CN104998261B - 一种双重载药的荧光磁性微球复合体系及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双重载药荧光磁性微球体系的制备，包括：①超声化学法合成磁性山奈酚微球；②水热法合成氨基化石墨烯量子点并实现对紫杉醇的负载；③通过氨羧反应将负载紫杉醇的石墨烯量子点连接到磁性微球上，得到负载山奈酚和紫杉醇药物的荧光磁性微球复合体系。所制备的荧光磁性微球体系中，石墨烯量子点通过π–π物理作用实现对紫杉醇的负载，以及磁性微球通过物理包埋实现对山奈酚的负载，从而实现双重载药。所制备的双重载药荧光磁性微球体系装载紫杉醇和山奈酚两种抗癌药，山奈酚能显著增强人宫颈癌Hela细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性，该双重载药荧光磁性微球体系能提高疗效并延缓耐药性产生、大大降低抗癌药毒副作用。

Description

一种双重载药的荧光磁性微球复合体系及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术和纳米材料领域，具体涉及一种双重载药的荧光磁性微球复合体系及其制备方法。

背景技术

伴随着全球人口老龄化的加剧和世界总人口的持续增长，以及逐年增多的癌因性行为，导致全球癌症患者人数逐渐上升。根据2011年世界卫生组织最新的统计结果显示，至2030年，全球死于癌症的人数将继续增加74％。化疗是恶性肿瘤治疗中的重要方法之一，但由于目前临床用的传统剂型化疗药物缺乏靶向性，导致疗效低、毒副作用强。因此，增强化疗药物的抗肿瘤效果并减小毒副作用是临床亟待解决的问题。

临床研究表明，单一药物化疗对肿瘤疗效不佳，在治疗过程中会出现耐药性的问题；另外，由于单药效果不明显，导致增加药物用量或者延长用药时间，于是增加了药物的毒性。因此，联合用药一直是化疗的主流，选择不同作用机制的抗癌药物同时使用，可以分别作用于细胞代谢或增生过程中的不同环节，可杀伤不同的肿瘤细胞，提高疗效，并且可以延缓耐药性的产生。

纳米载药系统作为一种提高药物生物利用度、控制药物释放、改变药物体内分布等优点的技术手段，已成为生物纳米材料领域的研究热点。在研究领域，人们主要利用新型纳米材料作为载体，通过共价键连接药物的方式与物理包埋药物的方式实现载药，克服传统药物生物利用度低、毒副作用大、选择性差等问题，提升疗效和安全性。纳米载药系统的种类比较多，如脂质体、胶束、蛋白质微球、复乳等。目前，关于双重载药的纳米载药体系的研究还非常有限。

专利CN200910092500.1公开了一种双重载药的复合微球及其制备方法，此方法所制备的复合微球具有球中球结构，基体由内部的乳酸-羟基乙酸共聚物微球和外部的壳聚糖外壳构成，药物分别被包埋于内部微球和外壳中，总载药率为1-10％，能根据应用需要调控药物投放量和种类，减少突释。

申请号为201310180236.3、公开号为103251561A的发明专利《一种双敏感可崩解式纳米囊泡药物载体制剂及其制备方法》，提供了一种可崩解式纳米囊泡药物载体制剂，具有疏水双分子膜及亲水内腔的纳米囊泡，其中疏水双子膜可负载疏水药物，亲水内腔可负载亲水药物，从一定程度上逆转了化疗中的耐药性。

山奈酚(Kaempferol，KAE)，属于黄酮类化合物，微溶于水，主要来源于姜科植物山奈的根茎，研究表明，山奈酚对宫颈癌、肺癌、胰腺癌等都有很好的抑制作用。

山奈酚除了自身有很好的抗癌效果外，与其他抗癌药物联用能起到很好的协同作用。例如山奈酚与阿霉素联用，山奈酚可以放大其使胶质母细胞瘤释放活性氧的能力并减慢阿霉素在体内的排泄，以达到持续杀瘤的目的；山奈酚还能显著增强人宫颈癌细胞对化疗药物紫杉醇(paclitaxel，PTX)的敏感性。尽管山奈酚具有较好的抗癌效果，但是目前国内外将其作为抗癌药物在临床上开发应用却非常有限，主要的因素是由于山奈酚水溶性差，导致其体内生物利用度低，降低了其实际应用效果。

迄今，尚未有采用纳米载药系统同时运载山奈酚和紫杉醇两种抗癌药物的报道。本发明开发一种能同时运载山奈酚和紫杉醇两种抗癌药物的纳米载药系统的制备方法，并以所制备的复合体系开展其对宫颈癌Hela细胞的毒性研究。通过本发明的制备方法多得到的双载药荧光磁性微球复合体系能够长效缓释，并在用量较少的情况下就表现出；对肿瘤Hela细胞较好的抑制作用

发明内容

本发明的目的是提供一种工艺简单、双重载药、荧光标记的磁性微球复合体系。

为达到本发明的目的，本发明的技术方案包括以下步骤：①首先采用超声化学法合成磁性山奈酚微球的同时，实现对山奈酚的包埋；②然后采用水热法合成氨基化石墨烯量子点，并通过π–π作用实现对紫杉醇的负载；③通过氨羧反应将负载紫杉醇的石墨烯量子点连接到磁性微球上，得到了同时负载山奈酚和紫杉醇药物的荧光磁性微球复合体系；④将荧光磁性双重载药微球进行药物缓释实验；⑤将荧光磁性双重载药微球与人体Hela细胞共培育，用MTT法检测细胞毒性。

具体步骤为：

步骤1：首先将疏水性药物山奈酚溶于油基改性Fe₃O₄磁流体，混合均匀后，用注射器滴入牛血清蛋白溶液中，超声、搅拌形成均匀乳液；将该乳液在250～400W超声功率下超声破碎，超声破碎时间10～20min，反应后将产物磁吸洗涤、真空干燥，得到负载山奈酚药物的磁性微球(Fe₃O₄/BSA@KAE)；

所述油基改性磁流体，磁流体介质为环己烷，Fe₃O₄磁流体的质量分数为20％；所述所述牛血清蛋白溶液的质量分数为2％；

所述的疏水性药物山奈酚与油基改性Fe₃O₄磁流体的质量比为1：400；

步骤2：采用水热法合成氨基化石墨烯量子点，并通过π–π作用实现对紫杉醇的负载，具体过程如下：

水热法合成绿色石墨烯量子点

参见Wang L,Wang YL,Xu T,et al,Nature communications,2014,5:5357，依照该现有技术制备纯化的绿色石墨烯量子点GQDs，大小大约在5～10nm。

将紫杉醇(PTX)和石墨烯量子点添加到pH＝7.4的PBS磷酸缓冲溶液中，将混合液超声分散，混合均匀，在黑暗中不断搅拌，振荡12～24h，获得载有紫杉醇的石墨烯量子点溶液(PTX/GQDs-NH₂)；将此溶液离心，取沉淀物进行真空干燥，干燥后得到石墨烯量子点载药体系，备用；其中：紫杉醇在PBS磷酸缓冲溶液中的质量体积比为1mg：30ml；石墨烯量子点在PBS磷酸缓冲溶液中的质量体积比为15mg：30ml；所得到的石墨烯量子点载药体系中，紫杉醇：石墨烯量子点质量比1:15；

步骤3：通过氨羧反应将负载紫杉醇的石墨烯量子点连接到磁性微球上，得到了同时负载山奈酚和紫杉醇药物的荧光磁性微球复合体系，具体过程如下：

将磁性山奈酚微球、羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入H₂O中，磁性山奈酚微球的质量浓度为0.4～0.6mg/mL、羟基琥珀酰亚胺(NHS)与磁性山奈酚微球的质量比为86：75，在20～30℃的温度下反应0.5～1h；

加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，于20～30℃下振荡反应1～3h，EDC与磁性山奈酚微球的质量比为4：3；

在上述反应后的溶液中加入浓度为0.2～0.4mg/mL载有紫杉醇的石墨烯量子点(PTX/GQDs-NH₂)水溶液，载紫杉醇的石墨烯量子点与磁性山奈酚微球的质量比为2：5；于20～30℃的反应温度下振荡反应6～18h；反应后将产物磁吸分离、去离子水洗涤、在30～50℃下干燥，得到同时负载山奈酚和紫杉醇药物的荧光磁性微球复合体系；

步骤4：将荧光磁性双重载药微球进行药物缓释实验；

把10.0mg荧光磁性双重载药微球分别置于pH＝5.5和pH＝7.4的磷酸缓冲溶液(100ml)中，进行缓释实验。在恒温振荡器中于37℃以100rpm速度搅拌，在特定的时间间隔里取3.0ml的缓冲液作为样品，使用紫外单分光光度计测定波长为370nm时的吸光度，并补加3.0ml的缓冲液。通过线性回归方程得到各个时间点样品的浓度，根据以下公式计算药物累积释放率并得到其关于时间的曲线。W_n＝(50C_n+3×∑C_n-1)/m₀×100％，其中W_n表示第n次药物的累积释放率，C_n是第n次取样的质量浓度，m₀是载药体系中药物原有的质量。

步骤5：将荧光磁性双重载药微球与与宫颈癌Hela细胞共培育，用MTT法检测细胞毒性；

在装有荧光磁性双重载药微球的EP管中，加入75％乙醇消毒，备用。将对数期生长的Hela细胞接种于96孔板，利用DMEM高糖完全培养基进行培养，培养24h后，分别加入不同浓度的荧光磁性双重载药微球，同时设置只加入DMEM高糖完全培养基作为对照组，未接种细胞作为空白组，每组设置6个复孔，分别继续培养24h，每孔加入MTT溶液，培养箱内继续培养4h后，弃去孔内的培养基，然后每孔加入二甲基亚砜(DMSO)，置摇床避光低速振荡，使结晶物充分溶解。利用酶标仪在490nm波长下测定吸光值(OD)。将对照组的细胞存活率定义为100％，存活率按公式计算：

细胞存活率＝(试验组OD值/对照组OD值)×l00％

所述步骤1中，所述的超声功率优选300W。

所述步骤1中，所述的超声破碎时间优选15min。

所述步骤3中，所述的羟基琥珀酰亚胺(NHS)与磁性山奈酚微球反应温度优选25℃。

所述步骤3中，加入载有紫杉醇的石墨烯量子点(PTX/GQDs-NH₂)水溶液后的反应，振荡反应时间优选12h。

根据上述步骤所制备的荧光磁性双重载药微球体系。

所述的荧光磁性双重载药微球体系，粒径50～120nm。

本发明所取得的有益效果：

(1)本发明的荧光磁性微球体系中石墨烯量子点通过π–π物理作用实现对紫杉醇的负载，以及磁性微球通过物理包埋实现对山奈酚的负载，从而实现了双重载药的效果。

(2)本发明装载紫杉醇和山奈酚两种抗癌药，山奈酚能显著增强人宫颈癌细胞对化疗药物紫杉醇(paclitaxel，PTX)的敏感性，提高疗效，并且可以延缓耐药性的产生，同时可大大降低抗癌药的毒副作用。

(3)本发明首次合成同时负载紫杉醇和山奈酚的磁性微球体系，尚未见到有纳米载体同时负载该两种药物的研究报道。

(4)本发明制备的荧光磁性双重载药微球体系，制备方法操作简单、实验条件温和。

(5)本发明的荧光磁性双重载药微球体系的药物装载率高，能够长效缓释，并在用量较少的情况下就表现出；对肿瘤Hela细胞较好的抑制作用。

附图说明

图1为具体实施例所制备的样品的FTIR图谱：a曲线为磁性山奈酚微球的FTIR图谱；b曲线为载紫杉醇的石墨烯量子点的FTIR图谱；c曲线为荧光磁性双重载药微球的FTIR图谱。

图2为具体实施例所制备荧光磁性双载药微球的磁滞回线VSM图。

图3为具体实施例所制备荧光磁性双载药微球的荧光光谱(XRF)图：a曲线，负载紫杉醇的石墨烯量子点；b曲线，荧光磁性双重载药微球。

图4为具体实施例所制备荧光磁性双重载药微球的磁响应图：a图，未加磁场；b图外加磁场。

图5荧光磁性双重载药微球在37℃，pH＝5.5和pH＝7.4条件下的PBS缓冲溶液所测的药物释放曲线。

图6为人体Hela细胞加入荧光磁性双重载药微球溶液后的细胞毒性图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明，但下述实施例对本发明的保护范围并无明确限制。

实施例

将5mg山奈酚加入2g油基改性Fe₃O₄磁流体中，形成混合溶液后，用注射器将此混合液缓慢滴入50mL 2％的牛血清蛋白溶液中，并搅拌形成均匀乳液。接着将该乳液在300W功率下超声15min，反应后将产物洗涤、干燥，制备磁性山奈酚微球，密封保存，备用。

水热法合成氨基化石墨烯量子点(参见：Wang L,Wang YL,Xu T,et al,Naturecommunications,2014,5:5357)。

将1mg紫杉醇(PTX)和15mg石墨烯量子点添加到30mL pH＝7.4的PBS磷酸缓冲溶液中，将混合液超声分散，混合均匀，在黑暗中不断搅拌，振荡24h，获得载有紫杉醇的石墨烯量子点溶液(PTX/GQDs-NH₂)；将此溶液离心，取沉淀物进行真空干燥，干燥后得到负载紫杉醇的石墨烯量子点载药体系。

将7.5mg的磁性山奈酚微球、8.6mg羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入15mlH₂O，置于锥形瓶中，室温下反应0.5h，加入10mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，室温下振荡反应2h。反应后在上述溶液中加入10ml，0.3mg/mL的负载紫杉醇的石墨烯量子点(GQDs-NH₂)水溶液，室温下振荡反应12h，反应后将产物磁吸分离、洗涤、干燥，制得荧光磁性双重载药微球，密封保存，备用。

对本发明所制备的药物体系进行表征及性能分析。

图1为具体实施例所制备的样品的FTIR图谱：a曲线为磁性山奈酚微球的FTIR图谱；b曲线为载紫杉醇的石墨烯量子点的FTIR图谱；c曲线为荧光磁性双重载药微球的FTIR图谱。

通过与文献谱图对照，图1中a曲线，3421cm^-1为-OH的伸缩振动峰。1604cm^-1和1400cm^-1为蛋白质BSA的特征吸收峰。1175和1046cm^-1对应于山奈酚的特征吸收峰。由此表明已经成功合成了负载山奈酚药物的磁性微球。图1的b曲线中，3402和3194cm^-1为-NH₂的特征吸收双峰；1614cm^-1对应于酰胺中C＝O的伸缩振动，1722cm^-1对应于酯基中C＝O的伸缩振动，对应于紫杉醇的特征吸收峰，由此可以判断载有紫杉醇的氨基化石墨烯量子点已经成功连接在磁性山奈酚微球上。与曲线a，b相比，图1中的c曲线中，3434cm^-1处出现-OH和-NH₂重叠吸收峰，1749cm^-1对应于紫杉醇中酮羰基的吸收峰，1652cm^-1为酰胺键的特征吸收峰，1175和1046cm^-1对应于山奈酚的特征吸收峰，表明已经成功合成了负载紫杉醇和山奈酚两种抗癌药物的荧光磁性双重载药微球。

图2为具体实施例所制备荧光磁性双重载药微球的磁滞回线VSM图。

如图2所示，荧光磁性双重载药微球在室温下没有磁滞环现象，显示了良好的超顺磁性。其超顺磁性也表现为十分低的Mr/Ms比和Hc值。饱和磁化强度(Ms)为24.36emu/g，因而，所制备的磁性山奈酚微球有较好的超顺磁性，可以满足后续实验的要求。

图3为具体实施例所制备样品的荧光光谱(XRF)图：a曲线，载紫杉醇的石墨烯量子点的XRF图；b曲线，荧光磁性双重载药微球的XRF图。

如图3中a曲线所示，当紫外激发波长为365nm时，载紫杉醇的石墨烯量子点的荧光最大发射波峰位于446nm左右，表明石墨烯量子点具有窄的发射波长范围，在示踪成像方面有明显优势。如图3中b曲线所示，荧光磁性双重载药微球的最大发射波峰仍位于446nm，其荧光强度有所降低，说明溶液的荧光强度随着石墨烯量子点浓度的减小而减小，但荧光磁性双重载药微球依然具有良好的发光性能；

图4为具体实施例所制备荧光磁性双重载药微球的磁响应图：a图，未加磁场；b图，外加磁场。

如图4a所示，在没有外加磁场情况下，荧光磁性双重载药微球在水溶液中分散性良好，没有分层现象；如图4b所示，外加磁场后，所制备的荧光磁性双重载药微球迅速移动到有磁铁的一侧，表明产物的磁响应性能良好，满足肿瘤药物载体磁靶向性能的要求。

紫杉醇和山奈酚标准曲线的绘制：

取一定体积的浓度为0.05mg/mL紫杉醇(PTX)的PBS溶液(pH＝7.4)稀释成一系列已知浓度的溶液，用紫外-可见分光光度计测定这些溶液在230nm处的吸光度，以吸光度对药物浓度作图，得到紫杉醇的吸光度-浓度标准曲线，该标准曲线的方程为:Y＝24.755X+0.158(相关系数R²＝0.996)。石墨烯量子点对紫杉醇的包封率计算公式为Φ＝实际载药量/投药量×100％。根据实验结果，可计算出紫杉醇的包封率为58.8％。

取一定体积的浓度为0.05mg/mL山奈酚(KAE)的PBS溶液(pH＝7.4)稀释成一系列已知浓度的溶液，用紫外-可见分光光度计测定这些溶液在370nm处的吸光度，以吸光度对药物浓度作图，得到山奈酚的吸光度-浓度标准曲线，该标准曲线的方程为:Y＝17.150X+0.0278(相关系数R²＝0.998)。磁性山奈酚微球对山奈酚的包封率的计算公式为Φ＝实际载药量/投药量×100％。根据实验结果，可计算出山奈酚的包封率为10.37％。

把10.0mg磁性荧光双重载药微球分别置于pH＝5.5和pH＝7.4的磷酸缓冲溶液(100ml)中，进行缓释实验。在恒温振荡器中于37℃以110rpm速度搅拌，在特定的时间间隔里取3.0ml的缓冲液作为样品，使用紫外单分光光度计分别测定波长为230nm和370nm时的吸光度，并补加3.0ml的缓冲液。

图5具体实施例所制备荧光磁性双重载药微球在37℃，pH＝5.5和pH＝7.4条件下的PBS缓冲溶液所测的药物释放曲线：A.紫杉醇；B.山奈酚。

如图5A所示，在pH＝5.5条件下，约有33.3％的紫杉醇释放出来，在pH＝7.4条件下，约有25.1％的紫杉醇释放出来，20h以后为缓释部分，整个缓释阶段可以保持90h。

可见，紫杉醇的释放率在酸性条件下要高于在中性条件下，这是因为在较低pH值条件下，会降低紫杉醇与石墨烯量子点载体间的π–π作用力。

如图5B所示，测试了山奈酚的缓释曲线。当pH＝5.5时，约有70.4％的山奈酚释放出来，当pH＝7.4时，约有66.8％的山奈酚释放出来，整个缓释阶段可以保持90h。可见，不同pH环境对山奈酚释放的影响不大，主要通过蛋白质壳体的分解释放山奈酚。

将对数期生长的Hela细胞接种于96孔板，利用DMEM高糖完全培养基进行培养，培养24h后，分别加入不同浓度的荧光磁性双重载药微球(0.01μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)，同时设置只加入DMEM高糖完全培养基作为对照组，未接种细胞作为空白组，每组设置6个复孔，分别继续培养24h，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/mL)，培养箱内继续培养4h后，弃去孔内的培养基，然后每孔加入200μ1的二甲基亚砜(DMSO)，置摇床避光低速振荡10min，使结晶物充分溶解。利用酶标仪在490nm波长下测定吸光值(OD)。将对照组的细胞存活率定义为100％，存活率按公式计算:

细胞存活率＝(试验组OD值/对照组OD值)×l00％。

图6为人体Hela细胞加入荧光磁性山奈酚微球溶液后的细胞毒性图。

如图6所示：当载药体系浓度为0.01μg/mL时，细胞活性降低为24％；当浓度增大到0.1μg/mL时，细胞活性为11％；之后在0.5μg/mL～10μg/mL范围内，随着浓度的升高，细胞活性反而有所升高。表明所合成的荧光磁性双重载药微球在在用量较少的情况下(0.01μg/mL)就表现出对肿瘤Hela细胞较好的抑制作用，在生物医药领域有广阔的应用前景。

Claims (7)

1.一种双重载药的荧光磁性微球复合体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：超声化学法合成磁性山奈酚微球，具体过程：

将疏水性药物山奈酚溶于油基改性Fe₃O₄磁流体，混合均匀后，用注射器滴入牛血清蛋白溶液中，超声、搅拌形成均匀乳液；将该乳液在250～400W超声功率下超声破碎，超声破碎时间10～20min，反应后将产物磁吸洗涤、真空干燥，得到负载山奈酚药物的磁性微球；所述油基改性Fe₃O₄磁流体，磁流体介质为环己烷，Fe₃O₄磁流体的质量分数为20％；所述牛血清蛋白溶液的质量分数为2％；所述的疏水性药物山奈酚与油基改性Fe₃O₄磁流体的质量比为1：400；

步骤2：水热法合成氨基化石墨烯量子点并通过π–π作用实现对紫杉醇的负载，具体过程如下：

水热法合成绿色的石墨烯量子点GQDs，粒径大小5～10nm；

将紫杉醇PTX和石墨烯量子点添加到pH＝7.4的PBS磷酸缓冲溶液中，将混合液超声分散，混合均匀，在黑暗中不断搅拌，振荡12～24h，获得载有紫杉醇的石墨烯量子点溶液PTX/GQDs-NH₂；将此溶液离心，取沉淀物进行真空干燥，干燥后得到石墨烯量子点载药体系，备用；

紫杉醇在PBS磷酸缓冲溶液中的质量体积比为1mg：30ml；石墨烯量子点在PBS磷酸缓冲溶液中的质量体积比为15mg：30ml；所得到的石墨烯量子点载药体系中，紫杉醇：石墨烯量子点质量比1:15；

步骤3：通过氨羧反应将负载紫杉醇的石墨烯量子点连接到磁性微球上，得到了同时负载山奈酚和紫杉醇药物的荧光磁性微球复合体系，具体过程如下：

将磁性山奈酚微球、羟基琥珀酰亚胺NHS加入H₂O中，磁性山奈酚微球的质量浓度为0.4～0.6mg/mL、羟基琥珀酰亚胺NHS与磁性山奈酚微球的质量比为86：75，在20～30℃的温度下反应0.5～1h；

加入1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐EDC，于20～30℃下振荡反应1～3h，EDC与磁性山奈酚微球的质量比为4：3；

在上述反应后的溶液中加入浓度为0.2～0.4mg/mL载有紫杉醇的石墨烯量子点PTX/GQDs-NH₂水溶液，载紫杉醇的石墨烯量子点与磁性山奈酚微球的质量比为2：5；于20～30℃的反应温度下振荡反应6～18h；反应后将产物磁吸分离、去离子水洗涤、在30～50℃下干燥，得到同时负载山奈酚和紫杉醇药物的荧光磁性微球复合体系；

步骤4：将荧光磁性双重载药微球进行药物缓释实验

步骤5：将荧光磁性双重载药微球与与宫颈癌Hela细胞共培育，用MTT法检测细胞毒性。

2.根据权利要求1所述的一种双重载药的荧光磁性微球复合体系的制备方法，其特征在于：所述步骤1中，所述的超声功率为300W。

3.根据权利要求2所述的一种双重载药的荧光磁性微球复合体系的制备方法，其特征在于：所述步骤1中，所述的超声破碎时间为15min。

4.根据权利要求1或3所述的一种双重载药的荧光磁性微球复合体系的制备方法，其特征在于：所述步骤3中，所述的羟基琥珀酰亚胺NHS与磁性山奈酚微球反应温度为25℃。

5.根据权利要求4所述的一种双重载药的荧光磁性微球复合体系的制备方法，其特征在于：所述步骤3中，加入载有紫杉醇的石墨烯量子点PTX/GQDs-NH₂水溶液后的反应，振荡反应时间优选12h。

6.一种按照权利要求1-5所述的一种双重载药的荧光磁性微球复合体系的制备方法所制备的荧光磁性双重载药微球复合体系。

7.一种按照权利要求6所述的一种双重载药的荧光磁性微球复合体系的制备方法所制备的荧光磁性双重载药微球复合体系，其特征在于：所述的荧光磁性双重载药微球复合体系，粒径50～120nm。