CN103333250A - 一种生物安全性好的纳米荧光探针的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的主要是利用一种生物安全性极好的天然高分子材料壳聚糖来包裹荧光蛋白质以提高其稳定性，扩展其使用领域和范围。该制备步骤包括吸附和交联，十分简单易行、包裹效率极高，所得的纳米颗粒具有很好的稳定性、分散性和生物安全性，且可以保护蛋白质不易被酶解和变性，还具有保护荧光不易淬灭和光漂白等优良性能。且体外实验表明该材料可以成功进入细胞，并且作为一种生物安全性好的荧光探针应用于分子水平上。

Description

一种生物安全性好的纳米荧光探针的制备方法

技术领域

    本发明涉及一种生物安全性好的纳米荧光探针的制备方法，属于高分子纳米材料及生物化学领域。

背景技术

荧光探针已经被广泛应用在生物医学领域，包括呈像、传感、诊断，但是传统的荧光探针的生物安全性是问题一直备受争议，如传统有机染料制备的荧光探针沿用至今，但是由于有机染料在稳定性和安全性方面存在的严重问题，其在生物医学领域的应用已经逐步被新型的纳米探针取代，例如量子点，然而多数量子点材料（如CdSe等）含有重金属元素，其重金属的毒性是一个潜在隐患，使其应用受到局限，虽然由硅胶或聚合物封装可减少重金属离子释放的风险，但一旦泄露就存在巨大的安全隐患，限制了其作为荧光探针在生物体内的应用。

荧光蛋白作为一种蛋白质而具有很好的生物安全性，目前已经成功研究并合成了一系列发射不同波长并具有优异荧光性能的的荧光蛋白质，他们高的量子产率和荧光稳定性使得他们还可以作为单个分子的检测。但目前荧光蛋白的应用主要是基于基因水平操作的，纯化的蛋白质由于蛋白质自身的不稳定性（酶解、变性等）尚无法作为单独的荧光探针使用。

壳聚糖是自然界中唯一一种带正电荷的天然碱性多糖，它存在范围广、廉价易得、无毒副作用、生物相容性极好、易于表面修饰、并且可生物降解，具有十分优异的生物活性，在生物医学领域应用十分广泛。利用壳聚糖来包裹大分子类材料应用十分广泛，如开发蛋白质和多肽类的药物等。

本发明利用十分简便的方法将荧光蛋白质包裹在壳聚糖纳米颗粒内部，通过包裹提高了蛋白质的稳定性，大大扩展了荧光蛋白的利用范围和领域。本发明的实施案例中包裹了红色荧光蛋白，这种方法包裹效率高（几乎100%），制备的纳米颗粒尺寸小，分散性稳定性很好；大大提高了蛋白质的热稳定性和pH稳定性，同时还具有不易被酶解和变性的优良性能，还可以保护荧光蛋白不易淬灭和不易发生光漂白等现象；该纳米材料无毒，并且该材料可以成功进入细胞，作为一种生物荧光探针应用于分子水平上。

目前的技术仅仅是利用乳化交联或者复凝聚法等传统方法制备壳聚糖纳米颗粒，并且通过物理包埋或吸附作用作用来包裹蛋白质等药物，这种方法包裹效率很低（一般低于60%），且制备的纳米颗粒较大，有些甚至达到微米级别，这样纳米颗粒的分散性和稳定性都不好，也不能长期存放，不然会发生严重的团聚。

发明内容

荧光探针已经被广泛应用在生物医学领域，包括呈像、传感、诊断。但是传统的荧光探针的生物安全性是问题一直备受争议，荧光蛋白作为一种蛋白质而具有很好的生物安全性，他们高的量子产率和荧光稳定性使得他们还可以作为单个分子的检测。但是纯化的蛋白质由于蛋白质自身的不稳定性，易被酶解和变性，生物利用度差，尚无法作为单独的荧光探针使用。本发明的主要思想是：使用一种生物安全性极好的天然高分子材料——壳聚糖来包裹荧光蛋白质，通过包裹来提高荧光蛋白质的稳定性，大大扩展其利用范围和领域。本思想通过以下方式实现：

先将壳聚糖质子化，然后静电吸附于荧光蛋白质表面，再用戊二醛作为交联剂对表面的壳聚糖进行交联，即可得包裹各种荧光蛋白质的壳聚糖纳米颗粒。其特征在于，具有以下的步骤：

a. 壳聚糖的质子化处理：将壳聚糖完全溶解于盐酸溶液中，加入3-5倍于盐酸体积的无水乙醇溶液，将沉淀物烘干研磨得质子化壳聚糖的固体粉末。

 b. 包裹蛋荧光白质的壳聚糖纳米颗粒的制备：将荧光蛋白质加入到pH值7.0-10.0的10-50mM的缓冲溶液中， 加入上述质子化壳聚糖，壳聚糖中氨基葡萄糖单元与荧光蛋白质的摩尔比为2000:1-10000:1，室温搅拌至完全溶解后，加入戊二醛水溶液，戊二醛与氨基葡萄糖单元的摩尔比为0.35:1- 0.7:1，室温搅拌至反应完全后，超滤洗涤三次（3000g，15min）以除去未反应的壳聚糖等，即可得包裹荧光蛋白质的壳聚糖纳米颗粒。

c. 将所得的包裹荧光蛋白质的壳聚糖纳米颗粒分散在培养基中，与Hela细胞共同培养2-48 h，用激光共聚焦显微镜拍摄，显示可以成功的进入Hela细胞并在分子水平上成像。

与现有技术相比，本发明具有如下突出优点：

本发明利用一种简单的方法制备包裹荧光蛋白质的壳聚糖纳米颗粒，包裹效率几乎100%，通过包裹提高了蛋白质的稳定性，具有更好的热稳定性和pH稳定性，使蛋白不易酶解和变性，同时具有使荧光不易淬灭和光漂白等优良的性能；而且所得纳米颗粒的粒径小，分散性稳定性好，这大大扩展了荧光蛋白质的利用范围和领域。用这种方法包裹红色荧光蛋白已经成功的应用于分子水平的成像。

附图说明

    图 1为本发明所得包裹红色荧光蛋白的壳聚糖纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）照片图。

    图 2为本发明所得包裹红色荧光蛋白的壳聚糖纳米颗粒的动态光散射（DLS）图。

图3为本发明所得包裹红色荧光蛋白的壳聚糖纳米颗粒与红色荧光蛋白酶解对比曲线图。

图 4 为本发明所得包裹红色荧光蛋白的壳聚糖纳米颗粒与红色荧光蛋白盐酸胍变性对比图。

图 5 为本发明所得包裹红色荧光蛋白的壳聚糖纳米颗粒与红色荧光蛋白在阳离子淬灭剂氯化铯的作用下的荧光淬灭实验对比图。

图 6  为本发明所得包裹红色荧光蛋白的壳聚糖纳米颗粒与红色荧光蛋白在阴离子淬灭剂碘化钾的作用下的荧光淬灭实验对比图。

图 7 为本发明所得包裹红色荧光蛋白的壳聚糖纳米颗粒与红色荧光蛋白及与常用的有机荧光染料Cy5（波长与RFP相近）的光漂白对比曲线图。

图 8 为本发明所得包裹红色荧光蛋白的壳聚糖纳米颗粒与红色荧光蛋白的pH稳定性对比曲线图。

图 9 为本发明所得包裹红色荧光蛋白的壳聚糖纳米颗粒与红色荧光蛋白的热稳定性对比曲线图。

图 10 为本发明所得直接包裹红色荧光蛋白的壳聚糖纳米颗粒成功进入Hela细胞的共聚焦显微镜图（543nm激发）。

图 11为本发明所得的壳聚糖纳米颗粒的Hela细胞毒性试验。

具体实施方式

下面结合附图，本发明的具体实施的过程和步骤以及结果分析如下：

实施例1

a.  壳聚糖的质子化处理：将壳聚糖完全溶解于1mol/L 盐酸溶液中，加入5倍于盐酸体积的无水乙醇溶液，将沉淀物烘干研磨得质子化壳聚糖的固体粉末。

b. 包裹蛋白质的壳聚糖纳米颗粒的制备：将1mg红色荧光蛋白（RFP，mcherry，激发波长587nm，发射波长610nm）加入到2mL 、pH值为8.0、浓度为20mM的磷酸盐缓冲溶液（即PBS）中， 加入上述质子化壳聚糖12mg，室温搅拌30min，加入100微升2.5%（体积分数）的戊二醛水溶液，室温搅拌12小时，反应完全后，超滤洗涤三次（3000g，15min）以除去未反应的壳聚糖等，即可得包裹蛋白质的壳聚糖纳米颗粒。

附图1附图2表明该纳米颗粒尺寸小，约为10nm左右，具有很好的分散性；附图3表明该纳米颗粒可以有效的保护自由的蛋白质，提高其酶解稳定性；附图4表明在强变性剂盐酸胍的存在下，该纳米颗粒可以在很长时间的时间内保护自由蛋白质不易变性；附图5附图6表明在荧光淬灭剂的存在下，该纳米颗粒可以很好的保护蛋白，使荧光不易淬灭；附图7表明该纳米颗粒可以很好的保护荧光蛋白不易发生光漂白；附图8附图9表明通过包裹该荧光蛋白的pH稳定性和热稳定性都提高了不少。

c. 将所得的包裹红色荧光蛋白的壳聚糖纳米颗粒分散在培养基中，终浓度100 ??g/mL,与Hela细胞共同培养6h，用激光共聚焦显微镜拍摄，附图10，显示该纳米颗粒可以成功的进入Hela细胞，并在分子水平上成像（附图10：左图为空白细胞对照图，右图为纳米颗粒进入细胞后成像图，右图显示有红色荧光）。附图11显示该纳米颗粒对Hela细胞是无毒的。

实施例2

可将实施例1中的红色荧光蛋白换成近红外荧光蛋白（eqFP650），其他操作方法参照实施例1，仍可得到包裹近红外荧光蛋白的壳聚糖纳米材料应用于分子水平上的成像，同时还可以利用红外光强的穿透性，使其具有能用于小动物活体成像的潜能。

实施例3

可将实施例1中的红色荧光蛋白换成绿色荧光蛋白（EGFP），其他操作方法参照实施例1，仍可得到包裹绿色荧光蛋白的壳聚糖纳米材料，利用EGFP优良的光学特性（比如：量子产率高），可以很好的应用于分子水平上的成像。

实施例5

可将实施例1中的红色荧光蛋白换成mNeptune 荧光蛋白，其他操作方法参照实施例1，仍可得到包裹mNeptune荧光蛋白的壳聚糖纳米颗粒材料应用于分子水平上的成像。 

Claims (1)

1.一种生物安全性好的纳米荧光探针的制备方法，先将壳聚糖质子化，然后静电吸附于荧光蛋白质表面，再用戊二醛作为交联剂对表面的壳聚糖进行交联，即可得包裹各种荧光蛋白质的壳聚糖纳米颗粒，其特征在于该方法具有以下的工艺步骤：

a. 壳聚糖的质子化处理：将壳聚糖完全溶解于盐酸溶液中，加入3-5倍于盐酸体积的无水乙醇溶液，将沉淀物烘干研磨得质子化壳聚糖的固体粉末；

 b. 包裹蛋荧光白质的壳聚糖纳米颗粒的制备：将荧光蛋白质加入到pH值7.0-10.0的10-50mM的缓冲溶液中，加入上述质子化壳聚糖，壳聚糖中氨基葡萄糖单元与荧光蛋白质的摩尔比为2000:1-10000:1，室温搅拌至完全溶解后，加入戊二醛水溶液，戊二醛与氨基葡萄糖单元的摩尔比为0.35:1-0.7:1，室温搅拌至反应完全后，超滤洗涤三次以除去未反应的壳聚糖，即可得包裹荧光蛋白质的壳聚糖纳米颗粒；

c. 将所得的包裹荧光蛋白质的壳聚糖纳米颗粒分散在培养基中，与Hela细胞共同培养2-48 h，用激光共聚焦显微镜拍摄，显示可以成功的进入Hela细胞并在分子水平上成像。

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