CN105816877B - 一种具有光热效应的纳米微粒的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有光热效应的纳米微粒的制备方法及其应用。所述纳米微粒由壳聚糖等带正电荷的分子在反相微乳液中用京尼平引发聚合反应，然后表面经PEG修饰以增强生物相容性，最后经由正负电荷作用担载光热转化材料后制备得到，得到的纳米微粒具有显著的光热效应。该纳米微粒可应用于肿瘤细胞的光热治疗中，其较强的光热杀伤能力能杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。

Description

一种具有光热效应的纳米微粒的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及纳米医学材料领域，具体为一种具有光热效应的纳米微粒的制备方法及其应用。

背景技术

光热治疗(photothermal therapy，PTT)是一种微创肿瘤治疗技术，即是激光照射到肿瘤部位，将光能转化为热能使肿瘤部位温度升高而杀死肿瘤。近红外光热疗法是在肿瘤局部注射或者是埋植光热剂提高光敏性，在特定波长的激光辐射后，光热剂快速将光热转化为热能，达到杀死肿瘤的目的。该方法降低了全身系统毒性，具有低创伤性和易操作等优点，还可以进行载体修饰靶向治疗，具有较好的应用前景。用于光热治疗的光敏剂有无机金纳米粒、硫化铜纳米粒等，具有较高的光热转换效率。但无机材料的不可降解带来潜在毒性，表面难以修饰导致靶向性差，载药困难。有机材料具有良好生物相容性，被广泛用作药物或者基因运输，在这些有机材料中，吲哚菁绿(ICG)、聚吡咯、聚苯胺、多巴胺黑色素、聚噻吩等光热转化材料在肿瘤治疗研究中引起了研究者的广泛兴趣。其中吲哚菁绿是FDA批准的唯一可用于临床诊断的具有近红外特性的分子，然而其在肿瘤治疗中的应用仍然受限于：1.光漂白性，在水溶液里光照下淬灭加速；2.在水溶液中高温显著加速热降解；3.水中不稳定，出现浓度性的聚集、不可逆降解等，光学性质发生改变，甚至丧失光热转化能力；4.半衰期短，易和血清蛋白结合被肝脏清除。研究发现适当的载体包裹能在一定程度上提高这些光热转化材料的光、溶剂和热稳定性，可有效避免光热转化材料的分解体内清除，调节其体内循环和分布。

壳聚糖、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、赖氨酸、牛血清白蛋白等分子，具有良好的生物相容性，已经广泛地被作为药物载体材料，应用于生物医学领域。通过以这些带伯氨基的分子为骨架材料，利用纳米制备技术，有望制备光热转化材料的纳米微粒，表面PEG化修饰后进一步改善和提高光热转化材料的稳定性、肿瘤蓄积能力，进而提高肿瘤光热治疗效果。

发明内容

为此本发明提供了一种具有光热效应的纳米微粒的制备方法及其应用。所述纳米粒担载吲哚菁绿等光热转换材料后提高了光热稳定性，延长了肿瘤瘤内迟滞时间，延缓了体内代谢排出，并且对肿瘤细胞及荷瘤小鼠肿瘤有明显杀伤作用。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供的一种具有光热效应的纳米微粒的制备方法，是以带伯氨基的分子为骨架材料，京尼平作为交联剂，利用反相微乳液方法制备得到纳米微粒，然后利用PEG进行表面修饰，担载光热转化材料，从而制备得到具有光热效应的纳米微粒。

所述的带伯氨基的分子为壳聚糖、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、赖氨酸、牛血清白蛋白中的一种。

所述的光热转化材料为吲哚菁绿、聚吡咯、聚苯胺、多巴胺黑色素、聚噻吩类物质中的一种。

所述的反相微乳液方法中的反相微乳液体系为以环己烷为油相，聚氧乙烯基辛基苯基醚、聚氧乙烯基壬基苯基醚中的一种或二种为表面活性剂，以乙醇、丙醇、正己醇、正辛醇或正癸醇中的一种或二种以上为助表面活性剂和水组成的反相微乳液体系。

所述的用来表面修饰的PEG，分子量为500-5000Da，修饰在纳米微粒伯氨基上，PEG投入量为骨架材料伯氨基摩尔数的1/5-1/50。

所述具有光热效应的纳米微粒，骨架材料伯氨基与京尼平摩尔比为1:1-5:1。

所述具有光热效应的纳米微粒，纳米微粒粒径不受京尼平与骨架材料摩尔比影响，动态光散射测得粒径在50-150nm之间，表面电势及氨基残余受京尼平与骨架材料摩尔比影响。

所述的反相微乳液体系中，体积比，油相：助表面活性剂：水相＝16.5：4：1，表面活性剂在油相、助表面活性剂以及水相组成的混合液中的浓度为0.17g/mL。

所述具有光热效应的纳米微粒，表面带有大量正电荷，电势为30-60mv。

所述具有光热效应的纳米微粒，带伯氨基的骨架材料与京尼平反应生成蓝色栀子素，其最大吸收波长为605nm左右，随着反应时间的延长(8天)，该吸收波长处吸收值明显增大。

所述具有光热效应的纳米微粒，在水中分散良好，且在不同pH条件下(pH＝2.82-7.3)，纳米微粒粒径基本维持不变。

所述具有光热效应的纳米微粒，能吸收光能转化为热能，较佳地，在808nm激光器0.17w/cm²光强下，担载光热转换材料75ug/mL照射20min可升至46℃。

所述具有光热效应的纳米微粒具有较低的细胞毒性。当担载光热转换材料≥9.375ug/mL下具有细胞活性抑制作用，随着浓度增大细胞活性抑制作用更强。

所述具有光热效应的纳米微粒，可用于肿瘤细胞的光热治疗中，具体为将制得的具有光热效应的纳米微粒递送到肿瘤部位后，在特定波长激光的照射下，纳米微粒可以将光能转化成热能，从而杀死肿瘤细胞。

所述的的特定波长为605nm。

本发明具有以下优点：京尼平广泛用于生物交联，但是制备纳米材料的较少，反相微乳法制备壳聚糖京尼平纳米粒在生理条件下易发生交联聚集沉淀，稳定性差。该专利利用小分子量壳聚糖作为骨架材料，京尼平作为交联剂，SCM-PEG修饰，使其在较宽的pH范围内维持稳定，此外未修饰的壳聚糖正电荷可用于药物传递，用作生物体外体内光热治疗。

附图说明

图1为本发明实施例提供的PEG壳聚糖京尼平纳米粒透射电子显微镜图及其粒径分布；

图2为本发明实施例提供的PEG修饰纳米粒红外吸收光谱图(CS：壳聚糖，CS-g：壳聚糖京尼平纳米粒；CG-PEG：PEG化的壳聚糖京尼平纳米粒)；

图3为本发明实施例提供的不同pH条件下PEG壳聚糖京尼平纳米粒动态光散射粒径及多分散系数图；

图4为本发明实施例提供的壳聚糖京尼平-吲哚菁绿纳米微粒白炽灯照射及在37℃震荡放置时荧光光稳定性分析图；

图5为本发明实施例提供的壳聚糖京尼平-吲哚菁绿纳米微粒的体外光热杀伤细胞效果图；

图6为本发明实施例提供的壳聚糖京尼平-吲哚菁绿纳米微粒瘤内迟滞效应考察结果；

图7为本发明实施例提供的壳聚糖京尼平-吲哚菁绿纳米微粒光照瘤体升温情况图；

图8为本发明实施例提供的壳聚糖京尼平-吲哚菁绿纳米微粒对荷瘤小鼠肿瘤光热治疗效果图；

具体实施方式

本发明基于天然低毒的纳米骨架材料和交联剂，利用反相微乳液的方法制备生物相容性好的纳米微粒，经过PEG修饰和光热转化材料担载后可用于肿瘤光热治疗。

吲哚菁绿购自丹东怡创，壳聚糖购自浙江金壳，京尼平购自临川之信，SCM-PEG(2090Da,≥98.5％)购自上海炎怡生物有限公司，Triton X-100购买于Sigma.细胞株U87来自ATCC细胞库.

具体实施例如下：

实施例1：PEG化壳聚糖京尼平纳米微粒的制备

1)环己烷18.15mL为油相、tritonX-1004.74g为表面活性剂，正辛醇4.41mL为助表面活性剂，混合搅拌30min。

2)壳聚糖33mg溶解在水中超声漩涡震荡形成0.55mL溶液，其中壳聚糖的伯氨基摩尔数为0.183mmol，京尼平27mg溶解于200ul乙醇中，后添加去离子水形成0.55mL溶液，上述两种溶液首先混合超声2min交联，制备水相。

3)步骤2)的水相溶液加入至步骤1)包含包表面活性剂与助表面活性剂的油相中，超声10min，形成反相微乳液(1)，室温反应12h。

4)琥珀酰亚胺乙酸酯PEG50mg溶解在0.55mL水溶液中，加入至步骤1)油相中制备反相微乳液(2)，200ul N,N-二异丙基乙胺催化继续反应12h。

5)将步骤4)制得的反相微乳液体系(2)加入到步骤3)制得的反相微乳液体系(1)中，使反相微乳液(1)中的壳聚糖残余氨基和反相微乳液(2)中的PEG继续反应12h，之后向混合体系中加入15mL丙酮3000转/分钟，离心5分钟破乳，收集沉淀，用乙醇洗涤2-3次；然后3000转/分钟，离心5分钟，得到蓝色沉淀，最终溶解分散在去离子水中，得到相应的PEG化壳聚糖京尼平纳米微粒。

实施例2：PEG化壳聚糖京尼平纳米微粒担载吲哚菁绿及其性质表征

1)取光热转化材料吲哚菁绿溶解于去离子水中，超声分散形成1mg/mL溶液，取1mL上述吲哚菁绿溶液逐滴添加至1mL的2mg/mL PEG化壳聚糖京尼平纳米微粒中，100w超声10min，搅拌过夜12h，利用10KDa超滤管超滤除去多余游离吲哚菁绿。

2)透射电子显微镜照片(图1)显示所制备的纳米微粒呈圆球状，粒径平均在5纳米左右，均在10纳米以内。

3)傅里叶变换红外吸收光谱(图2)说明，PEG分子成功地被修饰到聚糖京尼平纳米微粒表面。

4)动态光散射分析(图3)表明纳米微粒在pH＝2.82-7.3范围内，动态粒径120-160纳米之间，多分散系数稳定在0.2左右。

5)光稳定性试验(图4-左)表明PEG化壳聚糖京尼平纳米微粒担载吲哚菁绿经白炽灯照射1h后荧光下降到初始值的70％，而游离的吲哚菁绿则为初始值的30％；热稳定性实验(图4-右)表明PEG化壳聚糖京尼平纳米微粒担载吲哚菁绿37°震荡20天后荧光保留75％，而游离吲哚菁绿淬灭为原来的40％说明纳米微粒可以有效地保持光热转换材料的荧光性质。

实施例3：PEG化壳聚糖京尼平-吲哚菁绿纳米微粒细胞杀伤作用

取U87细胞10⁴接种于96孔板孵育过夜，取PEG化壳聚糖京尼平-吲哚菁绿纳米微粒及游离吲哚菁绿等梯度稀释，添加10ul至DMEM培养基中，形成ICG终浓度为4.68、9.375、18.75、37.5、17.5ug/mL的培养液，5％CO₂，37°条件下共孵育4h,37°水浴下激光照射15min，倒掉上述培养液，PBS清洗一遍后加入正常培养液，MTT法检测细胞活性，图5结果表明：

1)聚糖京尼平-吲哚菁绿纳米微粒在无激光照射下，当吲哚菁绿浓度为75ug/mL时，细胞活性高于70％，说明纳米粒对细胞毒性较小；在激光的照射下(808nm，0.17W/cm²，10min),细胞活性明显降低，降至<20％。

2)对照组(细胞+光照)细胞活性基本维持不变>90％，说明该光照条件下(808nm，0.17W/cm²，10min)对细胞无明显损伤。

3)低浓度下(<18.75ug/mL)ICG光热杀伤细胞能力较纳米粒组强(～65％)，高浓度下(>37.5ug/mL)CG-PEG-ICG纳米杀伤细胞能力较强，细胞活率<20％。

实施例4：瘤内迟滞效应

小鼠左、右后肢上侧分别荷瘤1个，待肿瘤直径长至约5mm大小，瘤内分别注射游离吲哚菁绿、吲哚菁绿纳米粒100ul(其中ICG浓度为50ug/mL)，利用小动物活体成像仪考察不同时间点瘤内荧光变化，并对荧光强度信号做衰减定量分析。图6结果表明：游离ICG和纳米粒在2h后荧光强度达到最大，之后都有不同程度的荧光衰减，但是ICG组荧光衰减大于纳米粒组，说明PEG化壳聚糖京尼平纳米微粒担载吲哚菁绿能更好的在瘤内存留迟滞，更有利于肿瘤光热治疗。

实施例5：肿瘤原位注射纳米粒光热升温

每只荷瘤小鼠荷瘤2个，位于左、右后肢上侧，待肿瘤直径长至约5mm大小时，瘤内分别注射含有不同吲哚菁绿的纳米粒150ul(其中ICG浓度为50、75、100、200ug/mL)，利用808nm波长，光密度为0.3w/cm²激光器照射15min，近红外光热成像仪记录每分钟小鼠肿瘤温度变化，图7结果表明：注射PBS组肿瘤最高温度小于37℃，24h后肿瘤处肉眼观察无变化，而含有不同浓度ICG的纳米粒经照射后，温度均升高；且随着ICG浓度增大而增大，肿瘤组织呈现不同程度损伤。

实施例6：小鼠肿瘤抑制作用

待胶质瘤U87体积长至约100-200mm³时，荷瘤小鼠分成三组，每组4只，每只小鼠荷瘤两个。各组每只瘤分别注射100ul PBS、游离ICG、壳聚糖京尼平-吲哚菁绿纳米微粒CG-PEG-ICG(75ug/mL ICG)，用808nm，0.3w/cm²激光器照射15min，4天后再次分别注射100ulPBS、游离ICG、壳聚糖京尼平-吲哚菁绿纳米微粒CG-PEG-ICG(200ug/mL ICG)，利用808nm，0.3w/cm²激光器照射15min，期间近红外成像仪记录每分钟肿瘤温度变化，每天测量肿瘤体积变化。图8结果表明：11天后PBS组肿瘤体积达5000-6000mm³，ICG组达1500mm³，壳聚糖京尼平-吲哚菁绿纳米微粒组肿瘤坏死，没有明显的体积增长，生长受到抑制。

Claims (4)

1.一种具有光热效应的纳米微粒的制备方法，其特征在于：以伯氨基的分子为骨架材料， 京尼平为交联剂，反相微乳液方法制备得到纳米微粒，然后利用 PEG 进行表面修饰，担载光热转化材料，从而制备得到具有光热效应的纳米微粒，所述反相微乳液方法中环己烷18.15mL、tritonX-100 4.74g、正辛醇 4.41mL混合搅拌 30min制备油相，壳聚糖 33mg溶解在水中超声漩涡震荡形成 0.55mL 溶液，其中伯氨基摩尔数为 0.183mmol，京尼平27mg 溶解于 200ul 乙醇中，后添加去离子水形成 0.55mL 溶液，壳聚糖和京尼平溶液首先混合超声 2min 交联制备水相，水相溶液添加至油相中超声形成反相微乳液。

2.按照权利要求 1 所述的制备具有光热效应的纳米微粒的方法，其特征在于：所述的光热转化材料为吲哚菁绿、聚吡咯、聚苯胺、多巴胺黑色素、聚噻吩类物质中的一种。

3.按照权利要求 1 所述的制备具有光热效应的纳米微粒的方法，其特征在于： 所述的反相微乳液方法中的反相微乳液体系为以环己烷为油相， 聚氧乙烯基辛基苯基醚、聚氧乙烯基壬基苯基醚中的一种或二种为表面活性剂，以乙醇、丙醇、正己醇、正辛醇或正癸醇中的一种或二种以上为助表面活性剂和水组成的反相微乳液体系。

4.按照权利要求 1 所述的制备具有光热效应的纳米微粒的方法，其特征在于：所述的PEG 分子量为 500-5000 Da， PEG 投入量为骨架材料伯氨基摩尔数的 1/5-1/50。