CN114540228B - 一种经光热剂修饰的细菌、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种经光热剂修饰的细菌、其制备方法及其应用。该细菌是一种组合光热剂表面修饰和遗传表达的工程化细菌，是在细胞内表达黑色素且在细胞外表面由至少一种光热剂修饰的细菌。该至少一种光热剂包括第一光热剂和/或第二光热剂，其中第一光热剂为多巴胺，第二光热剂包括选自光热染料中的一种或多种；优选地，第二光热剂为近红外荧光染料，更优选地，吲哚菁绿。该经光热剂修饰的细菌在激光照射之后具有稳定的三重光热升温效果，在肿瘤部位具有特异性定植能力，且渗透能力强，能够实现均匀分布和持久的滞留效应。

Description

一种经光热剂修饰的细菌、其制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种经光热剂修饰的细菌、其制备方法及其应用。该细菌是一种组合光热剂表面修饰和遗传表达的工程化细菌，具体地，是在细胞内表达黑色素且在细胞外表面由至少一种光热剂修饰的细菌。该经光热剂修饰的细菌在激光照射之后具有稳定的三重光热升温效果，在肿瘤部位具有特异性定植能力，且渗透能力强，能够实现均匀分布和持久的滞留效应。
背景技术
光热疗法(PTT)是一种直接作用于病灶部位的局部治疗方法，通过光敏剂在电磁辐射下产生的热疗来消融实体瘤，由于其微创性和低毒性有良好的临床应用转化前景。光热剂(PTA)是光热疗法的关键组成部分，能够响应近红外光(NIR)并有效地将吸收的光能转化为热能。常用的光热剂包括黑色素等天然产物和涉及贵金属、碳基材料、近红外染料等的合成化合物。尽管光热能量转换效率高，但传统光热剂仍存在水溶性低、药代动力学欠佳或副作用严重的问题。为了解决这些问题，各种功能性纳米材料已被用于递送光热剂，使得水溶性、循环时间和生物相容性大幅增加。虽然使用纳米制剂能负载并递送光热剂，但由于存在多个生物屏障使其在肿瘤部位的有效积累仍然很困难，令人失望的是，静脉注射总体富集率低于1.4％。即使在局部注射的帮助下，由于受肿瘤内高的间质液压力和致密的细胞外基质等影响，光热剂向远端肿瘤组织的扩散性极低，造成肿瘤组织不均匀受热，从而引发治疗失败。
微生物，如厌氧细菌、溶瘤病毒和工程酵母，鉴于它们的生物趋向特性，已成为有前途的治疗剂或药物输送载体。特别地，据报道，使用天然或功能化细菌作为光热剂来治疗不同类型的实体瘤，通过缺氧环境趋向性来靶向和定植于肿瘤组织。近期有研究报道，在激光照射下，鼠伤寒沙门氏菌侵染的肿瘤能诱发血栓从而实现光热治疗，而且光合细菌在肿瘤中也具有发挥光热效应的潜力；此外，多巴胺沉积涂层包裹的减毒沙门氏菌以及在细菌表面修饰有光敏剂纳米颗粒的兼性厌氧细菌已被用于提高光热剂的功效。毫无疑问，这些工作为开发用于增强肿瘤光热疗法的更优的光热剂铺平了道路。尽管该领域取得了上述令人振奋的进展，但先前报道的光热细菌仍面临着一些重大挑战，包括：(1)单一且易于衰减的光热效应；(2)有限的光热剂负载量导致高剂量的细菌或辐射，不可避免地引起安全问题；(3)很少探究基于细菌的光热剂的肿瘤内分布和保留。因此，持续需要开发具有生命活性强且高效的光热剂。
关于黑色素，其存在于许多生物体中，在可见光和近红外光波段范围内被强烈吸收，是有高光热转换效率的天然光热剂，因此，黑色素非常适用于光热疗法。同时，聚多巴胺(pDA)是天然黑色素(真黑色素)的主要色素，它具有优异的生物相容性，主要由多巴胺聚合而成。在体外，多巴胺能自发粘附并形成聚多巴胺表面涂层，特别是在富含氨基和巯基的生物膜表面。此外，吲哚菁绿(ICG)是广泛应用于医学领域的近红外荧光染料，具有优异的光热转换能力，但是由于其具有强亲脂性和血清蛋白亲和力，游离ICG会被肝胆快速清除(血浆半衰期<5min)，严重限制了其肿瘤靶向递送效率。
发明内容
针对现有技术中肿瘤光热疗法中存在的不足和持续的需求，本发明申请的发明人及其团队旨在优化光热剂的肿瘤靶向性能、提高其肿瘤穿透能力并增强光热效应，通过组合多种光热材料各自特点及微生物独特修饰，采用至少一种光热剂表面修饰和遗传表达黑色素的工程化细菌，由此提供一种经光热剂修饰的细菌、生物制剂、多种光热剂递送系统、其制备方法及应用。
第一方面，本发明申请提供一种经多种光热剂修饰的细菌，在细胞内表达黑色素并且在细胞外表面由至少一种光热剂修饰的细菌。
进一步地，该细菌是选自肠杆菌科、双歧杆菌科、乳杆菌科、拟杆菌科、梭菌科中的任一种，优选地，埃希氏菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、乳杆菌属、李斯特菌属、拟杆菌属、梭菌属中的一种菌，具体地，选择大肠杆菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌、丁酸梭菌或减毒沙门氏菌。
进一步地，该至少一种光热剂包括第一光热剂和/或第二光热剂，其中第一光热剂为多巴胺，第二光热剂包括选自光热染料中的一种或多种；优选地，第二光热剂为近红外荧光染料，更优选地，吲哚菁绿(ICG)。
进一步地，在经光热剂修饰的细菌中，聚多巴胺和吲哚菁绿(ICG)附着在细菌细胞膜表面。
进一步地，在该经光热剂修饰的细菌的表面，聚多巴胺通过化学键与吲哚菁绿(ICG)结合。具体地，依靠分子间相互作用力、π-π堆积、电荷相互作用等，将不同光热剂结合在细菌表面。
第二方面，本发明申请提供一种用于肿瘤光热疗法的生物制剂，该生物制剂包括上述任一种经光热剂修饰的细菌，其中，在细胞内表达黑色素并且在细胞外表面由至少一种光热剂修饰的细菌。
进一步地，该细菌是选自肠杆菌科、双歧杆菌科、乳杆菌科、拟杆菌科、梭菌科中的任一种，优选地，埃希氏菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、乳杆菌属、李斯特菌属、拟杆菌属、梭菌属中的一种菌，具体地，选择大肠杆菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌、丁酸梭菌或减毒沙门氏菌。
进一步地，该至少一种光热剂包括第一光热剂和/或第二光热剂，其中第一光热剂为多巴胺，第二光热剂包括选自光热染料中的一种或多种；优选地，第二光热剂为近红外荧光染料，更优选地，吲哚菁绿(ICG)。
进一步地，在经光热剂修饰的细菌中，聚多巴胺和吲哚菁绿(ICG)附着在细菌细胞外表面。
进一步地，在该经光热剂修饰的细菌的表面，聚多巴胺通过化学键与吲哚菁绿(ICG)结合。
第三方面，本发明申请提供一种用于肿瘤光热疗法的光热剂递送系统，其包括上述任一种经光热剂修饰的细菌，其中，在细胞内表达黑色素并且在细胞外表面由至少一种光热剂修饰的细菌。
进一步地，该细菌是选自肠杆菌科、双歧杆菌科、乳杆菌科、拟杆菌科、梭菌科中的任一种，优选地，埃希氏菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、乳杆菌属、李斯特菌属、拟杆菌属、梭菌属中的一种菌，具体地，选择大肠杆菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌、丁酸梭菌或减毒沙门氏菌。
进一步地，该至少一种光热剂包括第一光热剂和/或第二光热剂，其中第一光热剂为多巴胺，第二光热剂包括选自光热染料中的一种或多种；优选地，第二光热剂为近红外荧光染料，更优选地，吲哚菁绿(ICG)。
进一步地，在经光热剂修饰的细菌中，聚多巴胺和吲哚菁绿(ICG)附着在细菌细胞外表面。
进一步地，在该经光热剂修饰的细菌的表面，聚多巴胺通过化学键与吲哚菁绿(ICG)结合。
第四方面，本发明申请提供一种制备上述经光热剂修饰的细菌的方法，包括：构建表达天然黑色素的工程化菌株；将至少一种光热剂中第一光热剂通过原位聚合沉积在该菌株表面；和/或，向包含第一光热剂的缓冲液中加入第二光热剂，使该菌株的细胞外表面结合第一光热剂和第二光热剂，由此获得在细胞内表达黑色素并且由至少一种光热剂修饰的细菌。
进一步地，第一光热剂为多巴胺，第二光热剂为选自光热染料中的一种；优选地，第二光热剂为近红外荧光染料，更优选地，吲哚菁绿(ICG)。
进一步地，在经光热剂修饰的细菌中，聚多巴胺和吲哚菁绿(ICG)附着在细菌细胞膜表面。
进一步地，在该经光热剂修饰的细菌的表面，聚多巴胺通过化学键与吲哚菁绿(ICG)结合。
第五方面，本发明申请提供上述任一种经光热剂修饰的细菌在制备治疗肿瘤的生物制剂方面的用途。
有益效果
在本发明中，该经光热剂修饰的细菌在激光照射之后具有稳定的三重光热升温效果；在肿瘤部位具有特异性定植能力，且渗透能力强，能够实现均匀分布和持久的滞留效应。
具体地，通过基因工程技术使细菌通过表达蛋白质、肽或其他生物分子来引入相对稳定功能的替代方案。为了实现稳健的光热效果，本发明联合采用基因工程和表面改性工程来改造细菌，提供了这样一种含有黑色素、ICG和聚多巴胺的三元光敏系统。基于被光热剂修饰细菌具有的三重光热效应，本发明探索并初步证明该被光热剂修饰细菌作为活体光热剂用于肿瘤光热疗法的潜力。在保证细菌活性条件下，构建产生天然黑色素的细菌，再通过多巴胺在细菌表面的原位聚合共沉积形成聚多巴胺，同时负载光热染料，制备具有多重光热效应的细菌，其中黑色素、光热染料和聚多巴胺具有相似的最大吸收波长，可以在单光照射下产生稳定的三重光热效应。
由于本发明中被光热剂修饰的细菌具有渗透和定植在缺氧肿瘤组织中的活体特性，该细菌可以使光热剂在肿瘤内均匀分布和持续保留。在一定波段范围内的激光照射后，获得的细菌在安全剂量下引起均匀而充分的肿瘤热疗，显著增强肿瘤消退，例如，显著延长不同荷瘤小鼠模型中小鼠的生存期。
附图说明
图1分别示出了制备本发明经光热剂修饰的细菌的流程图、该经光热剂修饰的细菌表征。
其中：a.利用基因工程和多巴胺表面沉积聚合法制备三元光热细菌的示意图；
b.分别含有Bac和Mel琼脂平板的照片；
c.Mel、Mel-pDA和Mel-pDA-ICG的代表性TEM图像，其中，比例尺：500nm；
d,e.分别示出了由DLS测量的Mel、Mel-pDA和Mel-pDA-ICG的粒径大小分布和zeta电位的结果(平均值±SEM，n＝3)；
f.Mel-pDA-ICG的活体成像荧光图像；
g.Mel、Mel-pDA和Mel-pDA-ICG的共聚焦图像，其中pDA用FITC标记，绿色和红色分别表示pDA和ICG，比例尺：2μm；
h.分别为Mel、Mel-pDA和Mel-pDA-ICG的流式细胞术直方图。
图2示出了Mel-pDA-ICG的三重光热效应。
其中：a.在激光照射(1.2W/cm2，808nm)后，有或没有pDA和ICG的Bac和Mel(4×107CFU/管)的照片和热成像图，其中该光热图像由近红外成像系统获取。
b.Mel-pDA-ICG涂到LB琼脂板上并暴露于激光照射后的热图像。
c.激光照射(1.2W/cm2,808nm)300s后，裸菌或光热细菌(2×108CFU/mL)的温度变化。
d.体外凝胶(200μL)的照片，分别注入4×107CFU Mel、Mel-pDA或Mel-pDA-ICG并用1.2W/cm2 808nm激光照射300s的凝胶的热图像。
e.激光照射后凝胶的温度变化。
图3示出了Mel-pDA-ICG的光稳定性变化趋势。
其中：a.ICG水溶液和Mel-pDA-ICG(4×107CFU/管)在激光照射(1.2W/cm2 808nm)180s后的热图像；
b,c.(b)ICG水溶液和(c)Mel-pDA-ICG在不同辐照周期后的温度变化；
d.细菌流式细胞术直方图结果；
e.Mel-pDA-ICG在LB培养基中37℃孵育4h后细菌的平均荧光强度；
f.在LB培养基中孵育或未孵育4h的Mel-pDA-ICG的共聚焦图像，其中绿色和红色分别表示FITC标记的pDA和ICG，比例尺：5μm。
图4示出了Mel-pDA-ICG在皮下4T1荷瘤小鼠体内的生物分布和光热效应。
其中：a.LB琼脂平板的代表性照片；
b.通过平板计数确定的Mel-pDA-ICG的生物分布(n＝3)，注射后48h，收集器官和肿瘤组织并匀浆，将组织匀浆稀释并在37℃下在LB琼脂平板上培养24h，计数；
c.注射后不同时间时的活体成像照片；
d.注射Mel-pDA-ICG或等量的游离ICG的肿瘤的ICG辐射效率(n＝3)；
e.注射4×107CFU的Bac、Mel、Mel-pDA和Mel-pDA-ICG后皮下肿瘤在注射后2h并暴露于1.2W/cm2 808nm的光热图像；
f.不同组小鼠的温度变化(n＝5)。
图5示出了Mel-pDA-ICG的瘤内分布和光热效应。
其中：a,b.瘤内注射a)pDA纳米颗粒或b)Bac-pDA-ICG的4T1皮下肿瘤的冷冻切片的代表性荧光图像，其中pDA纳米颗粒用FITC标记，绿色、红色和蓝色分别表示FITC标记的pDA、表达mCherry荧光蛋白的细菌和DAPI染色的细胞核；
c.注射pDA纳米颗粒或Mel-pDA-ICG后2h时辐射5min(1.2W/cm2,808nm激光)后4T1肿瘤的典型热图像；
d.温度变化与4T1肿瘤中pDA纳米颗粒或Mel-pDA-ICG注射点距离的比率(n＝3，t检验，*p<0.05)。
图6示出了Mel-pDA-ICG的光热治疗价值。
其中：a.4T1细胞在与4×107CFU的Bac、Mel、Mel-pDA或Mel-pDA-ICG孵育并照射5min后的共聚焦图像；
b.4T1细胞在与4×107CFU的Bac、Mel、Mel-pDA或Mel-pDA-ICG孵育并照射5min后的流式细胞分析；
c.4T1细胞在与4×107CFU的Bac、Mel、Mel-pDA或Mel-pDA-ICG孵育并照射5min后的CCK-8活力测定(1.2W/cm2,808nm激光)，其中细胞在测量前用Hoechst(蓝色)/碘化丙啶(红色)或CCK-8染色；
d.在注射后并光照治疗后第14天切片的CT26肿瘤的照片；
e.不同组4T1荷瘤小鼠治疗后的肿瘤生长曲线(n＝5)；
f.不同组皮下4T1荷瘤小鼠治疗后的体重的变化；
g.不同组4T1荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线；
h.不同组4T1荷瘤小鼠的存活率(n＝6)；
i.不同组4T1肿瘤切片在瘤内注射和照射后48h的H&E染色，其中瘤内注射4×107CFU的Bac、Mel、Mel-pDA或Mel-pDA-ICG，并在注射后2h和24h照射两次(1.2W/cm2,808nm,激光5min)，PBS用作对照，误差棒代表标准偏差。
采用单因素方差分析(ANOVA)和图基(Tukey)检验进行统计分析，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。
图7示出了制备Mel、Mel-pDA与Mel-pDA-ICG三组细菌的存活率。
其中：a.示出了三组细菌涂板的代表照片；b.示出了细菌涂板计数定量的结果。
图8示出了Mel、Mel-pDA与Mel-pDA-ICG三组细菌电镜下的原始照片。
图9示出了共聚焦原始照片。
图10示出了流式细胞术的原始代表图。
图11示出了在不同激光强度与细菌浓度下的升温曲线。
其中：a.示出了不同激光强度细菌升温曲线；b.示出了不同细菌浓度的升温曲线。
图12示出了照射不同时间的细菌存活数。
图13示出了对照组Bac、Mel、Mel-pDA与Mel-pDA-ICG在肿瘤内的菌数。
图14示出了瘤内注射后其他主要脏器的HE切片。
图15示出了对照组pDA纳米颗粒的粒径。
图16示出了皮下瘤模型药效的每只小鼠4T1肿瘤大小变化。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步说明，但是并不以此限制本发明。在不背离本发明的技术构思及技术方案的前提下，对本发明所属领域的普通技术人员来说，能够实现的任何修改、调整或修饰、或者等同替换方法都将落入本发明的要求保护的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在一种实施方案中，本发明申请提供一种经光热剂修饰的细菌，在细胞内表达黑色素并且在细胞外表面由至少一种光热剂修饰的细菌。
进一步地，该细菌是选自肠杆菌科、双歧杆菌科、乳杆菌科、拟杆菌科、梭菌科中的任一种，优选地，埃希氏菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、乳杆菌属、李斯特菌属、拟杆菌属、梭菌属中的一种菌，具体地，选择大肠杆菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌、丁酸梭菌或减毒沙门氏菌。
进一步地，该至少一种光热剂包括第一光热剂和/或第二光热剂，其中第一光热剂为多巴胺，第二光热剂包括选自光热染料中的一种或多种；优选地，第二光热剂为近红外荧光染料，更优选地，吲哚菁绿(ICG)。
进一步地，在经光热剂修饰的细菌中，聚多巴胺和吲哚菁绿(ICG)附着在细菌细胞膜表面。
进一步地，在该经光热剂修饰的细菌的表面，聚多巴胺通过共价键与吲哚菁绿(ICG)结合。
在另一种实施方案中，本发明申请提供一种用于肿瘤光热疗法的生物制剂，该生物制剂包括上述任一种经光热剂修饰的细菌，其中，在细胞内表达黑色素并且在细胞外表面由至少一种光热剂修饰的细菌。
进一步地，该细菌是选自肠杆菌科、双歧杆菌科、乳杆菌科、拟杆菌科、梭菌科中的任一种，优选地，埃希氏菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、乳杆菌属、李斯特菌属、拟杆菌属、梭菌属中的一种菌，具体地，选择大肠杆菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌、丁酸梭菌或减毒沙门氏菌。
进一步地，该至少一种光热剂包括第一光热剂和/或第二光热剂，其中第一光热剂为多巴胺，第二光热剂包括选自光热染料中的一种或多种；优选地，第二光热剂为近红外荧光染料，更优选地，吲哚菁绿(ICG)。
进一步地，在经光热剂修饰的细菌中，聚多巴胺和吲哚菁绿(ICG)附着在细菌细胞外表面。
进一步地，在该经光热剂修饰的细菌的表面，聚多巴胺通过共价键与吲哚菁绿(ICG)结合。
在再一种实施方案中，本发明申请提供一种用于肿瘤光热疗法的光热剂递送系统，其包括上述任一种经光热剂修饰的细菌，其中，在细胞内表达黑色素并且在细胞外表面由至少一种光热剂修饰的细菌。
进一步地，该细菌是选自肠杆菌科、双歧杆菌科、乳杆菌科、拟杆菌科、梭菌科中的任一种，优选地，埃希氏菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、乳杆菌属、李斯特菌属、拟杆菌属、梭菌属中的一种菌，具体地，选择大肠杆菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌、丁酸梭菌或减毒沙门氏菌。
进一步地，该至少一种光热剂包括第一光热剂和/或第二光热剂，其中第一光热剂为多巴胺，第二光热剂包括选自光热染料中的一种或多种；优选地，第二光热剂为近红外荧光染料，更优选地，吲哚菁绿(ICG)。
进一步地，在经光热剂修饰的细菌中，聚多巴胺和吲哚菁绿(ICG)附着在细菌细胞外表面。
进一步地，在该经光热剂修饰的细菌的表面，聚多巴胺通过共价键与吲哚菁绿(ICG)结合。
在再一种实施方案中，本发明申请提供一种制备上述经光热剂修饰的细菌的方法，包括：构建表达天然黑色素的工程化菌株；将至少一种光热剂中第一光热剂通过原位聚合沉积在该菌株表面；和/或，向包含第一光热剂的缓冲液中加入第二光热剂，使该菌株的细胞外表面结合第一光热剂和第二光热剂，由此获得在细胞内表达黑色素并且由至少一种光热剂修饰的细菌。
进一步地，第一光热剂为多巴胺，第二光热剂为选自光热染料中的一种；优选地，第二光热剂为近红外荧光染料，更优选地，吲哚菁绿(ICG)。
进一步地，在经光热剂修饰的细菌中，聚多巴胺和吲哚菁绿(ICG)附着在细菌细胞膜表面。
进一步地，在该经光热剂修饰的细菌的表面，聚多巴胺通过共价键与吲哚菁绿(ICG)结合。
在再一种实施方案中，本发明申请提供上述任一种经光热剂修饰的细菌在制备治疗肿瘤的生物制剂方面的用途。
实施例
1.制备经光热剂修饰的细菌，并检测其性能
通过基因工程和表面工程来改造细菌，构建含有黑色素、ICG和聚多巴胺的三元光敏系统(图1.a)。
对于产生黑色素的BL21mel细菌(Mel)，我们将用酪氨酸酶编码的质粒(pET-28a-melA)转到大肠杆菌BL21中，在含有卡那霉素、胰蛋白胨、酪蛋白、酪氨酸和CuSO4的固体培养基中，30℃培养48h，表达黑色素(图1.b)。通过多巴胺的氧化和自聚合制备表面结合聚多巴胺的细菌(Mel-pDA)，具体地，将Mel(2×108CFU)加入到含有0.25mg/ml多巴胺的10mMtris-HCl缓冲液中，并将混合物在1500rpm涡旋15min。然后，加入50μl的1mg/ml ICG水溶液，涡旋30min，使其通过氢键、π-π堆叠及离子键结合于pDA。最后，用PBS洗涤两次，得到经多种光热剂修饰的细菌(Mel-pDA-ICG)。
细菌活力测定显示，未修饰的Mel与Mel-pDA-ICG的菌活性相似，表明改性对细菌活力的影响可忽略不计(图7)。比较Mel，Mel-pDA的透射电子显微镜(TEM)图像在细菌表面上存在大量聚多巴胺纳米颗粒(图1.c和图8)。用ICG共沉积后，Mel-pDA-ICG在其表面上纳米颗粒的分布更均匀，且尺寸降低。动态光散射(DLS)结果显示，在用PDA和pDA-ICG修饰(图1.d)时，Mel的尺寸从1092±9nm分别增加至1623±29、1406±174nm。同时，在用pDA或pDA-ICG修饰(图1.e)之后，Mel的ζ电位从-35±2mV至-14±1mV。在活体成像系统中，Mel-pDA-ICG呈现来自共沉积ICG的强荧光信号(图1.f)。共聚焦成像和流式细胞术分析进一步证实了pDA与ICG的成功修饰。如图1.g和图9所示，用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记pDA呈现的荧光与ICG的荧光能够共定位。通过流式细胞仪的定量分析表明，约92％的Mel成功修饰了pDA和ICG(图1.h和图10)。
为了实现多重光热效果，关键步骤是组合的多种光敏剂需要位于类似的最大吸收波长的范围内，由此可以通过单辐射引发多个光热转换。否则，实施多次照射增加操作难度，还可能损害组合光敏剂的光热转化能力。实际上，含有黑色素、聚多巴胺和ICG的三元光敏细菌系统在808nm处表现出类似的近红外(NIR)吸收。通过不同的激光强度、细菌数、不同光敏剂的组合以及ICG的加载量，系统地评估Mel-pDA-ICG的光热效果。
如实施例及附图所证实，随着激光强度从0.8增加至1.6W/cm2，Mel-pDA-ICG的上升温度增加(图11.a)。在1.2W/cm2的相对温和的激光照射下，随着细菌浓度从2×106增加至2×109CFU/mL，最大上升温度增加(图11.b)。当暴露于1.2W/cm2激光下仅180s后，每108CFU/mL改性细菌的温度升高可能超过20℃。
与图2.a和图2.b中所示的双蒸馏水(DDW)和未改性BL21的光热效应不同，用PDA(Bac-pDA)的表面改性显示，在暴露于激光照射时，其温度升高，ICG(Bac-pDA-ICG)沉积后温度进一步增加。从20μg/ml ICG(Bac-pDA-ICG-20)增加ICG负载量，可进一步促进其温度升高(图2.c)。重要的是，Mel和Bac-pDA-ICG-50之间的升温比的重叠曲线，这表明，黑色素的光热效应相当于pDA与ICG的组合。MEL的光热转化能力强，归因于高水平的黑色素表达。通过用pDA和ICG组合来实现三重光热效应，这在NIR辐射升温上表现出协同效应。暴露于1.2W/cm2激光照射180s后，Mel-pDA-ICG-50的温度变化可以达到28℃，这证明，本发明经光热剂改性的细菌这种三元光敏系统的稳健光热效果。
然后，通过平板计数评估了被照射后不同组的细菌活力。如图12所示，随着曝光时间的增加，存活的Mel-pDA-ICG的数量降低，但激光照射180s后，这些细菌的存活率高达60％。
再者，用胶原水凝胶作为体外肿瘤模拟模型，以研究Mel-pDA-ICG对热疗的效力。注射了4×107CFU的细菌，并在NIR辐射后记录温度的变化。在60s的短时间暴露后，用Mel-pDA-ICG注入的凝胶温度迅速增加35℃(图2.d)。而空白凝胶，用Mel处理的凝胶和用Mel-pDA处理的凝胶的最大温度变化分别为1℃、16℃和21℃。与这些对照相比，Mel-pDA-ICG处理的凝胶的温度升高显示出显著的叠加效果，其归因于黑色素、pDA和ICG的多个NIR吸收。
我们接下来测量了Mel-pDA-ICG的光稳定性，因为这对于确保维持有效的光对热转换至关重要。据报道，由于产生氧自由基，诸如ICG的常规光敏剂在激光照射下是不稳定的，易于被分解从而减弱光热效应。如图3.a和图3.b，在游离ICG暴露于激光照射后，温度变化减弱约50％。在循环光热实验之后，游离的ICG几乎失去了光热能力。而Mel-pDA-ICG表现出卓越的光稳定性，即使在五个循环暴露后，温度变化仍能增加高达67％(图3.c)。Mel-pDA-ICG能经受反复激光辐射，可能与三种光热剂组合的协同效应有关。
此外，通过检测ICG的固有荧光测定在细菌生长期间其表面上的光热剂的保留。实验结果显示，荧光强度随着时间的增加而降低(图3.d,图3.e)。荧光强度的衰减是由细菌复制诱导的所修饰纳米颗粒减少产生的。但是，值得一提的是，在此期间大多数细菌表面仍然修饰有光热剂(图3.f)，这意味着锚定的纳米颗粒可以保留在新生的细菌表面上。凭借这种独特的优势，可以推测，Mel-pDA-ICG特异性定植可以驱动光热剂的深度分布和持续保留。
为了研究Mel-PDA-ICG的体内性能，我们首先考察了它们在皮下4T1肿瘤模型的生物分布。瘤内注射4×107CFU的Mel-pDA-ICG，48h后，取主要器官与肿瘤组织涂板计数。如图4a和b，高于99.99％的细菌集中在肿瘤(图13)内部，血液以及正常器官包括心脏，肝，脾，肺，肾和脑的菌量几乎可以忽略。苏木精-伊红(H&E)染色显示Mel-PDA-ICG有良好的安全性(图14)。Mel-pDA-ICG在肿瘤部位特异性定植是由于Mel具有缺氧环境趋向性。与体外光热作用不同，瘤内注射光热细菌并NIR照射后细菌数与未照射的组相近，这说明，激光照射对Mel-pDA-ICG在肿瘤组织的影响有限。Mel-pDA-ICG的定植能力赋予细菌表面上附着的光敏剂具有较长的肿瘤滞留作用(图4.c)，而游离的ICG在注射1h后几乎全部被清除。光热细菌搭载的ICG在48h时仍有40％集中在肿瘤部位，使PTT有充足的治疗时间(图4.d)。然后，我们通过1.2W/cm2 NIR激光照射记录肿瘤温度的变化，研究了荷瘤小鼠瘤内注射Mel-pDA-ICG的三重光热效应。Bac、Mel和Mel-PDA使肿瘤温度上升于4至10℃(图4.e)。在相同实验条件下，Mel-pDA-ICG表现出协同增强的光热效应。此外，Mel-PDA-ICG引起的温度上升能够从60至300s激光曝光时间内保持。肿瘤内给予Mel、Mel-PDA和Mel-PDA-ICG三组小鼠的温度分别上升到42℃、46℃和60℃(图4.f)。
光热剂在肿瘤组织内的渗透和分布对热疗的性能有着至关重要的影响，特别是对肿瘤光热疗法。常规的光热剂易受低渗透和肿瘤内生物屏障影响，导致肿瘤组织的非均匀加热。因此，我们探究Mel-pDA-ICG注射肿瘤内2h后的瘤内分布。制备相近大小的pDA纳米颗粒(图15)作为对照。pDA纳米颗粒被局限于注射部位，难以渗透到肿瘤组织远端(图5.a)。而肿瘤组织(图5.b)的冷冻切片利用表达的mCherry和表面FITC的荧光信号共同定位细菌，其证明了Mel-PDA-ICG的分布更均一，这可以归因于它们能够通过无血管区域和肿瘤的缺氧区域内的定植渗透能力。相比于pDA纳米颗粒的不均匀加热现象，MeI-PDA-ICG治疗组在激光照射(图5.c)之后的肿瘤热效应均一。通过注射中心和肿瘤的边缘距离与温度差的比值进一步说明热疗的均匀性改善(图5.d)。这些结果表明这种经三重光热剂修饰的细菌能够实现在实体肿瘤光热效应的叠加，滞留延长，且更为均匀的光热效应。
通过活/死荧光染色测定，在体外测试Mel-pDA-ICG对肿瘤细胞光热杀伤作用。将4×107CFU的Mel-pDA-ICG加入到铺有4T1细胞孔内，用1.2W/cm2的808nm激光照射5min，随后用碘化丙啶(PI)和Hoechst进行共聚焦成像和流式分析。与PBS，BL21加激光，Mel加激光、Mel-pDA加激光的对照组相比，MEL-PDA-ICG的光热效应杀伤肿瘤细胞的比率最高(图6.a和图6.b)。与所有对照相比，细胞活力测定进一步证实了Mel-PDA-ICG对肿瘤细胞生长有显著的抑制效果(图6.c)。体内的光热治疗效果首先在CT26结肠癌的鼠模型中进行评价。在肿瘤内注射4×107CFU的Mel-pDA-ICG后，2h和24h时，用1.2W/cm2的808nm激光照射两次。结果显示，与所有对照组相比，Mel-pDA-ICG显示出最高的抑制效果，激光照射后的肿瘤生长显著变慢(图6.d和图6.e)。
进一步评估对4T1肿瘤小鼠模型的抗肿瘤功效。类似地，用PBS、BL21加激光、Mel加激光、Mel-pDA加激光的治疗效果有限，小鼠的生存期短均于23天。在没有显著体重波动的情况下，用Mel-pDA-ICG治疗显示有效的肿瘤缩小，而且小鼠的中位生存期延长至30天以上(图6.f-h和图16)。H&E染色的病理检查表明，由于Mel引发的温度升至约42℃，导致不可逆的组织损伤，Mel-pDA引发的46℃左右的温度导致细胞坏死。而Mel-pDA-ICG可以达到高达约60℃的温度升高，导致蛋白质变性和细胞膜破坏，以及细胞破裂和细胞核分离(图6.i)。Mel-pDA-ICG对肿瘤的治疗效果显示出其在用于增强肿瘤光热疗法方面的巨大潜在和临床价值。
综上，我们已通过表面装饰联合遗传表达将三元光热剂集成到大肠杆菌BL21中，并研究了光热细菌作为肿瘤PPT的效果。通过本领域常规方式，基因工程化BL21，使其表达黑色素，然后将ICG和多巴胺原位共沉积在细菌表面上。由于黑色素、ICG和多巴胺其共享类似的最大吸收波长，使集成的BL21能够在单辐射之后引发稳定的三重光热效果。利用细菌的定植特性，该被光热剂修饰的细菌在肿瘤部位显示出有利的渗透和定植，使得分布均匀并能持续滞留。在瘤内注射后，给药的细菌在暴露于激光照射时产生均匀但足够的肿瘤加热。在CT26和4T1的模型小鼠中，本发明该细菌能显著缩小肿瘤，并延长生存期。
以上仅是本发明的具体实施例以及用于证实本发明申请发明构思的实验例，但并不以此限制本发明。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为包含在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种经光热剂修饰的细菌，其特征在于，所述细菌是在细胞内表达黑色素并且在细胞外表面由至少一种光热剂修饰的细菌，所述至少一种光热剂包括第一光热剂和/或第二光热剂，其中第一光热剂为多巴胺，第二光热剂包括选自光热染料中的一种或多种；
其中，所述第二光热剂为近红外荧光染料；
所述细菌为大肠杆菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌、丁酸梭菌或减毒沙门氏菌。
2.一种用于肿瘤光热疗法的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包括上述权利要求1所述的经光热剂修饰的细菌，所述细菌是在细胞内表达黑色素并且在细胞外表面由至少一种光热剂修饰的细菌；所述肿瘤为实体瘤。
3.一种用于肿瘤光热疗法的光热剂递送产品，其特征在于，所述光热剂递送产品包括上述权利要求1所述的经光热剂修饰的细菌，其中，所述经光热剂修饰的细菌是在细胞内表达黑色素并且在细胞外表面由至少一种光热剂修饰的细菌，所述肿瘤为实体瘤。
4.一种制备经光热剂修饰的细菌的方法，其特征在于，所述方法包括：构建表达天然黑色素的工程化菌株；
将至少一种光热剂中第一光热剂通过原位聚合沉积在该菌株表面；和/或，向包含第一光热剂的缓冲液中加入第二光热剂，使该菌株的细胞外表面结合第一光热剂和第二光热剂，由此获得在细胞内表达黑色素并且由至少一种光热剂修饰的细菌；
其中，第一光热剂为多巴胺，所述第二光热剂为近红外荧光染料；
所述细菌为大肠杆菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌、丁酸梭菌或减毒沙门氏菌。
5.如权利要求1所述的经光热剂修饰的细菌在制备治疗肿瘤的生物制剂方面的用途，所述肿瘤为实体瘤。
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