JP2002533354A - 安定なポジプレックスの懸濁液の製造法 - Google Patents

安定なポジプレックスの懸濁液の製造法

Info

Publication number
JP2002533354A
JP2002533354A JP2000589718A JP2000589718A JP2002533354A JP 2002533354 A JP2002533354 A JP 2002533354A JP 2000589718 A JP2000589718 A JP 2000589718A JP 2000589718 A JP2000589718 A JP 2000589718A JP 2002533354 A JP2002533354 A JP 2002533354A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
cationic
molecule
positive
plex
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000589718A
Other languages
English (en)
Inventor
オトマーヌ、ブシフ
オリビエ、メイエ
ハンノ、ファウ．ヨット．コルベ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Transgene SA
Original Assignee
Transgene SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Transgene SA filed Critical Transgene SA
Publication of JP2002533354A publication Critical patent/JP2002533354A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】 核酸を細胞に送達して、治療を必要とする個体の細胞に治療分子を提供する目的で用いることができる安定なポジプレックス、および安定なポジプレックスの均質懸濁液を記載する。更に、安定なポジプレックスおよびその均質懸濁液の調製法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野 本発明は、治療を必要とする個人の細胞に治療分子を提供する目的で核酸を細
胞に伝達するのに用いることができる安定なポジプレックス(posiplex)および安
定なポジプレックスの均質な懸濁液、および安定なポジプレックスの均質な懸濁
液の製造法に関する。
【０００２】 背景技術 遺伝病は、特に特定の遺伝子の発現における機能障害または非機能性突然変異
ポリペプチドの発現によるものである。例えば嚢胞性繊維症は、平均余命が２５
〜３０年の致死的遺伝病（１／２０００）の最もよく見られるものと考えられ、
粘膜由来の分泌物の実質的な濃厚化、慢性的肺発作、および膵外分泌機能不全を
特徴とする。この疾患は上皮膜を通る電解質、特に塩化物の輸送の障害と関連し
ており、この障害はＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質）遺伝子にお
ける突然変異の結果である(Rommens, Science 245 (1989), 1059-1066; Rosenfe
ld, Chest 109 (1996), 241-252)。この種の疾患に最も適当であると思われる治
療法は、機能性ＣＦＴＲポリペプチドをコードする遺伝子を標的細胞に移して、
観察された細胞機能障害を修正する方法である。遺伝子治療とも呼ばれるこの方
法に関して、数名の著者らは、気道上皮の細胞は、特に肺内伝達、例えば肺への
点滴注入によるその入手可能性の結果として一般に好まれる標的であることを示
唆している。通常のＣＦＴＲタンパク質の約５〜７％の発現レベルが電解質輸送
の快復が観察されるようにするために標的細胞で得られなければならないことが
示されている。同様に、数件の公表文献には、癌標的細胞に遺伝子を移行させる
手法を用いることによる腫瘍除去の可能性またはそれがだめな場合にはその進行
の遅延の可能性が記載されている。数種類の方法、特に免疫刺激遺伝子（免疫療
法）であって腫瘍に対して細胞性免疫応答を誘導しまたは活性化することができ
る遺伝子を導入する方法であって、これらの遺伝子の治療用途の例としては、サ
イトカインをコードする遺伝子の投与を挙げることができ、単純疱疹ウイルス１
型（ＨＳＶ−１）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子などの細胞毒性遺伝子を発
現する細胞に毒性を付与する細胞毒性遺伝子を導入する方法、または網膜芽腫遺
伝子またはｐ５３遺伝子のような腫瘍サプレッサー遺伝子、または癌遺伝子の特
異的メッセンジャーＲＮＡを分解することができるアンチセンス分子またはリボ
ザイムのような癌遺伝子の活性を阻害することができるポリヌクレオチドを導入
する方法が考えられている。
【０００３】 過去３０年にわたって、様々な異種遺伝子を細胞、特に哺乳類細胞へ導入する
ための多数の手段が開発されてきた。これらの様々な手法は、２つの範疇に分け
ることができる。第一の範疇は、微量注入、電気穿孔または粒子衝撃など、有効
ではあるが、実行し難いイン・ビトロでの用途に大部分限定されている物理的手
法に関する。第二の範疇は、分子および細胞生物学に関する技術を伴い、導入さ
れる遺伝学を上記材料の導入を促進する生物学的または合成ベクターと組み合わ
せる。現在のところ最も有効なベクターはウイルスベクターであり、特にアデノ
ウイルスまたはレトロウイルスベクターである。開発されてきた手法は、細胞膜
を横切り、それらの遺伝材料の分解を回避し、そのゲノムを核に浸透させるため
のこれらのウイルスが有する天然の特性に基づいている。これらのウイルスは既
に多数の研究の主題となっており、それらの幾つかは例えばワクチン接種、免疫
療法または遺伝子欠失の補償を目的とする治療に関してヒトで遺伝子ベクターと
して実験的に用いられている。しかしながら、このウイルス法は、特にウイルス
ゲノム内でのクローニング能力が限定され、産生して宿主生物および環境に広が
ったウイルス粒子の感染の危険性があり、レトロウイルスベクターの場合には宿
主細胞への挿入によって人工的突然変異誘発を生じる危険性があり、免疫および
炎症性応答が治療所値の際にイン・ビボで強力に誘導されることによって、考え
られる投与回数が実質的に制限されるため、多くの制限を受けている(McCoy, Hu
man Gene Therapy 6 (1995), 1553-1560; Yang, Immunity 1 (1996), 433-442)
。これらの多くの欠点、特にヒトでウイルスベクターを使用することに関する欠
点により、幾つかの研究グループはポリヌクレオチドを導入するための代替系の
開発を行っている。
【０００４】 レセプター依存性機構(Wagner, Advanced Drug Delivery Review, 14 (1994),
113-135)またはカチオン性分子（例えば、カチオン性脂質またはカチオン性ポ
リマー）依存性トランスフェクション（総説については、Rolland, Critical Re
view in Therapeutic Drug Carrier Systems 15 (1998), 143-198を参照された
い）は、大量生産、ウイルスベクターに関する危険性の減少、トランスフェクシ
ョン可能な細胞の標的設定、免疫原性の低下、および核酸の大きめの断片を伝達
する能力に関して有利であると思われる。
【０００５】 核酸を細胞中に伝達するための非ウイルス性ベクターの開発には、核酸と結合
してこれらの大きな親水性ポリアニオンがリン脂質二重層の疎水性の負に帯電し
たバリヤーである細胞膜を通過させ、それらをリソソーム分解を免れやすくし、
それらの核への移行を促進し、従って上記核酸に封入された目的とする遺伝子の
発現を促進することができる分子を必要とする。
【０００６】 目的とする分子をカプセル化して細胞へ伝達することができるリポソームは既
に１９６５年には報告されているが(Bangham, J. Mol. Biol. 13 (1965), 238-2
52)、１９９０年代までヒトの注射治療薬として発売はされなかった(Gregoriadi
s, Trends in BioTechnology 13 (1995), 527-537)。この遅延は、許容可能な安
定性を有する再現性のある処方物を得ることが困難なことに帰因している。大き
な伸展は、一定割合のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−改質リン脂質（ＰＥ
Ｇ−ＰＬ）を含む「立体的に安定化したリポソーム」開発であった(Gregoriadis
, 1995)。これらのＰＥＧ−ＰＬ含有リポソームは、網内皮系による検出および
除去により一層成功することが分かり、これにより循環半減期が著しく増大した
。（ＰＥＬ）−改質リポソームが極めて広汎に用いられているが、リポソーム表
面にグラフトしたときにリポソームの安定性を増加するポリ（ビニルピロリドン
）のような他の親水性ポリマー が記載されている(Torchilin, Biochem. Biophy
s. Acta 1195 (1994), 181-184)。
【０００７】 細胞への脂質依存性核酸の導入の進行は、核酸を細胞へ導入するためのビヒク
ルとしてカチオン性脂質を導入することによって促進された(Felgner, Proc. Na
tl. Acad. Sci. 84 (1987), 7413-7417; Scherman, Current Opinion in Biotec
hnology 9 (1998), 480-485)。カチオン性脂質は正に帯電しているので、負に帯
電した分子、具体的にはリポプレックスと呼ばれる複合体を形成する核酸と複合
体を形成することができる。リポソームとは異なり、これらの複合体はカプセル
化段階を必要とせず、成分同士を混合するだけで調製される。この複合体または
リポプレックスは本質的には脂質をコーティングした核酸を含んでなり、リポプ
レックスの正に帯電した皮膜が核酸の負電荷を中和し、負に帯電した細胞表面に
効率的に結合して、核酸の細胞中への浸透を促進することができる。
【０００８】 同様に、負に帯電した核酸と複合体を形成してポリプレックスを形成しかつ核
酸の細胞中へのトランスフェクションを媒介することができるカチオン性ポリマ
ーが確認されている。これらのカチオン性ポリマーの例は、ポリアミドアミン(H
aensler, Bioconjugate Chem. 4 (1993)、372-379)、樹脂状ポリマー（ＷＯ９５
／２４２２１号明細書）、ポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミン（Ｗ
Ｏ９６／０２６５５号明細書）、ポリリシン（ＵＳ−Ａ−５,５９５,８９７号明
細書、またはＦＲ２７１９３１６号明細書）、またはキトサン（ＵＳ−Ａ−５,
７４４,１６６号明細書）である。
【０００９】 核酸のトランスフェクションを媒介するのにカチオン性分子を用いることの利
点としては、複合体の調製が簡単であること（「リポプレックス」(lipoplex)、
「ポリプレックス」(polyplex)、または「リポポリプレックス」(lipopolyplex)
と呼ばれる核酸とカチオン性脂質およびポリマーとの会合であって、以後これら
三種類の複合体は一般に「ポジプレックス」と呼ばれる）、脂質および／または
ポリマー成分が核酸のほとんどと複合体を形成する能力、トランスフェクション
が容易な細胞の種類が広汎であること、導入の効率が高いこと、複合体が免疫原
性を欠くこと、および化学合成によるカチオン性脂質またはポリマーを利用でき
ることが挙げられる。
【００１０】 多種多様な種類の細胞への核酸のカチオン性脂質依存性伝達は、イン・ビトロ
およびイン・ビボで明らかにされている。例えば、カチオン性脂質と複合体形成
したＣＦＴＲ遺伝子をコードする核酸は、気管内点滴注入により(Yoshimura, Nu
cleic Acid Res. 20 (1992), 3233-3240)またはエアゾール送達によって(Stribl
ing, Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992), 11277-11281)マウス肺に送られてい
る。ＣＦ患者に対するＣＦＴＲ遺伝子のリポプレックス送達によるヒトでの臨床
的研究では、鼻上皮における遺伝子の発現が見られ、有害な臨床的効果は見られ
なかった(Caplen, Nature Medicine 1 (1995), 39-46)。
【００１１】 カチオン性脂質−ＤＮＡ複合体の単回静脈内投与に続くレポーター遺伝子の全
身的遺伝子発現は、マウスで示されている(Zhu, Science 261 (1993), 209-211)
。更に、全身的に投与されたカチオン性脂質−核酸複合体の齧歯類およびヒト以
外の霊長類での安全性検討では、これらの複合体の投与に関連して著しい毒性は
示されていない(Parker, Human Gene Therapy 6 (1995), 575-590)。
【００１２】 組織培養におけるｍＲＮＡのカチオン性脂質依存性トランスフェクションでは
、転写産物が翻訳されることが明らかにされた(Malone, Proc. Natl. Acad. Sci
. 86 (1989), 6077-6081)。カチオン性脂質を用いるヒト内皮細胞へのアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの送達により、オリゴヌクレオチドの細胞への接種が増
加し、細胞でのその活性が増加した(Bennet, Mol. Pharm. 41 (1992), 1023-103
3)。レトロウイルス粒子に複合体形成したカチオン性脂質を用いることによって
、適当なウイルスレセプターを欠く細胞のウイルス感染を行うことができ(Innes
, J. Virol. 64 (1990), 957-962)、またはヴィロソーム(virosome)として知ら
れる複合体を用いてレトロウイルス形質導入を増大させた(Hodgson, Nature Bio
technol. 14 (1996), 339-342)。
【００１３】 マウス腫瘍に直接投与した主要組織適合（ＭＨＣ）遺伝子を含むリポプレック
スを用いる癌の免疫療法により、腫瘍退縮を生じる免疫応答を誘導した(Plautz,
Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (1993), 4645-4649)。
【００１４】 ヒトでの臨床研究は、ヒト黒色腫、結腸直腸および腎臓癌患者における免疫治
療分子をコードするＤＮＡ配列のカチオン性脂質依存性送達を用いて行った(Nab
el, Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (1993), 11307-11311; Crystal, Science 270
(1995), 404-410)。
【００１５】 同様に、プラスミドＤＮＡのカチオン性ポリマー依存性トランスフェクション
は、ポリアミノポリマーを用いてイン・ビボおよびイン・ビトロで示された(Gol
dman, Nature Biotech. 15 (1997), 462-466)。置換ポリリシンを用いて、嚢胞
性繊維症の気道上皮細胞に遺伝子を導入した(Kollen, Human Gene Therapy 7 (1
996), 1577-1586)。Alila, Human Gene Therapy 8 (1997), 1785-1795も、ポリ
ビニルピロリドンと複合体形成したプラスミドＤＮＡを筋肉内投与することによ
り標的筋肉内にＩＧＦ−１を発現する目的で非ウイルス遺伝子療法を開発した。
【００１６】 現在までのカチオン性脂質処方物は、リン脂質ジオレイルホスファチジルエタ
ノールアミン（ＤＯＰＥ）を配合することが多かった。このリン脂質は、その二
重層構造を不安定にすることによってエンドソーム膜を崩壊させ、脂質−核酸複
合体がエンドソーム分解を免れ、細胞質中に入ることができると考えられる(Far
hood, Biochem. Biophys. Acta 1235 (1995), 289-295)。
【００１７】 しかしながら、核酸を細胞へ送達する目的でポジプレックスを広汎に使用する
場合の重大な障害は、上記複合体が不安定となり、溶液中で、更に詳細にはポジ
プレックス中の電荷比（＋／−）が１０以下である場合には、大きな凝集体を形
成しがちになることである。上記凝集体は、遺伝子治療でのそれらの使用と適合
しない粒度を有する。更に、リポソームの静脈内投与後の薬物動態を評価する検
討により、リポソーム粒度は循環寿命の重要な決定因子であることが明らかにな
った(Senior, Biochim. Biophys. Acta 839 (1985), 1-8; Liu and Huang, Jour
nal of Liposome Research 2 (1992), 57-66)。従って、本発明の基礎をなす技
術的問題点は、安定なポジプレックスを得て、安定なポジプレックスの均質な懸
濁液を調製するための手段および方法を提供することである。
【００１８】 ＷＯ９６／３４１０９号明細書では、個々のプラスミドＤＮＡとカチオン性脂
質成分を混合してプラスミドＤＮＡ／カチオン性脂質複合体（リポプレックス）
を生成させる順序が最終結果にとって重要であることが示唆されており、等張よ
り低いイオン強度でプラスミドＤＮＡ溶液をカチオン性脂質溶液へ徐々に添加し
た後にリポプレックスを等張付近まで調製する段階によって脂質の凝集を防止す
ることが提案されている。
【００１９】 ＷＯ９６／４０９０６号明細書では、ＤＮＡの脂質キャリヤーに対する比を調
節し、溶液中のＤＮＡ：脂質キャリヤーの総濃度を最小とし（通常は５mgＤＮＡ
／ml溶液未満）、ＥＤＴＡのようなキレート化剤および／またはかなりの量の塩
の使用を回避することによってリポプレックスの凝集を防止している。
【００２０】 ＷＯ９８／０８４８９号明細書では、複合体粒子にポリエチレングリコール過
フッ化または部分フッ化アルキル鎖、またはリポプレックスに包含することがで
きる残基にカップリングしたポリグルクロン酸を配合することによって、リポプ
レックスの凝集を防止することが提案されている。
【００２１】 ＷＯ９８／３４６４８号明細書では、ポジプレックス組成物に少なくとも一種
類の疎水性および少なくとも一種類の親水性部分を有する非イオン性界面活性剤
、例えばポリオキシアルキレンまたはその誘導体を包含させることによってポジ
プレックスの凝集を防止している。
【００２２】
【発明の概要】
本出願人は、特許請求の範囲に記載の態様によって達成されるこの技術的問題
に対する新たな解決法を明らかにしたのであり、すなわち本出願人は、安定なポ
ジプレックスの均質な懸濁液の調製法であって、この懸濁液が特にその成分が無
害であるため特にイン・ビボでの遺伝子治療に関して使用が考えられるものを開
発した。
【００２３】 従って、本発明は、治療を必要とする個人に治療分子を提供する目的で核酸を
細胞に送達するのに用いることができる安定なポジプレックスに関する。本発明
は、安定化添加剤を含む安定なポジプレックスにも関する。本発明は、更に少な
くとも一種類のカチオン性トランスフェクション分子と、少なくとも一種類の核
酸と、少なくとも一種類の安定化添加剤と、最終的に少なくとも一種類のコリピ
ドおよび／または他の化合物、例えばペプチドまたは標的化合物とを組み合わせ
ることによる安定なポジプレックスの均質懸濁液の調製法にも関する。本発明は
、必要に応じて、治療目的で患者に投与するポジプレックスの生産工程における
最終的滅菌段階として用いることもできる押出のようなサイジング処置を用いる
安定なポジプレックスの均質懸濁液の調製法も包含する。本発明は、上記の方法
によって製造された安定なポジプレックスの均質懸濁液にも関する。
【００２４】
【発明の具体的説明】
第一の態様では、本発明は、 少なくとも一種類のカチオン性トランスフェクション分子と、少なくとも一種
類の核酸成分と、少なくとも一種類の安定化添加剤と、必要に応じて少なくとも
一種類のコリピドとを組み合わせてポジプレックスを形成させることを含んでな
る、安定なポジプレックスの均質懸濁液の製造法であって、 前記の安定化添加剤が、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される極性化合物
である、前記方法に関する。 ａ）下記の式Ｉ：
【化１】 式II：
【化２】 または、式III：
【化３】 ［前記式中、 Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同一であるかまたは異なり、１〜８個の炭素
原子を有するアリール、アルキル、シクロアルキル、フルオロアルキル、アルケ
ニルまたはオキシアルキル基であって、必要に応じて反復しており、線状または
分岐状であり、かつ必要に応じて置換されており、 Ｒ５はそれぞれの［Ｒ５−Ｓ］ｎの反復において互いに独立して（ＣＨ２）ｘ
であり、但し、ｘ＝１〜６であり、Ｒ５は必要に応じて置換されており、 ｎ＝１〜５０であり、 Ｒ１およびＲ２、またはＲ３およびＲ４は、それぞれ結合して分子を環化する
ことができる］ によって定義される非プロトン性の極性化合物、 ｂ）ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、テトラメチル尿素、および
それらの誘導体からなる群から選択される非プロトン性の極性化合物、 ｃ）下記の式Ｉ：
【化１】 式II：
【化２】 または、 式III：
【化３】 ［前記式中、 Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同一であるかまたは異なり、１〜８個の炭素
原子を有するアリール、アルキル、シクロアルキル、フルオロアルキル、アルケ
ニルまたはオキシアルキル基であって、必要に応じて反復しており、線状または
分岐状であり、かつ例えばヒドロキシル基のような少なくとも一種類のプロトン
性基によって置換されており、 Ｒ５はそれぞれの［Ｒ５−Ｓ］ｎの反復において互いに独立して（ＣＨ２）ｘ
であり、但し、ｘ＝１〜６であり、Ｒ５は必要に応じて置換されており、 ｎ＝１〜５０であり、 Ｒ１およびＲ２、またはＲ３およびＲ４は、それぞれ結合して分子を環化する
ことができる］ によって定義される群から選択されるプロトン性の極性化合物。
【００２５】 好ましくは、上記の基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３および／またはＲ４は、２〜６個の炭
素原子を含んでなり、更に好ましくは２〜４個の炭素原子を含んでなり、特に好
ましくは２または３個の炭素原子を含んでなる。上記式の総ての可能なラセミ体
、鏡像異性体およびジアステレオマーの形態の分子も、本発明の範囲に包含され
る。
【００２６】 「アルケニル」という表現は、炭素鎖がその鎖に沿って一個以上の二重結合を
含むことができる意味と理解される。
【００２７】 好ましい態様によれば、前記安定化添加剤は非プロトン性の極性化合物であり
、ジエチルスルホキシド（ＤＥＳＯ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジ
−ｎ−プロピルスルホキシド（ＤＰＳＯ）、テトラメチレンスルホキシド（ＴＥ
ＭＳＯ）、ジメチルスルホン、スルホラン、１−メチル−２−ピロリドン 、お
よびそれらの誘導体からなる群から選択される。
【００２８】 本発明によれば、「非プロトン性の極性化合物」は、任意の正に分極した水素
原子を含まない化合物（非プロトン性）を表すものと理解される。これらの化合
物の特性は、広汎に記載されている（例えば、Vollhardt and Schore, 1994, Tr
aite de Chimie Organique [有機化学概論], 第２版, De Boeck University監修
を参照されたい)。このような化合物は、特に天然でまたは合成的に得ることが
でき、または最初の中は上記特性を示さない最初の化合物の化学修飾によって得
ることができる。当業者であれば、このような化合物を同定するのに必要な知識
を持っている。下記のような本発明の組成物、方法および用途に用いられる非プ
ロトン性の極性化合物は、様々な商業的供給源から得ることができ、または従来
の技術に記載の方法によって製造することができる。多数の極性化合物が、本発
明に関連してようとを考えることができる。好ましい態様によれば、非プロトン
性の極性化合物は水性溶液であり、すなわち、適宜塩水でありかつ緩衝されてい
る水性溶液で希釈されている。当業者であれば、標的設定した種類の細胞に最も
適している水性溶液を選択することができる十分な知識を有している。更に具体
的には、上記の極性化合物は水溶液または緩衝剤、例えば２０mM Ｈｅｐｅｓ，
ｐＨ７．５の溶液である。
【００２９】 本発明によれば、極性化合物の基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４および／またはＲ５
は置換することができる。このような置換は、特にイン・ビトロまたはイン・ビ
ボで投与した後に化合物またはこれを配合している複合体の分布を視認できる標
識分子（ＵＳ−Ａ−４，７１１，９５５号明細書の標識分子を参照）、細胞標的
設定分子（リガンド）、または固定分子(anchoring molecule)からなることがで
きる。これらの要素は科学文献に広く記載されており、特異的細胞種を標的設定
し、細胞への浸透を促進し、エンドソームのリーシス、または核への細胞内輸送
を行うことができる。これらの要素は、糖の全部または一部、グリコール、ペプ
チド（例えば、ＧＲＰ（ガストリン放出ペプチド））、オリゴヌクレオチド、脂
質、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体（またはその断片）、特異的膜受容体リガ
ンド、アンチリガンドと反応することができるリガンド、フソゲンペプチド(fus
ogen peptide)、核局在化ペプチド、リン脂質のようなポジプレックスに配合す
ることができる残基、または上記化合物の組合わせ、例えば、肝細胞表面のアシ
アログリコプロテイン受容体に標的設定するためのガラクトシル残基、 膜融合
のためのインフルエンザウイルス赤血球凝集素のＨＡ−２サブユニットから誘導
されるＩＮＦ−７フソゲンペプチド(Plank, J. Biol. Chem. 269 (1994), 12918
-12924)、またはＳＶ４０ウイルスのＴ−抗原（Lanford、Cell 37 (1984)、801-
813）またはエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１タンパク質（Ambinder
、J. Virol. 65 (1991)、1466-1478）から誘導される核シグナル配列を含んでな
ることができる。
【００３０】 本発明の目的に対して、上記化合物の任意のものの「誘導体」は、化学構造が
上記化合物の化学構造に基づいており、かつ本発明による安定化ポジプレックス
に用いることができる分子を意味する。このような誘導体の調製法は当業者に周
知であり、例えば、Beilstein著、有機化学便覧（Handbook of Organic Chemist
ry）、Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 1
0010 U.S.A. および有機合成(Organic Synthesis), Wiley, New York, USAに記
載されている。更に、例えば、当該技術分野で知られている方法によって適当な
誘導体および類似体のコンピューターによるデザインを用いることができる。更
に、ＤＭＳＯおよび他の関連した非プロトン性の極性化合物を添加剤を安定化す
ることができる化合物のデザインに用いることができる (Rose, Biochemistry 3
5 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558)
。
【００３１】 本発明によれば、「カチオン性トランスフェクション分子」はカチオン性脂質
および／またはカチオン性ポリマーを意味する。上記のカチオン性脂質およびポ
リマーは互いに独立しており、または化学修飾によって結合することができる。
本発明の特定の態様では、特許請求の範囲に記載の方法で用いられるカチオン性
トランスフェクション分子は、少なくとも一種類のカチオン性脂質、少なくとも
一種類のカチオン性ポリマー、または、少なくとも一種類のカチオン性脂質と少
なくとも一種類のカチオン性ポリマーとの混合物であることができる。カチオン
性トランスフェクション分子は正に帯電しているため、負に帯電した核酸と複合
体を形成して、複合体または粒子を形成することができる。
【００３２】 本発明によれば、「ポジプレックス」は「リポプレックス」、「ポリプレック
ス」および／または「リボポリプレックス」を表す一般名である。「リポプレッ
クス」は、カチオン性脂質を基剤とする核酸複合体または粒子を意味する。この
ような複合体または粒子は、通常は少なくとも一種類のカチオン性脂質および少
なくとも一種類の核酸成分を含む。「ポリプレックス」は、カチオン性ポリマー
を基剤とする核酸複合体または粒子を意味する。このような複合体または粒子は
、通常は少なくとも一種類のカチオン性ポリマーおよび少なくとも一種類の核酸
成分を含む。「リポポリプレックス」は、カチオン性脂質／ポリマー混合物を基
剤とする核酸複合体または粒子を意味する。このような複合体または粒子は、通
常は少なくとも一種類のカチオン性脂質、少なくとも一種類のカチオン性ポリマ
ー、および少なくとも一種類の核酸成分を含んでいる。
【００３３】 上記のポジプレックスは、更に少なくとも一種類の安定化添加剤および必要に
応じて少なくとも一種類のコリピド、および／または他の化合物、例えばペプチ
ド、糖、標的化合物、ＰＥＧ、脂質を基剤とする化合物（ＤＳＰＥ−ＰＥＧを除
く）を含んでなることができる。
【００３４】 「安定なポジプレックス」とは、その大きさとは独立して、上記ポジプレック
スが溶液、特に水溶液中に凝集体および／または沈澱を形成しないことを意味す
る。
【００３５】 「均質な懸濁液」とは、特に、凝集せずおよび／または沈澱しない複合体また
は粒子、例えばポジプレックスを含む懸濁液の成果である。本発明の範囲におけ
る「均質な懸濁液」という用語は、これに関して、安定化添加剤を加えずに調製
した懸濁液と比較して安定化添加剤が含まれているときには、前記懸濁液が凝集
したり沈澱したりすることが少なくなるかまたは全くなくなることを意味する。
これは、安定化添加剤を用いない場合に見られる凝集体または沈澱の量を同じ実
験条件下で上記安定化添加剤の存在下で見られる量と比較することによって決定
することができる。懸濁液の均質性は、得られた懸濁液が、安定化添加剤を省い
た場合には速やかに凝集したり、沈澱することを目視により検査することによっ
て決定することができ、または動的レーザー光散乱（光子相関分光学、ＰＣＳ）
、電子顕微鏡法、凍結破壊電子顕微鏡法、並びに当業者に知られている他の手法
など、これらに限定されない多数の手法によって得ることができる（Washington
著、薬剤学および他の産業における粒度分析(Particle Size Analysis in Pharm
aceutics and other Industries)、Ellis Horwood、New York、1992、135-169)
。「安定なポジプレックスの均質な懸濁液」は、安定な「リポプレックス」、安
定な「ポリプレックス」、安定な「リポポリプレックス」、またはこれらのもの
の少なくとも二種類の混合物の懸濁液を表すことができる。
【００３６】 特定の態様によれば、前記の発明は、前記のカチオン性トランスフェクション
分子と、前記核酸と、前記安定化添加剤と、必要に応じて前記コリピドとを、標
的化合物および標識化合物からなる群から選択される少なくとも一種類の化合物
と組み合わせることを更に含んでなる前記方法に関する。
【００３７】 「標的化合物」および「標識化合物」は、特異的細胞種を標的設定し、細胞へ
の浸透を促進し、エンドソームのリーシス、または核への細胞内輸送を行うこと
ができ、それぞれそれらを配合する複合体の分布を視認することができる天然ま
たは合成成分または分子を意味する。このような化合物は広く文献に開示されて
おり、幾つかの例は上記に提供している。
【００３８】 本発明によれば、安定なポジプレックスの均質な懸濁液はサイジング処置であ
る任意段階によって均質にサイジングするのが有利であることがある。従って、
本発明は、上記の方法であって、サイジング処置である任意段階をさらに含んで
なる方法にも関する。このサイジング段階に用いることができる方法としては、
押出し、音波処理および微小流動化、サイズ排除クロマトグラフィー、フィール
ドフロー分画、電気泳動、および超遠心分離が挙げられるが、これらに限定され
ない。
【００３９】 好ましい態様では、上記のサイジング段階は、カチオン性トランスフェクショ
ン分子またはポジプレックスを所定の細孔径を有する膜を介して押出すことを含
んでなる。所定の細孔径のポリカーボネート膜を重ねて、懸濁液を加圧下にて膜
を介して押出す押出機を用いることができる（例えば、Lipex Biomembranes, In
c., Vancouver, Canada製）。カチオン性トランスフェクション分子またはポジ
プレックスは、細孔度が５０〜５００nmの膜を介して押出すことができる。好ま
しい膜の細孔径は、２００〜３００nmである。ポジプレックスの押出は、治療目
的で患者に投与するためのポジプレックスの製造工程における最終滅菌段階とし
て用いることもできる。
【００４０】 本発明は、上記の安定なポジプレックスの均質な懸濁液の調製法であって、上
記のようなカチオン性トランスフェクション分子の粒度を規格化するサイジング
法を用いて核酸を添加する前に上記カチオン性トランスフェクション分子をサイ
ジングする段階をさらに含んでなる方法にも関する。
【００４１】 特別の態様によれば、本発明の方法は、上記カチオン性トランスフェクション
分子、および必要に応じて上記コリピドを、上記安定化添加剤と組み合わせる前
に上記核酸と組み合わせることを特徴としている。
【００４２】 もう一つの特別な態様によれば、本発明の方法は、上記カチオン性トランスフ
ェクション分子または上記核酸を、それぞれ上記核酸または上記カチオン性トラ
ンスフェクション分子と組み合わせる前に、上記安定化添加剤と組み合わせるこ
とを特徴としている。
【００４３】 本発明の好ましい態様では、均質な懸濁液中のポジプレックスの複合体または
粒子の粒子のサイズは５００nm以下であり、好ましくは３００nm以下である。粒
子のサイズは、特定の用途での使用に最適となるように選択することができる。
【００４４】 ポジプレックス粒度は、 動的レーザー光散乱（光子相関分光学、ＰＣＳ）、
並びに当業者に知られている他の手法など、これらに限定されない多数の手法に
よって測定することができ、例えばWashington著、薬剤学および他の産業におけ
る粒度分析(Particle Size Analysis in Pharmaceutics and other Industries)
、Ellis Horwood、New York、1992、135-169を参照されたい。
【００４５】 ポジプレックスにサイジング処置、例えば押出しを施した後、収率を計算して
回収率を評価することができる。この計算は、処置の前後の核酸濃度を測定する
ことに基づいている。例えば、ポジプレックスの懸濁液をサイジング膜を通って
押出す場合には、懸濁液中のＤＮＡ濃度を、標準的手法、例えば核酸を検出する
２６０nmにおける吸光度の測定を用いて決定することができる。
【００４６】 本発明の安定化添加剤のもう一つの有益な効果は、ポジプレックスの一体性の
保持、サイジング処置を行う場合にはその際のポジプレックスの安定性の保持、
および保管寿命の増加であった。
【００４７】 本発明の方法によれば、カチオン性トランスフェクション分子はカチオン性
脂質またはカチオン性ポリマーである。
【００４８】 本発明の方法で用いることができるカチオン性脂質またはカチオン性脂質の混
合物としては、Lipofectin（商標）、ＤＯＴＭＡ： Ｎ−［１−（２，３−ジオ
レイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム(Felgner, PN
AS 84 (1987), 7413-7417)、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミ
ンまたはTransfectam（商標）(Behr, PNAS 86 (1989), 6982-6986)、ＤＭＲＩＥ
：１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアン
モニウムおよびＤＯＲＩＥ：１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル
ヒドロキシエチルアンモニウム(Felgner, Methods 5 (1993), 67-75)、ＤＣ−Ｃ
ＨＯＬ：３［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレ
ステロール(Gao, BBRC 179 (1991), 280-285)、ＤＯＴＡＰ(McLachlan, Gene Th
erapy 2 (1995), 674-622)、Lipofectamine（商標）、スペルミンまたはスペル
ミジン−コレステロール、Lipofectace（商標）（総説については、例えばLegen
dre, Medecine/Science 12 (1996), 1334-1341またはGao, Gene Therapy 2 (199
5), 710-722を参照されたい）、特許出願明細書ＷＯ９８／３４９１０号、ＷＯ
９８／１４４３９号、ＷＯ９７／１９６７５号、ＷＯ９７／３７９６６号、ＦＲ
９７０２４２０号（出願番号）またはＦＲ９７０７２９０号（出願番号）に開示
されているカチオン性脂質、およびそれらの異性体が挙げられる。しかしながら
、このリストは総てを網羅しているものではなく、当該技術分野で周知の他のカ
チオン性脂質も同様に本発明の方法に用いることができる。
【００４９】 好ましくは、本発明のカチオン性脂質は、式IV（ＷＯ９８／３４９１０号明細
書）：
【化４】 ［上記式中、 Ｒ１およびＲ２は同一であるかまたは異なり、線状または分岐状のＣ６〜Ｃ２ ３ アルキルまたはアルケニルであるか、または 線状または分岐状の−Ｃ（＝Ｏ
）−（Ｃ６〜Ｃ２３）アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ２３）アルケニ
ルであり、 ＸはＯまたは−ＮＲ３であり、Ｒ３はＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、 ｎ＝１〜６であり、 ｍ＝１〜６であり、ｎ＞１であるときには、ｍは同一であるかまたは異なるこ
とができる］ のカチオン性脂質から選択される。
【００５０】 もう一つの態様によれば、カチオン性脂質は、式V（ＦＲ９７０２４２０号明
細書（出願番号）） Ｒ−ＨＮ−[−(ＣＨ２)ｍ−ＮＲ−]ｎ−１−(ＣＨ２)ｍ−ＮＨ−Ｒ （式V） 上記式中、 Ｒは互いに独立して、Ｈであるか、または
【化５】 ［上記式中、 Ｒ１およびＲ２は互いに独立して、線状または分岐状のＣ６〜Ｃ２３アルキル
またはアルケニルであるか、または線状または分岐状の−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６〜
Ｃ２３）アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ２３）アルケニル、アリール
、シクロアルキル、フルオロアルキル、ポリエチレングリコール、オキシエチレ
ンまたはオキシメチレン基であり、 ｐ＝１〜４であり、 ｎ＝１〜６であり、 ｍ＝１〜６である］ のカチオン性脂質から選択される。
【００５１】 本発明の方法で用いることができるカチオン性ポリマーまたはカチオン性ポリ
マーの混合物としては、キトサン、ポリリシンのようなポリ（アミノ酸）（ＵＳ
−Ａ−５，５９５，８９７号明細書およびＦＲ２７１９３１６号明細書）；ポリ
第四化合物；プロタミン；ポリイミン；ポリエチレンイミンまたはポリプロピレ
ンイミン（ＷＯ９６／０２６５５号明細書）；ポリビニルアミン；ＤＥＡＥとメ
タクリレート、デキストラン、アクリルアミド、ポリイミン、アルブミン、プル
ーラン、セルロースとの複合体のようなＤＥＡＥと誘導体形成したポリカチオン
性ポリマー；ポリビニルピロリドン; ポリメタクリレート; ポリアクリレート;
ポリオキセタン; ポリチオジエチルアミノメチルエチレン（Ｐ（ＴＤＡＥ））;
ポリヒスチジン; ポリオルニチン; ポリ−ｐ−アミノスチレン; ポリオキセタン
; コ−ポリメタクリレート（例えば、ＨＰＭＡのコポリマー；Ｎ−（２−ヒドロ
キシプロピル）−メタクリルアミド）; ＵＳ−Ａ−３，９１０，８６２号明細書
に開示されている化合物、ポリビニルピロリドンジメチルアミノメチルメタクリ
レートおよびポリビニルピロリドンメチルアクリルアミノプロピルトリメチルア
ンモニウムクロリド; ポリアミドアミン; テロマー性化合物（特許出願番号ＥＰ
９８．４０１４７１．２号明細書）が挙げられる。しかしながら、このリストは
総てを網羅しているものではなく、当該技術分野で周知の他のカチオン性ポリマ
ーも同様に本発明の方法で用いることができる。
【００５２】 特別な態様によれば、カチオン性ポリマーは、式VI：
【化６】 ［上記式中、 ｎ＝０〜５であり、ｐ＝２〜２００００であり、 遊離ＮＨ２の少なくとも１０％はＲで置換されており、Ｒは親水性基である］ によって定義されているような置換ポリビニルアミン（ＰＣＴ特許出願明細書、
出願番号ＰＣＴ／ＦＲ９８／０１５８１）である。
【００５３】 もう一つの態様によれば、上記カチオン性ポリマーは、一般式VII（欧州特許
出願明細書、出願番号９８／４０２１４２．８号）：
【化７】 ［上記式中、 重合度ｐは２〜１００００００の範囲であり、 Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれの［ＣＨ−ＣＨ２］反復において互いに独
立して、Ｈ、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル、または５〜７個の炭素原
子を有するアリールから選択され、ｎは０または１であり、但し、少なくとも１
個のｎはポリマーの全長において１である］ を有するポリマーである。
【００５４】 コリピドは、必要に応じてポジプレックスに包含されて、核酸の細胞への進入
を促進し、または本発明による安定化添加剤を接合させる。本発明の方法によれ
ば、コリピドは正または負に帯電した、中性および双性イオン性脂質からなる群
から選択される。これらのコリピドは天然または合成化合物であるか、またはそ
れぞれの組合わせであることができる。
【００５５】 好ましくは、コリピドは、正に帯電したホスファチジルエタノールアミン（Ｐ
Ｅ）、ホスファチジルコリン、ホスホコリン、ジオレイルホスファチジルエタノ
ールアミン （ＤＯＰＥ）、スフィンゴミエリン、セラミドまたはセレブロシド
、またはそれらの誘導体の一つからなる群から選択される。
【００５６】 カチオン性トランスフェクション分子対コリピドの（重量対重量に基づく）比
は、１：０〜１：１０の範囲であることができる。好ましい態様では、比は１：
０．５〜１：４の範囲である。
【００５７】 特定の態様によれば、本発明の方法の安定化添加剤を複合体または粒子に組込
むことができる残基にカップリングさせる。コリピドを本発明のポジプレックス
に加えて、安定化添加剤を上記ポジプレックスに付着させる。コリピドは、安定
化添加剤をポジプレックスに組込むことができる残基であることができる。脂質
と添加剤との誘導体形成により、この残基が安定化添加剤をポジプレックスに固
定させる。コリピドを添加剤に接合させて、ポジプレックスの凝集、フロキュレ
ーション、および／または沈澱を防止することができる。
【００５８】 本発明のポジプレックスにこのような添加剤を組込むのに用いることができる
コリピドまたは残基としては、双性イオン性または他のリン脂質が挙げられるが
、これらに限定されない。好ましくは、安定化添加剤を接合するのに用いられる
コリピドはポジプレックスに組込むことができる残基である。更に好ましくは、
このようなコリピドは不活性で、生物適合性である。
【００５９】 特定の態様によれば、本発明の方法で用いられるカチオン性トランスフェクシ
ョン分子は、上記したような安定化添加剤を含むように合成することができる。
【００６０】 「ポリヌクレオチドまたは核酸」は、天然に単離されまたは合成された、線状
または環状の、二本鎖または一本鎖のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片を意味す
るものと理解され、この用語は標識したまたは未標識の（例えば、ＵＳ−Ａ−４
，７１１，９５５号明細書またはＥＰ−Ａ−０３０２１７５号明細書を参照）、
改質または未改質の（例えば、ＵＳ−Ａ−５，５２５，７１１号明細書を参照）
ヌクレオチドの正確な配列を表し、核酸の断片または領域をその大きさを限定せ
ずに画定することができる。核酸は、特にｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミド
ＤＮＡ、細胞中への導入を促進する化合物を全く含まない核酸、少なくとも一種
類のポリペプチド、特にウイルス起源、更に詳細にはアデノウイルスまたはレト
ロウイルス起源のポリペプチドまたは合成ポリペプチドと結合している核酸、リ
ガンドと結合している核酸、少なくとも一種類のカチオン性の両親媒性化合物、
特に脂質と結合している核酸、少なくとも一種類のカチオン性または中性ポリマ
ーと結合している核酸、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、転移ＲＮ
Ａ、リボソームＲＮＡ、またはこのようなＲＮＡをコードするＤＮＡを表すもの
と理解される。
【００６１】 本発明の好ましい態様によれば、上記核酸は、少なくとも一種類の目的とする
遺伝子、およびこの目的とする遺伝子を発現させることができる要素を含んでな
る。この態様では、上記核酸はプラスミド形態であるのが有利である。発現を引
起すことができる要素は、上記ＤＮＡ断片をＲＮＡ(アンチセンスＲＮＡまたは
ｍＲＮＡ)に転写しかつこのｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することができる要
素の全体である。これらの要素は、特に上記細胞で有効なプロモーター配列およ
び／または調節配列、および適当な場合には、上記ポリペプチドを標的細胞の表
面に分泌しまたは発現させるのに必要な配列である。例えば、ＲＳＶ、ＭＰＳＶ
、ＳＶ４０、ＣＭＶまたは７．５ｋウイルスまたはワクシニアウイルスのプロモ
ーター、または筋肉クレアチンキナーゼアクチンおよび肺界面活性剤(pulmonary
surfactant)をコードする遺伝子のプロモーターを挙げることができる。更に、
所定の細胞の型に特異的であるかまたは規定された条件下で活性化することがで
きるプロモーター配列を選択することもできる。文献は、このようなプロモータ
ー配列に関する多量の情報を提供する。更に、上記核酸は、転写プロモーター活
性を示す少なくとも二種類の同一であるかまたは異なる配列、および／または互
いに同一方向または反対方向に連続的または間隔を置いて配置されており、転写
プロモーターまたはこれによって影響を受ける上記配列の転写の機能を持たない
少なくとも二種類の同一であるかまたは異なるＤＮＡコード配列を包含すること
ができる。同様に、この種の核酸構築物では、転写に影響せずかつ転写段階の前
にスプライシングを行っている「中性」核酸配列またはイントロンを導入するこ
とができる。この種の配列およびそれらの使用は、文献に記載されている。上記
核酸は、細胞内輸送、複製、および／または組込みに必要な配列を包含すること
もできる。このような配列は、当業者には周知である。更に、本発明による核酸
は、修飾されて標的細胞のゲノム憎み込むことができない核酸、または例えばス
ペルミンのような薬剤で安定化される核酸であることもできる。
【００６２】 本発明の懸濁液／組成物は、上記核酸に結合したまたは例えば組換えプラスミ
ド中で別々の核酸分子としての選択可能なマーカー遺伝子を含んでなることもで
きる。この態様は、組織、細胞および器官のエクス・ビボ治療に特に適している
。異種ＤＮＡを導入した後、処理した細胞は、特異的培地で１〜２日間増殖させ
ることができ、次に選択的培地に取り換える。組換えプラスミド中の選択可能な
マーカーは選択に対する耐性を付与し、プラスミドをそれらの染色体に安定に組
込み、増殖して細胞増殖巣を形成し、次にこれをクローニングして細胞系に拡張
することができる細胞を準備する。それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒ
ｔ−細胞では、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(Wigler, Cell 11 (1977), 2
23)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026)、およびアデニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ(Lowy, Cell 22 (1980), 817)など多数の選択系を用いる
ことができるが、これらに限定されない。また、抗代謝物耐性を、メトトレキセ
ートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ(Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77
(1980), 3567; O'Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527)、ミコ
フェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ(Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 78 (1981), 2072)、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する
ｎｅｏ(Colberre-Garapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1)、ハイグロマイシン
に対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ(Santerre, Gene 30 (1984), 147)、または
ピューロマイシン（ｐａｔ、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ
）の選択の基礎として用いることができる。追加の選択可能な遺伝子、例えば、
細胞にトリプトファンの代わりにインドールを用いることができるｔｒｐＢ、細
胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを用いることができるｈｉｓＤ(Har
tman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047)、およびオルニチンデカ
ルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、Ｄ
ＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）(McCon
logue, 1987,「分子生物学における最新のコミュニケーション(Current Communi
cations in Molecular Biology)」, Cold Spring Harbor Laboratory刊)が記載
されている。
【００６３】 イン・ビトロまたはイン・ビボでの遺伝子治療のための本発明の懸濁液／組成
物に用いるのに有用な適当なベクターおよびプラスミドは文献に記載されており
、当業者には知られている。例えば、Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 53
4-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (19
92), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res.
77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; ＷＯ９４
／２９４６９号明細書; ＷＯ９７／００９５７号明細書またはSchaper, Current
Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640およびそこに引用されている文
献を参照されたい。好ましくは、上記ベクターは遺伝子導入またはターゲッティ
ングベクターである。当業者に周知の方法を用いて上記核酸、プラスミドおよび
組換えベクターを構築することができ、例えば、Sambrook, 「分子クローニング
、実験室便覧(Molecular Cloning A Laboratory Manual)」, Cold Spring Harbo
r Laboratory (1989) N.Y. およびAusubel, 「分子生物学の最新実験計画(Curre
nt Protocols in Molecular Biology)」, Green Publishing Associates and Wi
ley Interscience, N.Y. (1989), (1994)を参照されたい。
【００６４】 本発明に関して、核酸は標的細胞に対して同種または異種であることができる
。ポリペプチド、特に治療または予防活性、更に具体的には細胞性または体液性
の免疫原活性を示すポリペプチドの全部または一部をコードする核酸を用いるの
が有利であることができる。ポリペプチドという用語は、ポリペプチドの大きさ
または（グリコシル化などにより）修飾される程度に関しては制限がない物取り
介すべきである。例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、膜受容体、構造ポリ
ペプチド、膜チャンネルを形成するポリペプチド、輸送ポリペプチド、接着分子
、リガンド、転写、翻訳、複製または転写産物安定性を調節する因子をコードす
る遺伝子、または抗体、例えばＣＦＴＲタンパク質、ジストロフィン、VIII因子
またはIX因子、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７、ＭＵＣ１、ＢＲＡＣ１、インターフェロン
、インターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７およびＩＬ−１
２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αまたはＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコ
ロニー刺激因子）、または単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）のｔｋ遺伝
子、網膜芽細胞遺伝子またはｐ５３の遺伝子、またはＦ（ａｂ）２、Ｆａｂ′お
よびＦａｂ断片のような免疫グロブリンの全部または一部、またはアンチイディ
オタイプ免疫グロブリン（ＵＳ−Ａ−４，６９９，８８０号明細書）を挙げるこ
とができる。このリストは限定的なものではなく、他の遺伝子を用いることがで
きると理解されるのは当然である。
【００６５】 本発明によれば、できるだけ高濃度の核酸を含んでなり、必要ならばできるだ
け少ない容積の本発明による懸濁液／組成物を投与することができる安定なポジ
プレックスを得ることが望ましいことがある。当業者であれば、上記核酸を溶解
する媒質の可溶化力によってこの濃度を調節するのに適当な能力を有する。
【００６６】 発現可能な核酸を用いる好ましい態様では、プラスミド ＤＮＡが用いられる
。カチオン性脂質に加えて本発明のポジプレックスを形成することができる核酸
の濃度は10μg/ml〜1000μg/mlの範囲である。本発明の好ましい態様では、核酸
の濃度は20μg/ml〜500μg/mlの範囲である。
【００６７】 ポジプレックスは、ポジプレックスの正に帯電したカチオン性脂質成分と負に
帯電した核酸成分の比である電荷比（＋／−）を特徴とすることもある。一般に
、ポジプレックスの過剰な正電荷は、負に帯電した細胞表面へのその結合を促進
する。本発明の複合体の電荷比は、ポジプレックスの正電荷の和を負電荷で割る
ことによって計算することができる。モル当たりの正電荷は、特定のカチオン性
脂質またはコリピドについて測定して、所定重量の脂質が特定の正電荷となるよ
うにすることができる。同様な測定を核酸またはコリピドに関して行い、モル当
たりの負電荷を生じて、所定重量の核酸またはコリピドが特定の負電荷を表すよ
うにすることができる。全正電荷を全負電荷で割ることによって、ポジプレック
スの真の電荷比（＋／−）が決定される。
【００６８】 好ましくは、本発明のポジプレックスの電荷比の範囲は、１〜２０（＋／−）
である。更に好ましくは、この範囲は２．５〜１０（＋／−）である。
【００６９】 本発明は、上記の方法によって製造された安定なポジプレックスおよび均質懸
濁液にも関する。特定の態様によれば、他成分と結合した安定化添加剤の容積、
従って上記方法によって調製した均質懸濁液中のその容積は、上記懸濁液の総容
積の０．０５〜９９％であり、更に具体的には１〜５０％であり、有利には２〜
１５％であることができる。
【００７０】 本発明は、好ましくは、一種類以上のカチオン性脂質と、一種類以上の安定化
添加剤と、一種類以上の核酸成分と、必要に応じて一種類以上のコリピドとを含
んでなるポジプレックスであって、 上記の安定化添加剤が、 ａ）式Ｉ：
【化１】 式II：
【化２】 または、 式III：
【化３】 ［上記式中、 Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同一であるかまたは異なり、１〜８個の炭素
原子を有するアリール、アルキル、シクロアルキル、フルオロアルキル、アルケ
ニルまたはオキシアルキル基であって、必要に応じて反復しており、線状または
分岐状であり、かつ必要に応じて置換されており、 Ｒ５はそれぞれの［Ｒ５−Ｓ］ｎの反復において互いに独立して（ＣＨ２）ｘ
であり、但し、ｘ＝１〜６であり、Ｒ５は必要に応じて置換されており、 ｎ＝１〜５０であり、 Ｒ１およびＲ２、またはＲ３およびＲ４は、それぞれ結合して分子を環化する
ことができる］ によって定義される非プロトン性の極性化合物、 ｂ）ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、テトラメチル尿素、および
それらの誘導体からなる群から選択される非プロトン性の極性化合物、 ｃ）式Ｉ：
【化１】 式II：
【化２】 または 式III：
【化３】 ［上記式中、 Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同一であるかまたは異なり、１〜８個の炭素
原子を有するアリール、アルキル、シクロアルキル、フルオロアルキル、アルケ
ニルまたはオキシアルキル基であって、必要に応じて反復しており、線状または
分岐状であり、かつ例えばヒドロキシル基のような少なくとも一種類の非プロト
ン性基によって置換されており、 Ｒ５はそれぞれの［Ｒ５−Ｓ］ｎの反復において互いに独立して(ＣＨ２)ｘで
あり、但し、ｘ＝１〜６であり、Ｒ５は必要に応じて置換されており、 ｎ＝１〜５０ であり、Ｒ１およびＲ２、またはＲ３およびＲ４は、それぞれ結合して分子を環
化することができる］ によって定義される群から選択されるプロトン性の極性化合物 からなる群から選択される極性化合物であるものを包含する。
【００７１】 好ましい態様では、本発明のポジプレックスに含まれる安定化添加剤は非プロ
トン性の極性化合物であり、ジエチルスルホキシド（ＤＥＳＯ）、ジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド（ＤＰＳＯ）、テトラメ
チルスルホキシド（ＴＥＭＳＯ）、ジメチルスルホン、スルホラン、１−メチル
−２−ピロリドン 、およびそれらの誘導体からなる群から選択される。
【００７２】 特定の好ましい態様によれば、本発明のポジプレックスは５００nm以下、好ま
しくは３００nm以下の複合体粒度を示す。
【００７３】 本発明は、安定なポジプレックスの少なくとも一種類の上記均質懸濁液、また
は上記の少なくとも一種類のポジプレックス、および薬学上許容可能なキャリヤ
ーを含んでなる組成物にも関する。
【００７４】 適当な医薬キャリヤーの例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝食塩溶液
、水、水中油型エマルションのようなエマルション、各種の湿潤剤、滅菌溶液な
どが挙げられる。このようなキャリヤーを含んでなる組成物は、周知の常法によ
って処方することができる。
【００７５】 本発明は、治療、予防またはワクチン接種用の組成物を製造するための上記の
安定なポジプレックスの均質懸濁液または少なくとも一種類の上記ポジプレック
スの使用であって、上記組成物が遺伝子治療によりヒトまたは動物体の治療を行
おうとすることを特徴とする使用にも関する。特定の態様によれば、上記組成物
は筋肉内経路によって注射することができる形態で投与するか、または上記組成
物の吸入、気管内注射、点滴注入またはエアゾール化によって投与しようとする
ものである。
【００７６】 本発明によれば、これらの組成物は適当な用量で被験者に投与することができ
る。適当なその投与は、例えば静脈内、気管内、肺内、腹腔内、皮下、筋肉内、
局所または皮内投与などの様々な方法によって行うことができる。投薬法(dosag
e regimen)は、担当医および他の臨床的要因によって決定される。医療技術では
周知のように、任意の患者に対する投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、
投与を行う特定の物質、投与時間および経路、一般的健康、および同時に投与さ
れる他の薬剤など多くの要因によって変化する。一般に、組成物の規則的投与と
してのレジーメン(regimen)は、１日当たりの生物活性化合物として１μg〜１０
mgの範囲にあるべきである。レジーメンが連続輸液であれば、体重１kg当たり１
分当たりの生物活性化合物として１μg〜１０mgの範囲にあるべきでもある。進
行は定期的に評価することによって観察することができる。投薬量は変動するが
、核酸、ＤＮＡの静脈内投与に好ましい投薬量は、ＤＮＡ分子約１０６〜１０１ ２ 個である。本発明の組成物は、局所的または全身的に投与することができる。
投与は通常は非経口、例えば静脈内であるが、ＤＮＡは標的部位に直接投与する
こともでき、例えばカテーテルなどによって動脈内の部位に投与することができ
る。更に、本発明の組成物は、注射前にマイクロカプセルまたは微小球に結合さ
せることができる。二重バルーンまたは他のカテーテルのようなをデザインした
イン・ビボでの遺伝子導入法、または上記のような標的組織への直接投与を用い
ることができる。あるいは、身体から組織に入っていることが知られている細胞
を単離した後、上記組成物の一つを用いてトランスフェクションし、再投与する
エクス・ビボ法を用いることもできる。
【００７７】 更にもう一つの態様では、本発明は、上記懸濁液／組成物のいずれか一つを含
んでなるワクチンに関する。この態様では、治療活性物質は疾患に罹りやすいヒ
トまたは動物におけるこの疾患に対する防御的免疫学的応答を生成することがで
きる抗原または同じものをコードする核酸であるのが好ましい。本発明のワクチ
ンは、当該技術分野で周知の方法によって製造することができる。ワクチン接種
に用いられる抗原の免疫原性は、例えば分泌されたサイトカインまたはケモカイ
ン、または膜分子をコードする同時形質導入ｃＤＮＡによって高めることができ
、例えばＴｈ１−またはＴｈ２−指定免疫応答をプログラミングすることができ
る。ワクチンは、例えば皮内、皮下、筋肉内、または特に抗腫瘍ワクチン接種の
場合には、腫瘍増殖部位、またはリンパ管または腫瘍増殖部位を排膿するリンパ
節に注射することができる。
【００７８】 もう一つの態様では、本発明は、本発明の上記懸濁液／組成物のいずれか一つ
と必要に応じて検出に適当な手段を含んでなる診断組成物に関する。この態様で
は、治療活性物質は標識するのが好ましい。当業者に知られている多数の様々な
標識や標識法がある。本発明で用いることができる標識の種類の例としては、酵
素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発
光化合物が挙げられる。更にまたはあるいは、治療活性物質は、（β−ガラクト
シダーゼ、グリーン蛍光タンパク質またはルシフェラーゼのような）直接または
間接的に検出可能なタンパク質をコードするマーカー遺伝子を含んでなる。本発
明の診断組成物は、ターゲッティング、例えば選択された領域への光放出、並び
に被験者内部のものの追跡に有利に用いることができる。更に、疾病状態の動物
モデルは、動物内部の疾病の進行または病原体を突きとめ、追跡し、疾病または
病原体を抑制するのに有効な治療化合物と推定されるものをスクリーニングする
方法と同様に、上記組成物を用いることによって完成することができる。哺乳類
由来の光を検出し、局在化する方法は、従来の技術、例えばＷＯ９７／１８８４
１号明細書、およびそこに引用されている文献に記載されている。
【００７９】 本発明は、少なくとも一種類の核酸をイン・ビトロ、エクス・ビボまたはイン
・ビボで、更に具体的にはイン・ビボで標的細胞に導入するための本発明による
懸濁液／組成物の使用にも関する。
【００８０】 導入または移行工程は、それ自体周知である。「導入または移行」とは、治療
活性物質を細胞に導入して、この工程の終了時に上記細胞の内部またはその膜内
または上に局在化することを意味する。活性物質が核酸である場合には、これは
「トランスフェクション」と呼ばれる。トランスフェクションは、例えば上記遺
伝子の発現を測定することによるまたは発現したタンパク質の濃度を測定するこ
とによる任意の適当な方法によって立証することができる。
【００８１】 本発明による「標的細胞」は、原核細胞、酵母細胞および真核細胞、植物細胞
、ヒトまたは動物細胞、特に哺乳類細胞を意味するものと理解される。更に、癌
細胞を挙げることもできる。イン・ビボでは、本発明は、肺、気管、皮膚、筋肉
、脳、肝臓、心臓、脾臓、骨髄、胸腺、膀胱、リンパ、血液、血管、膵臓、胃、
腎臓、卵巣、精巣、直腸、末梢または中枢神経系、目、リンパ器官、軟骨、内皮
のような組織の間質または管腔内に適用することができる。本発明の有利な選択
によれば、標的細胞は筋肉細胞、造血幹細胞または気道細胞、更に具体的には器
官または肺細胞、有利には呼吸上皮細胞である。
【００８２】 本発明は、治療活性物質を標的細胞に導入することによって、上記細胞を本発
明による組成物と接触させる方法にも関する。
【００８３】 特に、本発明の組成物は、少なくとも一種類の核酸を標的細胞に導入する治療
処置の方法の実行に用いることができる。好ましくは、これらの標的細胞は哺乳
類細胞である。この哺乳類細胞は、特に肺細胞、筋肉細胞、または造血幹細胞で
ある。
【００８４】 本発明によれば、イン・ビボでの遺伝子治療に関しては、所定の患者で、投与
した化合物の一つに対して著しい免疫反応を誘発することなく、この提案した処
置を数回反復することができる。投与は、単回用量で行うことができ、または一
回または特定の間隔を置いて数回反復する用量で行うことができる。適当な投与
経路および投薬量は、治療を行う個体または疾患、または導入する核酸などの様
々なパラメーターによって変化する。
【００８５】 これらおよび他の態様は、本発明の説明および例に開示されておりまたはこれ
から明らかであり、これらに包含されている。本発明に用いられる方法、用途お
よび化合物のいずれか一つに関する他の文献は、電子装置などを用いて公共図書
館から検索することができる。例えば、周知のデータベースである「Medline」
を利用することができ、これはインターネット上で、例えば http://www.ncbi.n
lm.nih.gov/PubMed/medline.htmlで入手できる。他のデーターベースおよびアド
レス、例えば http://www.ncbi.nlm.nih.gov、http://www.infobiogen.fr、http
://www.fmi.ch/biology/research_tools.html、http://www.tigr.orgは当業者に
知られており、http://www.lycos.com を用いて得ることもできる。バイオテク
ノロジーの特許情報のあらまし、および遡及検索および最新の知見について有用
な特許情報の関連供給源の概説は、Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364 に記載
されている。
【００８６】 本発明の方法、組成物、用途は、治療および／または診断が核酸の細胞への導
入に関係しまたはこれに依存しているあらゆる種類の疾患の治療に用いることが
できる。本発明の組成物および用途は、ヒトで望ましく用いることができるが、
動物の治療も本明細書に記載の用途に包含される。
【００８７】
【実施例】
本発明を、下記の例について説明する。
【００８８】例１: 極性の非プロトン性化合物によるリポプレックスの安定化 極性の非プロトン性化合物のリポプレックス安定化効果を、様々な脂質系で得
た様々なリポプレックスを用いて分析することができる。 系１：ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌ （１：１） Ｎ／Ｐ＝２．２ 系２：ｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥ （１：１） Ｎ／Ｐ＝５ 系３：ＤＯＧＳ／ＤＯＰＥ （１：１） Ｎ／Ｐ＝５ ｐｃＴＧ９０は、特許出願明細書ＷＯ９８／３４９１０号明細書に記載されて
いる。
【００８９】 プラスミドＤＮＡ（ｐｃＴＧ１１０３３および／またはｐＣＭＶ−ｌｕｃ; い
ずれの場合にも、ルシフェラーゼ遺伝子はＣＭＶ由来のプロモーター配列によっ
て制御される）および上記カチオン性脂質およびコリピド（系１〜系３）からな
るリポプレックスを０．２５mg ＤＮＡ／mlで処方し、指定量のＤＭＳＯ（最終
濃度）を処方したリポプレックスに加える。 系１：０．２５mg ＤＮＡ／mlと、０％ＤＭＳＯ、２％ＤＭＳＯ、５％ＤＭＳ
Ｏ、または１０％ＤＭＳＯ． 系２：０．２５mg ＤＮＡ／mlと、０％ＤＭＳＯ、２％ＤＭＳＯ、５％ＤＭＳ
Ｏ、または１０％ＤＭＳＯ． 系３：０．２５mg ＤＮＡ／mlと、０％ＤＭＳＯ、２％ＤＭＳＯ、５％ＤＭＳ
Ｏ、または１０％ＤＭＳＯ．
【００９０】 再現性を確かめるために、試料を３個ずつ調製し（３×３×４＝３６）、分析
を粒度測定（１日目、３日目、７日目および１４日目に９０°の擬似弾性レーザ
ー光散乱(quasi-elastic laser light scattering)、 並びに１日目、７日目お
よび１４日目にルシフェラーゼ活性の検出によるイン・ビトロでのトランスフェ
クション分析によって行う。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/43 Ａ６１Ｋ 47/16 39/395 47/20 47/04 47/22 47/16 47/30 47/20 47/44 47/22 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 47/30 Ａ６１Ｋ 37/02 47/44 37/48 Ｃ１２Ｎ 15/09 37/24 (72)発明者 ハンノ、ファウ．ヨット．コルベ フランス国アシェンハイム、リュ、ド、テ ュイリエ、６ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA01 CA11 HA11 HA17 4C076 AA22 AA24 BB11 BB15 BB17 CC50 DD48Q DD52 DD55Q DD60Q DD63 EE01 EE51 FF02 FF43 4C084 AA02 AA03 AA13 BA44 CA62 DA01 DB01 DC01 MA05 MA13 MA23 MA57 MA66 NA03 NA10 NA13 4C085 AA13 EE07 GG01 GG03 GG08

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも一種類のカチオン性トランスフェクション分子と、少なくとも一種
    類の核酸成分と、少なくとも一種類の安定化添加剤と、必要に応じて少なくとも
    一種類のコリピドとを組み合わせてポジプレックスを形成させることを含んでな
    る、安定なポジプレックスまたはその均質な懸濁液の製造方法であって、 前記の安定化添加剤が、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される極性化合物
    である、方法。 ａ）式Ｉ： 【化１】 式II： 【化２】 または 式III： 【化３】 ［前記式中、 Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同一であるかまたは異なり、１〜８個の炭素
    原子を有するアリール、アルキル、シクロアルキル、フルオロアルキル、アルケ
    ニルまたはオキシアルキル基であって、必要に応じて反復しており、線状または
    分岐状であり、かつ必要に応じて置換されており、 Ｒ５はそれぞれの［Ｒ５−Ｓ］ｎの反復において互いに独立して（ＣＨ２）ｘ
    であり、但し、ｘ＝１〜６であり、Ｒ５は必要に応じて置換されており、 ｎ＝１〜５０であり、 Ｒ１およびＲ２、またはＲ３およびＲ４は、それぞれ結合して分子を環化する
    ことができる］ によって定義される非プロトン性の極性化合物、 ｂ）ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、テトラメチル尿素、および
    それらの誘導体からなる群から選択される非プロトン性の極性化合物、 ｃ）式Ｉ： 【化１】 式II： 【化２】 または 式III： 【化３】 ［前記式中、 Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同一であるかまたは異なり、１〜８個の炭素
    原子を有するアリール、アルキル、シクロアルキル、フルオロアルキル、アルケ
    ニルまたはオキシアルキル基であって、必要に応じて反復しており、線状または
    分岐状であり、かつ少なくとも一種類のプロトン性基によって置換されており、 Ｒ５はそれぞれの［Ｒ５−Ｓ］ｎの反復において互いに独立して（ＣＨ２）ｘ
    であり、但し、ｘ＝１〜６であり、Ｒ５は必要に応じて置換されており、 ｎ＝１〜５０であり、 Ｒ１およびＲ２、またはＲ３およびＲ４は、それぞれ結合して分子を環化する
    ことができる］ によって定義される群から選択されるプロトン性の極性化合物。
  2. 【請求項２】 前記安定化添加剤が非プロトン性の極性化合物であり、かつ、ジエチルスルホ
    キシド（ＤＥＳＯ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジ−ｎ−プロピルス
    ルホキシド（ＤＰＳＯ）、テトラメチレンスルホキシド（ＴＥＭＳＯ）、ジメチ
    ルスルホン、スルホラン、１−メチル−２−ピロリドン、およびそれらの誘導体
    からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記カチオン性トランスフェクション分子と、前記核酸と、前記安定化添加剤
    と、必要に応じて前記コリピドとを、少なくとも一種類の標的化合物および標識
    化合物と組み合わせることをさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法
    。
  4. 【請求項４】 サイジング処置である任意段階をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか
    一項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 サイジング処置が、細孔度が５０〜５００nmの範囲の膜を介してポジプレック
    スを押出すことを含んでなる、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記カチオン性トランスフェクション分子および必要に応じて前記コリピドを
    、前記安定化添加剤と組み合わせる前に前記核酸と組み合わせる、請求項１〜５
    のいずれか一項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記カチオン性トランスフェクション分子または前記核酸を、それぞれ前記核
    酸または前記カチオン性トランスフェクション分子と組み合わせる前に前記安定
    化添加剤と組み合わせる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 均質な懸濁液中のポジプレックスの複合体または粒子のサイズが５００nm以下
    である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 均質懸濁液中のポジプレックスの複合体または粒子のサイズが３００nm以下で
    ある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記カチオン性トランスフェクション分子がカチオン性脂質またはカチオン性
    ポリマーである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 コリピドが、正もしくは負に帯電した、中性または双性イオン性の脂質である
    、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記コリピドが、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジル
    コリン、ホスホコリン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ
    ）、スフィンゴミエリン、セラミド、セレブロシド、またはそれらの誘導体の一
    つである、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 安定化添加剤を、該複合体または粒子に配合することができる残基とカップリ
    ングさせる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 該残基がリン脂質である、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記核酸成分が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、
    ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチ
    ドである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記核酸成分が、少なくとも一種類の目的とする遺伝子と、この目的とする遺
    伝子を発現させることができる要素とを含んでなる、請求項１〜１５のいずれか
    一項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記核酸成分が、ポリペプチドの全部または一部をコードする、請求項１〜１
    ６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記ポリペプチドが治療活性を示す、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記ポリペプチドが予防活性、特に免疫原活性を示す、請求項１７に記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】 前記ポリペプチドが、酵素、ホルモン、サイトカイン、膜受容体、抗体、転写
    、翻訳または複製を調節しかつ転写産物の安定性に関与する因子、構造ポリペプ
    チド、膜チャンネルを形成するポリペプチド、輸送ポリペプチド、接着分子、ま
    たはリガンドである、請求項１７に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、安定
    なポジプレックスの均質懸濁液。
  22. 【請求項２２】 安定化添加剤の容積が、前記懸濁液の全容積の０．０５〜９９％、１〜５０％
    、または２〜１５％である、請求項２１に記載の均質懸濁液。
  23. 【請求項２３】 請求項２１または２２に記載の、または請求項１〜２０のいずれか一項に記載
    の方法によって得ることができる、均質懸濁液のポジプレックス。
  24. 【請求項２４】 請求項２１または２２に記載の少なくとも一種類の懸濁液、または請求項２３
    に記載の少なくとも一種類のポジプレックスと、必要に応じて薬学上許容可能な
    キャリヤーとを含んでなる、組成物。
  25. 【請求項２５】 治療、予防またはワクチン接種を目的とする組成物であって、遺伝子治療によ
    りヒトまたは動物体を治療するようにデザインされた組成物を調製するための、
    請求項２１または２２に記載の懸濁液、または請求項２３に記載のポジプレック
    スの使用。
  26. 【請求項２６】 前記組成物が、筋肉内経路によって注射することができる形態で投与されるよ
    うにデザインされている、請求項２５に記載の使用。
  27. 【請求項２７】 前記組成物が、この組成物を吸入、気管内注射、点滴注入またはエアゾール化
    によって投与するようにデザインされている、請求項２５に記載の使用。
JP2000589718A 1998-12-21 1999-12-08 安定なポジプレックスの懸濁液の製造法 Pending JP2002533354A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98403267.2 1998-12-21
EP98403267A EP1013772A1 (en) 1998-12-21 1998-12-21 Method for preparing suspension of stable posiplexes
PCT/EP1999/009651 WO2000037664A1 (en) 1998-12-21 1999-12-08 Method for preparing suspension of stable posiplexes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002533354A true JP2002533354A (ja) 2002-10-08

Family

ID=8235603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000589718A Pending JP2002533354A (ja) 1998-12-21 1999-12-08 安定なポジプレックスの懸濁液の製造法

Country Status (5)

Country Link
EP (2) EP1013772A1 (ja)
JP (1) JP2002533354A (ja)
AU (1) AU1973300A (ja)
CA (1) CA2352535A1 (ja)
WO (1) WO2000037664A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2724552C (en) 2008-05-27 2018-10-09 Dako Denmark A/S Compositions and methods for detection of chromosomal aberrations with hybridization buffers comprising a polar aprotic solvent
WO2010097655A1 (en) 2009-02-26 2010-09-02 Dako Denmark A/S Compositions and methods for rna hybridization applications
EP2761028A1 (en) 2011-09-30 2014-08-06 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods using formamide
EP3252173A1 (en) 2011-10-21 2017-12-06 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT941066E (pt) * 1996-08-26 2004-03-31 Transgene Sa Complexos de lipido cationico - acido nucleico
AU739998B2 (en) * 1997-06-12 2001-10-25 Transgene S.A. Novel lipid complexes for transferring at least one therapeutically active substance, in particular a polynucleotide, into a target cell, and use in gene therapy
AU707186B2 (en) * 1997-07-01 1999-07-01 Transgene S.A. Compositions useful for transferring therapeutically active substances into a target cell, and their use in gene therapy

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000037664A1 (en) 2000-06-29
AU1973300A (en) 2000-07-12
EP1141365A1 (en) 2001-10-10
EP1013772A1 (en) 2000-06-28
CA2352535A1 (en) 2000-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3499137B2 (ja) 標的細胞へ治療学上活性な物質を輪送するのに有用な組成物及びその遺伝子治療における使用
EP0935415B1 (en) In vitro methods for delivering nucleic acids into a cell
Ledley Nonviral gene therapy: the promise of genes as pharmaceutical products
US6110745A (en) Preparation of lipid-nucleic acid particles using a solvent extraction and direct hydration method
US20200016274A1 (en) Messenger rna vaccines and uses thereof
US6743779B1 (en) Methods for delivering compounds into a cell
WO1998041192A9 (en) The use of temperature to control the size of cationic liposome/plasmid dna complexes
JP2003528131A (ja) カチオン性リポソーム
WO1998041192A1 (en) The use of temperature to control the size of cationic liposome/plasmid dna complexes
EP1023048A1 (en) Methods for encapsulating nucleic acids in lipid bilayers
JP2002316997A (ja) 目的とするアニオン性物質を細胞に導入するための複合体
Ansari et al. Biomaterials for polynucleotide delivery to anchorage-independent cells
CA2284399C (en) Use of magnesium (mg2+) for the preparation of a therapeutic composition for transfection of a polynucleotide into a cell and compositions useful in gene therapy
JP2002533354A (ja) 安定なポジプレックスの懸濁液の製造法
EP0987029B1 (en) Use of a catonic polymer for the preparation of a complex with nucleic acid and related compositions
US20020193331A1 (en) Non-naturally occurring nucleic acid compositions, their use for the preparation of formulations useful for transfecting a nucleic acid into cells and applications
JP2005513073A6 (ja) ポリヌクレオチドを細胞へトランスフェクションするための組成物の製造のためのリゾ脂質の使用
JP2005513073A (ja) ポリヌクレオチドを細胞へトランスフェクションするための組成物の製造のためのリゾ脂質の使用
US6723708B2 (en) Use of lithium (Li+) for the preparation of a composition for transfection of a polynucleotide into a cell and compositions useful in gene therapy
EP1052288A1 (en) Complex for transferring an anionic substance of interest into a cell
AU770607B2 (en) Complex for transferring an anionic substance of interest into a cell
JP2004534004A (ja) ポリヌクレオチドを細胞へトランスフェクションするための組成物を製造するための非複合体化ペプチドの使用および遺伝子治療において有用な組成物