CN105106970B - 高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物制备和应用。本发明首先用H2N‑PEG‑COOH修饰纳米钻石，合成ND‑PEG‑COOH载体，其次在柠檬酸钠或醋酸钠条件下物理吸附阿霉素制得目标药物纳米钻石‑聚乙二醇‑阿霉素/柠檬酸钠(ND‑PEG‑DOX/Na3Cit)或纳米钻石‑聚乙二醇‑阿霉素/醋酸钠(ND‑PEG‑DOX/NaAc)。经过体外释药实验、MTT实验和流式细胞仪检测细胞摄取纳米药物实验，表明ND‑PEG‑DOX/Na3Cit和ND‑PEG‑DOX/NaAc可诱导肿瘤细胞凋亡，其可在制备抗肿瘤药物中应用。
Description
技术领域
本发明涉及纳米药物，具体涉及一种高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症严重危害着人类的生命健康，其发病率和死亡率在全世界范围内仅次于心脏病和传染疾病。目前，癌症的主要治疗手段有手术切除、放射疗法和化学疗法三种。如果肿瘤只在某个局部范围内生长或发现时间较早，适合采用手术切除和放射疗法这两种治疗手段。但是，通常病人发现肿瘤的时候己经处于癌症中晚期，且常常伴随着病灶转移和扩散的迹象，这种情况下化学疗法才是病人存活的唯一希望。传统的化学疗法是通过口服或静脉注射抗癌药物(如阿霉素、喜树碱、紫杉醇、顺铀等，使这些抗癌药物经血液循环系统到达肿瘤部位，以此杀死癌细胞。然而，这些临床中使用的抗癌药物通常具有很强的细胞毒性，并且缺乏特异识别性，在杀死癌细胞的同时，也会杀死正常的组织细胞。此外，化学疗法还存在药物生物利用率低的缺点，具体表现为癌细胞对药物的摄入效率较低，药物在血液循环过程中难以跨过生理障碍到达肿瘤部位。这些问题都不同程度地限制了抗癌药物的使用剂量和应用范围，阻碍了化学疗法在癌症治疗中的应用，亟待人们的解决。
纳米材料由于具有独特的尺寸优势，靶向功能，可跨越生理屏障，多功能性，能增溶疏水性药物，可提高药物的稳定性，对药物的可控释放，降低药物的毒副作用等化学和物理特性，使其在药物传输方面具有很多优越性，受到了材料科学家和临床医生的重视并得到了广泛的研究。纳米钻石因其具有低毒性、高生物相容性和表面易修饰特性，将其作为载体制备纳米药物时受到了众多研究者的青睐。PEG在水溶液和一些溶剂中具有极好的溶解性，无毒且具有低的免疫原性，这使其制备过程具有灵活性且在制备肿瘤药物中得到了广泛应用。基于此，本文以H2N-PEG-COOH修饰纳米钻石，在柠檬酸钠或醋酸钠作用下物理吸附化疗药物阿霉素制备得到高负载及pH控释的纳米药物，并研究了该种药物的抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供的一种高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取真空干燥的羧基化纳米钻石，按每毫克羧基化纳米钻石加入1-1.5mL的浓度为0.1M、pH为5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每毫克羧基化纳米钻石加入0.2mg EDC、0.25mg NHS，室温搅拌反应6h，反应完毕后以15000rpm高速离心5min弃除上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；接着将活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到浓度为0.1M、pH为8.4的硼酸缓冲溶液中，经过短暂超声分散形成悬浊液，再按每毫克活化的羧基化纳米钻石快速加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，继续室温搅拌反应12h，待反应结束，以15000rpm高速离心5min吸除上清液，并用0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液高速离心洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)沉淀物；
(2)取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)1mg，按每毫克ND-PEG-COOH加入1-1.5mL柠檬酸钠(Na3Cit，1.0M)溶液，超声分散1小时形成悬浊液，再按每毫克ND-PEG-COOH加入0.1-0.2mg阿霉素(DOX)，避光于摇匀仪上反应6小时，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用1.0M柠檬酸钠(Na3Cit)继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，制得纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/柠檬酸钠(ND-PEG-DOX/Na3Cit)纳米药物，真空干燥，冷藏，避光保存。
所述的柠檬酸钠可以用醋酸钠替代。
上述制备的高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物可以在制备抗肿瘤药物中应用。
与现有技术相比本发明的有益效果：本发明选用的纳米钻石材料具有生物相容性好、无毒、化学性质稳定、表面易修饰等诸多优点；PEG因其在水溶液和一些溶剂中具有极好的溶解性、无毒且具有低的免疫原性等优势，使制备过程具有灵活性。与本实验室前期研究相比较，本文发明的纳米药物其载药量比之高了5-6倍，且在肿瘤环境中的释药率高达到80％，而在正常组织环境中却相对稳定，释药率仅为7％，这均比前期研究略胜一筹。通过纳米载体ND-PEG与人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)作用，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；将纳米载体纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG)在柠檬酸钠或醋酸钠作用下，物理吸附阿霉素，制备得到ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc纳米药物，通过流式细胞仪检测细胞摄取ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc实验，表明ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc均可以进入细胞，从而诱导细胞凋亡，经MTT实验检测药物对细胞的活性，表明该纳米药物不仅可以降低化疗药物对正常细胞的毒副作用，而且能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，所以ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc可在制备抗肿瘤药物中应用。
附图说明
图1各种纳米颗粒的红外光谱图
图2A不同pH对纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit体外释药的影响
图2B不同pH对纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc体外释药的影响
图3A用流式细胞仪检测MCF-7细胞的散点图
图3B用流式细胞仪检测MCF-7细胞摄取ND-PEG-DOX/Na3Cit的散点图
图3C用流式细胞仪检测MCF-7细胞摄取ND-PEG-DOX/NaAc的散点图
图4A用流式细胞仪检测MCF-7细胞的荧光强度图
图4B用流式细胞仪检测MCF-7细胞摄取ND-PEG-DOX/Na3Cit的荧光强度图
图4C用流式细胞仪检测MCF-7细胞摄取ND-PEG-DOX/NaAc的荧光强度图
图5A不同浓度的纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit对体外培养HepG2细胞活性的影响
图5B不同浓度的纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit对体外培养HeLa细胞活性的影响
图5C不同浓度的纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit对体外培养MCF-7细胞活性的影响
图6A纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit对体外培养不同时间HepG2细胞活性的影响
图6B纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit对体外培养不同时间HeLa细胞活性的影响
图6C纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit对体外培养不同时间MCF-7细胞活性的影响
图7A纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc对体外培养不同时间MCF-7细胞活性的影响
图7B纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc对体外培养不同时间HeLa细胞活性的影响
图7C纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc对体外培养不同时间MCF-7细胞活性的影响
具体实施方式
以下为实施例中使用的材料：
纳米钻石(ND，元素六，直径大约140nm,Ireland)。
阿霉素(DOX)是盐酸多柔比星，分子式为C27H29NO11·HCl，分子量为579.99，深圳万乐药业有限公司，规格按C27H29NO11·HCl计算为10mg。
聚乙二醇(H2N-PEG-COOH，分子量为2000)为上海西宝生物有限公司生产。
二水合柠檬酸钠(C6H5Na3O7·2H2O，分子量为294.10)为阿拉丁(Aladdin)试剂有限公司生产。
醋酸钠(CH3COONa，分子量为82.03)为天津市化学试剂批发部监制生产。
实施例1
(1)纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)纳米粒子的制备
准确称取1.0mg羧基化纳米钻石，分别经过二甲基亚砜(DMSO)、无水乙醇(C2H5OH)、蒸馏水(H2O)洗涤后，置于1.0mL MES(0.1M、pH5.8)缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，接着加入0.2mg EDC、0.25mg NHS，室温搅拌反应6h，待反应结束后以15000rpm高速离心5min，除去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；
把活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到1.0mL BBS(0.1M、pH8.4)缓冲溶液中，超声分散10min形成悬浊液，接着加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，继续室温搅拌反应12h，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用蒸馏水继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)纳米粒子，置于真空干燥箱中保存备用。把未反应的H2N-PEG-COOH上清液小心移取到干净的烧杯中静置，待测定ND-PEG-COOH纳米颗粒上偶联H2N-PEG-COOH的质量。
精确称取1mg H2N-PEG-COOH，用BBS(0.1M，pH8.4)溶解并定容于10ml的比色管中，分别量取0.8ml、0.56mL、0.4ml、0.16ml、0.08mL置入2ml的EP管中，按摩尔比向其中入相应体积的荧光胺，再加入一定体积使溶液总体积为2mL,立即涡流10秒，放置5分钟,采用荧光分光光度法设激发波长为385nm，测485nm处的荧光强度，以H2N-PEG-COOH摩尔浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制H2N-PEG-COOH标准曲线。据标准曲线公式，用反应前加入H2N-PEG-COOH的总量减去反应后上清液中H2N-PEG-COOH质量，即得到每毫克ND粒子偶联H2N-PEG-COOH的量为0.15mg。
(2)纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/柠檬酸钠(ND-PEG-DOX/Na3Cit)纳米药物的制备
称取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)1mg，加入1mL柠檬酸钠(Na3Cit，1.0M)溶液，超声分散1小时形成悬浊液，接着加入0.2mg阿霉素(DOX)，避光于摇匀仪上反应6小时，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用1.0M柠檬酸钠(Na3Cit)继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/柠檬酸钠(ND-PEG-DOX/Na3Cit)纳米药物，置于真空干燥箱中保存备用。收集所有上清液到一小烧杯中于4℃冰箱静置过夜，待测定ND-PEG-COOH纳米颗粒上吸附DOX的质量。用紫外可见光分光光谱法检测阿霉素490nm峰位处的吸光度，计算DOX的吸附量，经计算可知每毫克ND-PEG-COOH吸附阿霉素质量约(170±1.26)微克。
实施例2
(1)纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)纳米粒子的制备同实施例1
(2)纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/柠檬酸钠(ND-PEG-DOX/Na3Cit)纳米药物的制备
称取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)1mg，加入1mL柠檬酸钠(Na3Cit，1.0M)溶液，超声分散1小时形成悬浊液，接着加入0.1mg阿霉素(DOX)，避光于摇匀仪上反应6小时，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用1.0M柠檬酸钠(Na3Cit)继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/柠檬酸钠(ND-PEG-DOX/Na3Cit)纳米粒子，置于真空干燥箱中保存备用。收集所有上清液到一小烧杯中于4℃冰箱静置过夜，待测定ND-PEG-COOH纳米颗粒上吸附DOX的质量。用紫外可见光分光光谱法检测阿霉素490nm峰位处的吸光度，计算DOX的吸附量，经计算可知每毫克ND-PEG-COOH吸附阿霉素质量约(80±0.56)微克。
实施例3
(1)同实施例1步骤(1)。
(2)纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/醋酸钠(ND-PEG-DOX/NaAc)纳米药物的制备
称取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)1mg，加入1mL醋酸钠(NaAc，1.0M)溶液，超声分散1小时形成悬浊液，接着加入0.2mg阿霉素(DOX)，避光于摇匀仪上反应6小时，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用1.0M醋酸钠(NaAc)继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/柠檬酸钠(ND-PEG-DOX/NaAc)纳米药物，置于真空干燥箱中保存备用。收集所有上清液到一小烧杯中于4℃冰箱静置过夜，待测定ND-PEG-COOH纳米颗粒上吸附DOX的质量。用紫外可见光分光光谱法检测阿霉素490nm峰位处的吸光度，计算DOX的吸附量，经计算可知每毫克ND-PEG-COOH吸附阿霉素质量约(190±0.96)微克。
实施例4
纳米粒子的红外光谱图表征
为了确认聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)是否通过酰胺键连接到了纳米钻石表面，阿霉素是否吸附到了纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)表面，纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/柠檬酸钠(ND-PEG-DOX/Na3Cit)纳米粒子中是否有柠檬酸钠的存在，纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/醋酸钠(ND-PEG-DOX/NaAc)纳米粒子中是否有醋酸钠的存在。分别取微量纳米颗粒与溴化钾按质量比为1:100混合研磨压片，测定其红外光谱。
图1为所制备纳米颗粒的红外光谱图，图1中A为纳米钻石(ND)的红外光谱图，图1中B为纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)的红外光谱图，图1中C为纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/柠檬酸钠的红外光谱图，图1中D为纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/醋酸钠(ND-PEG-DOX/NaAc)的红外光谱图.图1中A，3422cm-1左右的吸收峰为－OH的伸缩振动峰，1747cm-1处为－COO-的特征吸收峰，1625cm-1处为C＝O的伸缩振动吸收峰，1385cm-1处为－OH弯曲振动吸收峰；1098cm-1处为C-O键的伸缩振动吸收峰；图1中B，3423cm-1处为酰胺键中的－NH的伸缩振动吸收峰，1656cm-1处为－COO-中C＝O的特征峰，1621cm-1处为酰胺键中为C＝O的伸缩振动峰，1556cm-1处为酰胺键中N-H的面内弯曲振动吸收峰，748cm-1、619cm-1、655cm-1处为酰胺键中N-H的面外弯曲振动吸收峰，1385cm-1处为酰胺键中C-N的伸缩振动吸收峰，2924、2851cm-1处-CH2的不对称伸缩振动吸收峰，1100cm-1处为ND-PEG中C－O的伸缩振动吸收峰。通过酰胺键的形成表明聚乙二醇成功连接到了钻石表面；图1中C，3453cm-1处为阿霉素中-NH2和酰胺键中-NH的伸缩振动吸收峰，3263cm-1处为柠檬酸钠中-OH的伸缩振动吸收峰，1393cm-1处为阿霉素中-OH的面内弯曲振动吸收峰，902cm-1处为阿霉素中苯环的特征吸收峰，1593cm-1处为酰胺键与柠檬酸钠中羰基的重叠吸收峰，这些特征吸收峰表明阿霉素成功吸附到了纳米钻石-聚乙二醇表面，也表面纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/柠檬酸钠(ND-PEG-DOX/Na3Cit)纳米粒子中有柠檬酸钠的存在。图1中D，3435cm-1处为阿霉素中-NH2和酰胺键中-NH的伸缩振动吸收峰，1640cm-1处为醋酸钠中-OH和酰胺键中-C＝O的伸缩振动吸收重叠峰，1413cm-1处为阿霉素中-OH的面内弯曲振动吸收峰，980cm-1处为阿霉素中苯环的特征吸收峰，1204cm-1处为酰胺键中C-N的伸缩振动吸收峰，这些特征吸收峰表明阿霉素成功吸附到了纳米钻石-聚乙二醇表面，也表面纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素/醋酸钠(ND-PEG-DOX/NaAc)纳米粒子中有醋酸钠的存在。
实施例5
不同pH对纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit体外释药的影响
纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit的体外释放实验在37℃下PBS(0.01M，pH 5.0)、PBS(0.01M，pH 6.5)、PBS(0.01M，pH 7.4)三种条件下进行。分别取三分等量纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit或ND-PEG-DOX/NaAc悬浊分散于相应介质溶剂中并放入释放用透析袋中，透析袋分别浸入9mL上述三种缓冲溶液介质中，置于37℃恒温震荡仪中，在每个取样时间点，取走2mL溶液用于紫外测试，另外补加2mL对应的新鲜透析溶剂。取出的2mL溶液通过阿霉素(DOX)在485nm处的吸光度从而测定其含量。
图2A为纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit在不同pH下体外释药曲线，结果可以看出，在生理条件(PBS，pH 7.4)下，纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit很稳定，经过长达约50个小时后累计释药率才为7％左右，而在酸性条件PBS(0.01M，pH 5.0)、PBS(0.01M，pH 6.5)下，纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit的释放率大于正常生理条件下，且随着酸性的增加(pH值的减小)，阿霉素的释放速率越来越快，释药量也不断增多，尤其在PBS(0.01M，pH 5.0)酸性条件下，累计释放率达到了约80％。研究表明，人体的血液和正常组织的pH值为7.4，在此pH值下，纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit释放阿霉素的速率很缓慢，这就避免了ND-PEG-DOX/Na3Cit在血液循环的过程中释放大量药物，从而减少正常组织对阿霉素(DOX)的摄取和吸收，降低药物对正常组织和细胞的毒副作用。表明纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit可以应用于肿瘤治疗。图2B为纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc在不同pH下体外释药曲线，结果可以看出，在生理条件(PBS，pH 7.4)下，纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc很稳定，经过长达约70个小时后累计释药率才为9.6％左右，而在酸性条件PBS(0.01M，pH 5.0)、PBS(0.01M，pH 6.5)下，纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc的释放率大于正常生理条件下，且随着酸性的增加(pH值的减小)，阿霉素的释放速率越来越快，释药量也不断增多，约为正常组织生理条件下的四倍。研究表明，人体的血液和正常组织的pH值为7.4，在此pH值下，纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc释放阿霉素的速率很缓慢，这就避免了ND-PEG-DOX/NaAc在血液循环的过程中释放大量药物，从而减少正常组织对阿霉素(DOX)的摄取和吸收，降低药物对正常组织和细胞的毒副作用。表明纳米药物ND-PEG-DOX/NaAc可以应用于肿瘤治疗。
实施例6
流式细胞仪检测体外MCF-7细胞摄取纳米钻石-聚乙二醇-阿霉素-柠檬酸钠(ND-PEG-DOX/Na3Cit)实验
取对数生长期的MCF-7细胞以2.0×105/dish的密度接种于35mm培养皿中，培养16h后，弃除上清液，PBS洗涤三次，本实验中用实施例1制备的ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc纳米药物，分别加入ND-PEG-DOX/Na3Cit或ND-PEG-DOX/NaAc(含5μg/ml DOX)纳米药物于37℃孵育2h，孵育完毕，收集细胞，加入buffer缓冲液，通过流式细胞仪测定其红色荧光强度(488nm激发波长)信号，以未做任何处理的细胞为对照。
图3A、图3B和图3C为MCF-7细胞的前向散射光强度(forward scatter intensity，FSC)和侧向散射光强度(side scatter intensity，SSC)的散点图，FSC反映细胞的相对大小，SSC反映细胞内颗粒物质的复杂程度，颗粒越多，SSC散射强度就越大。由图3B及图3C和图3A比较，观察到当ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc纳米药物与细胞作用后的SSC信号明显强于细胞本身的SSC强度，表明细胞内的颗粒物增多，这是由于纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc大量进入细胞内导致，说明了ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc纳米药物可以进入MCF-7细胞。而两者FSC的强度没有明显差异，表明细胞的大小基本未发生变化，说明纳米药物对细胞本身性质不会产生影响。由于DOX以488nm为激发波长时，在500-700nm有荧光信号产生，因此通过检测细胞内ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc的荧光强度，间接反映细胞摄取ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc量的多少。图4A是未经处理的细胞所检测到的荧光信号强度，是细胞自发荧光，即细胞内部的荧光分子经光照射后所产生的荧光；图4B是含5μg/ml DOX的ND-PEG-DOX/Na3Cit与细胞作用2h后所检测到的荧光信号强度图，图4C是含5μg/ml DOX的ND-PEG-DOX/NaAc与细胞作用2h后所检测到的荧光信号强度图，可以看到，用ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc处理细胞的荧光强度明显大于细胞本身的荧光强度，再次表明ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc已进入细胞，与图3结果一致。
实施例7
不同浓度ND-PEG-DOX/Na3Cit纳米药物对人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)活性的影响
将处于对数生长期的人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)细胞(10％FBS/DMEM培养基，5％CO2，37℃)按每孔5×103个接种于96孔培养板，细胞贴壁后，换200μL 10％FBS/DMEM培养基配制的各实验组(A：ND-PEG 5.88μg/mL、ND-PEG-DOX/Na3Cit 5.88μg/mL(含DOX 1μg/mL)；B:ND-PEG 17.65μg/mL、ND-PEG-DOX/Na3Cit 17.65μg/mL(含DOX 3μg/mL)；C：ND-PEG 29.41μg/mL、ND-PEG-DOX/Na3Cit29.41μg/mL(含DOX 5μg/mL)；D：ND-PEG 41.18μg/mL、ND-PEG-DOX/Na3Cit 4μg/mL(含DOX 7μg/mL)；E：ND-PEG52.94μg/mL、ND-PEG-DOX/Na3Cit 52.94μg/mL(含DOX9μg/mL)，每组均以未处理的HepG2、HeLa、MCF-7细胞为空白对照组，每组设置6个复孔，培养72h后每孔加入20μL5mg/mL MTT的PBS溶液，继续培养4h，然后弃除孔内旧培养液，每孔加入150μL DMSO，均匀振摇10min，进行酶标仪上机检测。
图5A为各药物组对体外HepG2细胞增殖的影响，图5B为各药物组对体外HeLa细胞增殖的影响，图5C为各药物组对体外MCF-7细胞增殖的影响。与空白细胞组对照，发现纳米材料载体ND-PEG在不同浓度条件下，对HepG2、HeLa、MCF-7三种细胞活性几乎没有影响，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；而纳米药物ND-PEG-DOX/Na3Cit对HepG2、HeLa、MCF-7三种细胞均表现出不同程度的杀伤作用，对HepG2细胞和MCF-7细胞的杀伤性较敏感，均表现为在低浓度(1μg/mL)时杀伤力不强，当浓度逐渐增大时，杀伤力增强，在浓度为5μg/mL时对HepG2细胞杀伤力达到饱和，细胞存活率降到约为20％，在浓度为3μg/mL时对MCF-7细胞杀伤力达到饱和，细胞存活率降到约为10％；相对而言，对HeLa细胞的杀伤力比上述两种细胞稍弱，表现为在低浓度(1μg/mL)时杀伤力不强，随着浓度逐渐增大，杀伤力不断增强，在浓度高达到9μg/mL时，细胞存活率约为15％。表明ND-PEG-DOX/Na3Cit药物可以有效杀死肿瘤细胞，且对不同的肿瘤细胞具有不同的杀伤力，其强弱顺序依次表现为MCF-7>HepG2>HeLa,即对HeLa细胞杀伤力最弱，MCF-7细胞杀伤力最强。
实施例8
ND-PEG-DOX/Na3Cit纳米药物对人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)培养不同时间活性的影响
将处于对数生长期的人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)细胞(10％FBS/DMEM培养基，5％CO2，37℃)按每孔5×103个接种于96孔培养板，细胞贴壁后，换200μL 10％FBS/DMEM培养基配制的各实验组(A：ND组，29.41μg/ml；B:ND-PEG组，29.41μg/ml；C：ND-PEG-DOX/Na3Cit组，29.41μg/ml ND-PEG+5μg/ml DOX；D：DOX组，5μg/mlDOX)，每组均以未处理的HepG2、HeLa、MCF-7细胞为空白对照组，分别培养24h、48h和72h后每孔加入20μl 5mg/ml MTT溶液，继续培养4h，然后弃除孔内旧培养液，接着每孔加入150μLDMSO，振摇10min，进行MTT检测。
图6A为各药物组对体外HepG2细胞增殖的影响，图6B为各药物组对体外HeLa细胞增殖的影响，图6C为各药物组对体外MCF-7细胞增殖的影响。与空白细胞组对照，A和B药物组在选定浓度条件下，对HepG2、HeLa、MCF-7细胞增值基本没有影响，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；加药24h后，C组对细胞活性的影响与对照组相比基本上没有明显差异，但随着时间的延长，C组对细胞的毒性明显大于对照组，表明ND-PEG-DOX/Na3Cit药物能够有效杀死肿瘤细胞，在相同时间(小于72h)与相同阿霉素浓度条件下，D组药物对细胞的杀伤力均大于C组药物对细胞的杀伤力，表明ND-PEG-DOX/Na3Cit具有缓释药物特性，但达到72h时，C组药物对HepG2细胞和MCF-7细胞的杀伤力均大于D组药物，但是对HeLa细胞的杀伤力基本相同，更进一步表明ND-PEG-DOX/Na3Cit对HepG2细胞和MCF-7细胞的杀伤性较敏感。
实施例9
ND-PEG-DOX/NaAc纳米药物对人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)培养不同时间活性的影响
将处于对数生长期的人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)细胞(10％FBS/DMEM培养基，5％CO2，37℃)按每孔5×103个接种于96孔培养板，细胞贴壁后，换200μL10％FBS/DMEM培养基配制的各实验组(A：ND组，26.32μg/ml；B:ND-PEG组，26.32μg/ml；C：ND-PEG-DOX/NaAc组，26.32μg/ml ND-PEG+5μg/ml DOX；D：DOX组，5μg/mlDOX)，每组均以未处理的HepG2、HeLa、MCF-7细胞为空白对照组，分别培养24h、48h和72h后每孔加入20μl 5mg/ml MTT溶液，继续培养4h，然后弃除孔内旧培养液，接着每孔加入150μLDMSO，振摇10min，进行MTT检测。
图7A为各药物组对体外HepG2细胞增殖的影响，图7B为各药物组对体外HeLa细胞增殖的影响，图7C为各药物组对体外MCF-7细胞增殖的影响。与空白细胞组对照，A和B药物组在选定浓度条件下，对HepG2、HeLa、MCF-7细胞增值基本没有影响，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；加药24h后，C组对细胞活性的影响与对照组相比基本上没有明显差异，但随着时间的延长，C组对细胞的毒性明显大于对照组，表明ND-PEG-DOX/NaAc药物能够有效杀死肿瘤细胞，且表现为对HepG2细胞和MCF-7细胞杀伤力最大，对HeLa细胞稍弱。
综上所述，在柠檬酸钠或醋酸钠的作用下，将阿霉素物理吸附到纳米载体纳米钻石-聚乙二醇表面从而成功制得ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc纳米药物。通过体外释药实验，发现该纳米药物在人体的血液和正常组织的pH值条件下，释放阿霉素的速率很缓慢，表明该纳米药物可以有效降低对正常组织和细胞的毒副作用；用MTT测试ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc与HepG2、MCF-7、HeLa三种细胞作用，表明该纳米药物可以有效杀死肿瘤细胞，与游离阿霉素对细胞的杀伤力相比，ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc具有缓释药物特性，且随着时间的延长，杀伤力强于游离的阿霉素。因此ND-PEG-DOX/Na3Cit和ND-PEG-DOX/NaAc既能降低化疗药物对正常细胞的毒副，又能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，可在制备抗肿瘤药物中应用。
Claims (2)
1.高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物在制备抗乳腺癌药物中的应用，所述高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物，通过如下步骤的方法制备得到：
(1)称取真空干燥的羧基化纳米钻石，按每毫克羧基化纳米钻石加入1-1.5mL的浓度为0.1M、pH为5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每毫克羧基化纳米钻石加入0.2mg EDC、0.25mg NHS，室温搅拌反应6h，反应完毕后以15000rpm高速离心5min弃除上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；接着将活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到浓度为0.1M、pH为8.4的硼酸缓冲溶液中，经过短暂超声分散形成悬浊液，再按每毫克活化羧基的纳米钻石快速加入0.3mg H2N-PEG-COOH，继续室温搅拌反应12h，待反应结束，以15000rpm高速离心5min吸除上清液，并用0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液高速离心洗涤三次，获得ND-PEG-COOH沉淀物；
(2)称取真空干燥的ND-PEG-COOH，按每毫克ND-PEG-COOH加入1mL浓度为1.0M的柠檬酸钠溶液中，超声分散1h形成悬浊液，再按ND-PEG-COOH与阿霉素质量比为5：1加入阿霉素，摇匀，避光反应6h，以15000rpm离心5min，用1.0M的柠檬酸钠溶液洗涤3次，制得pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物ND-PEG-DOX/Na3Cit真空干燥，冷藏，避光保存；
所述步骤(1)中纳米钻石粒径为140nm。
2.如权利要求1所述高负载及pH可控释放阿霉素的纳米钻石药物在制备抗乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的柠檬酸钠用醋酸钠替代。
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