CN102205134A - 壳聚糖-dna纳米颗粒复合物及其制备方法 - Google Patents

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文铁桥
霍一楠
刘芳
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本发明涉及一种壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物及其制备方法。该复合物为该复合物为壳聚糖上的氨基质子化为—NH3 +，与银光蛋白质粒DNA上的磷酸基以静电作用结合而形成，其中N:P的摩尔比为4-8。本发明的复合物能保护DNA免受核酸酶的降解，并与带负电的细胞膜产生静电吸附作用，促进细胞的内吞作用，实现目的基因的转染。该复合物细胞毒性低，因而可作为良好的基因载体用于基因转染。实现了目标基因的转染，为基因治疗的应用提供了有力的条件。

Description

壳聚糖 -DNA 纳米颗粒复合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物及其制备方法。
背景技术
基因治疗一直是人们关注的热点之一，它可以通过填补缺失的基因、替换有缺陷的基因或沉默不需要的基因来治疗遗传性和非遗传性疾病。但裸露的基因在体内很容易被核酸酶降解，转染效率很低。因此，发展安全高效的基因载体成为基因治疗成功的先决条件。近年来，主要的基因载体系统分为病毒和非病毒载体两种。虽然病毒载体在体内有较高的转染效率，但存在可能的毒性、易引起免疫反应及产生炎症的风险。非病毒载体包括脂质体和阳离子复合物，脂质体目前虽被广泛应用于细胞转染，但其包封率低、贮存稳定性差、容易被血液中的成分清除，使其在生物整体的应用受到限制。因此，人们将目光转向了非病毒载体中富含阳离子且骨架包含氨基的聚合物。其中，壳聚糖作为一种聚阳离子基因载体正受到人们的广泛关注。
甲壳素在脱乙酰度达50％-100％之间时，成为壳聚糖（Chitosan，CS），系统名(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，可溶于酸性水溶液形成自身带正电荷的大分子。壳聚糖大分子能够与DNA相互作用形成壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物（CNPs-DNA），且此复合物对DNA有一定的保护作用，使其免受核酸酶的降解，并具有黏膜附着剂的性质。除此之外，壳聚糖纳米颗粒DNA复合物的粒径大小适于细胞吞噬，且表面带有适量正电荷可与带负电的细胞膜产生静电吸附作用，进而打开上皮细胞之间的紧密连接使大分子物质通过细胞间隙运输，对细胞无毒副作用。因而可作为良好的基因载体用于基因转染。
影响壳聚糖纳米粒体外基因转染效率的因素很多，主要包括壳聚糖的分子量、脱乙酰度、壳聚糖氨基与DNA磷酸基比例(N/P)、DNA浓度、pH值、离子强度、温度等。因此，研究壳聚糖的各种影响因素对转染效率的影响，探寻最有效的CNPs-DNA，对提高目标基因的转染效率有重要意义，为基因治疗奠定了基础。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物（CNPs-DNA）。
本发明的目的之二在于提供该复合物的制备方法。
为达以上目的，本发明通过下述方案实现：
一种壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物，其特征在于该复合物为壳聚糖上的氨基质子化为—NH3 +，与荧光蛋白质粒DNA上的磷酸基以静电作用结合而形成，其中N:P的摩尔比为4-8。
上述的荧光蛋白质粒为：绿色荧光蛋白质粒。
上述的绿色荧光蛋白质粒为：pEGFP-C1。
一种制备上述的壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 将经纯化的壳聚糖溶于10%醋酸中配制成浓度为2g/L的溶液，调节pH为5-6，得壳聚糖原液，经0.22μm滤膜过滤除菌；
b.将步骤a所得壳聚糖原液稀释成0.2-0.8g/L，调pH为6-8，经0.22μm滤膜过滤除菌备用；
c.将荧光蛋白质粒DNA用浓度为25-75mmol/L的Na2SO4水溶液稀释为100—400μg/ml的溶液；
d将步骤b和步骤c所得的壳聚糖稀释液和质粒溶液置于55℃保温30 min；
e.按24孔板每孔以10ul壳聚糖溶液与10ul、400ug/ml质粒溶液的比例混合30 s，室温下静置1小时。
本发明的复合物能保护DNA免受核酸酶的降解，并与带负电的细胞膜产生静电吸附作用，促进细胞的内吞作用，实现目的基因的转染。该复合物细胞毒性低，因而可作为良好的基因载体用于基因转染。实现了目标基因的转染，为基因治疗的应用提供了有力的条件。
附图说明
图1为本发明的凝胶阻滞实验，其中A,A’为裸质粒DNA；B,B’为CS；C-I分别为N/P=10、8、6、4、2、1、1/2的CNPs-DNA。
图2为本发明的DNaseI消化后，其中A,A’为裸质粒DNA；B,B’为CS；C-I分别为N/P=10、8、6、4、2、1、1/2的CNPs-DNA。
图3为倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，其中A为裸质粒转染组；B为Lipofectamine™ 2000转染组；C、D、E分别为N/P=8、6、4的CNPs-DNA转染组）。
图4为本发明的流式细胞仪检测转染效率，其中A为裸质粒转染组；B为Lipofectamine™ 2000转染组；C、D、E分别为N/P=8、6、4的CNPs-DNA转染组。
图5为CNPs-DNA的细胞毒性实验。
具体实施方案
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例一：壳聚糖纳米颗粒 DNA 复合物 CNPs-DNA 的制备
（1）称20mg纯化后的壳聚糖溶于10%的醋酸，可微微加热（勿超42℃），待壳聚糖颗粒完全溶解后，用10M的NaOH溶液粗调pH为5.5，得0.2%（w/v）的壳聚糖原液，经0.22μm滤膜过滤除菌。
（2）取适量的壳聚糖原液稀释成浓度为0.08%（w/v）的壳聚糖溶液，用10M的NaOH溶液调pH为6.5-7.0之间，经0.22μm滤膜过滤除菌备用。
（3）质粒DNA（pEGFP-C1）用蒸馏水稀释为400μg/ml的DNA溶液，加入1/10体积500mM的Na2SO4溶液（使其终浓度为50mM）。
（4）将壳聚糖溶液与质粒溶液分别置于55℃恒温孵育器上保温30 min。等体积混合后，迅速于涡旋器上混合30s，室温下静置1h，即得壳聚糖纳米颗粒DNA复合物CNPs-DNA，可用于后续转染实验。
实施例二：对 CNPs-DNA 物理性质的测定
1 ．凝胶电泳阻滞和 DNase Ⅰ的消化实验：请具体说明凝胶电泳阻滞消化实验的具体步骤，
（1）凝胶电泳阻滞实验：CNPs-DNA经1.0%的琼脂糖凝胶电泳60V，40min，由于壳聚糖包裹DNA后掩盖了DNA本身的负电荷，使其无法在电泳中从负极向正极移动而被阻滞于上样孔中。
（2）DNaseⅠ的消化实验：CNPs-DNA中加入0.5U DNaseⅠ（1U/ul），37℃温浴1h，经1.0%的琼脂糖凝胶电泳60V，40min，被包裹的DNA滞留在上样孔中，未被包裹的DNA被DNaseⅠ消化降解。以此来判断壳聚糖纳米颗粒对DNA的保护能力。参见图 1 和图 2 ，说明CNPs-DNA能够有效保护DNA免受DNaseⅠ的消化。
的粒径和 Zeta 电位测定：使用Zetasizer3000HS粒度及电位分析仪测定其平均粒径和Zeta电位。参见表1
表1： 不同N/P的CS-DNA粒径及Zeta分布情况
Figure 89902DEST_PATH_IMAGE001
。
实施例三：不同 N/P 的 CNPs-DNA 对转染效率的影响：
应用 CNPs-DNA 介导 pEGFP-C1 对 HEK293T 细胞的转染，具体步骤为 :
细胞复苏后传代培养，大约三代左右达到对数生长期（此时细胞生长旺盛，分裂速度最快），挑选生长状态好的细胞进行试验。按先前细胞传代步骤消化细胞后计数，转移到24孔板内培养，每孔细胞数约为5´105个。培养16-24h后观察，细胞均匀贴壁且密度达到80%-90%即可进行转染实验。
（1）移去培养基，小心加入PBS清洗细胞两次（勿损伤或吹起细胞）；
（2）设一孔空白对照，只加入完全培养基；
（3）设一孔为阴性对照，加入DMEM和裸质粒DNA；
（4）设一孔为阳性对照，按Lipofectamine™ 2000说明书进行转染（24孔板每孔质粒用量1-1.5ug，lipo用量1ul）
（4）将制备好的壳聚糖纳米颗粒DNA复合物与500ml完全培养基混合（此时培养及颜色呈略微橙红或粉红色，以此判断此时的pH值约为6.5-7之间），缓慢加入到培养板中；
（5）观察每孔细胞状态正常后，放入37℃，CO2培养箱培养；
（6）根据细胞生长情况和时间，可适量补加含10%胎牛血清的完全培养基；
（7）培养24h以上可在荧光显微镜下观察发光情况（48h后逐步变强，96h后减弱）；
（8）转染48h后用流式细胞仪检测转染效率。
实验表明复合物中壳聚糖所含氨基的摩尔数与DNA所含磷酸的摩尔数之比N/P是影响CNPs-DNA转染效率的关键因素。
实施例四：细胞毒性检测
选择处于对数生长期的细胞，96孔板每孔加入100ul 约2000个细胞。设不做任何处理的细胞为空白对照，实验组加入N/P为4的CNPs-DNA， Lipofectamine™ 2000与质粒DNA的复合物为阳性对照，每个样本设5个重复。培养24h、48h、72h后，移去培养基，更换90ul新的培养基，待测孔每孔加入10ul CCK-8溶液。37℃，5%CO2细胞培养箱内继续培养1h，避光取出，在酶标仪上振荡混匀，450nm测定吸光度。参见图5，，说明本发明的CNPs-DNA对细胞毒性小。

Claims (4)

1.一种壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物，其特征在于该复合物为壳聚糖上的氨基质子化为—NH3 +，与荧光蛋白质粒DNA上的磷酸基以静电作用结合而形成，其中N:P的摩尔比为4-8。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物，其特征在于所述的荧光蛋白质粒为：绿色荧光蛋白质粒。
3.根据权利要求2所述的壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物，其特征在于所述的绿色荧光蛋白质粒为：pEGFP-C1。
4.一种制备根据权利要求1所述的壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 将经纯化的壳聚糖溶于10%醋酸中配制成浓度为2g/L的溶液，调节pH为5-6，得壳聚糖原液，经0.22μm滤膜过滤除菌；
b.将步骤a所得壳聚糖原液稀释成0.2-0.8g/L，调pH为6-8，经0.22μm滤膜过滤除菌备用；
c.将荧光蛋白质粒DNA用浓度为25-75mmol/L的Na2SO4水溶液稀释为100—400μg/ml的溶液；
d将步骤b和步骤c所得的壳聚糖稀释液和质粒溶液置于55℃保温30 min；
e.按24孔板每孔以10ul壳聚糖溶液与10ul、400ug/ml质粒溶液的比例混合30 s，室温下静置1小时。
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