JP2003518511A - ポリヌクレオチドを細胞へトランスフェクションするための組成物を調製するためのリチウム（Ｌｉ＋）の使用および遺伝子治療で有用な組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ポリヌクレオチドを細胞へ導入するのための治療組成物の調製を目的とするリチウム（Ｌｉ^＋）の使用が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】

発明の分野 本発明は、細胞中へのポリヌクレオチドのトランスフェクションまたは形質導
入を改良するための組成物を調製するためのリチウム（Ｌｉ^＋）の使用に関する
。このような組成物は、遺伝子治療、予防接種、および遺伝子に基づく産物をイ
ン・ビボで細胞に投与する任意の治療または予防的状態で有用である。

【０００２】 背景技術 遺伝子治療は、機能的遺伝子を導入することによって永久的に治癒させること
ができる遺伝性不全症（嚢胞性繊維症、ジストロフィー、血友病など）に主とし
て応用できると一般に考えられている。しかしながら、遙かに大きな群の疾患、
特に後天性疾患（癌、ＡＩＤＳ、多発性硬化症など）は、宿主細胞を一時的に遺
伝子工学処理することによって治療し、有益なタンパク質を産生することができ
る。

【０００３】 例えば、筋ジストロフィーまたは嚢胞性繊維症の治療に応用される。デュシェ
ーヌ／ベッカー筋ジストロフィーおよび嚢胞性繊維症の遺伝子は同定されており
、それぞれジストロフィンおよび嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンスレギュレー
ター（ＣＦＴＲ）と呼ばれるポリペプチドをコードする。それぞれ患者の筋肉ま
たは肺細胞内でのこれらの遺伝子の直接発現は、標的設定した組織の機能的ポリ
ペプチドの発現によって症状の著しい緩快に寄与するものである。更に、嚢胞性
繊維症では、肺の症状を著しく改善するには肺上皮細胞の約５％のみでＣＦＴＲ
遺伝子産物を行う必要があることが、研究によって示唆されている。

【０００４】 遺伝子治療のもう一つの応用は、ワクチン接種である。これに関して、脊椎動
物の細胞に導入されたポリヌクレオチドによってコードされる免疫原性は、主要
な組織適合抗原に関連して上記細胞によって発現されかつ分泌されまたは提供さ
れることにより、発現した免疫原に対する免疫応答を顕在化することができる。
機能的ポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドがプラスミド由来のポリヌク
レオチドにあるときには一過性トランスフェクションと呼ばれ、上記ポリヌクレ
オチドがウイルス由来のポリヌクレオチドにあるときには形質導入と呼ばれる目
的とする遺伝子の一過性発現を生じる様々な手法、またはポリヌクレオチドの宿
主ゲノムへの組込みを生じる宿主細胞の永久的形質転換によって細胞中に導入す
ることができる。

【０００５】 良好な遺伝子治療は、生体の細胞内への遺伝情報の効率的伝達および発現によ
って変化する。今日まで用いられているほとんどの伝達機構は、ウイルスベクタ
ー、特にアデノおよびレトロウイルスを含んでいる。ウイルスは、細胞膜の横断
リソソーム分解の回避、ゲノムの核への伝達などの目的を達成するために多様な
高度に複雑化した機構を発現しており、ヒトに応用されるワクチン接種や遺伝子
治療における多くの遺伝子伝達用途に用いられている。

【０００６】 その上、レセプター依存機構(Perales et al., Eur. J. Biochem., 226 (1994
), 255-266; Wagner et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 14 (1994), 11
3-135)、ポリアミドアミン(Haensler and Szoka, Bioconjugate Chem., 4 (1993
), 372-379)、樹枝状ポリマー（ＷＯ９５／２４２２１号公報）、ポリエチレン
イミンまたはポリプロピレンイミン（ＷＯ９６／０２６５５号公報）、ポリリシ
ン（ＵＳ−Ａ−５５９５８９７号明細書またはＦＲ２７１９３１６号明細書）の
ようなポリマー依存性トランスフェクション、またはＤＯＴＭＡ(Felgner et al
., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 (1987), 7413-7417)、ＤＯＧＳまたはTran
sfectam(商標)(Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989), 6982-6
986)ＤＭＲＩＥまたはＤＯＲＩＥ(Felgner et al., Methods, 5 (1993), 67-75)
、ＤＣ−ＣＨＯＬ(Gao and Huang, BBRC, 179 (1991), 280-285)、ＤＯＴＡＰ(
商標)(McLachlan et al., Gene Therapy, 2 (1995), 674-622)またはLipofectam
ine(商標)のような脂質依存性トランスフェクション(Felgner et al., Nature,
337 (1989), 387-388)に基づく非ウイルス伝達系も開発されている。これらの系
は、トランスフェクション可能な細胞の大量生産、安全性、ターゲッティング、
低免疫原性、およびＤＮＡの大きな断片を伝達する能力に関して潜在的利点をも
たらす。しかしながら、それらのイン・ビボでの有効性は限定されている。

【０００７】 最後に、１９９０年にWolff et al. (Science, 247 (1990), 1465-1468)は、
裸の、すなわち特殊な伝達系を持たないＲＮＡまたはＤＮＡをマウス骨格筋に直
接投与することにより、筋肉細胞中にレポーター遺伝子が発現することを示した
。細胞をトランスフェクションするためのこの手法は簡単であるという利点を有
し、肺(Tsan et al., Am. J. Physiol., 268 (1995), L1052-L1056; Meyer et a
l., Gene Therapy, 2 (1995), 450-460)、脳(Schwartz et al., Gene Therapy,
3 (1996), 405-411)、関節(Evans and Roddins, 関節炎の遺伝子治療(Gene ther
apy for arthritis); Wolff監修、遺伝子治療薬：直接遺伝子導入の方法および
応用(Gene therapeutics: Methods and Applications of direct Gene Transfer
), Birkhaiser, Boston (1990), 320-343)、甲状腺(Sikes et al., Human Gene.
Ther., 5 (1994), 837-844)、皮膚(Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
91 (1994), 9519-9523)、および肝臓(Hickman et al., Hum. Gene Ther., 5 (1
994), 1477-1483)へ送達するためのこの系の有用性を支持する実験が行われてい
る。

【０００８】 しかしながら、Davis et al. (Human Gene Therapy, 4 (1993), 151-159およ
びHuman Mol. Genet., 4 (1993), 733-740)は、骨格筋に投与した裸のＤＮＡの
発現が大きく変動し、原発性ミオパシーの治療などには不十分であることを観察
した。この著者らは、比較的大容量の高張性スクロースまたは心臓毒素などの毒
素を予備投与することによって遺伝子導入の効率を向上させ、筋肉の再生を刺激
する解決法を提案している。しかしながら、これらの方法は、有望ではあるが、
ヒトの治療には応用できない。

【０００９】 従って、利用可能な送達法は、イン・ビボでの遺伝子治療におけるそれらの手
段の安全性または有効性については十分ではない。

【００１０】

【発明の概要】

従って、本発明の基礎をなしている技術的問題は、遺伝子治療において、裸の
またはカチオン性脂質、ポリマーまたはウイルスタンパク質のような特殊な伝達
促進物質と組み合わせた核酸分子を送達するための改良法または手段を提供する
ことである。 この技術的問題は、特許請求の範囲に記載の態様を提供することによって解決
される。

【００１１】 従って、本発明は、ポリヌクレオチドを細胞中に導入するための組成物の調製
するためのリチウム（Ｌｉ^＋）の使用に関する。驚くべきことには、ポリヌクレ
オチドを脊椎動物細胞および特に脊椎動物の組織に導入するときには、リチウム
の特異的付加によって導入効率が劇的に向上することが見いだされた。従って、
本発明は、好ましくはポリヌクレオチドの細胞中への導入を向上させるための医
薬組成物の調製を目的とするリチウム（Ｌｉ^＋）の使用に関する。

【００１２】

【発明の具体的説明】

本発明において、「ポリヌクレオチド」という用語は、裸（naked）および裸
でない（non-naked）核酸の両方を表そうとするものである。「核酸」は、一本
鎖または二本鎖、鎖状または環状、天然または合成、修飾されたまたは修飾され
ていないＤＮＡまたはＲＮＡでよい（修飾例については、米国特許第５５２５７
１１号明細書、米国特許第４７１１９５５号明細書またはＥＰ−Ａ３０２１７５
号明細書を参照されたい）。これは、とりわけゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、転移
ＲＮＡまたはこのようなＲＮＡをコードするＤＮＡであることができる。核酸は
、ポリペプチド、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、または細胞へ送達された目
的とするもう一つの分子を生成することができる少なくとも一種類の発現可能な
配列を含むプラスミドまたは線状核酸の形態をとることができる。核酸は、例え
ば、アンチセンスまたはリボザイム機能について細胞に送達されるオリゴヌクレ
オチド（すなわち、１００bp未満の短いサイズの核酸）であることもできる。本
発明によれば、上記核酸は裸であることもまたは裸でないこともできる。「裸」
とは、上記核酸が、その種類（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、その大きさ、その形態（
一本鎖／二本鎖、環状／線状など）とは無関係にトランスフェクション促進ウイ
ルス粒子、リポソーム処方物、帯電した脂質またはポリマー、および沈澱剤とは
結合していないものとして定義されることを意味する(Wolff et al., Science,
247 (1990), 1465-1468; 欧州特許第４６５５２９号明細書)。反対に、「裸でな
い」とは、上記核酸が(i)通常はウイルス（アデノウイルス、レトロウイルス、
ポックスウイルスなど）と呼ばれるものを形成しまたは核酸がウイルスキャプシ
ドのようなウイルス要素と結合しているがこの中に包含されない複合体を形成す
るウイルスポリペプチド（米国特許第５，９２８，９４４号明細書およびＷＯ９
５２１２５９号明細書参照）、(ii)核酸の細胞中への導入取り込みに関与するこ
とができる任意成分（総説については、Ledley, Human Gene Therapy, 6 (1995)
, 1129-1144を参照)と結合することができることを意味する。ポリヌクレオチド
が結合する帯電化合物は、好ましくはカチオン性脂質、特にＷＯ９８／３４９１
０号公報または欧州特許第９０１４６３号明細書に開示されているものである。
好ましくは、核酸はプラスミドＤＮＡの形態であり、ポリヌクレオチドは裸のプ
ラスミドＤＮＡである。広汎なプラスミドが市販されており、当業者には周知で
ある。これらの入手可能なプラスミドは、分子生物学の手法によって容易に修飾
される（Sambrook et al., 1989, 実験室便覧(Laboratory Manual), Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）。pBR322 (Gibco
BRL)、pUC (Gibco BRL)、pBluescript (Stratagene)、pREP4、pCEP4 (Invitrog
en)およびpPoly (Lathe et al., 1987, Gene, 57, 193-201)由来のプラスミドは
、これらの修飾の実例である。

【００１３】 核酸が適正な遺伝情報を含むときには、これが比較的多量のコードされたポリ
ペプチドの合成を指示する。細胞に送達されたポリヌクレオチドが免疫ポリペプ
チドをコードする核酸を含むときには、本発明による使用を応用して、細胞内ウ
イルスなどの感染性病原体および腫瘍細胞に対する免疫を改良し効果的にするこ
とができる。標的細胞による発現に必要な遺伝情報は、上記ＤＮＡのｍＲＮＡへ
の転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳に必要なすべての要素を含んでな
る。様々な脊椎動物系での使用に適する転写プロモーターは、文献に広汎に記載
されている。例えば、適当なプロモーターとしては、ＲＳＶ、ＭＰＳＶ、ＳＶ４
０、ＣＭＶまたは７．５ｋのようなウイルスプロモーター、ワクシニアプロモー
ター、誘導プロモーターなどが挙げられる。核酸としては、イントロン配列、タ
ーゲッティング配列、輸送配列、複製または組込みに関与する配列を挙げること
もできる。上記配列は文献に報告されており、当業者が容易に得ることができる
。核酸またはポリヌクレオチドを修飾して、スペルミンのような特異的成分によ
って安定化することもできる。

【００１４】 本発明によれば、「導入または転移」とは、ポリヌクレオチドを細胞中に導入
して、この家庭の終了時に上記細胞内部またはその膜内または上に配置されるこ
とを意味する。これはポリヌクレオチドの種類によって「トランスフェクション
」または「形質導入」とも呼ばれ、「トランスフェクション」はキャプシドまた
はウイルスポリペプチドのようなウイルス要素を含まないポリヌクレオチドの導
入を計画するのに用いられ、「形質導入」はウイルスの導入を表す。これらの用
語は、本発明の技術分野では通常のものである。

【００１５】 本発明の範囲における「改良された導入」という用語は、これに関してはリチ
ウム（Ｌｉ^＋）を用いずに行った導入と比較してリチウムを含む場合に細胞によ
るポリヌクレオチドの導入が更に効率的であることを意味している。これは、リ
チウムを用いずに摂取したポリヌクレオチドの量を比較し、この量を同一条件下
でリチウムを用いるときに細胞によって摂取される量と比較することによって決
定することができる。好ましくは、改良された導入は、リチウム（Ｌｉ^＋）を用
いない場合と比較してリチウム（Ｌｉ^＋）を用いるときに細胞中に導入されたポ
リヌクレオチドの発現の量が一層高くなることによって決定することができる。

【００１６】 本発明の使用に従って調製した組成物は、イン・ビボまたはエクス・ビボでの
ポリヌクレオチドの細胞へのトランスフェクションに用いることができる。これ
に関して、エクス・ビボとは、ポリヌクレオチドをトランスフェクションする細
胞が生体にはないが、トランスフェクションの後に生体に導入することができる
ことを意味する。

【００１７】 「遺伝子治療法」という用語は、イン・ビボでポリヌクレオチドを細胞に導入
する方法と理解するのが好ましい。「遺伝子治療」は、特に遺伝子産物が標的組
織で発現される場合、並びに遺伝子産物が特に血流中に排出される場合に関する
。

【００１８】 リチウム（Ｌｉ^＋）は、躁的興奮の治療および躁鬱病性障害の予防的治療技術
における最も重要な方法として以前に報告されている。これは、単極細胞障害に
関連した再発性鬱病を安定化することができ、抗鬱薬の存在下で不応性大鬱病障
害の治療に有効である(Soares JC; Gershon S, 1998 Neuropsychopharmacology, 19:167-182; Lenox RH et al., 1998, J. Clin. Psychiatry, 59 Suppl. 6:37-
47)。

【００１９】 本明細書で用いられる「リチウム（Ｌｉ^＋）」という用語は、リチウムの一価
カチオンを意味する。このような生成物は、ブロマイド、クロライド、フルオラ
イド、スルフェート、ホスフェート、ナイトレート、ニオベート、ペタホスフェ
ート、タンタレート、二酸化マンガン、モリブデート、オキシド、ぺルオキシド
、シリケート、ヨーダイド、テトラクロロアルミネート、テトラクロロガレート
、テトラフルオロボレートなどのような一種類または数種類の生物学的に許容可
能なアニオンと結合して市販されている（例えば、Aldrichカタログ，１９９６
／１９９７年を参照されたい）。好ましい態様によれば、上記リチウム（Ｌｉ^＋ ）はクロライドと結合している（ＬｉＣｌ）。

【００２０】 好ましい態様では、本発明の使用に準じて調製した組成物中のリチウムの量は
、リチウムが約０．１〜約１００mMであり、好ましくは約０．１〜約１０mMの範
囲であり、更に好ましくは１０mMである。この濃度は、リチウム濃度に影響を及
ぼす可能性がある特別の場合に当業者によって適合させることもできる。例えば
、組成物がEDTAまたはEGTAのようなキレート化剤をも含んでなるときには、キレ
ート化によるリチウム涸渇を保証する目的でリチウム濃度を向上させるのが好ま
しい。これは、ポリヌクレオチドがTE（トリス−EDTA）のような緩衝液中で予め
調製しておいたときに起きる可能性がある。

【００２１】 好ましい態様では、本発明の使用に従って調製した組成物は、脊椎動物への投
与形態をしている。これらの組織としては、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、
骨髄、心臓、リンパ、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮
、直腸、神経系、目、腺、結合組織、血液、腫瘍などの組織が挙げられる。異種
ポリヌクレオチドの導入を向上させる細胞は、上記の標的組織のそれぞれに見ら
れるもの（筋肉細胞、気道細胞、造血細胞など）である。投与は、皮内、皮下、
静脈内、筋肉内、鼻内、大脳内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜腔内、
冠状動脈内または腫瘍内経路によって、または注射器または他の装置を用いる注
射によって行うことができる。吸入またはエアゾール投与のような経皮投与も考
えられる。ポリヌクレオチドの投与部位および導入部位は、同一であることもま
たは異なることもできる。好ましい態様では、本発明によって調製された治療組
成物は、筋肉細胞への導入のためのものであり、更に好ましくは筋肉内注射経路
または脈管内経路によるものである。後者に関しては、投与法は、輸入管および
／または輸出管への注射を上記血管の透過性の増加と組み合わせることによって
有利に改良することができる。具体的態様では、上記増加は、静水圧の増加（す
なわち、流出および／または流入の遮断）、（高張液を用いる）浸透圧、および
／または生物学的に活性な分子（例えば、投与組成物へのヒスタミン）の導入に
よって行うことができる（ＷＯ９８／５８５４２号公報を参照されたい）。

【００２２】 もう一つの好ましい態様では、本発明は、細胞へのポリヌクレオチドの導入を
向上させるため治療組成物の調製する目的でのリチウムの使用であって、上記治
療組成物を少なくとも一種類のポリヌクレオチドを含む組成物の投与からなる二
回目の投与とは無関係に投与するものを提供する。本発明によれば、第一の投与
は第二の投与の前、同時または後に行うことができ、またはその逆を行うことも
できる。治療組成物の投与および第二の投与は、異なるまたは同一の送達経路（
例えば、全身的送達、標的設定した送達、または複数の標的設定した送達）によ
って行うことができる。好ましい態様では、それぞれは同一の標的組織に行うべ
きであり、最も好ましくは注射によって行うべきである。

【００２３】 本発明による使用のもう一つの好ましい態様では、組成物は少なくとも一種類
のポリヌクレオチドをも含んでなる。特に好ましい態様では、組成物に含まれる
ポリヌクレオチドはコード核酸配列を含み、上記細胞で機能的に発現することが
できる。

【００２４】 一般に、組成物中のポリヌクレオチドの濃度は約０．０１mM〜約１Ｍであり、
好ましい態様では、約０．１mM〜１０mMである。本発明によれば、ポリヌクレオ
チドは、これが導入される標的細胞と相同性または非相同性であることができる
。上記ポリヌクレオチドがポリペプチド、特に組成物に治療または予防特性を付
与する治療または予防用ポリペプチドの全部または一部をコードするのが有利で
ある。ポリペプチドは、大きさやグリコシル化されているかまたはいないかに拘
わらずポリヌクレオチドの任意の翻訳産物であると理解され、ペプチドおよびタ
ンパク質が挙げられる。治療用ポリペプチドとしては、主要な例としては、動物
またはヒト生体における欠陥のあるまたは不完全なタンパク質を補償することが
できるポリペプチド、または毒性作用により有害な細胞を限定しまたは体内から
除去する作用をするものが挙げられる。それらは、体液性または細胞性応答、ま
たは両方を誘発する内因性免疫原として作用する免疫付与ポリペプチドであるこ
ともできる。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの例は、酵素
、ホルモン、サイトカイン、膜レセプター、構造ポリペプチド、輸送ポリペプチ
ド、アドヘシン(adhesines)、リガンド、転写因子、形質導入因子(traduction f
actors)、複製因子、安定化因子、抗体、更に具体的にはCFTR、ジストロフィン
、VIIIまたはIX因子、HPV由来のE6またはE7、MUC1、BRCA1、インターフェロン、
インターロイキン（IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12）、GM-CSF（顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子）、単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1）由来のtk遺
伝子、p53またはVEGFである。ポリヌクレオチドは、抗体をコードすることもで
きる。これに関して、抗体は、任意の種類の総ての免疫グロブリン、二重または
多重抗原またはエピトープ特異性を有するキメラ抗体またはハイブリッド抗体、
およびF(ab)₂、Fab′、Fabのような断片、例えばハイブリッド断片および抗イデ
ィオタイプ（米国特許第４，６９９，８８０号明細書）を包含する。

【００２５】 更に好ましい態様では、組成物は更にクロロキン、プロピレングリコール、ポ
リエチレングリコール、グリセロール、エタノール、１−メチル＝Ｌ−２−ピロ
リドンまたはそれらの誘導体のようなプロトン性化合物、ジメチルスルホキシド
（DMSO）、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルス
ルホン、スルホラン、ジメチル−ホルムアミド、ジメチルアセタミド、テトラメ
チル尿素、アセトニトリルまたは誘導体のような非プロトン性化合物からなる群
から選択される少なくとも一種類の成分を含んでなる。上記組成物は、サイトカ
イン、特にインターロイキン−１０（IL-10）、および例えばアクチンＧのよう
なヌクレアーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種類の成分を含ん
でなることもできる。

【００２６】 もう一つの好ましい態様では、本発明の用法に従って調製した組成物は、ヒト
または動物の治療法に用いることができる。この特定の場合には、組成物は、薬
学上適当な注射用キャリヤーまたは希釈剤（例えば、レミントンの薬科学、第１
６版(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th ed.)、１９８０年、Mack Pu
blishing Co）を含んでなることもできる。キャリヤーまたは希釈剤は好ましく
は等張性、低張性または弱高張性であり、スクロース溶液によって提供されるよ
うな比較的低イオン強度を有する。更に、これは、滅菌した発熱性物質不含水、
分散媒質、コーティング、および同等なものを含んでなる任意の関連溶媒、水性
または部分的に水性の液体キャリヤー、または希釈剤（例えば、トリス−ＨＣｌ
、アセテート、ホスフェート）、乳化剤、可溶化剤またはアジュバントを含むこ
とができる。医薬製剤のｐＨは、適当に調節して緩衝し、イン・ビボでの応用に
用いる。 これは、液体溶液としてまたは固形形態（例えば、凍結乾燥形態）として調製
し、投与前に溶液に懸濁することができる。

【００２７】 もう一つの態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを細胞に導入する方法であ
って、本発明の用法によって調製した組成物をポリヌクレオチドと接触させる前
、同時または後に上記細胞に接触させることを含んでなる方法にも関する。この
方法は、動物の細胞へイン・ビボで上記組成物を直接投与することによって適用
することができる。本発明の実施によれば、標的「細胞」および「イン・ビボ投
与経路」は、上記のように定義される。「標的細胞」は、ポリヌクレオチド摂取
および発現が起こるものであり、それは注射を行った組織（投与部位）に配置さ
れるとは限らない。特殊な態様では、投与を血管に行い、ポリヌクレオチドトラ
ンスフェクションまたは感染が近位または遠位、例えば肺、筋肉、肝臓、腎臓、
心臓のような器官または組織で起こる。

【００２８】 好ましくは、多数の治療用途においてポリヌクレオチドの送達および発現の部
位として筋肉が用いられるが、動物では筋肉質量が比較的大きく、これは皮膚を
通して直接注射することによって好都合に達成される。従って、好ましい場合に
は、本発明は、少なくとも一種類のポリヌクレオチドとリチウムをイン・ビボで
好ましくは筋肉内に投与することによって、ポリヌクレオチドを組織の筋肉細胞
に直接投与することにより、ポリヌクレオチドを輸出および／または輸入筋肉血
管に投与する段階を含んでなるポリヌクレオチドを好ましくは裸の形態でイン・
ビボで筋肉細胞に導入する方法に関する。ポリヌクレオチドは、筋肉細胞によっ
て発現され、脊椎動物を治療する目的での接触段階の後に最終的に血流中に分泌
される治療用ポリペプチドをコードすることができる。同様に、これは、接触段
階の後に筋肉細胞によって発現され、免疫応答を生じることによって脊椎動物を
免疫化する免疫原性ポリペプチドをコードすることができる。本発明の一つの重
要な態様は、上記ポリヌクレオチドがジストロフィンを機能的にコードすること
を特徴とする、筋ジストロフィーの治療法である。好ましくは、組成物は、筋肉
組織に直接投与される。

【００２９】 最後に、本発明は、イン・ビトロ（またはエクス・ビボ、上記参照）またはイ
ン・ビボでのポリヌクレオチドの細胞中への導入を改良するためのリチウム（Ｌ
ｉ^＋）の用法に関する。

【００３０】 本発明を例示的に説明してきたが、使用した用語は制限よりはむしろ記載され
ている単語の性質を意味するものと理解すべきである。本発明の多くの修飾およ
び変更が上記の観点で可能であることは明らかである。従って、特許請求の範囲
内では、本発明は具体的に記載されているものとは別の方法で実施することがで
きると理解すべきである。

【００３１】 上記に引用した特許明細書、公表文献およびデーターベース記載事項の開示内
容の総ては、これらの個々の特許明細書、公表文献または記載事項が参考として
引用されていることが具体的かつ個々に示唆されるのと同じ程度まで完全に参考
として具体的に引用される。

【００３２】

【実施例】

下記の例により、本発明を説明する。材料および方法 下記の材料および方法を、例において用いる。

【００３３】１．プラスミド／二価イオン組成物の筋肉内投与 プラスミドＤＮＡ（pTG11033：CMVプロモーター、β−グロブリンイントロン
、ルシフェラーゼカセット−ＷＯ９８／３４９１０号公報）を、Bischoff et al
., Analytical Biochemistry, 254 (1997), 69-81に準じて調製した。筋肉内注
射の前に、筋肉内注射の前に、試験分子をプラスミドＤＮＡ製剤と混合した。プ
ラスミドＤＮＡ２５μgを、５〜１０週齢のC57BL/10マウスの筋肉に注射した。
二種類の前脛骨筋（右および左）を注射した（それぞれの筋を試料と考えた）。
更に、それぞれの条件について、最低および最高ルシフェラーゼ活性値を省いた
が、これは条件あたりの試料の数＝（２×条件あたりのマウスの数）−２を意味
する。

【００３４】２．筋肉の生検およびルシフェラーゼ測定 組成物の投与から１週間後に、マウスを屠殺して前脛骨筋を回収して、凍結し
た。全筋肉抽出物について、通常の測定キット（Luciferase Assay System, Pro
mega）を用いてルシフェラーゼ活性を定量した。簡単に説明すれば、筋肉を個別
に磨砕し、レポーターリーシス緩衝液（Promega）２００μlで希釈した。１０μ
l試料を９６穴プレートに入れ、基質１００μlと混合した。ルシフェラーゼ活性
を、タンパク質１mg当たり１分間に放出されるRLUの数として表した。

【００３５】３．タンパク質測定 タンパク質を、１０μl試料についてVCA Protein Assayキット(Pierce)を用い
て測定した。

【００３６】例１ ＬｉＣｌはイン・ビボでのトランスフェクションを増加する（マウスでのプラス
ミドＤＮＡの筋肉内投与） この例では、プラスミドpTG11033の保存溶液をＴＥ緩衝液（トリス１０−ＥＤ
ＴＡ１mM）中で１μg/μl の核酸濃度で調製した。 ＬｉＣｌの保存溶液を、水中で１Mの濃度で調製した。

【００３７】 ４尾のC57Bl/10マウスに、症状によって右および左前脛骨筋にpTG11033（２５
μg／筋肉）および様々な濃度の塩化リチウム（０．１、１、１０mM）を含んで
なる様々な組成物を投与した。対照実験は、一価イオンを加えずに０．９％Ｎａ
Ｃｌ５μlを加えたこと以外は同一条件に従って行った。注射容積は３０μlであ
った。

【００３８】 結果を図１に示す。それらは、ＬｉＣｌが投与を行った筋肉のルシフェラーゼ
活性を増加させる（この例では約５倍）ことを示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】 pTG11033の筋肉内トランスフェクションに対するＬｉＣｌの効果。マウス右お
よび左前脛骨筋のルシフェラーゼ活性は、０．９％ＮａＣｌ緩衝液（対照物、Ｎ
ａＣｌ）または０．１〜１０mMＬｉＣｌを加えた２５μgのプラスミドを投与し
てから７日後に測定。棒グラフは、タンパク質１mg当たり１分間でのRLUの平均
± ６回の測定のs.e.m.である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＡＵ，Ｃ Ａ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 セルジュ、ブラウン フランス国ドルリシャイム、フォブール、 デ、ボスジュ、28 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 CA11 DA02 EA04 GA11 HA17 4C076 AA11 AA16 BB11 BB15 CC29 DD22E DD22Q FF15 FF63 GG45 4C084 AA13 MA05 MA16 MA66 NA02 NA03 ZB212

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリヌクレオチドを細胞に導入するための組成物を調製するための、リチウム
   （Ｌｉ^＋）の使用。
2. 【請求項２】 医薬組成物の調製におけるリチウム（Ｌｉ^＋）の使用であって、前記組成物を
   脊椎動物の組織に投与するときポリヌクレオチドの細胞中への導入を改良するこ
   とができることを特徴とする、使用。
3. 【請求項３】 前記マグネシウムが塩化リチウムである、請求項１または２に記載の使用。
4. 【請求項４】 前記組成物がリチウム約０．１〜約１００mM、好ましくは約０．１〜約１０mM
   を含む、請求項１または２に記載の使用。
5. 【請求項５】 前記組成物が脊椎動物の標的組織に投与するためものである、請求項１〜４の
   いずれか一項に記載の使用。
6. 【請求項６】 前記標的組織が筋肉である、請求項４に記載の使用。
7. 【請求項７】 少なくとも一種類のポリヌクレオチドを含む組成物を同じ標的組織に投与する
   ことからなる第二の投与から独立して、リチウム（Ｌｉ^＋）の投与を行う、請求
   項２〜６のいずれか一項に記載の使用。
8. 【請求項８】 リチウム（Ｌｉ^＋）の投与を前記第二の投与の前に行う、請求項７に記載の使
   用。
9. 【請求項９】 前記治療組成物が少なくとも一種類のポリヌクレオチドをさらに含んでなる、
   請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
10. 【請求項１０】 前記ポリヌクレオチドが、遺伝子を含み、かつ、該遺伝子を前記細胞中で機能
    的に発現することができる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
11. 【請求項１１】 前記ポリヌクレオチドが裸の核酸である、請求項９または１０に記載の使用。
12. 【請求項１２】 前記ポリヌクレオチドが裸でない核酸である、請求項９または１０に記載の使
    用。
13. 【請求項１３】 上記組成物中のポリヌクレオチド濃度が約０．０１mM〜約１の範囲である、請
    求項９〜１２のいずれか一項に記載の使用。
14. 【請求項１４】 組成物が薬学上許容可能な注射用キャリヤーをさらに含んでなる、請求項１〜
    １３のいずれか一項に記載の使用。
15. 【請求項１５】 ポリヌクレオチドを細胞中に導入する方法であって、リチウム（Ｌｉ^＋）を含
    んでなる少なくとも一種類の組成物をポリヌクレオチドと接触させる前、同時に
    、または後に、前記細胞をこの組成物と接触させることを含んでなる、方法。
16. 【請求項１６】 細胞をリチウム（Ｌｉ^＋）およびポリヌクレオチドと同時に接触させる、請求
    項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 細胞中へのポリヌクレオチドの導入を改良させるための、リチウム（Ｌｉ^＋）
    の使用。