｐは２から１００００００，好ましくは
１０から１００００，一層好ましくは５０から２０００
の範囲であり，Ｒ１ ，Ｒ２ およびＲ３ は各［ＣＨ−
ＣＨ２ ］繰返しにおいて相互に独立にＨ，炭素原子１
から２０のアルキルまたは炭素原子５から７のアリール
であり，ｎは０または１であり，ただしポリマーの全長
において少なくとも一つのｎは１である］の少なくとも
一種のポリマー，およびｂ）少なくとも一種の核酸を含
む複合体に関する。
１０から１００００，一層好ましくは５０から２０００
の範囲であり，Ｒ１ ，Ｒ２ およびＲ３ は各［ＣＨ−
ＣＨ２ ］繰返しにおいて相互に独立にＨ，炭素原子１
から２０のアルキルまたは炭素原子５から７のアリール
であり，ｎは０または１であり，ただしポリマーの全長
において少なくとも一つのｎは１である］の少なくとも
一種のポリマー，およびｂ）少なくとも一種の核酸を含
む複合体に関する。
【００１５】本発明にしたがえば，上記アルキルまたは
アリール基は任意に繰返しでき，直鎖もしくは分岐であ
ってもよく，任意に置換されていてもよい。加えて，Ｒ
１，Ｒ２ および／またはＲ３ は分子環化のために連結
されていてもよい。
アリール基は任意に繰返しでき，直鎖もしくは分岐であ
ってもよく，任意に置換されていてもよい。加えて，Ｒ
１，Ｒ２ および／またはＲ３ は分子環化のために連結
されていてもよい。
【００１６】好ましい実施体様によれば，重合度ｐは１
から１０００ｋＤａ，好ましくは７から４５０ｋＤａの
範囲の分子質量を有するポリマーを取得する目的で選択
される。
から１０００ｋＤａ，好ましくは７から４５０ｋＤａの
範囲の分子質量を有するポリマーを取得する目的で選択
される。
【００１７】上記ポリマーは例えば Lewis, E.A., Bark
er, J., St. Pierre, T. (1981) "Calorometric Titrat
ion of Poly (vinylamine) and Poly (iminoethylene).
"Macromolecules, 14, 546-551 に記載の方法に従って
合成できる。
er, J., St. Pierre, T. (1981) "Calorometric Titrat
ion of Poly (vinylamine) and Poly (iminoethylene).
"Macromolecules, 14, 546-551 に記載の方法に従って
合成できる。
【００１８】その上，アミノ官能基ならびにＲ１ ，Ｒ
２ および／またはＲ３ 基の存在により上記複合体のポ
リマーは，当業者には周知のＳＰＤＰもしくはＳＣＭ
Ｃ，官能化ＰＥＧ等のヘテロ二官能性反応基等のスペー
サーを介して，または直接に置換され得る（Mattson
ら，1993, Mol. Biol. Reports, 17, 167-183 ）。これ
らの置換基は科学刊行物中に広く開示される次の要素の
少なくとも一つであり得る：例えば in vitro または i
n vivo 投与後にポリマーまたは複合化核酸の分布の視
覚化を可能ならしめるラベル化分子（例えば US-A-4,71
1,955 号に開示の分子を参照）；細胞標的化分子（リガ
ンド）または固定化分子；細胞中への浸透，エンドソー
ムの溶菌，または核指向細胞内輸送さえも容易にする諸
要素。これら諸要素は，糖類，グリコール，ペプチド
（例えばＧＲＰ，ガストリン放出ペプチド），オリゴヌ
クレオチド，脂質（特にＣ２−Ｃ２２のもの），ホルモ
ン，ビタミン，抗原，抗体（またはその断片），特異的
膜受容体リガンド，抗リガンドと反応し得るリガンド，
融合誘導（fusogenic）ペプチド，核局在ペプチド，の
全てもしくは一部，または上記化合物の組合わせ、例え
ば肝細胞の表面上のアシアロ糖タンパク質受容体を標的
とするガラクトシル残基，膜融合の場合のインフルエン
ザウイルス血球凝集素のＨＡ−２サブユニット由来のＩ
ＮＦ−７融合誘導ペプチド（Plank らの 1994, J. Bio
l. Chem. 269, 12918-12924) ，またはＳＶ４０ウイル
ス（Lanford および Butel, 1984, Cell 37, 801-813）
のＴ−抗原由来の，またはエプスタイン・バールウイル
ス（Ambinder ら, 1991, J. Virol. 65, 1466-1478 ）
のＥＢＮＡ−１タンパク質由来の核シグナル配列から構
成されてもよい。その上，本発明にしたがったポリマー
のアミノ基ならびにＲ１ ，Ｒ２および／またはＲ３ 基
はフランス特許出願 FR 97/09209 号および FR 97/158
07 号中に記載の親水基Ｒで一部または全部が置換され
ていてもよく，これらの内容は本出願の一部として本明
細書中に加入する。
２ および／またはＲ３ 基の存在により上記複合体のポ
リマーは，当業者には周知のＳＰＤＰもしくはＳＣＭ
Ｃ，官能化ＰＥＧ等のヘテロ二官能性反応基等のスペー
サーを介して，または直接に置換され得る（Mattson
ら，1993, Mol. Biol. Reports, 17, 167-183 ）。これ
らの置換基は科学刊行物中に広く開示される次の要素の
少なくとも一つであり得る：例えば in vitro または i
n vivo 投与後にポリマーまたは複合化核酸の分布の視
覚化を可能ならしめるラベル化分子（例えば US-A-4,71
1,955 号に開示の分子を参照）；細胞標的化分子（リガ
ンド）または固定化分子；細胞中への浸透，エンドソー
ムの溶菌，または核指向細胞内輸送さえも容易にする諸
要素。これら諸要素は，糖類，グリコール，ペプチド
（例えばＧＲＰ，ガストリン放出ペプチド），オリゴヌ
クレオチド，脂質（特にＣ２−Ｃ２２のもの），ホルモ
ン，ビタミン，抗原，抗体（またはその断片），特異的
膜受容体リガンド，抗リガンドと反応し得るリガンド，
融合誘導（fusogenic）ペプチド，核局在ペプチド，の
全てもしくは一部，または上記化合物の組合わせ、例え
ば肝細胞の表面上のアシアロ糖タンパク質受容体を標的
とするガラクトシル残基，膜融合の場合のインフルエン
ザウイルス血球凝集素のＨＡ−２サブユニット由来のＩ
ＮＦ−７融合誘導ペプチド（Plank らの 1994, J. Bio
l. Chem. 269, 12918-12924) ，またはＳＶ４０ウイル
ス（Lanford および Butel, 1984, Cell 37, 801-813）
のＴ−抗原由来の，またはエプスタイン・バールウイル
ス（Ambinder ら, 1991, J. Virol. 65, 1466-1478 ）
のＥＢＮＡ−１タンパク質由来の核シグナル配列から構
成されてもよい。その上，本発明にしたがったポリマー
のアミノ基ならびにＲ１ ，Ｒ２および／またはＲ３ 基
はフランス特許出願 FR 97/09209 号および FR 97/158
07 号中に記載の親水基Ｒで一部または全部が置換され
ていてもよく，これらの内容は本出願の一部として本明
細書中に加入する。
【００１９】かかる置換ポリマーは，特にアミン部位上
のトリフルオロアセチル，Ｆｍｏｃ（９−フルオレニル
メトキシカルボニル）またはＢＯＣ（tert- ブチルオキ
シカルボニル）等の保護基を用いた化学的結合により，
文献記載の技法により容易に得ることができる。引続い
ての保護基の選択的除去により標的要素のカップリング
が可能になり，次いでこのポリマーの完全な脱保護を可
能にする（Greene T.W. および Wuts P.G.M., 1991, Pr
otective groups in organicsynthesis. Ed. J. Wiley
& Sons, Inc. New York）。
のトリフルオロアセチル，Ｆｍｏｃ（９−フルオレニル
メトキシカルボニル）またはＢＯＣ（tert- ブチルオキ
シカルボニル）等の保護基を用いた化学的結合により，
文献記載の技法により容易に得ることができる。引続い
ての保護基の選択的除去により標的要素のカップリング
が可能になり，次いでこのポリマーの完全な脱保護を可
能にする（Greene T.W. および Wuts P.G.M., 1991, Pr
otective groups in organicsynthesis. Ed. J. Wiley
& Sons, Inc. New York）。
【００２０】核酸との複合体を形成するためには，本発
明にしたがったポリマーはカチオン形態にある。このこ
とは，ａ）これらがアミノ基上に存在する少なくとも一
つの窒素原子にプロトンを結合させることによるプロト
ン化形態にあるか，またはｂ）これらがアミノ基上に存
在する少なくとも一つの窒素原子に例えば−ＣＨ３，−
Ｃ２ Ｈ５ または−ＣＨ２ ＣＨ２ ＯＨで結合すること
によるアンモニウム形態にあるか，またはｃ）これらは
ａ）およびｂ）の形態にあることを意味する。これらの
場合の上記カチオンポリマーは，例えばトリフルオロア
セテート，モノエチルスルフェート，アセテート，ヨウ
化物，塩化物，臭化物等の各種生物学的に許容される一
種または数種のアニオンと会合している。
明にしたがったポリマーはカチオン形態にある。このこ
とは，ａ）これらがアミノ基上に存在する少なくとも一
つの窒素原子にプロトンを結合させることによるプロト
ン化形態にあるか，またはｂ）これらがアミノ基上に存
在する少なくとも一つの窒素原子に例えば−ＣＨ３，−
Ｃ２ Ｈ５ または−ＣＨ２ ＣＨ２ ＯＨで結合すること
によるアンモニウム形態にあるか，またはｃ）これらは
ａ）およびｂ）の形態にあることを意味する。これらの
場合の上記カチオンポリマーは，例えばトリフルオロア
セテート，モノエチルスルフェート，アセテート，ヨウ
化物，塩化物，臭化物等の各種生物学的に許容される一
種または数種のアニオンと会合している。
【００２１】上記複合体に含まれる核酸は核酸の断片も
しくは核酸の一部を画定する，単鎖もしくは二重鎖，直
鎖もしくは環状，天然もしくは合成，修飾もしくは非修
飾（修飾実施例の場合は US-A-5,525,711 号, US-A-4,7
11,955号または EP-A-302 175 号参照）の，寸法限定さ
れないＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片であってもよ
い。特にこれは，ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ，
アンチセンスＲＮＡ，リボソームＲＮＡ，リボザイム，
ｔＲＮＡまたはかかるＲＮＡをコードするＤＮＡであっ
てもよい。”ポリヌクレオチド”および”核酸”なる用
語は本発明に関しては同義語である。核酸は，細胞へ搬
送された際に目的のポリペプチド，リボザイム，アンチ
センスもしくは他の分子を発生する目的で転写および翻
訳され得る，核酸の少なくとも一つのコード配列を含む
プラスミドもしくは直鎖ポリヌクレオチド形態であって
もよい。この核酸は，例えばアンチセンスもしくはリボ
ザイム機能のために細胞へと搬送されるオリゴヌクレオ
チドであってもよい。本発明にしたがう上記核酸はウイ
ルスタンパク質，またはカチオン脂質，またはカチオン
ポリマーと共配合させることも可能である。
しくは核酸の一部を画定する，単鎖もしくは二重鎖，直
鎖もしくは環状，天然もしくは合成，修飾もしくは非修
飾（修飾実施例の場合は US-A-5,525,711 号, US-A-4,7
11,955号または EP-A-302 175 号参照）の，寸法限定さ
れないＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片であってもよ
い。特にこれは，ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ，
アンチセンスＲＮＡ，リボソームＲＮＡ，リボザイム，
ｔＲＮＡまたはかかるＲＮＡをコードするＤＮＡであっ
てもよい。”ポリヌクレオチド”および”核酸”なる用
語は本発明に関しては同義語である。核酸は，細胞へ搬
送された際に目的のポリペプチド，リボザイム，アンチ
センスもしくは他の分子を発生する目的で転写および翻
訳され得る，核酸の少なくとも一つのコード配列を含む
プラスミドもしくは直鎖ポリヌクレオチド形態であって
もよい。この核酸は，例えばアンチセンスもしくはリボ
ザイム機能のために細胞へと搬送されるオリゴヌクレオ
チドであってもよい。本発明にしたがう上記核酸はウイ
ルスタンパク質，またはカチオン脂質，またはカチオン
ポリマーと共配合させることも可能である。
【００２２】好ましい実施態様におけるＤＮＡおよびＲ
ＮＡの両方は細胞へ搬送され，細胞内に滞留または細胞
から分泌され得る目的ポリペプチドをそこで形成し得
る。一層好ましい実施態様では，プラスミドＤＮＡが好
ましい。もし適切な遺伝情報を核酸が含むと，核酸は比
較的大量のコードポリペプチドの合成を指図する。細胞
へ搬送された核酸が免疫化ポリペプチドをコードする場
合，本発明にしたがう使用は，細胞内ウイルスを包含す
る感染因子（agents）に対する，また同時に腫瘍細胞に
対する有効で改善された免疫達成に応用できる。
ＮＡの両方は細胞へ搬送され，細胞内に滞留または細胞
から分泌され得る目的ポリペプチドをそこで形成し得
る。一層好ましい実施態様では，プラスミドＤＮＡが好
ましい。もし適切な遺伝情報を核酸が含むと，核酸は比
較的大量のコードポリペプチドの合成を指図する。細胞
へ搬送された核酸が免疫化ポリペプチドをコードする場
合，本発明にしたがう使用は，細胞内ウイルスを包含す
る感染因子（agents）に対する，また同時に腫瘍細胞に
対する有効で改善された免疫達成に応用できる。
【００２３】標的細胞による発現に必要な遺伝子情報中
には，上記ＤＮＡをｍＲＮＡへと転写し，かつｍＲＮＡ
をポリペプチドへと翻訳するに要する全ての要素が包含
される。各種脊椎動物システムでの使用に適する転写プ
ロモーターは周知である。適切なプロモーターの例中に
は，ウイルスプロモーターＲＳＶ，ＭＰＳＶ，ＳＶ４
０，ＣＭＶまたは７．５ｋワクシニアプロモーター，誘
発性プロモーター等が包含される。核酸は，イントロン
配列，標的配列，輸送用配列，複製もしくは組込み関与
配列も含み得る。上記配列は文献に報告があり，かつ当
業者により容易に取得できる。核酸はスペルミン等の特
定成分を用いて安定化することもできる。
には，上記ＤＮＡをｍＲＮＡへと転写し，かつｍＲＮＡ
をポリペプチドへと翻訳するに要する全ての要素が包含
される。各種脊椎動物システムでの使用に適する転写プ
ロモーターは周知である。適切なプロモーターの例中に
は，ウイルスプロモーターＲＳＶ，ＭＰＳＶ，ＳＶ４
０，ＣＭＶまたは７．５ｋワクシニアプロモーター，誘
発性プロモーター等が包含される。核酸は，イントロン
配列，標的配列，輸送用配列，複製もしくは組込み関与
配列も含み得る。上記配列は文献に報告があり，かつ当
業者により容易に取得できる。核酸はスペルミン等の特
定成分を用いて安定化することもできる。
【００２４】本発明にしたがうと，この核酸は発現標的
細胞に対してホモもしくはヘテロであり得る。有利なこ
とに上記核酸は，ポリペプチド特に治療用または予防用
ポリペプチドの全てまたは一部をコードする。ポリペプ
チドなる用語は寸法やグリコシル化の有無に係わらず、
ポリヌクレオチドの任意の翻訳産物であると理解され，
かつペプチドおよびタンパク質を包含する。治療用ポリ
ペプチドの主たる例中には，動物中の不完全もしくは欠
失タンパク質を償い得るポリペプチド，または毒性効果
を通じて有害細胞を体から制約または除去するように機
能するポリペプチドが包含される。これらは体液性もし
くは細胞性応答またはその両方を刺激する内因性免疫原
として機能する免疫授与ポリペプチドでもあり得る。本
発明によるコードされるポリペプチドの例としては，酵
素，ホルモン，サイトカイン，膜受容体，構造ポリペプ
チド，輸送ポリペプチド，アドヘシン（adhesine），リ
ガンド，転写因子，形質導入因子，複製因子，安定化因
子，抗体，さらに具体的にはＣＦＴＲ，ジストロフイ
ン，因子ＶＩＩＩもしくはＩＸ，ＨＰＶからのＥ6 もし
くはＥ7 ，ＭＵＣ1 ，ＢＲＣＡ1 ，インターフェロン
β，インターフェロンγ，インターロイキンＩＬ−２，
ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−７，Ｉｌ−１２，ＧＭ−Ｃ
ＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子），単純
ヘルペス１型ウイルス（ＨＳＶ−１）からのｔｋ遺伝
子，ｐ５３，ＶＥＧＦが挙げられる。このポリヌクレオ
チドは抗体もコードできる。この点についての抗体に
は，任意のクラスの全免疫グロブリン，二重もしくは多
重抗原またはエピトープ特異性を示すキメラ抗体および
ハイブリッド抗体，ならびにハイブリッド断片および抗
イデイオタイプ（US-A-4,699,880号）を含むＦ（ａｂ）
２ ，Ｆａｂ’，Ｆａｂ等の断片が包含される。
細胞に対してホモもしくはヘテロであり得る。有利なこ
とに上記核酸は，ポリペプチド特に治療用または予防用
ポリペプチドの全てまたは一部をコードする。ポリペプ
チドなる用語は寸法やグリコシル化の有無に係わらず、
ポリヌクレオチドの任意の翻訳産物であると理解され，
かつペプチドおよびタンパク質を包含する。治療用ポリ
ペプチドの主たる例中には，動物中の不完全もしくは欠
失タンパク質を償い得るポリペプチド，または毒性効果
を通じて有害細胞を体から制約または除去するように機
能するポリペプチドが包含される。これらは体液性もし
くは細胞性応答またはその両方を刺激する内因性免疫原
として機能する免疫授与ポリペプチドでもあり得る。本
発明によるコードされるポリペプチドの例としては，酵
素，ホルモン，サイトカイン，膜受容体，構造ポリペプ
チド，輸送ポリペプチド，アドヘシン（adhesine），リ
ガンド，転写因子，形質導入因子，複製因子，安定化因
子，抗体，さらに具体的にはＣＦＴＲ，ジストロフイ
ン，因子ＶＩＩＩもしくはＩＸ，ＨＰＶからのＥ6 もし
くはＥ7 ，ＭＵＣ1 ，ＢＲＣＡ1 ，インターフェロン
β，インターフェロンγ，インターロイキンＩＬ−２，
ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−７，Ｉｌ−１２，ＧＭ−Ｃ
ＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子），単純
ヘルペス１型ウイルス（ＨＳＶ−１）からのｔｋ遺伝
子，ｐ５３，ＶＥＧＦが挙げられる。このポリヌクレオ
チドは抗体もコードできる。この点についての抗体に
は，任意のクラスの全免疫グロブリン，二重もしくは多
重抗原またはエピトープ特異性を示すキメラ抗体および
ハイブリッド抗体，ならびにハイブリッド断片および抗
イデイオタイプ（US-A-4,699,880号）を含むＦ（ａｂ）
２ ，Ｆａｂ’，Ｆａｂ等の断片が包含される。
【００２５】本発明の特有実施態様では，カチオンポリ
マー／核酸複合体の寸法は小寸法の（５μｍ未満，一層
有利には５００ｎｍ未満，および好ましくは２０から２
００ｎｍの範囲）のものである。複合体寸法は特定用途
における最適使用に対して選択できる。
マー／核酸複合体の寸法は小寸法の（５μｍ未満，一層
有利には５００ｎｍ未満，および好ましくは２０から２
００ｎｍの範囲）のものである。複合体寸法は特定用途
における最適使用に対して選択できる。
【００２６】複合体寸法の測定は，動的レーザー光散乱
法（光子相関分光分析, PCS)ならびに当業者に既知の他
の技法（Washington, Particle Size Analysis in Phar
maceutics and other Industries, Ellis Horwood, New
York, 1992, 135-169参照）を包含する多数の技法によ
り遂行できるが，これらのみに限定されない。
法（光子相関分光分析, PCS)ならびに当業者に既知の他
の技法（Washington, Particle Size Analysis in Phar
maceutics and other Industries, Ellis Horwood, New
York, 1992, 135-169参照）を包含する多数の技法によ
り遂行できるが，これらのみに限定されない。
【００２７】また本発明は上記複合体の調製方法も関
し，この方法は一種または二種以上の上記ポリマーを一
種または二種以上の核酸と混合し，上記複合体を次いで
回収することを特徴とする。
し，この方法は一種または二種以上の上記ポリマーを一
種または二種以上の核酸と混合し，上記複合体を次いで
回収することを特徴とする。
【００２８】本発明にしたがった上記複合体形成のため
にカチオンポリマーに添加できる負荷電核酸濃度は，医
薬組成物のｍｌ当り１０μｇから５０００μｇの範囲で
ある。本発明の好ましい実施態様での核酸濃度は１００
μｇ／ｍｌから１０００μｇ／ｍｌの範囲である。
にカチオンポリマーに添加できる負荷電核酸濃度は，医
薬組成物のｍｌ当り１０μｇから５０００μｇの範囲で
ある。本発明の好ましい実施態様での核酸濃度は１００
μｇ／ｍｌから１０００μｇ／ｍｌの範囲である。
【００２９】特定の実施態様によれば，この複合体は上
記カチオンポリマーと上記核酸との間の上記複合体の形
成を改善し，または細胞膜を渡る上記複合体の輸送を容
易にし，かつエンドソーム分解を妨げることのできる少
なくとも一種の補助剤（adjuvant）をさらに含有する。
記カチオンポリマーと上記核酸との間の上記複合体の形
成を改善し，または細胞膜を渡る上記複合体の輸送を容
易にし，かつエンドソーム分解を妨げることのできる少
なくとも一種の補助剤（adjuvant）をさらに含有する。
【００３０】したがって本発明は，上記補助剤が正もし
くは負荷電で中性または双性イオンの脂質例えばトリグ
リセリド，ジグリセリド，コレステロール（US-A-5,43
8,044号参照）からなる群，および特にホスフアチジル
エタノールアミン（ＰＥ），ホスフアチジルコリン，ホ
スホコリン，ジオレオイルホスフアチジルエタノールア
ミン（ＤＯＰＥ），スフインゴミエリン，セラミドもし
くはセレブロシドまたはそれらの誘導体である正もしく
は負荷電で中性または両性の脂質，グリセロ脂質（PCT/
FR 98/00250号参照）等のカチオン脂質またはＰＥＧ化
脂質（WO 98/08489 号参照）またはクロロキン等のリソ
モトロピック因子からなる群から選択される。
くは負荷電で中性または双性イオンの脂質例えばトリグ
リセリド，ジグリセリド，コレステロール（US-A-5,43
8,044号参照）からなる群，および特にホスフアチジル
エタノールアミン（ＰＥ），ホスフアチジルコリン，ホ
スホコリン，ジオレオイルホスフアチジルエタノールア
ミン（ＤＯＰＥ），スフインゴミエリン，セラミドもし
くはセレブロシドまたはそれらの誘導体である正もしく
は負荷電で中性または両性の脂質，グリセロ脂質（PCT/
FR 98/00250号参照）等のカチオン脂質またはＰＥＧ化
脂質（WO 98/08489 号参照）またはクロロキン等のリソ
モトロピック因子からなる群から選択される。
【００３１】ポリマー：上記補助剤の比率は（重量基準
の）は１：０．１から１：１０の範囲でありうるが，こ
の比率は化合物の種類に応じて適応できる。好ましい実
施態様における上記比率は１：１である。これら副次的
な調整は当業者において操作し得る。正もしくは負荷電
で中性および／または両性の脂質の混合物も使用可能で
ある。
の）は１：０．１から１：１０の範囲でありうるが，こ
の比率は化合物の種類に応じて適応できる。好ましい実
施態様における上記比率は１：１である。これら副次的
な調整は当業者において操作し得る。正もしくは負荷電
で中性および／または両性の脂質の混合物も使用可能で
ある。
【００３２】ポリプレックスとも呼称する本発明におけ
る複合体は，全ての潜在カチオン基が事実上カチオン状
態にあり，かつ全ての潜在アニオン基が事実上アニオン
状態にあることを前提に，複合体中の核酸により提供さ
れる負電荷に対する，カチオンポリマーにより提供され
る正電荷の比である理論電荷比（＋／−）によっても特
徴付けできる。一般的には，複合体上の過剰な正電荷は
負荷電細胞表面への複合体の結合を容易にする。かかる
比率を得るためには，核酸中の全ての負電荷を考慮して
計算し，次いで所望の上記理論電荷比を得るのに要する
カチオンポリマー量を調整すべきである。他の成分の量
と濃度とは，それらのそれぞれのモル質量およびそれら
の正電荷数の関数として調整すべきである。この比率は
特に制約されない：量は，カチオンポリマー中の正電荷
数と核酸中の負電荷数との比率が０．０５から２０，特
に２．５から１５，および好ましくは２．５から１０に
なるように選択する。
る複合体は，全ての潜在カチオン基が事実上カチオン状
態にあり，かつ全ての潜在アニオン基が事実上アニオン
状態にあることを前提に，複合体中の核酸により提供さ
れる負電荷に対する，カチオンポリマーにより提供され
る正電荷の比である理論電荷比（＋／−）によっても特
徴付けできる。一般的には，複合体上の過剰な正電荷は
負荷電細胞表面への複合体の結合を容易にする。かかる
比率を得るためには，核酸中の全ての負電荷を考慮して
計算し，次いで所望の上記理論電荷比を得るのに要する
カチオンポリマー量を調整すべきである。他の成分の量
と濃度とは，それらのそれぞれのモル質量およびそれら
の正電荷数の関数として調整すべきである。この比率は
特に制約されない：量は，カチオンポリマー中の正電荷
数と核酸中の負電荷数との比率が０．０５から２０，特
に２．５から１５，および好ましくは２．５から１０に
なるように選択する。
【００３３】本発明中には，上記開示の少なくとも一種
の複合体を含む医薬組成物も包含される。かかる医薬組
成物は，遺伝子治療法の領域で患者の細胞または組織に
ポリヌクレオチドを搬送するために特に有用であるが，
これらの使用には限定はされない。”遺伝子治療法”な
る用語は，in vivo で細胞中にポリヌクレオチドを導入
するか，または in vitro で細胞中に導入後患者に再注
入するかのいずれかの方法として理解するのが好まし
い。特に”遺伝子治療”なる用語は，遺伝子産物が標的
組織中で発現される場合ならびに遺伝子産物が特に血流
中に放出される場合に関する。本発明においては，核
酸，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチドまたは遺伝
子は同義語である。
の複合体を含む医薬組成物も包含される。かかる医薬組
成物は，遺伝子治療法の領域で患者の細胞または組織に
ポリヌクレオチドを搬送するために特に有用であるが，
これらの使用には限定はされない。”遺伝子治療法”な
る用語は，in vivo で細胞中にポリヌクレオチドを導入
するか，または in vitro で細胞中に導入後患者に再注
入するかのいずれかの方法として理解するのが好まし
い。特に”遺伝子治療”なる用語は，遺伝子産物が標的
組織中で発現される場合ならびに遺伝子産物が特に血流
中に放出される場合に関する。本発明においては，核
酸，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチドまたは遺伝
子は同義語である。
【００３４】この医薬組成物は医薬として容認される担
体をさらに含有するのが好ましい。この担体は等張性，
低張性または弱高張性であり，スクロース溶液により提
供されるような比較的低イオン強度を示すのが好まし
い。その上，関連溶媒，発熱物質を含まない滅菌水含有
水性もしくは部分水性液状担体，分散媒体，コーテイン
グ剤，および同等物の任意のものを含有できる。この医
薬製剤のｐＨは適切に調整し，緩衝性とする。
体をさらに含有するのが好ましい。この担体は等張性，
低張性または弱高張性であり，スクロース溶液により提
供されるような比較的低イオン強度を示すのが好まし
い。その上，関連溶媒，発熱物質を含まない滅菌水含有
水性もしくは部分水性液状担体，分散媒体，コーテイン
グ剤，および同等物の任意のものを含有できる。この医
薬製剤のｐＨは適切に調整し，緩衝性とする。
【００３５】本発明にしたがった医薬組成物は脊椎動物
組織中に投与できる。この投与は，皮内，皮下，静脈
内，筋内，鼻腔内，脳内，気管内，動脈内，腹腔内，膀
胱内，胸膜内，冠動脈内または腫瘍内注射により，注射
器もしくは他の手段を用いて実施できる。吸入またはエ
ーロゾル経路による経皮投与も考慮できる。
組織中に投与できる。この投与は，皮内，皮下，静脈
内，筋内，鼻腔内，脳内，気管内，動脈内，腹腔内，膀
胱内，胸膜内，冠動脈内または腫瘍内注射により，注射
器もしくは他の手段を用いて実施できる。吸入またはエ
ーロゾル経路による経皮投与も考慮できる。
【００３６】本発明にしたがえばこの医薬組成物は，
筋，皮膚，脳，肺，肝臓，脾臓，骨髄，胸腺，心臓，リ
ンパ，骨，軟骨，膵臓，腎臓，胆嚢，胃，腸，睾丸，卵
巣，子宮，直腸，神経系，眼，腺，結合組織，血液，腫
瘍等を包含する，脊椎動物身体の標的組織中に投与され
得る。
筋，皮膚，脳，肺，肝臓，脾臓，骨髄，胸腺，心臓，リ
ンパ，骨，軟骨，膵臓，腎臓，胆嚢，胃，腸，睾丸，卵
巣，子宮，直腸，神経系，眼，腺，結合組織，血液，腫
瘍等を包含する，脊椎動物身体の標的組織中に投与され
得る。
【００３７】In vivo での遺伝子治療に応用すると，本
発明は投与製剤の重要な免疫反応の生ずる危険なしに患
者への繰り返し投与を可能にする。投与は，単回もしく
は繰返し用量，ある時間経過後の１回もしくは数回によ
り実施できる。繰返し投与すると，活性物質特に単回投
与したＤＮＡの用量の低減を可能にする。投与経路およ
び適切な用量は例えば個々の患者，処置すべき病気，ま
たは搬送核酸等の種々のパラメーターの関数で変わる。
発明は投与製剤の重要な免疫反応の生ずる危険なしに患
者への繰り返し投与を可能にする。投与は，単回もしく
は繰返し用量，ある時間経過後の１回もしくは数回によ
り実施できる。繰返し投与すると，活性物質特に単回投
与したＤＮＡの用量の低減を可能にする。投与経路およ
び適切な用量は例えば個々の患者，処置すべき病気，ま
たは搬送核酸等の種々のパラメーターの関数で変わる。
【００３８】一層具体的には，本発明は上記複合体の少
なくとも一種を含み，かつ上記複合体のトランスフェク
ション能力を改善し得る少なくとも一種の補助剤をも配
合した医薬組成物に関する。補助剤はクロロキン；プロ
トン性極性化合物例えばプロピレングリコール，ポリエ
チレングリコール，グリセロール，ＥｔＯＨ，１−メチ
ルＬ−２−ピロリドンもしくはこれらの誘導体；または
非プロトン性極性化合物例えばジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ），ジエチルスルホキシド，ジ−ｎ−プロピ
ルスルホキシド，ジメチルスルホン，スルホラン，ジメ
チルホルムアミド，ジメチルアセトアミド，テトラメチ
ル尿素，アセトニトリルまたはこれらの誘導体；からな
る群から選択できる。
なくとも一種を含み，かつ上記複合体のトランスフェク
ション能力を改善し得る少なくとも一種の補助剤をも配
合した医薬組成物に関する。補助剤はクロロキン；プロ
トン性極性化合物例えばプロピレングリコール，ポリエ
チレングリコール，グリセロール，ＥｔＯＨ，１−メチ
ルＬ−２−ピロリドンもしくはこれらの誘導体；または
非プロトン性極性化合物例えばジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ），ジエチルスルホキシド，ジ−ｎ−プロピ
ルスルホキシド，ジメチルスルホン，スルホラン，ジメ
チルホルムアミド，ジメチルアセトアミド，テトラメチ
ル尿素，アセトニトリルまたはこれらの誘導体；からな
る群から選択できる。
【００３９】本発明にしたがえば，”細胞”なる用語中
には，原核生物細胞および真核生物細胞，酵母細胞，植
物細胞，ヒトもしくは動物細胞特に哺乳類細胞が包含さ
れる。特にがん細胞を挙げる必要がある。本発明は肺，
気管，皮膚，筋，脳，肝臓，心臓，脾臓，骨髄，胸腺，
膀胱，リンパ系，血液，膵臓，胃，腎臓，卵巣，睾丸，
直腸 ，抹消または中枢神経系，眼，リンパ器官，軟
骨，内皮中の組織の間質または管腔（luminal）空間中
に in vivo で適用できる。好ましい実施態様では，こ
の細胞は筋細胞，造血系幹細胞，または気道細胞，特に
気管または肺細胞であり，好ましくは呼吸器上皮細胞で
ある。
には，原核生物細胞および真核生物細胞，酵母細胞，植
物細胞，ヒトもしくは動物細胞特に哺乳類細胞が包含さ
れる。特にがん細胞を挙げる必要がある。本発明は肺，
気管，皮膚，筋，脳，肝臓，心臓，脾臓，骨髄，胸腺，
膀胱，リンパ系，血液，膵臓，胃，腎臓，卵巣，睾丸，
直腸 ，抹消または中枢神経系，眼，リンパ器官，軟
骨，内皮中の組織の間質または管腔（luminal）空間中
に in vivo で適用できる。好ましい実施態様では，こ
の細胞は筋細胞，造血系幹細胞，または気道細胞，特に
気管または肺細胞であり，好ましくは呼吸器上皮細胞で
ある。
【００４０】また本発明は細胞中への核酸の移入方法を
包含し，上記方法は，本発明にしたがった少なくとも一
種の複合体または組成物と上記細胞とを接触させること
を包含する。この方法は上記複合体または組成物の動物
細胞への直接投与により invivo で，または動物から
回収した細胞を in vitro で処理後，その動物身体へと
再導入（ex vivo 法）することにより適用できる。In v
itro での適用では，適切な媒体上で培養した細胞を本
発明にしたがう複合体もしくは組成物からなる懸濁物と
接触させる。保温時間後，細胞を洗浄し回収する。活性
物質の導入は任意の適切な方法により確認（最終的には
細胞の溶解後）できる。
包含し，上記方法は，本発明にしたがった少なくとも一
種の複合体または組成物と上記細胞とを接触させること
を包含する。この方法は上記複合体または組成物の動物
細胞への直接投与により invivo で，または動物から
回収した細胞を in vitro で処理後，その動物身体へと
再導入（ex vivo 法）することにより適用できる。In v
itro での適用では，適切な媒体上で培養した細胞を本
発明にしたがう複合体もしくは組成物からなる懸濁物と
接触させる。保温時間後，細胞を洗浄し回収する。活性
物質の導入は任意の適切な方法により確認（最終的には
細胞の溶解後）できる。
【００４１】導入または移入方法それ自体は周知であ
る。”導入または移入なる用語は，負荷電活性物質が細
胞中へと搬送され，最終的には上記細胞内またはその膜
内もしくは膜上に位置を定めることを意味する。この活
性物質が核酸である場合，これを”トランスフエクショ
ン”と呼称する。トランスフェクションは例えば上記遺
伝子の発現を測定し，または発現タンパク質もしくはそ
のｍＲＮＡの濃度測定により，またはその生物学的効力
の測定等の適切な任意の方法で実証できる。
る。”導入または移入なる用語は，負荷電活性物質が細
胞中へと搬送され，最終的には上記細胞内またはその膜
内もしくは膜上に位置を定めることを意味する。この活
性物質が核酸である場合，これを”トランスフエクショ
ン”と呼称する。トランスフェクションは例えば上記遺
伝子の発現を測定し，または発現タンパク質もしくはそ
のｍＲＮＡの濃度測定により，またはその生物学的効力
の測定等の適切な任意の方法で実証できる。
【００４２】本発明にしたがった in vivo での治療の
場合，トランスフェクション率を向上させる目的で，患
者に上記医薬調製物の投与に先立ちマクロフアージ枯渇
（depletion）処理を実施してもよい。かかる技法は文
献（特に Van Rooijenら, 1997, TibTech, 15, 178-184
参照）に記載がある。
場合，トランスフェクション率を向上させる目的で，患
者に上記医薬調製物の投与に先立ちマクロフアージ枯渇
（depletion）処理を実施してもよい。かかる技法は文
献（特に Van Rooijenら, 1997, TibTech, 15, 178-184
参照）に記載がある。
【００４３】一層具体的には本発明は次の一般式：
【化５】 ［式中，重合度ｐは２から１０Ｅ６，好ましくは１０か
ら１０Ｅ４，一層好ましくは５０から２０００の範囲で
あり，Ｒ１ ，Ｒ２ およびＲ３ は各［ＣＨ−ＣＨ２ ］
繰り返しにおいて互いに独立にＨ，炭素原子１から２０
のアルキルまたは炭素原子５から７のアリール，ｎは０
または１であるが，ポリマーの全長において少なくとも
一つのｎは１であることが前提］のポリマーの使用，ま
たは遺伝子治療用医薬組成物の調製，一層具体的には核
酸の細胞内搬送の方法に使用する目的の上記ポリマーと
核酸との間の複合体の使用に関するものである。
ら１０Ｅ４，一層好ましくは５０から２０００の範囲で
あり，Ｒ１ ，Ｒ２ およびＲ３ は各［ＣＨ−ＣＨ２ ］
繰り返しにおいて互いに独立にＨ，炭素原子１から２０
のアルキルまたは炭素原子５から７のアリール，ｎは０
または１であるが，ポリマーの全長において少なくとも
一つのｎは１であることが前提］のポリマーの使用，ま
たは遺伝子治療用医薬組成物の調製，一層具体的には核
酸の細胞内搬送の方法に使用する目的の上記ポリマーと
核酸との間の複合体の使用に関するものである。
【００４４】好ましい実施態様における重合度ｐは，分
子量１から１０００ｋＤａ，好ましくは７から４５０ｋ
Ｄａ範囲のポリマーを得る目的で選択される。
子量１から１０００ｋＤａ，好ましくは７から４５０ｋ
Ｄａ範囲のポリマーを得る目的で選択される。
【００４５】その上，そのカチオン性にしたがえば，上
記ポリマーはアニオン分子の細胞内搬送が必要な場合の
治療用医薬組成物の調製にも使用できる。かかるアニオ
ン分子は，核酸に限定して理解されるべきではなく，タ
ンパク質，薬剤等から構成されてもよい。
記ポリマーはアニオン分子の細胞内搬送が必要な場合の
治療用医薬組成物の調製にも使用できる。かかるアニオ
ン分子は，核酸に限定して理解されるべきではなく，タ
ンパク質，薬剤等から構成されてもよい。
【００４６】最後に本発明は前述のように複合体でトラ
ンスフェクションされた細胞，特に原核生物細胞，酵母
もしくは真核生物細胞特に哺乳類細胞，および特にがん
性細胞に関する。この発明は，気道細胞特に気管または
肺細胞，およびさらに呼吸気管上皮細胞に対して殊の外
有効である。
ンスフェクションされた細胞，特に原核生物細胞，酵母
もしくは真核生物細胞特に哺乳類細胞，および特にがん
性細胞に関する。この発明は，気道細胞特に気管または
肺細胞，およびさらに呼吸気管上皮細胞に対して殊の外
有効である。
【００４７】説明態様でこの発明を記載したので，採用
した用語は制限目的ではなく記載目的を意図したもので
あることを理解されるべきである。上記教示の観点から
本発明は多くの修飾および変更が可能であることは明ら
かである。したがって特許請求の範囲以内において本発
明は，特定的に記載した以外の態様で実施し得ることを
理解されるべきである。
した用語は制限目的ではなく記載目的を意図したもので
あることを理解されるべきである。上記教示の観点から
本発明は多くの修飾および変更が可能であることは明ら
かである。したがって特許請求の範囲以内において本発
明は，特定的に記載した以外の態様で実施し得ることを
理解されるべきである。
【００４８】
【実施例】（細胞）トランスフェクションに先立ち３７
℃および５％ＣＯ２ ２４時間での培養器中，１０％胎
児ウシ血清，グルタミン２８６ｍｇ／ｍｌおよびグルコ
ース２ｇ／ｌで補給したＤＭＥＭ培地中でＡ５４９細胞
（肺がん細胞系統）を保温し，トランスフェクション時
間で６０−８０％密集に達するように４８マルチウエル
板中で細胞を播種する。
℃および５％ＣＯ２ ２４時間での培養器中，１０％胎
児ウシ血清，グルタミン２８６ｍｇ／ｍｌおよびグルコ
ース２ｇ／ｌで補給したＤＭＥＭ培地中でＡ５４９細胞
（肺がん細胞系統）を保温し，トランスフェクション時
間で６０−８０％密集に達するように４８マルチウエル
板中で細胞を播種する。
【００４９】（プラスミド）サイトメガロウイルスエン
ハンサー／プロモーターの制御下にイントロンＨＭＧ1
を含む Photinus pyralis ルシフエラーゼ遺伝子をコー
ドするｐＴＧ１１０３３（FR 97/09209 号および FR 97
/15807号）プラスミドを使用する。
ハンサー／プロモーターの制御下にイントロンＨＭＧ1
を含む Photinus pyralis ルシフエラーゼ遺伝子をコー
ドするｐＴＧ１１０３３（FR 97/09209 号および FR 97
/15807号）プラスミドを使用する。
【００５０】（溶液）秤量済みの対応塩酸塩を蒸留水中
に溶解してアミノポリマー溶液を調製した。モノマーポ
リ（アミン塩酸塩）としてその濃度を表示した；ポリマ
ーは全部がプロトン化されたとみなした；モノマー当り
７９ＤａのＭＭ。
に溶解してアミノポリマー溶液を調製した。モノマーポ
リ（アミン塩酸塩）としてその濃度を表示した；ポリマ
ーは全部がプロトン化されたとみなした；モノマー当り
７９ＤａのＭＭ。
【００５１】（ポリマー／ＤＮＡポリプレックスの調製
およびトランスフェクションのプロトコール）次のよう
にポリマー／ＤＮＡ複合体を取得した；プラスミド２μ
ｇおよびカチオンポリマー［ｐＨ７．４の水中でのスト
ック溶液１０ｍＭ（プロトン化アミンによる）；１Ｎ／
Ｐ当量は核酸（３３０Ｄａ平均ＭＭ）のリン酸基（Ｐ）
当たり１個のアミノ基（Ｎ）を有するに要するポリマー
量に相当する］の所要量を５％グルコース溶液５０μｌ
中にそれぞれ希釈し撹拌した。次いで２つの溶液を混合
し，穏やかに撹拌した。３０分後に複合体を細胞に添加
した。トランスフェクション複合体の添加に先立ち，培
地（ＤＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を除き，無血清培
地０．５ｍｌで置換した。その直後に、プレートを１５
００ｒｐｍ（約２８０ｇ）で５分間遠心分離した。３時
間後，１０％胎児ウシ血清で補給した培地０．５ｍｌで
培地を置換した。クロロキン１００μＭの存在下にトラ
ンスフェクションが遂行されたら，１０ｍＭクロロキン
溶液５μｌをポリプレックス添加の直前にこの培地に加
えた。４８時間後，培地を除き，lysis緩衝液（Promega
）１００μｌを添加し，ルシフエラーゼ活性分析まで
−８０℃で細胞を冷凍した。上澄み２０μｌを９６マル
チウエル板（Biolumat LB 9500, Berthold, Wilbach, G
ermny) 中でルシフエラーゼ検定システムを用いて分析
した。各トランスフェクションは３回行った。値は平均
相対光単位（ＲＬＵ）／ｍｇ・細胞タンパク質（ＢＣＡ
検定，Pierce）として与える。
およびトランスフェクションのプロトコール）次のよう
にポリマー／ＤＮＡ複合体を取得した；プラスミド２μ
ｇおよびカチオンポリマー［ｐＨ７．４の水中でのスト
ック溶液１０ｍＭ（プロトン化アミンによる）；１Ｎ／
Ｐ当量は核酸（３３０Ｄａ平均ＭＭ）のリン酸基（Ｐ）
当たり１個のアミノ基（Ｎ）を有するに要するポリマー
量に相当する］の所要量を５％グルコース溶液５０μｌ
中にそれぞれ希釈し撹拌した。次いで２つの溶液を混合
し，穏やかに撹拌した。３０分後に複合体を細胞に添加
した。トランスフェクション複合体の添加に先立ち，培
地（ＤＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を除き，無血清培
地０．５ｍｌで置換した。その直後に、プレートを１５
００ｒｐｍ（約２８０ｇ）で５分間遠心分離した。３時
間後，１０％胎児ウシ血清で補給した培地０．５ｍｌで
培地を置換した。クロロキン１００μＭの存在下にトラ
ンスフェクションが遂行されたら，１０ｍＭクロロキン
溶液５μｌをポリプレックス添加の直前にこの培地に加
えた。４８時間後，培地を除き，lysis緩衝液（Promega
）１００μｌを添加し，ルシフエラーゼ活性分析まで
−８０℃で細胞を冷凍した。上澄み２０μｌを９６マル
チウエル板（Biolumat LB 9500, Berthold, Wilbach, G
ermny) 中でルシフエラーゼ検定システムを用いて分析
した。各トランスフェクションは３回行った。値は平均
相対光単位（ＲＬＵ）／ｍｇ・細胞タンパク質（ＢＣＡ
検定，Pierce）として与える。
【００５２】大多数の合成ベクターと同様に，このトラ
ンスフェクション効率はポリマー／ＤＮＡ比に依存す
る。負／正電荷比２．５から５の範囲で最適発現が常時
得られた。試験した全ての比率で毒性は見られなかっ
た。本発明者らは，クロロキン１００μＭの存在下のト
ランスフェクションは一層高い導入遺伝子発現を可能に
し得ることを証明した。
ンスフェクション効率はポリマー／ＤＮＡ比に依存す
る。負／正電荷比２．５から５の範囲で最適発現が常時
得られた。試験した全ての比率で毒性は見られなかっ
た。本発明者らは，クロロキン１００μＭの存在下のト
ランスフェクションは一層高い導入遺伝子発現を可能に
し得ることを証明した。
【図１】２μｇのｐＴＧ１１０３３および所望のポリマ
ーの所望量を用いて，所望のＮ／Ｐ当量（それぞれ２．
５，５および１０ｅｑｕ．；図の説明文参照）に達する
ようにＡ５４９細胞（ヒト肺がん細胞）をトランスフェ
クションした。４８時間後に発現は停止した。黒棒はク
ロロキン（１００μＭ）の存在下のトランスフェクショ
ンの結果を示す。
ーの所望量を用いて，所望のＮ／Ｐ当量（それぞれ２．
５，５および１０ｅｑｕ．；図の説明文参照）に達する
ようにＡ５４９細胞（ヒト肺がん細胞）をトランスフェ
クションした。４８時間後に発現は停止した。黒棒はク
ロロキン（１００μＭ）の存在下のトランスフェクショ
ンの結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０８Ｌ 39/00 Ｃ０８Ｌ 39/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Claims (25)
- 【請求項１】ａ）一般式； 【化１】 ［式中，重合度ｐは２から１００００００の範囲であ
り，Ｒ１ ，Ｒ２ およびＲ３ は各［ＣＨ−ＣＨ２ ］繰
返しにおいて相互に独立にＨ，炭素原子１から２０のア
ルキルまたは炭素原子５から７のアリールであり，ｎは
０または１であり，ただしポリマー全長において少なく
とも一つのｎは１である］および ｂ）少なくとも一種の核酸を含む複合体。 - 【請求項２】ｐが１０から１００００の範囲である，請
求項１記載の複合体。 - 【請求項３】Ｒ１ ，Ｒ２ およびＲ３ がＨである，請
求項２記載の複合体。 - 【請求項４】上記ポリマーがその窒素原子またはＲ
１ ，Ｒ２ およびＲ３ のいずれかに結合した一種また
は二種以上の標的要素も含有する，請求項１から３のい
ずれか１項記載の複合体。 - 【請求項５】上記標的要素が糖類，グリコール誘導体，
ペプチド，オリゴヌクレオチド，脂質，ホルモン，ビタ
ミン，抗原，抗体，特異的膜受容体リガンド，抗リガン
ドと反応し得るリガンド，融合誘導ペプチド，核局在ペ
プチド，の全てもしくは一部または上記化合物の組合わ
せからなる群から選択される，請求項４記載の複合体。 - 【請求項６】上記核酸がｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ，プラ
スミドＤＮＡ，メツセンジャーＲＮＡ，アンチセンスＲ
ＮＡ，リボザイム，転移ＲＮＡ，リボソームＲＮＡ，ま
たはかかる型のＲＮＡをコードするＤＮＡからなる群か
ら選択される，請求項１から５のいずれか１項記載の複
合体。 - 【請求項７】上記核酸が治療的に有用な遺伝子配列およ
びその発現を可能にする要素を含有する，請求項６記載
の複合体。 - 【請求項８】上記複合体寸法が５μｍ未満である，請求
項１から６のいずれか１項記載の複合体。 - 【請求項９】上記ポリマー中の正電荷数と上記核酸中の
負電荷数との比が０．０５から２０である，請求項１か
ら８のいずれか１項記載の複合体。 - 【請求項１０】正もしくは負荷電で中性および双性イオ
ン性の脂質から選択された少なくとも一種の補助剤をさ
らに含む，請求項１から９のいずれか１項記載の複合
体。 - 【請求項１１】ホスフアチジルエタノールアミン（Ｐ
Ｅ），ホスフアチジルコリン，ホスホコリン，ジオレイ
ルホスフアチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ），スフ
インゴミエリン，セラミドもしくはセレブロシドまたは
それらの誘導体の一種から上記補助剤が選択される，請
求項１０記載の複合体。 - 【請求項１２】上記補助剤がカチオン脂質化合物であ
る，請求項１０記載の複合体。 - 【請求項１３】ポリマー対上記補助剤の比が１：０．１
から１：１０（ｗ／ｗ）の範囲である，請求項１０から
１２のいずれか１項記載の複合体。 - 【請求項１４】請求項１から１３記載の少なくとも一種
の複合体を含む医薬組成物。 - 【請求項１５】負荷電核酸の濃度が組成物ｍｌ当り１０
μｇから５０００μｇの範囲である，請求項１４記載の
医薬組成物。 - 【請求項１６】上記濃度が組成物ｍｌ当り１００μｇか
ら１０００μｇの範囲である，請求項１５記載の医薬組
成物。 - 【請求項１７】クロロキン；プロトン性極性化合物例え
ばプロピレングリコール，ポリエチレングリコール，グ
リセロール，エタノール，１−メチルＬ−２−ピロリド
ンもしくはこれらの誘導体；または非プロトン性極性化
合物例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），ジエチ
ルスルホキシド，ジ−ｎ−プロピルスルホキシド，ジメ
チルスルホン，スルホラン，ジメチルホルムアミド，ジ
メチルアセトアミド，テトラメチル尿素，アセトニトリ
ルもしくはこれらの誘導体；からなる群から選択された
少なくとも一種の補助剤をさらに含む，請求項１６記載
の医薬組成物。 - 【請求項１８】上記細胞を，請求項１から１３の少なく
とも一種の複合体または請求項１４から１７のいずれか
１項記載の組成物と接触させることを特徴とする，細胞
中への核酸の移入方法。 - 【請求項１９】一般式； 【化２】 ［式中，重合度ｐは２から１００００００の範囲であ
り，Ｒ１ ，Ｒ２ およびＲ３ は各［ＣＨ−ＣＨ２ ］繰
返しにおいて相互に独立にＨまたは炭素原子１から２０
のアルキルまたは炭素原子５から７のアリールから選択
され，ｎは０または１であり，ただしポリマーの全長に
おいて少なくとも一つのｎは１である］のポリマーの，
アニオン性分子の細胞内搬送用医薬組成物の調製のため
の使用。 - 【請求項２０】核酸の細胞内搬送用医薬組成物の調製の
ための，請求項１から１３のいずれか一項記載の複合体
の使用。 - 【請求項２１】上記医薬組成物が筋肉内注射，吸入，気
管内注射，点滴，エーロゾル化または局所適用により投
与するための，請求項１９または２０記載の使用。 - 【請求項２２】細胞中に少なくとも一種の核酸を in vi
tro で移入するための，請求項１から１３のいずれか１
項記載の複合体，または請求項１４から１７のいずれか
１項記載の組成物の使用。 - 【請求項２３】上記細胞が哺乳動物細胞である，請求項
２２記載の使用。 - 【請求項２４】請求項１から１３のいずれか１項記載の
複合体によりトランスフエクションされた細胞。 - 【請求項２５】少なくとも一種の上記ポリマーを少なく
とも一種の核酸と混合し，この複合体を回収する工程を
含む，請求項１から１３のいずれか一項に記載の複合体
の調製方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98402142A EP0987029B1 (en) | 1998-08-28 | 1998-08-28 | Use of a catonic polymer for the preparation of a complex with nucleic acid and related compositions |
| EP98402142.8 | 1998-08-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000135082A true JP2000135082A (ja) | 2000-05-16 |
Family
ID=8235477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11244014A Pending JP2000135082A (ja) | 1998-08-28 | 1999-08-30 | 核酸との複合体および関連組成物の調製のためのカチオンポリマ―の使用 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0987029B1 (ja) |
| JP (1) | JP2000135082A (ja) |
| AT (1) | ATE231399T1 (ja) |
| AU (1) | AU750696B2 (ja) |
| CA (1) | CA2281442A1 (ja) |
| DE (1) | DE69810925T2 (ja) |
| DK (1) | DK0987029T3 (ja) |
| ES (1) | ES2191269T3 (ja) |
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| EP1352072A4 (en) * | 2001-01-17 | 2004-09-01 | Zycos Inc | NUCLEIC ACID RELEASE PREPARATIONS |
| FR2928373B1 (fr) | 2008-03-05 | 2010-12-31 | Centre Nat Rech Scient | Polymere derive de la polyethylenimine lineaire pour le transfert de gene. |
| EP3235513A1 (en) * | 2016-04-18 | 2017-10-25 | Université de Liège | Improvements in or relating to organic material |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE159262T1 (de) * | 1992-07-22 | 1997-11-15 | Hoechst Ag | Hydrophile zentren aufweisende polyvinylamin- derivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie die verwendung der verbindungen als arzneimittel, wirkstoffträger und nahrungsmittelhilfsstoff |
| US5629184A (en) * | 1995-01-25 | 1997-05-13 | Amgen Inc. | Cationic copolymers of vinylamine and vinyl alcohol for the delivery of oligonucleotides |
| FR2744453B1 (fr) * | 1996-02-05 | 1998-07-10 | Transgene Sa | Composes lipopolyamines, compositions pharmaceutiques en comprenant, vecteurs de transfert d'acide nucleique et procede de preparation |
-
1998
- 1998-08-28 DK DK98402142T patent/DK0987029T3/da active
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- 1998-08-28 ES ES98402142T patent/ES2191269T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-08-25 CA CA002281442A patent/CA2281442A1/en not_active Abandoned
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