CN105056252B - 一种荧光标记的磁性山奈酚微球体系及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光标记的磁性山奈酚微球载药体系及其制备方法，制备步骤：①首先将疏水性药物山奈酚溶于油基改性磁流体，混合均匀后，用注射器滴入适量的牛血清蛋白溶液中，采用超声化学法合成磁性山奈酚蛋白微球；②然后通过氨羧反应连接自制的氨基化石墨烯量子点，得到了具有荧光磁性双功能的山奈酚微球；③将磁性荧光双功能的山奈酚微球与人体Hela细胞共培育，用MTT法检测细胞毒性。本发明的荧光磁性双功能山奈酚微球，制备成本低，药物负载率高，既具有磁性粒子的超顺磁性，又保留了石墨烯量子点优异的荧光性能，在肿瘤的靶向治疗的药物上取得优异效果。

Description

一种荧光标记的磁性山奈酚微球体系及其制备方法

技术领域

本发明涉及纳米材料领域和生物技术领域，具体涉及一种荧光标记的磁性山奈酚微球载药体系及其制备方法。

背景技术

磁性微球因具有磁响应性和不同的表面功能，在靶向载药、细胞分离、固定化酶等领域的应用日益增多。随着医学技术的进步，对生物医用材料要求的提高，兼具磁性和优异荧光标记功能的磁性微球越来越受到人们的关注。

山奈酚(Kaempferol，KAE)来源于姜科植物山奈的根茎，是一种天然多酚类黄酮化合物，在抗癌、抗菌、抗炎、抗癫痫、止咳等方面具有较高的的医用价值。但是山奈酚属于疏水性药物，生物利用率较低，因此，学者们一直致力于山奈酚制剂的开发，以提高其溶解度而增加疗效。超声化学法是指两种(或两种以上)不相溶液体在强超声波空化作用下混合均匀形成分散物质系，其中一种液体均匀分布在另一液体之中而形成乳状液，此方法反应周期短，对温度、反应体系要求低，并且能制备各种形态的纳米结构。

石墨烯量子点是石墨烯家族的一分子，具有零维结构，拥有许多优点，如：大的比表面积、良好的光学性质、良好的水溶性和生物相容性等，在示踪成像、药物运输等方面具有良好的应用前景。研究发现，如果将它们与抗癌药物一起接枝在同一载体上，能够同时实现对癌细胞的荧光标记与治疗。

目前，荧光标记磁性微球的合成方法有很多，常用的有包埋法、接枝法、单体聚合法、偶联剂法等，然而这些方法反应条件苛刻，且制备步骤繁琐、生产周期长、能耗多、污染大。

CN201210112174.8公开了荧光磁性微球与氧化石墨烯的复合材料及其制备方法，此方法首先对氧化石墨烯进行羧基化，再将荧光磁性微球进行氨基化，采用接枝法制备荧光磁性微球与氧化石墨烯的复合材料。此方法制备的荧光磁性微球对病灶部位进行靶向定位的同时实现了荧光标记，此方法未进行负载抗肿瘤药物体系的研究。

CN201410330474.2公开了一种应用聚乳酸和纳米铁合成阿霉素靶向制剂的方法。该专利选择纳米铁作为磁性粒子、量子点作为荧光探针、阿霉素作为药物分子，通过自组装的方式将纳米铁和药物分子复合于聚乳酸微球内，得到靶向制剂。但是该方法合成成本高，且未对负载抗肿瘤药物阿霉素后的体系开展控制释放性能分析。

目前，尚未有荧光磁性山奈酚微球载药体系的研究或报道。本发明开发了一种工艺简单、负载率高的荧光磁性山奈酚微球载药体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种工艺简单、负载率高的荧光标记的磁性山奈酚微球载药体系。

为达到本发明的目的，本发明的技术方案包括以下步骤：①首先将疏水性药物山奈酚溶于油基改性磁流体，混合均匀后，用注射器滴入适量的牛血清蛋白溶液中，采用超声化学法合成磁性山奈酚蛋白微球；②然后通过氨羧反应连接自制的氨基化石墨烯量子点，得到了具有荧光磁性双功能的山奈酚微球；③将磁性荧光双功能的山奈酚微球与人体Hela细胞共培育，用MTT法检测细胞毒性。

具体步骤为：

步骤1：首先将疏水性药物山奈酚溶于油基改性Fe₃O₄磁流体，混合均匀后，用注射器滴入牛血清蛋白溶液中，超声、搅拌形成均匀乳液；将该乳液在250～400W超声功率下超声破碎，超声破碎时间10～20min，反应后将产物磁吸洗涤、真空干燥，得到负载山奈酚药物的磁性微球(Fe₃O₄/BSA@KAE)；

所述油基改性磁流体，磁流体介质为环己烷，Fe₃O₄磁流体的质量分数为20％；所述所述牛血清蛋白溶液的质量分数为2％；

所述的疏水性药物山奈酚与油基改性Fe₃O₄磁流体的质量比为1：400；

步骤2：通过氨羧反应连接自制的氨基化石墨烯量子点，得到了具有荧光磁性双功能的山奈酚微球，具体过程如下：

A、氨基化石墨烯量子点采用水热法合成，利用有机化合物芘在热浓硝酸条件下的硝化作用，稀释过滤除酸后，得到黄色的1,3,6—三硝基芘(1,3,6-trinitropyrene)，再利用配制的NaOH溶液或者水合肼和氨水修饰改性；通过超声处理和高压反应釜加热合成水溶性GQDs的产物；过滤，在真空条件下加热至30～50℃干燥，得到绿色的氨基化石墨烯量子点GQDs；

B、将磁性山奈酚微球、羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入H₂O中，磁性山奈酚微球的质量浓度为0.4～0.6mg/mL、羟基琥珀酰亚胺(NHS)与磁性山奈酚微球的质量比为86：75，在20～30℃的温度下反应0.5～1h，；

加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，于20～30℃下振荡反应1～3h，EDC与磁性山奈酚微球的质量比为4：3；

在上述反应后的溶液中加入浓度为0.01～0.5mol/L氨基化石墨烯量子点(GQDs-NH₂)水溶液，氨基化石墨烯量子点与磁性山奈酚微球的质量比为2：5；加入浓度为0.2～0.4mg/mL氨基化石墨烯量子点(GQDs-NH₂)水溶液后的反应，于20～30℃的反应温度下振荡反应6～18h；反应后将产物磁吸分离、去离子水洗涤、在30～50℃下干燥，得到荧光标记的磁性山奈酚微球；

步骤3：将磁性荧光双功能的山奈酚微球与人体Hela细胞共培育，用MTT法检测细胞毒性。

所述步骤1中，所述的超声功率优选300W。

所述步骤1中，所述的超声破碎时间优选15min。

所述步骤2B中，所述的羟基琥珀酰亚胺(NHS)与磁性山奈酚微球反应温度优选25℃。

所述步骤2B中，加入氨基化石墨烯量子点(GQDs-NH₂)水溶液后的反应，振荡反应时间优选12h。

根据上述步骤所制备的荧光标记磁性山奈酚微球体系，粒径50～120nm。

所述步骤2中，氨基化石墨烯量子点采用水热法合成，参见文献：Wang L,Wang YL,XuT,et al,Nature communications,2014,5:5357。

所述步骤3中，将荧光磁性山奈酚微球体系与宫颈癌Hela细胞共培育，用MTT法检测细胞毒性，具体过程如下：

在装有荧光磁性山奈酚微球体系的EP管中，加入75％乙醇消毒，备用。将对数期生长的Hela细胞接种于96孔板，利用DMEM高糖完全培养基进行培养，培养24h后，分别加入不同浓度的荧光磁性山奈酚微球体系，同时设置只加入DMEM高糖完全培养基作为对照组，未接种细胞作为空白组，每组设置6个复孔，分别继续培养24h，每孔加入MTT溶液，培养箱内继续培养4h后，弃去孔内的培养基，然后每孔加入二甲基亚砜(DMSO)，置摇床避光低速振荡，使结晶物充分溶解。利用酶标仪在490nm波长下测定吸光值(OD)。将对照组的细胞存活率定义为100％，存活率按公式计算：

细胞存活率＝(试验组OD值/对照组OD值)×100％

本发明所取得的有益效果：

(1)采用超声化学法合成磁性山奈酚微球，成功实现对疏水性药物山奈酚的有效负载，制备方法操作简单、实验条件温和。

(2)本发明的磁性荧光双功能山奈酚微球，药物负载率高，既具有磁性粒子的超顺磁性，又保留了石墨烯量子点优异的荧光性能。

(3)本发明制备的磁性荧光双功能山奈酚微球体系能够长效缓释，并表现出对宫颈癌Hela细胞较好的抑制作用。

附图说明

图1为具体实施例所制备的样品的FTIR图谱：a曲线为磁性山奈酚微球的FTIR图谱；b曲线为荧光磁性双功能山奈酚微球的FTIR图谱。

图2为具体实施例所制备样品的TEM图谱：图2A为Fe₃O₄磁流体的TEM图；图2B为磁性山奈酚微球的TEM图。

图3为具体实施例所制备磁性山奈酚微球的TG图。

图4为具体实施例所制备磁性山奈酚微球的磁滞回线VSM图。

图5为具体实施例所制备荧光磁性山奈酚微球的荧光光谱(PL)图：a曲线，荧光磁性山奈酚微球；b曲线，荧光磁性山奈酚微球被磁铁吸引后所剩上清液。

图6荧光磁性山奈酚微球在37℃，pH＝5.5和pH＝7.4条件下的PBS缓冲溶液所测的药物释放曲线。

图7为人体Hela细胞加入荧光磁性山奈酚微球溶液后的细胞毒性图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明，但下述实施例对本发明的保护范围并无明确限制。

实施例

将5mg山奈酚加入2g油基改性Fe₃O₄磁流体中，形成混合溶液后，用注射器将此混合液缓慢滴入50mL 2％的牛血清蛋白溶液中，并搅拌形成均匀乳液。接着将该乳液在300W功率下超声15min，反应后将产物洗涤、干燥，制备磁性山奈酚微球，密封保存，备用。

氨基化石墨烯量子点采用水热法合成，参见文献：Wang L,Wang YL,Xu T,et al,Nature communications,2014,5:5357。先称取2g的芘(纯度>98％)，量取160mL的浓硝酸，混合并放入圆底烧瓶中。在恒温水浴条件下，将混合物加热至80℃，电动搅拌12h，得黄色溶液，将所得的混合液冷却至室温。然后量取1L的去离子水，将混合物稀释，放入压滤机中，采用0.22um微孔膜过滤以除去酸。在真空下干燥得到1,3,6-trinitropyrene。再称取上述反应物1,3,6-trinitropyrene 3g，分别量取50mL水合肼溶液和10mL氨水，混合，放入超声细胞粉碎机中超声1h后，得到悬浮液。将悬浮液转移到衬有聚四氟乙烯的高压反应釜中，放至马弗炉，加热至200℃反应10h，待冷却至室温后，将含有水溶性GQDs的产物放入压滤机中，采用0.22μm微孔膜过滤以除去不溶碳产物，真空干燥，得到纯化的氨基化石墨烯量子点，保存备用。

将7.5mg的磁性山奈酚微球、8.6mg羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入15mlH₂O，置于锥形瓶中，室温下反应0.5h，加入10mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，室温下振荡反应2h。反应后在上述溶液中加入10ml，0.3mg/mL的氨基化石墨烯量子点(GQDs-NH₂)水溶液，室温下振荡反应12h，反应后将产物磁吸分离、洗涤、干燥，得到荧光标记的磁性山奈酚微球，密封保存，备用。

对制备过程中的中间产物及本发明最终产物进行性能分析。

图1为具体实施例所制备的样品的FTIR图谱：a曲线为磁性山奈酚微球；b曲线为荧光磁性双功能山奈酚微球。

通过与文献谱图对照，图1中a曲线，590cm^-1为Fe₃O₄的特征吸收峰，3421cm^-1为-OH的伸缩振动峰。1597cm^-1和1400cm^-1为蛋白质BSA的特征吸收峰，其中1597cm^-1为C＝O的伸缩振动峰，1400cm^-1为C-N的伸缩振动峰。1175cm^-1和1050cm^-1对应于山奈酚的特征吸收峰。由此表明已经成功合成了负载山奈酚药物的磁性微球。与图1的a曲线相比，图1的b曲线中，621cm^-1为Fe₃O₄的特征吸收峰，3194cm^-1为N-H的特征吸收峰，可以判断氨基化石墨烯量子点已经成功连接在磁性山奈酚微球上，合成了荧光磁性双功能磁性微球。

图2为具体实施例所制备样品的TEM图谱：图2A为Fe₃O₄磁流体的TEM图；图2B为磁性山奈酚微球的TEM图。

如图2A所示，Fe₃O₄磁流体单分散、颗粒规则、粒径小且均一，其平均粒径约为10nm；相比于图2A，载药后的磁性山奈酚微球Fe₃O₄/BSA@KAE，整体分散性和成球性好、粒径在50-120nm左右，可作为后续生物医用的载体材料。

图3为具体实施例所制备磁性山奈酚微球的TG图。

如图3所示，188℃以前的质量损失主要是水分，为样品中吸附水的脱附，当温度升高到188℃时，重量损失开始加速，为牛血清蛋白和山奈酚发生分解，在800℃时，曲线趋于平缓，从热失重曲线可以看出样品中Fe₃O₄含量为36.7％，Fe₃O₄/BSA磁性纳米球的磁含量相对较高，决定了其包覆后仍具有可观的磁响应性。

图4为具体实施例所制备磁性山奈酚微球的磁滞回线VSM图。

如图4所示，磁性山奈酚微球在室温下没有磁滞环现象，显示了良好的超顺磁性。其超顺磁性也表现为十分低的Mr/Ms比和Hc值。饱和磁化强度(Ms)为32.48emu/g，因而，所制备的磁性山奈酚微球有较好的超顺磁性，可以满足后续实验的要求。

图5为具体实施例所制备荧光磁性山奈酚微球的荧光光谱(PL)图：a曲线，荧光磁性山奈酚微球；b曲线，荧光磁性山奈酚微球被磁铁吸引后所剩上清液。

如图5中a曲线所示，当紫外激发波长为365nm时，荧光磁性双功能山奈酚微球的荧光最大发射波峰位于446nm左右，表明荧光标记后的磁性山奈酚微球具有窄的发射波长范围，在示踪成像方面有明显优势。图5中b曲线中的样品是运用外加磁场对图5中a曲线中的样品吸引3min后所得到的上清液，如图5中b曲线所示，其荧光强度明显低于原有样品的，说明溶液的荧光强度随着溶液中荧光标记磁性山奈酚微球浓度的减小而减小。

山奈酚标准曲线的绘制：

取一定体积的浓度为0.05mg/mL山奈酚(KAE)的PBS溶液(pH＝7.4)稀释成一系列已知浓度的溶液，用紫外-可见分光光度计测定这些溶液在370nm处的吸光度，以吸光度对药物浓度作图，得到山奈酚的吸光度-浓度标准曲线，该标准曲线的方程为:Y＝17.150X+0.0278(相关系数R²＝0.998)。磁性山奈酚微球的包封率的计算公式为Φ＝实际载药量/投药量×100％。根据实验结果，可计算出磁性山奈酚微球包封率为10.37％。

把10.0mg磁性山奈酚微球放入分别置于pH＝5.5和pH＝7.4的磷酸缓冲溶液(100ml)中，进行缓释实验。在恒温振荡器中于37℃以100rpm速度搅拌，在特定的时间间隔里取3.0ml的缓冲液作为样品，使用紫外单分光光度计测定波长为370nm时的吸光度，并补加3.0ml的缓冲液。

通过线性回归方程得到各个时间点样品的浓度，根据以下公式计算药物累积释放率并得到其关于时间的曲线。W_n＝(50C_n+3×∑C_n-1)/m₀×100％，其中W_n表示第n次药物的累积释放率，C_n是第n次取样的质量浓度，m₀是载药体系中山奈酚的质量。

图6荧光磁性山奈酚微球在37℃，pH＝5.5和pH＝7.4条件下的PBS缓冲溶液所测的药物释放曲线。

如图6所示，当pH＝5.5时，约有12.6％的山奈酚释放出来，当pH＝7.4时，约有11.9％要略高于在中性条件下。

将对数期生长的Hela细胞接种于96孔板，利用DMEM高糖完全培养基进行培养，培养24h后，分别加入不同浓度的的磁性山奈酚微球体系(0.1ug/ml、0.5ug/ml、1ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml、40ug/ml、50ug/ml)，同时设置只加入DMEM高糖完全培养基作为对照组，未接种细胞作为空白组，每组设置6个复孔，分别继续培养24h，每孔加入20ulMTT溶液(5mg/mL)，培养箱内继续培养4h后，弃去孔内的培养基，然后每孔加入200u1的二甲基亚砜(DMSO)，置摇床避光低速振荡10min，使结晶物充分溶解。利用酶标仪在490nm波长下测定吸光值(OD)。将对照组的细胞存活率定义为100％，存活率按公式计算:细胞存活率＝(试验组OD值/对照组OD值)×l00％。

图7为人体Hela细胞加入荧光磁性山奈酚微球溶液后的细胞毒性图。

当载药体系浓度为10μg/mL时，细胞活性降低为50％；当浓度增大到50μg/mL时，细胞活性为25％；在0.1μg/mL～50μg/mL范围内，随着浓度的升高，细胞活性变化逐渐减低；表明所合成的荧光磁性山奈酚载药体系表现出对肿瘤Hela细胞较好的抑制作用，在生物医药领域有广阔的应用前景。

Claims (6)

1.一种荧光标记的磁性山奈酚微球体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：首先将疏水性药物山奈酚溶于油基改性Fe₃O₄磁流体，混合均匀后，用注射器滴入牛血清蛋白溶液中，超声、搅拌形成均匀乳液；将该乳液在250～400W超声功率下超声破碎，超声破碎时间10～20min，反应后将产物磁吸洗涤、真空干燥，得到负载山奈酚药物的磁性山奈酚微球；

所述油基改性Fe₃O₄磁流体，磁流体介质为环己烷，Fe₃O₄磁流体的质量分数为20％；所述牛血清蛋白溶液的质量分数为2％；

所述的疏水性药物山奈酚与油基改性Fe₃O₄磁流体的质量比为1：400；

步骤2：通过氨羧反应连接自制的氨基化石墨烯量子点，得到具有荧光磁性双功能的山奈酚微球，具体过程如下：

A、氨基化石墨烯量子点采用水热法合成，利用有机化合物芘在热浓硝酸条件下的硝化作用，稀释过滤除酸后，得到黄色的1,3,6-三硝基芘，再利用配制的水合肼和氨水修饰改性；通过超声处理和高压反应釜加热合成水溶性GQDs的产物；过滤，在真空条件下加热至30～50℃干燥，得到绿色的氨基化石墨烯量子点GQDs；

B、将磁性山奈酚微球、羟基琥珀酰亚胺NHS加入H₂O中，磁性山奈酚微球的质量浓度为0.4～0.6mg/mL、羟基琥珀酰亚胺NHS与磁性山奈酚微球的质量比为86：75，在20～30℃的温度下反应0.5～1h，；

加入1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐EDC，于20～30℃下振荡反应1～3h，EDC与磁性山奈酚微球的质量比为4：3；

在上述反应后的溶液中加入浓度为0.01～0.5mol/L氨基化石墨烯量子点GQDs-NH₂水溶液，氨基化石墨烯量子点与磁性山奈酚微球的质量比为2：5；加入浓度为0.2～0.4mg/mL氨基化石墨烯量子点GQDs-NH₂水溶液后的反应，于20～30℃的反应温度下振荡反应6～18h；反应后将产物磁吸分离、去离子水洗涤、在30～50℃下干燥，得到荧光标记的磁性山奈酚微球；

步骤3：将磁性荧光双功能的山奈酚微球与人体Hela细胞共培育，用MTT法检测细胞毒性。

2.根据权利要求1所述的一种荧光标记的磁性山奈酚微球体系的制备方法，其特征在于：所述步骤1中，所述的超声功率为300W。

3.根据利要求2所述的一种荧光标记的磁性山奈酚微球体系的制备方法，其特征权在于：所述步骤1中，所述的超声破碎时间为15min。

4.根据利要求1所述的一种荧光标记的磁性山奈酚微球体系的制备方法，其特征权在于：所述步骤2、B中，所述的羟基琥珀酰亚胺NHS与磁性山奈酚微球反应温度为25℃。

5.根据利要求1所述的一种荧光标记的磁性山奈酚微球体系的制备方法，其特征权在于：所述步骤2、B中，加入氨基化石墨烯量子点GQDs-NH₂水溶液后的反应，振荡反应时间12h。

6.一种按照权利要求1-5所述的一种荧光标记的磁性山奈酚微球体系的制备方法所制备的荧光标记磁性山奈酚微球体系，粒径50～120nm。